Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина



Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина
Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина
Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина

Владельцы патента RU 2599500:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) (RU)

Изобретение относится к фармакологии и медицинской диагностике. Раскрыт контрастирующий агент, представляющий собой N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина, который может быть использован для введения фтор-19 метки в белковые молекулы, содержащие остатки лизина. Изобретение обеспечивает повышение качества и стабильности контрастирующего агента. 1 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к фармакологии и медицинской диагностике, конкретнее к контрастирующим агентам для введения фтор-19 метки в белки для последующей визуализации процессов фармакокинетики и фармакодинамики белковых препаратов в режиме фтор-19 ЯМР и магнитно-резонансной томографии (МРТ).

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) представляет собой сегодня широко применяемый метод медицинской диагностики, используемый для создания изображения in vivo, с помощью которого можно получить изображение сосудов и тканей тела (включая злокачественные опухоли), замеряя магнитные свойства ядер атомов в жидкости организма.

Исключительно перспективным ядром для ЯМР спектроскопии in vivo и томографических измерений является фтор-19 [Jesus Ruiz-Cabello, Brad P. Barnett, and Jeff W.M. Bulte / Fluorine (19F) MRS and MRI in biomedicine // NMR Biomed., 2011, 24(2), 114-129]. Он имеет почти такой же большой магнитный момент (40 МГц/Тл), как и протон (42,6 МГц/Тл), и его природное содержание составляет 100%. Ядер 19F в живых организмах практически нет, однако возможности реализовать томографию на ядрах фтор-19 (19F-МРТ) появляются благодаря особым свойствам фторорганических соединений, в которых с углеродом вместо атомов водорода связаны атомы фтора. Вещества, имеющие перфторированный радикал, применяются в МРТ для распознавания различных физиологических и патофизиологических структур и, таким образом, для улучшения диагностической информации, например, местоположения заболевания, для выбора и оценки результата направленной терапии и для профилактики заболеваний и расстройств.

В качестве агентов для МРТ по сигналу 19F широко используются эмульсии перфторуглерода [Díaz-López R, Tsapis N, Fattal E. Liquid perfluorocarbons as contrast agents for ultrasonography and (19)F-MRI // Pharm Res. 2010. V. 1. P. 1-16]. Однако эти препараты обладают серьезными недостатками: они гетерогенны, нестабильны, имеют расщепленные сигналы в спектрах 19F-MPT и, что наиболее важно, они могут задерживаться в различных тканях и органах на продолжительное (иногда месяцы) время.

Перечисленные недостатки агентов на основе перфторуглерода могут быть преодолены при условии использования в качестве контрастирующих агентов ковалентных или нековалентных комплексов фторсодержащих соединений, желательно с единичным сигналом 19F от множественных атомов фтора, с белками.

Так, например, в патентной заявке WO 2003045441, опубл. 05.06.2003 для in vivo для визуализации ферментативной активности используют конъюгаты субстратов различных ферментов, аномальная активность которых связана с конкретными заболеваниями, с соединениями, содержащими перфторалкильную или перфторарильную группу.

В заявке WO 2014135590, опубл. 12.09.2014, предложен универсальный реагент для визуализации биомолекул, в том числе для нужд тераностики, представляющий собой металлоцен, с обогащенными атомами фтора лигандами и линкерной группой для присоединения металлоцена к биополимерам. Визуализация может осуществляться как за счет атомов 19F, так и 18F или любого другого подходящего радионуклида, который может формировать металлоцен.

В заявке WO 2014041150, опубл. 12.09.2014, также предложен универсальный реагент для визуализации, состоящий из наночастиц сополимера молочной и гликолевой кислот, включающих полифторированные краунэфиры и комплексы гадолиния.

Однако для таких реагентов характерно «вымывание» ионов металлов из металлокомплексов, что, с одной стороны, повышает токсичность таких реагентов, а с другой стороны, приводит к расщеплению сигналов от атомов фтора и, в конечном итоге, к снижению чувствительности. Кроме того, реагенты, описанные в приведенных выше примерах, перед присоединением к белкам нуждаются в дополнительной активации.

Ближайшим к заявляемому контрастирующему агенту - прототипом, является контрастирующий агент на основе трифторацетилированного производного тиолактона гомоцистеина для введения в белки фтор-19 метки (19F). Реагент не требует предварительной активации и имеет единичный сигнал от трех атомов фтора -CF3 группы [A.S. Chubarov et. al. Bioorgan. Med. Chem. Lett. (2011) V. 21. P. 4050-4053]. Однако присоединение фтор-метки через трифторацетамидную связь делает такой реагент не достаточно устойчивым.

Задачей изобретения является получение нового контрастирующего агента, содержащего для увеличения интенсивности сигнала более одной CF3 группы, не содержащего нестабильной трифторацетамидной связи и не требующего для мечения белков предварительной активации.

Технический результат: повышение качества и стабильности контрастирующего агента.

Поставленная задача достигается предлагаемым контрастирующим агентом на основе фторпроизводного тиолактона гомоцистеина для введения фтор-19 метки в белки, содержащие в своем составе остатки лизина.

Заявляемый контрастирующий агент представляет собой N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина со следующей структурной формулой (I):

Способ получения заявляемого контрастирующего агента заключается в следующем (на фиг. 1 представлена общая схема его синтеза).

Исходную смесь оптических изомеров гидрохлорида тиолактона гомоцистеина (DL-гидрохлорид тиолактона гомоцистеина) переводят в основание 0,25 М раствором карбонатного буфера (pH 10,5) с последующей экстракцией свободного основания тиолактона гомоцистеина этилацетатом и последующим удалением органического растворителя на ротационном испарителе. Полученное свободное основание тиолактона сразу растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавляют эквивалентное количество м-перфторксилола и перемешивают на магнитной мешалке в течение 16 ч при 25°C. Целевой продукт осаждают из реакционной смеси водой, осадок отделяют центрифугированием. После двухкратной промывки осадка водой осадок высушивают в вакууме. Выход целевого продукта составляет 93,4-95,1%.

Полученный реагент отличается большей стабильностью, позволяет вводить в человеческий сывороточный альбумин до 6 трифторметильных групп на одну молекулу белка, не нуждаются в дополнительной активации перед присоединением к белкам.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Получение N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина.

К 20,4 мг DL-гидрохлориду тиолактона гомоцистеина добавляют 0,5 мл 0,25 М карбонатного буфера (pH 10,5), перемешивают в течение 40 секунд при комнатной температуре. Полученное свободное основание тиолактона гомоцистеина экстрагируют 10 мл этилацетата с последующим удалением органического растворителя на ротационном испарителе. Продукт сразу используется для следующей стадии синтеза ввиду его нестабильности.

К 15 мг свободного основания тиолактона гомоцистеина (tHcy) (0,128 ммоль) добавляют 0,6 мл ДМСО и 8,1 мкл м-перфторксилола. Перемешивают в течение 16 ч при 25°C. К реакционной смеси добавляют 0,6 мл дистиллированной воды и центрифугируют до полного осаждения осадка, декантируют. К осадку приливают 0,4 мл воды, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, центрифугируют, декантируют. Процедуру повторяют еще один раз. Выход целевого продукта составляет 95,1% в виде светло-желтого твердого вещества. 19F ЯМР (CD3CN, δ, м.д., J, Гц): 108,78 (д, 3F, CF3(1)), 108,17 (т, 3F, CF3(2)), 45,18 (м, 1F, F-3a), 31,60 (м, 1F, F-5a), 7,91 (м, 1F, F-6а), JCF3(1),3a=30,9, JCF3(1),5a=3,6, JCF3(2),3a=JCF3(2),5a=22,3, J3a,5a=2,6, J3a,6a=10,0, J5a,6a=18,0, JNH,6a=2,0. 1H ЯМР (DMSO-d6, δ, м.д., J, Гц): 6,52 (ш. д, 1H, NH), 4,71 (м, 1H, H-3), 3,43 (м, 1H, H-5′), 3,31 (м, 1H, H-5), 2,76 (м, 1H, H-4′), 2,26 (м, 1H, H-4), J3,4=12,8, J3,4′=7,0, J3,5=0,5, J3,NH=8,4, J4,4′=12,2, J4,5=7,0, J4,5′=12,2, J4′,5=1,3, J4′,5′=5,3, J5,5′=11,5, J4,NH=2,0, J4′,NH=1,0. 13C ЯМР (CD3CN, δ, м.д., J, Гц): 207,2 (CO), 155,0 (C-3a), 141,6 (C-5a), 140,7 (C-6a), 138,3 (C-1a), 125,8 (CF3), 124,4 (CF3), 123,1 (C-4a), 121,6 (C-2a), 66,2 (C-3), 33,4 (C-5,5′), 28,0 (C-4,4′). ESI MS (m/z) рассч. C12H5NOSF9 [M-H]: 381.995, найдено 381.896. УФ-спектр (CH3CN), λmax/нм (ε, M-1 см-1): 296 ((6,0±0,1)×103), 255 ((1,3±0,1)×104), 325 ((1,9±0,1)×103).

Пример 2.

Получение N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина.

К 204 мг DL-гидрохлориду тиолактона гомоцистеина добавляют 5 мл 0,25 М карбонатного буфера (pH 10,5), перемешивают в течение 2 мин. при комнатной температуре. Полученное свободное основание тиолактона гомоцистеина экстрагируют 3×40 мл этилацетата с последующим удалением органического растворителя на ротационном испарителе. Продукт сразу используется для следующей стадии синтеза ввиду его нестабильности.

К 150 мг свободного основания tHcy (1,28 ммоль) добавляют 6 мл ДМСО и 81 мкл м-перфторксилола. Перемешивают в течение 16 ч при 25°C. К реакционной смеси добавляют 6 мл дистиллированной воды и центрифугируют до полного осаждения осадка, декантируют. К осадку приливают 5 мл воды, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, центрифугируют, декантируют. Процедуру повторяют еще один раз. Выход: 93,4% в виде светло-желтого твердого вещества.

Пример 3.

Взаимодействие N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина с человеческим сывороточным альбумином.

Человеческий сывороточный альбумин 66,5 мг растворяют в 1 мл фосфатного буферного раствора (PBS), добавляют 109 мкл 29,4 мМ раствора N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил) тиолактона гомоцистеина в ДМСО и инкубируют при 37°C в течение 18 ч. После инкубации реакционную смесь очищают от низкомолекулярных веществ с помощью концентраторов «Centricon» (Amicon Centriprep YM30, Millipore, Bedford) при 9000 g. Для этого раствор белка концентрируют до минимально возможного объема (~0,2 мл), добавляют буфер PBS (0,4 мл×4), а затем воду (0,4 мл×6), после добавления каждой порции буфера или воды раствор концентрируют. Затем порции раствора человеческого сывороточного альбумина раскапывают по пробиркам порциями по 0,2 мл, упаривают досуха на вакуумной центрифуге Speed Vac при 30°C и хранят при -20°C. УФ-спектр (буфер PBS pH 7,4), λmax/нм: 259, 278, 300. 19F ЯМР (pH 7,4, буфер PBS): δ 109,3 (м, 3F, CF3(1)), 108,5 (м, 3F, CF3(2)), 47,0 (м, 1F, F-3a), 33,8 (м, 1F, F-5a), 4,0 (м, 1F, F-6а). Выход модифицированного белка составляет ~95%. С использованием 5,5′-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) было показано, что на одну молекулу белка в среднем приходится 3,0±0,1 остатка N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)гомоцистеина. Молярная масса конъюгата, по данным MALDI-TOF масс-спектрометрии, составила 67,6 кг/моль (что соответствует присоединению 3 остатков N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)гомоцистеина).

С помощью метода гель-электрофореза (SDS-PAGE) было показано отсутствие образования высокомолекулярных агломератов и соответствие полос белка нативному человеческому сывороточному альбумину.

Использование предлагаемого контрастирующего агента позволит увеличить чувствительность метода ЯМР спектроскопии за счет увеличения на одну молекулу белка числа CF3 групп, дающих единичный сигнал и повышения стабильности метки за счет исключения из реагента лабильной трифторацетамидной группы.

Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина, представляющий собой N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеин со следующей структурной формулой (I):



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к соединению формулы I или его терапевтически приемлемым солям, где А1 представляет собой фурил, имидазолил, изотиазолил, изоксазолил, пиразолил, пирролил, тиазолил, тиадиазолил, тиенил, триазолил, пиперидинил, морфолинил, дигидро-1,3,4-тиадиазол-2-ил, бензотиен-2-ил, бензотиазол-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил или имидазо[2,1-b][1,3]-тиазол-5-ил; где А1 незамещен или замещен одним, или двумя, или тремя, или четырьмя или пятью заместителями, независимо выбранными из R1, OR1, C(O)OR1, NHR1, N(R1)2, C(N)C(O)R1, C(O)NHR1, NHC(O)R1, NR1C(O)R1, (O), NO2, F, Cl, Br и CF3; R1 представляет собой R2, R3, R4 или R5; R2 представляет собой фенил; R3 представляет собой пиразолил или изоксазолил; R4 представляет собой пиперидинил; R5 представляет собой C1-C10алкил или C2-C10алкенил, каждый из которых не замещен или замещен заместителями, выбранными из R7, SR7, N(R7)2, NHC(O)R7, F и Cl; R7 представляет собой R8, R9, R10 или R11; R8 представляет собой фенил; R9 представляет собой оксадиазолил; R10 представляет собой морфолинил, пирролидинил или тетрагидропиранил; R11 представляет собой C1-C10алкил; Z1 представляет собой фенилен; Z2 представляет собой пиперидин, не замещенный или замещенный OCH3, или пиперазин; Z1A и Z2A оба отсутствуют; L1 представляет собой C1-C10алкил или C2-C10алкенил, каждый из которых не замещен или замещен R37B; R37B представляет собой фенил; Z3 представляет собой R38 или R40; R38 представляет собой фенил; R40 представляет собой циклогексил или циклогексенил; где фенилен, представленный Z1 не замещен или замещен группой OR41; R41 представляет собой R42 или R43; R42 представляет собой фенил, который не конденсирован или конденсирован с пирролилом, имидазолилом или пиразолом; R43 представляет собой пиридинил, который не конденсирован или конденсирован с пирролилом; где каждый вышеуказанный циклический фрагмент, представленный R2, R3, R4, R8, R9, R10, R38, R40, R42 и R43, независимо не замещен или замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из R57, OR57, С(О)OR57, F, Cl CF3 и Br; R57 представляет собой R58 или R61; R58 представляет собой фенил; R61 представляет собой C1-C10алкил; и где фенил, представленный группой R58, не замещен или замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из F и Cl.

Изобретение относится к соединению, представленное формулой (I), в которой A1 обозначает бензол или гетероцикл, выбранный из группы, состоящей из пиридина, пиразина, имидазола, тиазола, пиримидина, тиофена, пиридазина, бензоксазина и оксобензоксазина; A2 обозначает бензол, в случае необходимости замещенный фтором, или тиофен; B1 обозначает водород, низший алкил, в случае необходимости замещенный пиперазинилом или морфолино, галогензамещенный низший алкил, низший алкокси, замещенный карбамоилом, ациламино, карбамоил или низший алкилкарбонилокси (при условии, что, когда A1 обозначает тиазол, B1 не обозначает ациламино); B2 обозначает водород или функциональную группу, содержащую по меньшей мере один атом азота, выбранную из группы, состоящей из ациламино, пирролидинила, морфолино, пиперидинила, в случае необходимости замещенного ацилом, пиперазинила, в случае необходимости замещенного низшим алкилом или ацилом, пиразолила, диазабицикло[2.2.1]гептила, в случае необходимости замещенного ацилом, и ди-(низший алкил)амино, в случае необходимости замещенного амино или ациламино (при условии, что, когда A1 обозначает тиазол, B2 не обозначает ациламино); Y обозначает группу, представленную формулой (II), в которой J обозначает этилен или низший алкинилен; L обозначает связь; M обозначает связь; X обозначает -(CH2)m-, -(CH2)m-O- или -(CH2)m-NR2- (где m означает целое число от 0 до 3, и R2 обозначает водород); D обозначает -NR3-, где R3 обозначает водород; и E обозначает амино, или его фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение относится к способу получения 3-(2-хлорпропионил)амино-4-метил-2-метоксикарбонилтиофена ацилированием 3-амино-4-метил-2-метоксикарбонилтиофена с 2-хлорпропионилхлоридом путем одновременного введения в реакционную смесь, содержащую 3-амино-4-метил-2-метоксикарбонилтиофен, 2-хлорпропионилхлорида и щелочного компонента с относительной скоростью, обеспечивающей поддержание водородного показателя среды в водной фазе в интервале 4,0-8,0 рН.

Изобретение относится к производным фенилпентадиеноила, к способу их получения, к фармацевтическим композициям, содержащим эти производные, и к применению этих производных в качестве лекарственных средств для лечения и/или профилактики артериальных и венозных тромбозов, острых коронарных синдромов, рестеноза, стабильной стенокардии, нарушений сердечного ритма, инфаркта миокарда, гипертензии, сердечной недостаточности, инсульта, воспалительных заболеваний, легочных заболеваний, желудочно-кишечных заболеваний, развития фиброза у больных с хроническими заболеваниями печени, рака и кожных болезней.

Изобретение относится к органической химии, конкретно к способу получения N,N-диметил-5-алкил-2-тиофенаминов, который заключается во взаимодействии N,N-диметил-3-алкил-2-пропин-1-амина (где алкил=С3Н7, С5Н11 , C7H15) с избытком элементной серы (S 8) в присутствии трехкомпонентного катализатора, состоящего из ацетата кобальта, нанесенного на -окись алюминия [Со(ОАс)2/Аl2O 3], трифенилфосфина (Рh3Р) и триэтилалюминия (Еt3Аl), взятых в мольном соотношении N,N-диметил-3-алкил-2-пропин-1-амин:S 8:[Со(ОАс)2/Аl2O3]:Ph 3Р:Еt3Аl=10:(35-45):(0.3-0.7):(0.6-1.4):(0.6-1.4), предпочтительно 10:40:0.5:1.0:1.0, при температуре 120-130°С и атмосферном давлении в течение 4-6 ч.

Изобретение относится к новым производным мочевины формулы I: где А означает гетероарил, который выбирают из группы, включающей и где радикалы В, R1 и R2 имеют значения, указанные в описании.

Изобретение относится к новым производным амидина общей формулы (I’)где А представляет: в котором R1, R2 и R3 – ОН или С1-C6 алкил, С1-C6 алкокси, R4 – H, С1-C6 алкил, R5 – H, С1-C6 алкил или радикал:где R10, R11 и R12 – OH или Н, R13 – H, С1-C6 алкил; или радикал:где R18, R19 и R20 – Н, ОН, С1-C6 алкил, R21 и R22 – Н, С1-C6 алкил или R21-алкилсульфонил, алкилсульфоксид, алкилкарбонил, а R22 – Н или радикал:где Т – -(СН2)k-, k = 1, 2, R27 – Н, С1-C6 алкил.

Изобретение относится к медицине, нейрохирургии и нейрорадиологии. Проводят анализ МРТ снимков в режиме T1 c контрастированием поэтапно.
Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для определения показаний к лечению детей с патологией слезоотведения. Проводят мультиспиральную компьютерную томографию (КТ).

Изобретение относится к медицине, кардиологии, лучевой диагностике. Для отбора пациентов с фибрилляцией предсердий (ФП) на проведение процедуры сцинтиграфии миокарда при диагностике хронического латентного миокардита проводят клинико-анамнестическое и лабораторно-инструментальное обследование.
Изобретение относится к медицине, хирургии и касается определения показаний к максимально радикальному лечению хронического панкреатита с выраженными изменениями поджелудочной железы (ПЖ).

Изобретение относится к медицине, онкологии, гинекологии, лучевой диагностике. Проводят магнитно-резонансную томографию (МРТ) малого таза, используя Т1-спин эхо с подавлением сигнала от жировой ткани FATSAT в аксиальной плоскости с толщиной среза 2.5 мм и шагом сканирования 0.3 мм до введения контрастного препарата (КП) и на 30, 60, 90, 120, 150 с после его введения.

Изобретение относится к медицине, радионуклидной диагностике, предназначено для выявления коронарной недостаточности при многососудистом поражении, а также как функциональный тест при выборе метода лечения ишемической болезни сердца.
Изобретение относится к медицине, клинической лимфологии, томографическим исследованиям. Для диагностики степени лимфедемы конечности вводят парамагнитный лимфотропный препарат в межпальцевые промежутки, визуализируя лимфатические сосуды.

Раскрыты носители лекарственных средств и/или агентов визуализации MR, имеющие липидную бислойную оболочку, включающую фосфолипид, имеющий две концевые алкильные цепи, причем одна представляет собой короткую цепь, имеющую длину цепи самое большее семь углеродных атомов, другая является длинной цепью, имеющей длину цепи, составляющую пятнадцать-тридцать углеродных атомов.

Изобретение относится к медицине, лучевой диагностике и может применяться при обработке MP-изображений с отсроченным контрастированием, определении структуры миокарда левого предсердия (ЛП) у пациентов с мерцательной аритмией (MA).

Изобретение относится к медицине, офтальмологии и предназначено для оценки состояния слезоотводящих путей (СОП). При мультиспиральной компьютерной томографии с контрастированием СОП в аксиальной проекции определяют цифровую яркость зоны интереса относительно цифровой яркости мягких и костных тканей, непосредственно примыкающих в проекции к визуализируемому объекту справа и слева.

Изобретение относится к медицине, гинекологии, диагностике с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Проводят функциональную МРТ с использованием парамагнитного контрастного агента, определяя перфузионный кровоток при врожденных аномалиях матки в миометрии и в области внутриматочной перегородки. Результаты представляют графическими зависимостями и цветовым картированием. Причем МРТ выполняют на томографе с индукцией магнитного поля 3Т. В качестве контрастного препарата используют гадолиниевый парамагнитный контрастный агент, введение которого осуществляют с помощью автоматического инжектора со скоростью 4,5 мл/сек в локтевую вену одновременно с началом динамического сканирования. Количество вводимого контраста рассчитывают из соотношения 0,2 мл или 1 ммоль на кг массы тела пациентки. После введения контраста отслеживают и оценивают его кинетику в патологической и нормальной тканях. Построение кривых кинетики контрастного препарата с последующим цветовым картированием полученных данных и построением цветных перфузионных карт выполняют по результатам динамического сканирования. Для этого используют импульсную последовательность TWIST, время получения одной серии изображений 3 сек, количество серий - 100, программное обеспечение – MeanCurve рабочей станции SyngoVia. Способ обеспечивает точную оценку кровотока в миометрии при различных врожденных аномалиях матки, в том числе во внутриматочной перегородке, что позволяет определить дальнейшую хирургическую тактику ведения пациенток, а также прогноз акушерских осложнений. 2 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2016-10-10 2016-10-10T09:29:32
Наверх