Смешанная культура cellulosimicrobium funkei, trichosporon mycotoxinivorans, saccharomyces cerevisiae - продуцент кормового белкового продукта на древесных опилках
Владельцы патента RU 2601122:
Открытое Акционерное Общество "ГосНИИсинтезбелок" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве кормов для животных, птиц и рыб. Смешанная культура микроорганизмов содержит бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 в соотношении 1:1:1 соответственно. Смешанная культура является технологичной, так как способна расти в широком диапазоне аэрации, перемешивания и длительности процесса культивирования. Изобретение позволяет получать кормовой белок из древесных опилок с высоким содержанием сырого протеина в готовом продукте. 8 табл., 6 пр.
1. Область техники
Изобретение относится к области микробиологического производства кормовых белковых продуктов.
2. Уровень техники
Известно, что успешное развитие животноводства, птицеводства и рыболовства возможно при создании прочной кормовой базы.
Основой кормов является растительное сырье. Однако оно имеет низкое содержание белка, неполный набор незаменимых аминокислот.
Обогащение растительного сырья необходимым количеством белка и аминокислот возможно путем добавления в него биомассы микроорганизмов.
Интенсивное развитие производства кормового микробного белка в России началось еще в 20-30 гг. 20-го столетия. Тогда было создано гидролизное производство по получению спирта и кормового белка из гидролизатов древесины и различных отходов сельскохозяйственных растений. Гидролиз древесины и растительных отходов проводили в специальных гидролиз-аппаратах путем обработки сырья концентрированной серной кислотой при высокой температуре и давлении.
В 80-90-е годы интенсивное изучение и широкое распространение получили разработки по обогащению микробным белком крахмалсодержащего сырья (отходов мукомольного производства - отрубей и некондиционного зерна), а также древесных опилок, содержание которых может составлять 50-90%. В отличие от гидролизных производств, новые технологии основаны на проведении гидролиза и ферментолиза растительного сырья, которые протекают в щадящих условиях термической обработки и рН среды с использованием амилолитических и целлюлолитических ферментов в зависимости от вида сырья. Процесс выращивания на полученной питательной среде осуществляется с использованием микроорганизмов, способных разлагать крахмал или целлюлозу. Последние являются основными компонентами растительного сырья, и их содержание может составлять 50-90%.
Согласно литературным данным разложение целлюлозы осуществляется в основном грибами, способными синтезировать целлюлолитические ферменты. К ним относятся следующие виды грибов: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma. Однако нам неизвестны процессы биоконверсии древесных опилок с получением кормового белкового продукта с помощью перечисленных микроорганизмов. Кроме того, перечисленные высшие грибы образуют конидии, которые легко распространяются в окружающей среде, что недопустимо для процессов нестерильного культивирования. Проработка патентной литературы также не выявила каких-либо способов и технологий по обогащению древесных опилок микробным белком. Таким образом, аналогов предлагаемому способу культивирования смешанной культуры микроорганизмов на древесных опилках нам неизвестно.
В связи с изложенным, цель настоящего изобретения заключалась в подборе и испытании штаммов микроорганизмов, способных расти на древесных опилках с получением готового продукта, обогащенного микробным белком.
3. Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в создании и интенсификации производства кормового белкового продукта на отходах древесины, в частности на древесных опилках, за счет следующих нововведений:
- подбора и селекции новых активных штаммов микроорганизмов, обладающих целлюлолитической активностью;
- создания нового состава смешанной культуры микроорганизмов, включившей бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y- 3585, которые находятся в трофической (метаболической) взаимозависимости друг от друга, что обеспечивает им устойчивость и доминирование в биоценозе на стадии выращивания в нестерильных условиях;
- подготовки исходного сырья, включающей размалывание древесных опилок с размером частиц до 100 мкм, что повышает эффективность их последующей биоконверсии и осахаривания;
- приготовления водной суспензии древесных опилок с концентрацией 5% для улучшения условий ее последующей обработки;
- проведения щелочного гидролиза водной суспензии древесных опилок для разрушения лигноцеллюлозного комплекса;
- проведения ферментолиза водной суспензии древесных опилок для разложения целлюлозы, входящей в состав древесных опилок, до образования редуцирующих веществ (Рв) - глюкозы с помощью жидких ферментов нового поколения - целлюлаз и целлобиаз. Увеличение содержания глюкозы в питательной среде в результате разложения целлюлозы (клетчатки) обеспечивает повышение прироста биомассы микроорганизмов смешанной культуры на стадии выращивания и повышение содержания белка в готовом продукте.
4. Реализация изобретения
Настоящее изобретение направлено на селекцию и подбор штаммов микроорганизмов, обладающих целлюлолитическими ферментами, за счет которых происходит разложение целлюлозы, входящей в состав древесных опилок, с образованием глюкозы, которую потребляют эти же микроорганизмы, что в конечном результате позволяет получить готовый белковый кормовой продукт.
Селекцию осуществляли методом накопительных культур из биоценоза древесных опилок, в результате которой был получен штамм бактерий Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 и штамм дрожжеподобного гриба Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975.
Штамм Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 является сапрофитным непатогенным микроорганизмом. Грамположительный. Морфологические свойства: клетки представляют собой короткие подвижные прямые палочки или в виде укороченных неправильной формы палочек размером 1,0-0,5 мкм, обладают плеоморфизмом, не образуют эндоспор. Физиологические свойства: хемоорганотроф, каталазоположительный, ауксогетеротроф, нуждается в витаминах и ростовых факторах, метаболизм окислительный и бродильный, факультативный аэроб, не кислотоустойчивый, расщепляет целлюлозу, ассимилирует глюкозу. Биохимические свойства: образует комплекс целлюлолитических ферментов, способных разлагать целлюлозу до целлобиозы и глюкозы. Параметры роста: рН среды 6,0-8,0, температура 25-40°С. Разлагает остатки животного и растительного происхождения, содержащие клетчатку (пиломатериалы, телеграфные столбы, бумагу, волокна льна, джута, табака).
Помимо бактерий Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 способность роста на целлюлозе была проверена у штамма дрожжеподобного гриба Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, который активно растет на древесных опилках.
Штамм Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 является дрожжеподобным сапрофитным, непатогенным несовершенным грибом, у которого половой способ размножения неизвестен. Морфологические свойства: клетки крупные, цилиндрические размером 4-6×8-12 мкм, образует псевдомицелий, размножается делением, образует артроспоры, не образует конидий и пигментов, аскоспоры отсутствуют. Физиологические свойства: гетеротроф, аэроб, ассимилирует глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, а также различные органические кислоты и спирты. Биохимические свойства: образует амилолитические (амилазы, глюкоамилазы) и целлюлолитические ферменты (целлюлазы и целлобиазы). Активно растет на древесных опилках и крахмалсодержащем сырье. Параметры роста: рН 3,5-6,5, температура 26-43°С.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 относятся к совершенным грибам пищевого назначения, непатогенны, нетоксичны. Морфологические свойства: клетки округло-овальной и овальной формы размером 4-6×5-8 мкм, размножаются почкованием, образуют аскоспоры, мицелий или псевдомицелий отсутствуют. Физиологические свойства: ассимилируют глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, декстрины. Не усваивают лактозу, ксилозу, арабинозу. Биохимические свойства: образуют амилолитические ферменты, растут на крахмалсодержащем сырье. Параметры роста рН 3,5-6,5, температура 26-43°С. Применяют в хлебопечении, пивоварении и виноделии.
Проверку смешанной культурой микроорганизмов на способность к биоконверсии целлюлозы проводили путем приготовления питательной среды, содержащей древесные опилки масличной пальмы. Для этого был изучен химический состав древесных опилок масличной пальмы, который представлен в таблице №1:
| №№ пп | Показатель | Партия №1 | Партия №2 | Партия №3 |
| 1. | Влажность, % | 7,57 | 8,3 | 9,6 |
| 2. | Массовая доля протеина, % | 2,7 | 2.0 | 3,9 |
| 3. | Общие углеводы, % | 72,4 | 79,5 | 79,0 |
| 4. | Зольность, % | 7,2 | 2,4 | 3,1 |
| 5. | Крахмал, % | Отс. | Отс. | Отс. |
| 6. | Клетчатка, % | 38,8 | 35,75 | 35,8 |
| 7. | Жир, % | 0,6 | 0,9 | 0,3 |
Таким образом, из всех веществ, входящих в состав опилок масличной пальмы, углеводы, в том числе клетчатка, являются основными компонентами, составляющими 72%-79% и 35%-38% соответственно. Эти вещества являются основными источниками углерода для роста микроорганизмов.
Подготовку питательной среды осуществляли в несколько стадий. Сначала опилки размалывали с помощью мельницы с деформационным сдвигом под давлением для образования частиц размером до 100 мкм. Затем из опилок готовили 5% водную суспензию, которую далее подвергали щелочному гидролизу при температуре 90°С для разрушения лигноцеллюлозного комплекса, входящего в состав древесных опилок. Для этого в суспензию при перемешивании вносили 12% раствор едкого калия (KОН) для достижения рН среды, равной 12, и выдерживали при 90°С в течение 2-х часов. В результате щелочного гидролиза получили суспензию с содержанием редуцирующих веществ 0,48-0,57%. Полученный гидролизат использовали самостоятельно в качестве питательной среды либо подвергали ферментолизу. По первому варианту в щелочной гидролизат вносят источники азота и фосфора в виде сульфата аммония (NH2SO4) и однозамещенного фосфата калия (KН2РО4) из расчета, что на 1 г биомассы требуется 90 мг азота и 45 мг фосфора, устанавливают рН, равный 6,0, допустимый одновременно для роста бактерий, дрожжей и грибов. Таким образом получали питательную среду для выращивания смешанной культуры. По второму варианту щелочной гидролизат подвергали ферментолизу. Для этого устанавливали рН 6,0, вносили в гидролизат термоустойчивый жидкий фермент «вискоферм» (Дания) в количестве 0,2 г/кг сырья и выдерживали при 85°С в течение одного часа. Далее проводили вторую стадию ферментолиза с использованием жидкого фермента целлюлазы («целлюлокласт» Дания) в количестве 0,6 г/кг сырья и жидкой целлюлобиазы (Дания) в количестве 1,0 г/кг сырья при температуре 50-55°С в условиях слабого перемешивания в течение одного часа. Содержание рВ в ферментолизате составило 1,2%-1,7%. Для приготовления питательной среды из ферментолизата в нее вносили источники азота и фосфора в виде сульфата аммония (NH2SO4) и однозамещенного фосфата калия (KН2РО4) из расчета, что на 1 г биомассы требуется 90 мг азота и 45 мг фосфора.
Процесс периодического выращивания смешанной культуры осуществляли в аппарате «Biotec» объемом 5 и 15 л (рабочий объем 2,5-2,8 л и 5,8-7,0 л соответственно) при изменении следующих условий: температуры выращивания 30°С, 38°С, 43°С; состава питательной среды гидролизата или ферментолизата неразмолотых и размолотых опилок; аэрации интенсивной (максимальная подача воздуха и перемешивание 700 об/мин, принятых за 100 отн. ед.) и низкой аэрации (без подачи воздуха при перемешивании 300 об/мин, принятых за 1 отн. ед.); продолжительности процесса выращивания от 1 до 9 суток. Поддержание заданных значений рН 6,0 и температуры осуществляли автоматически. В аппарат вносили питательную среду в количестве 70% от общего объема аппарата и засевную биомассу смешанной культуры в количестве 10% от рабочего объема аппарата. Засевную биомассу готовили путем выращивания каждого штамма отдельно в течение суток в термостатированной качалке 160 об/мин при температуре 30-34°С. Для бактерий использовали мясо-пептонный бульон, для дрожжей и дрожжеподобного гриба использовали 6°Б жидкое сусло (солодовый экстракт).
Критерием оценки роста в аппарате служил показатель содержания сырого протеина в готовом продукте. Для этого суспензию из аппарата выращивания, обогащенную биомассой микроорганизмов, подвергали лиофилизации с последующим определением химического состава.
Результаты процессов выращивания представлены в таблице:
| № пп | Питательная среда | Длительность процесса, сутки | Температура, °С | Аэрация, условные | Содержание сырого |
| единицы | протеина, % | ||||
| Опилки масличной пальмы | - | - | - | 2-4 | |
| 1. | Гидролизат неразмолотых опилок | 1 | 32 | 100 | 22,2 |
| 2. | Гидролизат неразмолотых опилок | 2 | 32 | 100 | 29,5 |
| 3. | Гидролизат неразмолотых опилок | 3 | 32 | 100 | 33,0 |
| 4. | Гидролизат неразмолотых опилок | 5 | 32 | 100 | 37,3 |
| 5. | Гидролизат неразмолотых опилок | 7 | 32 | 100 | 39,1 |
| 6. | Гидролизат неразмолотых опилок | 9 | 32 | 100 | 40,1 |
| 7. | Гидролизат неразмолотых опилок | 1 | 38 | 100 | 26,1 |
| 8. | Гидролизат неразмолотых опилок | 1 | 43 | 100 | 25,5 |
| 9. | Гидролизат размолотых опилок | 1 | 32 | 100 | 26,3 |
| 10. | Ферментолизат неразмолотых опилок | 1 | 32 | 100 | 24,4 |
| 11. | Ферментолизат размолотых опилок | 1 | 32 | 100 | 29,8 |
| 12. | Ферментолизат размолотых опилок | 1 | 34 | 100 | 30,9 |
| 13. | Ферментолизат размолотых опилок | 1 | 34 | 1 | 32,4 |
Как видно из таблицы, содержание сырого протеина зависит от подготовки древесных опилок. Так на гидролизате и ферментолизате неразмолотых опилок оно составило 22,2% и 24,4% соответственно. На гидролизате и ферментолизате размолотых опилок содержание сырого протеина составило 26,3% и 32,4% соответственно. Из таблицы также следует, что содержание сырого протеина зависит от продолжительности процесса выращивания. Так через сутки процесса выращивания оно составило 25,2%, через двое суток 29,5, через 3, 5, 7 и 9 суток 33,0%, 37,3%, 39,1% и 40,1% соответственно. Содержание сырого протеина практически не зависит от температуры выращивания. Так в интервале температур 30-43°С через сутки процесса выращивания на гидролизате неразмолотых опилок оно составило 25,2%- 26,1%. Содержание сырого протеина также практически не зависит от интенсивности аэрации. Так через сутки выращивания на ферментолизате размолотых опилок при интенсивности аэрации 100,0 и 1,0 относительных единиц оно составило 30,9 и 32,4%.
5. Примеры реализации заявленного способа
Пример 1
Штаммы дрожжеподобного гриба Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 были изучены на способность наличия целлюлолитических ферментов, которые необходимы для разложения клетчатки древесных опилок до глюкозы. Для этого штаммы выращивали на минеральной среде следующего состава (г/л): NH4H2PO4 -10, K2НРО4 10, MgSO4×7 Н2O- 0,7; рН среды 5,0. В среду в качестве источника углерода вносили отдельно опилки масличной пальмы и аморфную химически чистую целлюлозу в количестве 1,0%. Выращивание проводили в аэробных условиях в колбах на качалке (150 об/мин) при температуре 30-34°С в течение 5 суток.
Оценку роста проводили путем определения сухого веса, а также методом фазово-контрастного микроскопирования до и после выращивания:
| Штамм микроорганизма | Источник углерода | Сухой вес до выращивания, г | Сухой вес после выращивания, г |
Число клеток в поле зрения до и после выращивания |
| Trichosporon mycotoxinivorans | целлюлоза | 5,1 | 2,5 | до 10/60 |
| ВКПМ Y-3975 | ||||
| Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 | опилки масличной пальмы | 6,0 | 3,4 | до 10/50 |
| Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 | целлюлоза | 5,1 | 5.0 | до 10/10 |
| Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 | опилки масличной пальмы | 6,0 | 5,8 | до 10/10 |
Согласно полученным данным дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 активно растет как на чистой целлюлозе, так и на опилках масличной пальмы, так как обладает целлюлолитическими ферментами. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 не растут на целлюлозе и древесных опилках, так как целлюлолитические ферменты отсутствуют.
Пример 2
Изучена способность роста бактерий Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 в виде монокультуры и в смеси с дрожжеподобным грибом Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 по примеру №1:
| штамм микроорганизма | Источник углерода | Сухой вес до выращивания, г | Сухой вес после выращивания, г | Число клеток в поле зрения до выращивания | Число клеток в поле зрения после выращивания |
| Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 | целлюлоза | 5,0 | 4,7 | единичные | единичные |
| Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 | опилки масличной пальмы | 6,0 | 5,8 | единичные | единичные |
| Cellulosimic- | целлюло- | 5,0 | 3,8 | единичные | до 50 |
| robium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxini-vorans ВКПМ Y-3975 | за | ||||
| Cellulosimic-robium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxini-vorans ВКПМ Y-3975 | опилки масличной пальмы |
6.0 | 3,0 | единичные | до 30 |
Согласно полученным данным бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 в виде монокультуры не способны расти на целлюлозе и древесных опилках; в составе смешанной культуры с Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 штамм бактерий растет практически так же, как монокультура Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 (см. пример 1).
Пример 3
Изучена способность смешанной культуры Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 + Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 на способность роста на гидролизате неразмолотых древесных опилок масличной пальмы и проведена сравнительная оценка скорости роста отдельно каждой из составляющих смешанную культуру на минеральной среде с 1% глюкозы.
Критерием оценки роста на гидролизате неразмолотых древесных опилок масличной пальмы было определение сухого веса и количества клеток в поле зрения. Скорость роста определяли по остаточному содержанию глюкозы в среде модифицированным методом Бертрана.
Штаммы отдельно выращивали на минеральной среде по примеру №1 с добавлением 1% глюкозы, рН среды 6,0. При выращивании на гидролизате древесных опилок в приготовленный гидролизат вносили сульфат аммония и калий фосфорнокислый двузамещенный из расчета, что на 1 г биомассы требуется 90 мг азота и 45 мг фосфора, рН среды 6,0. В обоих вариантах выращивание осуществляли в аэробных условиях в колбах на качалке (150 об/мин) при температуре 32°С в течение 1 суток.
Рост моно- и смешанной культур на целлюлозе и гидролизате немолотых древесных опилок:
| Штамм микроорганизма |
Источник углерода | Сухой вес до выращивания, г | Сухой вес после выращивания, г | Число клеток в поле зрения до выращивания | Число клеток в поле зрения после выращивания |
| Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 | целюлоза | 5,0 | 4,7 | до 10 | единичные |
| Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 | опилки масличной пальмы | 6,0 | 5,8 | до 10 | до 10 |
| Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 |
целлюлоза | 5,0 | 3,3 | до 10 | до 50 |
| Cellulosimicrobium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 | опилки масличной пальмы | 6.0 | 3,8 | до 10 | до 30 |
| Cellulosimicrobium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans | целлюлоза | 5,0 | 3,0 | до 10 |
| BKITMY-3975+ Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 | |||||
| Cellulosimicrobium funkei ВКПМ AC-1948+ Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975+ Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 | опилки масличной пальмы | 6,0 | 3,5 | до 10 |
Согласно полученным данным, монокультура Cellulosimicrobium funkei AC-1948 плохо растет на целлюлозе и гидролизате древесных опилок: сухой вес снижается с 5% и 6% до 4,7% и 5,8% соответственно, число клеток практически не меняется. Смешанная культура в составе двух и трех компонентов активно растет как на целлюлозе, так и на гидролизате древесных опилок: сухой вес снижается с 5% и 6% до 3,0% - 3,8% соответственно, число клеток увеличивается с 10 до 30-60.
Рост монокультур на минеральной среде с глюкозой:
| Штамм микроорганизма | Содержание глюкозы после выращивания, % |
| Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 | 0,7 |
| Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 | 0,5 |
| Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 | 0,4 |
Согласно полученным данным наибольшей скоростью роста и потребления глюкозы обладают дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585, далее гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и меньшей - бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948.
Таким образом, учитывая различный характер роста монокультур на целлюлозе, гидролизате древесных опилок и глюкозе, можно заключить, что монокультуры в составе смешанной культуры находятся в трофической зависимости. Это делает смешанную культуру технологичной, так как две монокультуры Cellulosimicrobium funkei ВКПМ AC-1948 и Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, обладающие целлюлолитической активностью, разлагают чистую целлюлозу и целлюлозу в составе древесных опилок до глюкозы и активно растут на этих субстратах. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae Y-3585 более активно, чем Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 и Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, потребляет глюкозу. В результате между ними происходит конкуренция за глюкозу, в которой преимущество получают дрожжи-сахаромицеты, что вынуждает бактерию и гриб разлагать целлюлозу.
Пример 4
Смешанную культуру выращивали на гидролизате нативных (неразмолотых) и размолотых древесных опилок. Для этого опилки размалывали с помощью мельницы, принцип действия которой основан на высоком давлении и деформационном сдвиге (ВДиДС), с образованием частиц размером до 100 мкм. Далее нативные (неразмолотые) и размолотые опилки подвергали гидролизу для разрушения лигноцеллюлозного комплекса. Для этого в 5% суспензию древесных опилок вносили 10% едкий калий (КОН) до получения рН, равного 12, после чего суспензию выдерживали без перемешивания в термостате при 90°С в течение 2-х часов. Содержание рВ после щелочного гидролиза составило 0,57%. В полученный гидролизат вносили в качестве источников азота и фосфора сульфат аммония и однозамещенный фосфат калия из расчета, что на 1 г биомассы требуется 90 мг азота и 45 мг фосфора. Для получения засевного материала монокультуры Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 отдельно выращивали на мясо-пептонном бульоне (бактерии) и на жидком сусле (дрожжи и грибы) в колбах на качалке (180 об/мин) при температуре 30°С в течение суток. Для получения смешанной культуры суспензии выросших монокультур смешивали в соотношении 1:1:1. Количество внесенного засевного материала составляло 10% от рабочего объема (2,5 или 2,8 л) аппарата «Biotec», в котором проводили выращивание в периодическом режиме в течение суток при максимальной подаче воздуха и перемешивании 700 об/мин, температуре 30°С, рН 6,0, которые поддерживали автоматически.
Критерием оценки роста в аппарате служил показатель содержания сырого протеина в готовом продукте. Для этого суспензию из аппарата выращивания, обогащенную биомассой микроорганизмов, подвергали лиофилизации. Химический состав полученных образцов готового продукта определяли на приборе с инфракрасным излучением, предназначенном для изучения состава кормов.
В результате проведенных исследований было установлено, что при выращивании смешанной культуры на гидролизате неразмолотых древесных опилок содержание сырого протеина составило 22,2%, на гидролизате размолотых опилок 26,3%, то есть на 4,1% больше.
Таким образом, при подготовке питательной среды необходимо проводить размалывание древесных опилок.
Пример 5
Смешанную культуру выращивали в периодическом режиме в течение одних суток по примеру 4 на ферментолизате нативных (неразмолотых) и размолотых древесных опилок в аппарате «Biotec» объемом 15 л (рабочий объем 7,0 л). Для этого древесные опилки подвергали размалыванию по примеру 4. Далее готовили 5% водную суспензию неразмолотых и размолотых опилок (по 350 г), которые подвергали гидролизу по примеру 4. Для получения ферментолизата устанавливали рН 6,0 в приготовленные гидролизаты вносили термоустойчивый жидкий фермент «вискоферм» (Дания) в количестве 0,07 г и выдерживали при температуре 85°С в течение одного часа. Содержание рВ составило 0,9%. Последующую стадию ферментолиза проводили при рН 5,0 и температуре 55°С в течение одного часа с использованием жидкого фермента «целлюлокласт» (Дания), который вносили в количестве 0,21 г и целлобиазы в количестве 0,35 г. Содержание рВ составило 1,7%.
Содержание сырого протеина в полученном продукте в зависимости от температуры роста представлено в таблице:
| Вариант опыта | Длительность процесса, сутки | Температура выращивания, °С | Аэрация, у.е. | Содержание сырого протеина, % |
| Ферментолизат неразмолотых опилок | 1 | 32 | 100 | 24,4 |
| Ферментолизат размолотых опилок | 1 | 32 | 100 | 29,8 |
| Ферментолизат неразмолотых опилок | 1 | 34 | 100 | 30,9 |
| Ферментолизат размолотых опилок | 1 | 34 | 100 | 32,4 |
В результате проведенных исследований было установлено, что при выращивании смешанной культуры при температуре 32°С на ферментолизате неразмолотых и размолотых древесных опилок содержание сырого протеина составило 24,4% и 29,8%, соответственно, при температуре 34°С - 30,9% и 32,4% соответственно, то есть на 1,5% и 5,4% больше.
Таким образом, для приготовления питательной среды необходимо проводить ферментолиз размолотых отрубей. Кроме того, выявлено, что смешанная культура обладает термотолерантными свойствами, так как содержание сырого протеина в готовом продукте при выращивании на ферментолизатах двух вариантов при температуре 34°С было больше на 6,5% и 2,6%, чем при температуре 32°С.
Пример 6
Смешанную культуру выращивали по примеру 4 на гидролизате неразмолотых древесных опилок при температуре 32°С в течение 5 и 7 суток:
| Питательная среда | Продолжительность процесса выращивания, сутки | Содержание сырого протеина, % |
| Гидролизат неразмолотых опилок | 1 | 22,2 |
| Гидролизат неразмолотых опилок | 5 | 37.3 |
| Гидролизат неразмолотых опилок | 7 | 39,1 |
Согласно полученным данным продолжительность процесса выращивания существенно влияет на содержание сырого протеина в готовом продукте. Так при увеличении времени выращивания с 1-х суток до 5 и 7 суток содержание сырого протеина увеличивалось с 22,2% до 37,3% и 39,1% соответственно.
6. Выводы:
- Разработан состав смешанной культуры микроорганизмов в качестве культуры-продуцента для получения кормового белкового продукта на древесных опилках масличной пальмы, которая включает бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 и дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585.
- Монокультуры микроорганизмов, которые входят в состав смешанной культуры, находятся в трофической (метаболической) взаимозависимости, что обеспечивает устойчивость, стабильность и доминирование культуры-продуцента в составе биоценоза в условиях длительного процесса культивирования. Штаммы бактерий Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948 и дрожжеподобного гриба Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975 обладают целлюлолитической активностью, разлагая целлюлозу до декстринов и глюкозы, дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 обладают большей скоростью потребления глюкозы по сравнению с бактериями и грибом.
- Смешанная культура является технологичной, способна расти при температуре 30-43°С, рН 6,0, в условиях низкой аэрации на гидролизате и ферментолизате неразмолотых и размолотых древесных опилок масличной пальмы.
- Разработан способ приготовления питательной среды путем предварительного размалывания древесных опилок масличной пальмы с образованием частиц до 100 мкм, приготовления 5% суспензии, которая подвергается щелочной термообработке с образованием гидролизата с содержанием редуцирующих веществ до 0,7%, в который добавляют соли аммония и фосфора. Гидролизат может быть подвергнут ферментолизу с использованием целлюлаз и целлобиаз с образованием ферментолизата с содержанием редуцирующих веществ до 2%, в который добавляют соли аммония и фосфора.
- Разработан способ периодического культивирования смешанной культуры микроорганизмов при широком диапазоне температуры 30-43°С, интенсивности аэрации от 1 до 100 у.е., продолжительности от 1 до 7 суток. Содержание сырого протеина в готовом продукте составляет 25-40% в зависимости от условий культивирования.
Смешанная культура Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585 в соотношении 1:1:1 соответственно - продуцент кормового белкового продукта на древесных опилках.
