Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов а, о, азия-1
Владельцы патента RU 2603003:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU)
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит активное вещество и целевые добавки. В качестве активного вещества вакцина содержит смесь из авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, А №2187/Кути/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и О №2123/Южная Осетия/2011, полученных в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, представляющих собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура, адъюванты: гидроокись алюминия с сапонином и поддерживающую среду в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичных возбудителей инфекции, циркулирующей в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока. 15 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 5 пр.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, касается вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О, Азия-1 с биштаммовым антигеном вируса ящура типа А, которая может быть использована для специфической профилактики парнокопытных животных против вируса ящура типов А, О, Азия-1.
Проблема профилактики ящура у животных и снижения экономического ущерба от его возникновения и распространения, способных вызывать чрезвычайные ситуации в животноводстве с тяжелыми социально-экономическими последствиями, актуальна для многих стран мира, в том числе и для Российской Федерации.
Ящур представляет собой мировую проблему, так как является высоко контагиозным и быстро распространяющимся заболеванием, к которому восприимчивы основные сельскохозяйственные животные: крупный рогатый скот (КРС), свиньи, мелкий рогатый скот (MPC), и многие дикие животные, всего более 100 видов. Существует 7 разных типов вируса, вакцинация против одного типа вируса ящура не защищает от вируса ящура другого типа [1].
Для профилактической вакцинации нашли практическое применение традиционные моно- и поливалентные сорбированные и эмульсионные вакцины, изготовленные из культурального вируса, выращенного в суспензии клеток ВНК-21, инактивированного аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) [2].
Несмотря на принимаемые меры, эпизоотическая ситуация по ящуру в мире, том числе и в странах Азии, в 2013-2014 гг. не улучшилась. С начала 2013 года и в последующее время в Китае в ряде провинций были отмечены вспышки ящура среди КРС и свиней, вызванные вирусом типов О и А. В 2013 году в 4 пограничных с Китаем районах Забайкальского края отмечены 9 вспышек ящура, они остаются неблагополучными до настоящего времени. По данным Всемирной референтной лаборатории МЭБ по ящуру, выделенные на территории Забайкальского края и Амурской области Российской Федерации, Казахстана и Монголии изоляты на 99% идентичны изолятам A/QHXN-CHA-2013-B и A/GDMM-CHA-2013S. В 2013 г. заболевание ящуром среди КРС отмечено на Северном Кавказе и в Краснодарском крае. Выделенные изоляты относились к генетической линии А/Иран/2005. Изоляты данной генетической линии в 2013 г. вызывали вспышки ящура на территории стран Ближнего Востока [3].
Следует отметить, что все выделенные изоляты отличаются в антигеном отношении от штаммов вируса ящура типа А, используемых до последнего времени для изготовления противоящурных вакцин [3].
Благодаря систематической вакцинации животных и контролю иммунного фона поголовья, подавляющее большинство субъектов РФ, в том числе Северного Кавказа, длительное время являются благополучными по ящуру. Однако, неблагоприятная эпизоотическая обстановка по ящуру в мире и реальная возможность заноса его возбудителя на территорию России диктует необходимость усиления противоящурных мероприятий, среди которых основным является осуществление профилактической поголовной вакцинации животных в зонах высокого риска возникновения и распространения ящура [4].
Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты или чаще в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины.
Кроме того, производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения вируса при инактивации и длительном его хранении [5].
Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов.
Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков. Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма приводят к тому, что вакцинация животных производственным вакцинным штаммом не гарантирует защиту поголовья от антигенно отличающихся эпизоотических штаммов вируса ящура [5, 6].
Зарубежные ученые показали, что смесь из двух вакцин, обусловила защиту у морских свинок против гетерологичного штамма, в то время как каждая из них в отдельности не обеспечивала иммунного ответа против гетерологичного штамма вируса ящура [7].
Отечественные ученые провели исследования по сравнению иммуногенной активности моно- и полиштаммовых вакцин. Из полученных результатов следует, что введение в состав вакцины антигенно отличающихся штаммов вируса данного типа приводит к расширению антигенного спектра действия, за счет чего повышается иммуногенная активность полиштаммовой вакцины в отношении гомо- и гетерологичных штаммов вируса данного типа и не снижается активность против производственного [8].
Разработка новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики ящура является актуальной задачей.
Известна вакцина трехвалентная инактивированная сорбированная против вируса ящура типов А, О и Азия-1 RAKSHA TRIVALENT производства INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED RAKSHAPURAM, GACHIBOWLI HYDEREBAD, Индия [9].
Известна вакцина инактивированная очищенная против ящура жвачных животных «Афтовакспур» (Aftovaxpur) типов А, О и Азия-1, производства компания «Merial Animal Health Ltd», Франция. Вакцина имеет протективную активность ≥6,00 PD50 [10].
Известна вакцина против ящура сорбированная трехвалентная (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21) [11].
Основным недостатком известных вакцин является невысокая эффективность из-за существующих антигенных различий между штаммами одного типа вируса ящура, а также недостаточной очищенности антигенных материалов.
Задачей изобретения является получение вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О, Азия-1, обладающей высокой иммуногенной активностью, с широким спектром антигенности при вакцинации от различающихся эпизоотических штаммов вируса ящура.
Поставленная задача достигается тем, что для профилактики и борьбы с заболеваем получена вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов А, О, Азия-1 с биштаммовым антигеном вируса ящура типа А, создающая эффективную защиту восприимчивых животных от заражения вирусом ящура типов А, О, Азия-1 и имеющая расширенное антигенное действие к вирусу ящура типа А.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении иммуногенной активности вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О, Азия-1, за счет расширения антигенного спектра действия по валентности А.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О и Азия-1 с биштаммовым антигеном типа А, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
Предлагаемая вакцина в 1 см3 препарата в качестве активного вещества содержит смесь авирулентных и очищенных материалов из штаммов вируса ящура, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты: биштаммовый антиген вируса ящура типа А в виде авирулентных и очищенных материалов из штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013 и А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, авирулентного и очищенного материала из штамма вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 типа О и авирулентного и очищенного материала из штамма вируса ящура Азия-1 №1946/Шамир 3/89 типа Азия-1, полученных предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, в количествах не менее 3 мкг каждого штамма, обеспечивающих антигенную активность в организме животного при введении ему целевого препарата и целевые добавки: ГОА, сапонин и поддерживающую среду в количестве, обеспечивающем толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного. Содержание целевых добавок в готовом препарате рассчитывают с учетом объема прививной дозы вакцины для каждого вида животных.
Исходный вирус для получения штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 выделен в 2013 году в селе Кути, Приаргунского района, Забайкальского края. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первично трипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.
Исходный вирус для получения штамма
А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 выделен в 2013 году в селе Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первичнотрипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.
Штамм вируса ящура Азия-1 №1946/Шамир 3/89 получен из Всемирной справочной лаборатории Pirbright.
Штамм вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011, был выделен в 2011 году в селе Стырфас Дзауского района Республики Южная Осетия. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первичнотрипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным культурам ВНК-21, IBRS-2 и ПСГК-30.
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды раствор Эрла без сыворотки с добавлением ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), гидролизатов белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН 7,4÷7,6.
Для инактивации вируса используют АЭЭИ, который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025÷0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [12].
Полученный антиген очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина гидрохлорида (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,005÷0,007% [13].
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штаммов вируса ящура: А №2187/Кути/2013, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и О №2123/Южная Осетия/2011, представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура.
Количественное и качественное содержание вирусного сырья определяют методом турбидиметрии [14].
Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см3 не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.
Необходимую концентрацию 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура каждого штамма в предлагаемой вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 см3 готового препарата, получают путем добавления в авирулентный и очищенный антигенный материал расчетного количества адъюванта-сорбента ГОА. Оптимальным является содержание ГОД в 1 см3 готового препарата в диапазоне 24000,0÷36000,0 мкг.
К полученному концентрату добавляют дополнительно 10% водный раствор сапонина до его содержания в 1 см3 готового препарата в диапазоне от 500,0 мкг до 1500,0 мкг.
Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов А, О и Азия-1 с биштаммовым антигеном вируса ящура типа А.
2. Активное вещество в виде смеси авирулентных очищенных антигенных материалов из иммуногенных 146S и 75S компонентов вируса ящура штаммов А №2187/Кути/2013 типа А, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 типа А, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 типа Азия-1 и 0№2123/Южная Осетия/2011 типа О, полученных предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и О №2123/Южная Осетия/2011.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура.
2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
5. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2123/Южная Осетия/2011, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа О.
6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2123/Южная Осетия/2011, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа О, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
7. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа Азия-1.
8. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа Азия-1, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
9. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА.
10. ГОА предпочтительно в количестве 24000,0÷36000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
11. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант сапонин.
12. Сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
13. Из целевых добавок вакцина содержит поддерживающую среду.
14. Вакцина содержит поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
15. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013 типа А, А №2171 /Кабардино-Балкарский/2013 типа А, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 типа Азия-1 и О №2123/Южная Осетия/2011 типа О, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющие собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура, ГОА, сапонин и поддерживающая среда в соотношении, мкг/см3 готового препарата:
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура серотипов А, О и Азия-1, циркулирующих в странах Закавказья, Центральной Азии, Ближнего и Дальнего Востока.
Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного вещества антигенный материал вируса ящура из штаммов А №2187/Кути/2013 типа А, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 типа А, Азия-1 №194б/Шамир 3/89 типа Азия-1 и О №2123/Южная Осетия/2011 типа О, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипов А, О и Азия-1, вызывающих вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья, Центральной Азии, Ближнего и Дальнего Востока.
Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А депонирован 22 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 (производственный).
Дендрограмма отражает филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1 (Фиг. 1).
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А;
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А.
Штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2187/Кути/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А22№550 - 21,49%, А22/Ирак/64 - 21,73%, А/Иран/96 - 22,03%, А/Армения/98 - 22,39%, А/Турция/06 - 22,11%, А/Иран/05 - 22,32%.
Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2187/Кути/2013 принадлежит к генетической линии Юго-Восточная Азия 97 (Sea-97) топотипа Азия.
Антигенное родство штамма ВЯ А №2187/Кути/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2187/Кути/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А22 №550, А №2179/Щелковский биокомбинат, А/Иран/97, А/Киргизия/07 (А/Иран/05). Штамм ВЯ А №2187/Кути/2013 имеется слабо выраженное антигенное родство со штаммом А/Турция/06 (А/Иран/05).
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r1) составило для А22 №550 - 0,13, А №2179/Щелковский биокомбинат - 0,11, А/Иран/97 - 0,004, А/Турция/06 - 0,37, А №2045/Киргизия/07 - 0,13. При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [15, 16].
Биотехнологические характеристики
Штамм А №2187/Кути/2013 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2, и в течение 18÷24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,0 до 7,0 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).
Гено- и хемотаксономическая характеристика
Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106Д.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеиновая оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм А №2187/Кути/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).
Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А депонирован 28 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 (производственный).
Дендрограмма отражает филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1 (Фиг. 2).
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO: 3 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А;
SEQ ID NO: 4 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А.
Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические признаки:
Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23÷25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм
А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура относится к типу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составила: А22№550 - 22,65%, А22/Ирак/64 - 21,66%, А/Иран/96 - 21,43%, А/Армения/98 - 21,98%, А/Турция/06 - 8,23%, А/Иран/05 - 8,75%.
Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 принадлежит к генетической линии «Иран-2005» топотипа «Азия» вируса ящура серологического типа А и антигенно отличается от имеющихся производственных штаммов ВЯ типа А.
Антигенное родство штамма ВЯ А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А22 №550, А22 Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/06 (А/Иран/05), А/Киргизия/07 (А/Иран/05).
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r1) составило для А22 №550 - 0,013, А22 Ирак/64 - 0,02, А/Иран/97 - 0,03, А/Турция/06 - 0,19 и А/Киргизия/2007 - 0,03. При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [15, 16].
Биотехнологические характеристики
Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 репродуцируется в монослойных культурах клеток: первично трипсинизированной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2. В течение 18÷24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах достигает значений от 6,00 до 7,50 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вирус вызывает ЦПД через 5 часов. Вирус сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).
Гено- и хемотаксономическая характеристика
Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106Д.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О депонирован 25 апреля 2013 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 (производственный).
Дендрограмма отражает филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1 (Фиг. 3).
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO: 5 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О;
SEQ ID NO: 6 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О.
Штамм вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм вируса ящура О №2123/Южная Осетия/2011 типа О относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23÷25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа О №2123/Южная Осетия/2011 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30.
Филогенетический анализ показал, что штамм О №2123/Южная Осетия/2011 принадлежит к генетической линии О PanAsia 2 топотипа Средний Восток - Южная Азия.
Антигенное родство штамма ВЯ О №2123/Южная Осетия/2011 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа О исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 антигенно родственен к производственным штаммам Ο1 Маниса, О №1734/Приморский/2000 (ПанАзия), О ПанАзия-2.
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 3. Антигенное соответствие (r1) составило для Ο1 Маниса - 0,74, О №1734/Приморский72000 (ПанАзия) - 1,0, О ПанАзия-2 - 1,0. При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [15, 16].
Биотехнологические характеристики
Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2, и в течение 18÷24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,0 до 7,0 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).
Гено- и хемотаксономическая характеристика
Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106Д.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеиновая оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3. Устойчивость к внешним факторам
Штамм О №2123/Южная Осетия/2011 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Штамм Азия-1 №1946/Шамир 3/89 вируса ящура типа Азия-1 депонирован 24 ноября 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура Азия-1 №1946/Шамир 3/89 (производственный).
Дендрограмма отражает филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура Азия-1 №1946/Шамир 3/89 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа Азия-1. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1 (Фиг. 4).
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO: 7 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89 вируса ящура типа Азия-1;
SEQ ID NO: 8 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89 вируса ящура типа Азия-1.
Штамм вируса ящура Азия-1 №1946/Шамир 3/89 вируса ящура типа Азия-1 характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм вируса ящура Азия-1 №1946/Шамир 3/89 типа Азия-1 относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу Азия-1 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23÷25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм Азия-1 №1946/Шамир 3/89 вируса ящура относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа Азия-1 №1946/Шамир 3/89 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:120.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа Азия-1 №1946/Шамир 3/89 значительно отличается от производственных штаммов типа Азия-1. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89 со штаммами вируса ящура серологического типа Азия-1 составило: Азия-1 №1987/Амурский/2005 - 26%, Азия-1/Таджикистан/2011 - 21,73%, Азия-1/Пакистан 29/09 - 22,03%.
Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм Азия-1 №1946/Шамир 3/89 принадлежит к топотипу Азия-1.
Антигенное родство штамма ВЯ Азия-1 №1946/Шамир 3/89 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа Азия-1 исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм Азия-1 №1946/Шамир 3/89 антигенно отличается от производственных штаммов Азия-1 №1987/Амурский/2005, Азия-1/Таджикистан/2011, Азия-1/Пакистан 29/09, Азия-1/Иран 58/99.
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 4. Антигенное соответствие (r1) составило для Азия-1 №1987/Амурский/2005 - 0,20, Азия-1/Таджикистан/2011 - 0,21, Азия-1/Пакистан 29/09 - 0,14.
При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [15, 16].
Биотехнологические характеристики
Штамм Азия-1 №1946/Шамир 3/89 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2, и в течение 18÷24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,0 до 7,0 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).
Гено- и хемотаксономическая характеристика
Штамм Азия-1 №1946/Шамир 3/89 вируса ящура типа Азия-1 является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106Д.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеиновая оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3. Устойчивость к внешним факторам
Штамм Азия-1 №1946/Шамир 3/89 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его осуществления и использования, которые не ограничивают объем правовой охраны изобретения.
Пример 1.
Вакцину инактивированную сорбированную против ящура типов А, О, Азия-1 с биштаммовым антигеном по типу А готовят из штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и О №2123/Южная Осетия/2011.
Штаммы вируса ящура культивируют в отдельных биореакторах.
Культивирование вируса ящура ведут при температуре 36-37°С. Через 6÷7 часов инкубирования проводят подсчет живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15÷20%, то инкубирование продолжают еще 2÷3 часа. При достижении количества мертвых клеток 90÷95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов. Количество 146S+75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см3. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15÷20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0÷8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025÷0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12÷24 часов при 36÷37°С и рН 7,2÷7,6 с перемешиванием через 5÷6 часов в течение 3÷5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.
В теплую суспензию добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005÷0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.
Пример 2.
Полученный антиген контролируют на авирулентность в культуре клеток свиной почки, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность.
Полученный авирулентный и очищенный антигенный материал четырех штаммов, как описано в примере 1, объединяют в зависимости от содержания 146S и 75S компонентов вируса.
Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов каждого штамма в 1 см3 адсорбированной вакцины достигают путем концентрирования антигена ГОА.
Расчетный объем ГОА 3% концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 2,13±0,26 Р<0,01 мг/см3 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов каждого штамма вируса ящура, по меньшей мере, 3,0 мкг/см3 готового препарата. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,050-0,150%, что соответствует 500÷1500 мкг сапонина в 1 см3 готовой вакцины.
Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль ее стерильности в соответствии с ГОСТом 28085-89.
Оптимальный компонентный состав полученной вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О, Азия-1 с биштаммовым антигеном по типу А представлен в таблице 5.
Вакцина легко рассасывается в месте введения, не вызывает абсцессов, общей реакции в виде подъема температуры. Вакцина обладает выраженной иммуногенной активностью для КРС в прививной дозе 2÷3 см3, для МРС в прививной дозе 1÷1,5 см3 через 21 день после введения вакцины. Вакцину вводят КРС подкожно в среднюю треть шеи, МРС подкожно с внутренней стороны бедра.
Пример 3.
Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 см3, а затем подкожно в дозе 10,0 см3. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или на морских свинках.
Пример 4.
Проведены испытания иммуногенной активности вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О и Азия-1 с биштаммовым антигеном по типу А. Вакцина была изготовлена так, как описано в примерах 1 и 2 с содержанием, мкг в 1 см3:
Авирулентность и безвредность полученной вакцины проверили на 5 головах КРС. Препарат вводили каждому животному под слизистую языка в дозе 2,0 см3, а затем подкожно в дозе 10,0 см3. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели в течение 10 суток.
После окончания контроля авирулентности и безвредности, исследовали гуморальный иммунитет у КРС, привитого вакциной против ящура с биштаммовым антигеном типа А. Вакцину вводили подкожно в количестве 2,0 см3. Результаты исследований представлены в таблице 6.
Данные таблицы 6 подтверждают, что вакцина из производственных штаммов вируса ящура А №2187/Кути/2013, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89 и О №2123/Южная Осетия/2011 стимулировала выработку антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 более 5,00 log2.
По рекомендациям МЭБ, титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных, иммунизированных цельной дозой вакцины, должны быть не менее 5,00 log2 [15].
Пример 5.
Проведены испытания иммуногенной активности вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О и Азия-1 с биштаммовым антигеном по типу А. Вакцина была изготовлена так, как описано в примерах 1 и 2 с содержанием, мкг в 1 см3:
По окончании контроля на авирулентность и безвредность вакцину проверили на иммуногенную активность для КРС. Испытания провели на 5 головах КРС. Результаты представлены в таблице 7. По результатам опыта видно, что вакцина способствовала выработке вируснейтрализующих антител в количестве, достаточном для защиты животных от генерализованной формы ящура.
Таким образом, изготовленная вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов А, О, Азия-1 с биштаммовым антигеном по типу А имеет высокую иммуногенную активность.
Источники информации
1. Гуленкин В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир. 2012. - Т. 10. - С. 31-41.
2. Дудников А.И. Стратегия вакцинации при ликвидации ящура / Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир. 2006. - Т. 4. - С. 81-90.
3. Мищенко А.В., Кременчугская С.Р., Рахманов A.M. Обострение эпизоотической ситуации по ящуру животных в Азии и России // Инновационные процессы в АПК: сб. статей 6-й Междунар. научно-практ. конф. преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов. - М., 2014. - С. 168-171.
4. Рахманов A.M., Мищенко А.В., Фомина C.H. Эпизоотическая ситуация по ящуру животных на Северном Кавказе // Вестник ветеринарии. - 2014. - Т. 69, №2. - С. 11-14.
5. Ререр X. Ящур /Перевод с нем. Г.А. Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.
6. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур /Под ред. А.Н. Бурдова. - М.: Агропромиздат, 1990. - С. 231-250.
7. Etudi immulogique comporative sur bovis de deuxsouches de virus aphteux de type О. О Flanders et O Espangne 64 / J. Fontaine [et al.] // Bull. Off. Intern. Epiz. - 1966. - Vol.65, №11-12. - P. 2051-2062. Патент Франции №2088038; A61К 27/00, С12К 5/00; 07.01.1972 г.
8. Сравнительное изучение иммуногенной активности моно- и полиштаммных вакцин из вируса ящура типа Азия-1 / Т.Ю. Черняева, А.Ф. Бондаренко, Ε.В. Белик, Л.А. Дудников //Актуальные вопр. вет. Вирусологии. - Владимир, 1990. - С. 83-84.
9. Raksha (FOOT AND MOUTH DISEASE VACCINE BP (Vet)) - URL: https://www.indimmune.com/livestock-vaccines.pclf (дата обращения 15.02.2015).
10. Ссылка на вакцину инактивированную сорбированную против ящура производства компании «Merial Animal Health Ltd », Франция - URL: ec.europa.eu/health/…/anx_128466_en.pdf (дата обращения 15.02.2015).
11. Официальный сайт ФГБУ «ВНИИЗЖ» - URL: http://www.arriah.ru/main/production/price-vaccines/117 (дата обращения 15.02.2015).
12. Пат. РФ 594771, МПК А61К 39/12. Средство для инактивации вирусов при изготовлении противовирусных препаратов/ Н.А. Улупов, А.И. Дудников, П.А. Гембицкий, Д.С. Жук; ВНИЯИ - Заявл. 07.05.1973; опубл. 07.07.93 г.
13. Пат. РФ 2054039, МПК А61К 39/135. Способ очистки и стерилизации культурального вируса ящура/ Т.Н. Лезова, Н.А. Улупов, В.В. Борисов, В.В. Михалишин, А.И. Дудников, П.А. Гембицкий; ВНИЯИ - Заявл. 07.02.1992; опубл. 10.02.1996 г.
14. Авт. свид. СССР 784335, C12Q 1/02. Способ определения качества вирусного сырья/ А.Ф. Бондаренко; ВНИЯИ. - Заявл. 04.07.1979; опубл. 20.03.2000 г.
15. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 7th Ed. -, Paris, 2012 - Vol.1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
16. Selection of foot-and-mouth disease vaccine strains a review / D.J. Paton, J.F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol.24(3). - P. 981-983.
| Таблица 7 | |||||
| Исследование иммуногенной активности вакцины инактивированной сорбированной против ящура типов А, О и Азия-1 | |||||
| № животного | Наличие генерализации | Титры антител на 21 сутки после вакцинации против вируса ящура, log2 | |||
| А №2187/ Кути/2013 |
А №2171/ Кабардино-Балкарский/ 2013 |
О №2123/ Южная Осетия/ 2011 |
Азия-1 №1946/ Шамир/ 3/89 |
||
| 1 | - | 5,75 | 5,75 | 5,25 | 5,25 |
| 2 | - | 6,00 | 5,50 | 5,00 | 5,50 |
| 3 | - | 5,25 | 5,00 | 5,75 | 5,75 |
| 4 | - | 5,50 | 6,00 | 5,50 | 4,75 |
| 5 | - | 5,75 | 5,75 | 4,75 | 5,00 |
| M±m | 5,65±0,13 | 5,60±0,17 | 5,25±0,18 | 5,25±0,18 | |
| контроль | + |
1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов А, О, Азия-1 с биштаммовым антигеном вируса типа А, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма вируса Aphtae epizooticae, семейства Picornaviridae, рода Aphtovirus, серотипа А, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером А №2187/Кути/2013 (производственный), авирулентного очищенного антигенного материала из штамма вируса Aphtae epizooticae, семейства Picornaviridae, рода Aphtovirus, серотипа А, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 (производственный), из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма вируса Aphtae epizooticae, семейства Picornaviridae, рода Aphtovirus, серотипа О, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером О №2123/Южная Осетия/2011 (производственный), из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, серотипа Азия-1, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером Азия-1 №1946/Шамир 3/89, в эффективном количестве.
2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
3. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
4. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
5. Вакцина по п. 4, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
6. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2123/Южная Осетия/2011, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа О.
7. Вакцина по п. 6, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2123/Южная Осетия/2011, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа О, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
8. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа Азия-1.
9. Вакцина по п. 8, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа Азия-1, в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
10. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что из целевых добавок она содержит адъювант-сорбент гидроокись алюминия (ГОА).
11. Вакцина по п. 10, отличающаяся тем, что она содержит ГОА предпочтительно в количестве 24000,0÷36000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
12. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что из целевых добавок она содержит адъювант сапонин.
13. Вакцина по п. 12, отличающаяся тем, что она содержит адъювант сапонин предпочтительно в количестве 500,0÷1500,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
14. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что из целевых добавок она содержит поддерживающую среду.
15. Вакцина по п. 14, отличающаяся тем, что она содержит поддерживающую среду в количестве до 1000000,0 мкг в 1 см3 готового препарата.
16. Вакцина по любому пп. 1-15, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных и очищенных антигенных материалов из штаммов А №2187/Кути/2013, А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, Азия-1 №1946/Шамир 3/89, О №2123/Южная Осетия/2011 вируса ящура, полученных предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, и целевые добавки: ГОА, сапонин, поддерживающую среду в количестве, мкг/см3:
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0;
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0;
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2123/Южная Осетия/2011, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа О в количестве не менее 3,0;
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №1946/Шамир 3/89, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа Азия-1 в количестве не менее 3,0;
ГОА 24000,0÷36000,0;
Сапонин 500,0÷1500,0;
Поддерживающая среда до 1000000,0.
