Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp1α риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме "реального времени"



Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp1α риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp1α риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp1α риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp1α риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp1α риккетсии anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Владельцы патента RU 2603254:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) (RU)

Изобретение относится к области биохимии. Представлен набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp1α риккетсии Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени». Набор содержит два олигодезоксирибонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Прямой праймер имеет структуру 5′-TGTTTGGAACCTAGGCTTATAG-3′; обратный праймер имеет структуру 5′-CTTCTGCTGATCTTCCTGTCTC-3′; флуоресцентно-меченый ДНК-зонд имеет структуру 5′-VIC-CGCTGATTTGGGGCTGCCTGGCACT-BHQ2. Изобретение позволяет повысить надежность детекции A. marginale, упростить анализ и сократить время его проведения. 3 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, ветеринарной медицины, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции видоспецифичного фрагмента ДНК Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени», содержащему два олигодезоксирибонуклеотидных праймера (прямой и обратный) и один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.

Anaplasma marginale (Род Anaplasma, отряд Rickettsiales, семейство Anaplasmatacea) является возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота (далее - КРС). A. marginale - облигатный внутриклеточный паразит, поражающий эритроциты. Анаплазмоз, вызванный A. marginale, протекает с признаками лихорадки, анемии, атонии желудочно-кишечного тракта и истощения. Смертность больных животных по разным оценкам составляет от 30 до 100%. Источником возбудителя являются инфицированные животные, переносчиками - около 20 видов клещей, а также кровососущие насекомые (Kocan, К.М., de la Fuente, J., Blouin, E.F., Garcia-Garcia, J.C., 2004. Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae): recent advances in defining host-pathogen adaptations of a tick-borne rickettsia. Parasitology 129, S285-S300. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15938516, 2015 г.; Scoles, G.A., Broce, A.B., Lysyk, T.J., Palmer, G.H., 2005. Relative efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) compared with mechanical transmission by Stomoxys calcitrans (Diptera:Muscidae). J. Med. Entomol. 42, 668-675. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.gov/pubmed/16119558 2015 г.). Возможна также механическая передача возбудителя от зараженных животных к здоровым через нестерильные инструменты при проведении зоотехнических мероприятий.

Анаплазмоз крупного рогатого скота широко распространен во всем мире и приводит к значительным экономическим потерям вследствие уменьшения мясомолочной продуктивности скота, ущерба от недополучения молодняка и гибели животных. Анаплазмоз КРС, вызванный A. marginale, зарегистрирован во многих тропических и субстропических странах. Анаплазмоз КРС является эндемичным для Мексики, Центральной и Южной Америки, Карибских островов, Африки и Азии. Энзоотическими очагами анаплазмоза являются все страны Латинской Америки (Guglielmone, А.А., 1995. Epidemiology of babesiosis and anaplasmosis in South and Central America. Vet. Parasitol. 57, 109-119. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.gov/pubmed/7597777, 2015 г.). Анаплазмоз КРС распространен фактически по всей территории США и Канады, также в некоторых странах Европы, главным образом, средиземноморских (De la Fuente, J., Lew, A., Lutz, H., Meli, M.L., Hofmann-Lehmann, R., Shkap, V., et al., 2005. Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development. Anim. Health Res. Rev. 6, 75-89. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.gov/pubmed/16164010, 2015 г.). Это заболевание регистрируют в Украине, Белоруссии, Молдавии, Казахстане, государствах Средней Азии и Закавказья. Согласно ветеринарной отчетности в Российской Федерации неблагополучными по анаплазмозу являются субъекты Центрального, Северо-Западного и Приволжского федеральных округов (Гулюкин М.И. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) / М.И. Гулюкин, В.Т. Заблоцкий, В.В. Белименко // РВЖ.СХЖ. - 2013. - №2. - С.36-40. Сайт Интернет: http://cyberleninka.ru/article/n/monitoring-epizooticheskoy-situatsii-po-protozoynym-kroveparazitarnym-boleznyam-domashnih-zhivotnyh-v-rossiyskoy-federatsii-2007-2012, 2015 г.).

Своевременная диагностика играет решающую роль в предотвращении распространения инфекционных заболеваний. Многообразие клинических проявлений анаплазмоза затрудняет его диагностику, поэтому проблема создания надежных тест-систем для выявления патогенных видов анаплазм остается актуальной. На сегодняшний день для диагностики анаплазмоза применяют в основном микроскопические и серологические методы исследования, однако эти методы имеют ряд существенных недостатков, а именно недостаточно высокую чувствительность и специфичность. Так, результаты микроскопических исследований мазков крови ненадежны на ранних стадиях инфицирования и в случаях заболеваний, сопровождающихся тяжелой формой анемии. Серологические методы, основанные на использовании антител к антигенам A. marginale, имеют недостаточно высокую чувствительность и не позволяют дифференцировать A. marginale от других видов анаплазм (Dreher, U.М., J. Fuente, R. Hofmann-Lehmann, М.L. Meli, N. Pusterla, К.М. Kocan, Z. Woldehiwet, U. Braun, G. Regula, К.D. Staerk, and H. Lutz, 2005: Serologic crossreactivity between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12, 1177-1183. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16210480, 2015 г.).

Наиболее оперативную и точную диагностическую информацию позволяет получить выявление ДНК возбудителей анаплазмоза в крови КРС с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) специфического фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров до количеств, достаточных для его детекции любым из известных методов - электрофоретическим, гибридизационно-ферментным или гибридизационно-флуоресцентным. Преимуществом ПЦР-диагностики является высокая чувствительность и специфичность - она позволяет обнаружить возбудителя на самых ранних стадиях заболевания, в том числе и во время латентной фазы, и надежно дифференцировать анаплазмоз от ряда сходных по клиническим проявлениям заболеваний. Другими достоинствами метода являются небольшие затраты времени на проведение анализа и возможность автоматизации процесса.

ПЦР является единственным средством для диагностики анаплазмоза при носительстве в отсутствии клинических симптомов (Kocan KM, de la Fuente J, Blouin EF, Coetzee JF, Ewing SA. The natural history of Anaplasma marginale. Vet Parasitol. 2010 Feb 10; 167(2-4):95-107. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19811876, 2015 г.)

Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения животных (OIE, the World Organisation for Animal Health), изложенным в «Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных 2015 г.» (Сайт Интернет: http://www.oie.int/en/intermational-standard-setting/terrestrial-manual/access-online, 2015 г.), ПЦР-диагностику A. marginale следует применять перед каждым перемещением животного на новое место и для подтверждения диагноза.

На сегодняшний день описаны разные методы ПЦР для детекции A. marginale, однако ни один из них не лишен недостатков, которые в связаны с выбором мишени для ПЦР и способа получения и анализа результатов. Сложность выбора олигодезоксирибонуклеотидов для ПЦР состоит в том, что они должны обладать строгой видовой специфичностью. В случае использования в ПЦР праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, не имеющих видовой специфичности, возможны ложноотрицательные результаты исследования. В случае же, если выбранные олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд имеют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты исследования. Правильный выбор сочетания пары праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет осуществить амплификацию и детекцию методом ПЦР в режиме «реального времени» строго целевого фрагмента ДНК.

Ближайшим аналогом является набор из трех праймеров к гену msp1α:

MSPa733F1 - TGTGCTTATGGCAGACATTTCC,

MSPa2957Pv2 - AAACCTTGTAGCCCCAACTTATCC,

MSPa3134R1 - TCACGGTCAAAACCTTTGCTTACC

(прототип - Lew, A.E., Bock, R.E., Minchin, С.M. and Masaka, S. 2002. A msplalpha polymerase chain reaction assay for specific detection and differentiation of Anaplasma marginale isolates. Vet. Microbiol. 86: 325-335. Сайт Интерент: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11955782, 2015 г.).

Недостатком этого метода является то, что в качестве мишени для ПЦР выбран высоковариабельный участок гена, что приводит к необходимости проведения двух последовательных ПЦР и получению фрагментов ДНК переменной длины (272-983 п.н.) для разных изолятов A. marginale.

Задачей изобретения является создание набора синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции фрагмента гена msp1α A. marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени», который может быть использован для дифференциального выявления риккетсий A. marginale в крови крупного рогатого скота и других жвачных животных, а также в кровососущих членистоногих.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в повышении надежности детекции A. marginale, упрощении анализа и сокращении времени его проведения до 1.5 часов (не включая подготовку пробы), а также в уменьшении стоимости анализа.

Технический результат достигается тем, что набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp1α риккетсий Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» содержит два олигодезоксирибонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, которые имеют следующую структуру:

Прямой праймер:

F: 5′-TGTTTGGAACCTAGGCTTATAG-3′

Обратный праймер:

R: 5′-CTTCTGCTGATCTTCCTGTCTC-3′

Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд:

Probe: 5′-VIC-CGCTGATTTGGGGCTGCCTGGCACT-BHQ2

Преимуществом использования в ПЦР флуоресцентно-меченого ДНК-зонда Probe: 5′-VIC-CGCTGATTTGGGGCTGCCTGGCACT-BHQ2 является отсутствие необходимости проведения дополнительной стадии анализа - электрофоретическую детекцию результатов ПЦР, поскольку регистрация накопления ДНК происходит непосредственно в ходе самой реакции, что приводит к значительному сокращению времени исследования (до 1.5 часов, не включая подготовку пробы), а использование флуоресцентно-меченого зонда повышает надежность исследования.

В рамках патентуемого технического решения разработанные олигодезоксирибонуклеотиды являются видоспецифичными для A. marginale и позволяют достоверно выявлять методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» фрагмент гена msp1α, и, следовательно, наличие риккетсий A. marginale в крови крупного рогатого скота и других жвачных животных, а также у кровососущих членистоногих.

Характеристика набора олигодезоксирибонуклеотидов и участка амплифицируемой ДНК. Предлагаемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры фланкируют участок гена msp1α A. marginale длиной 207 пар нуклеотидов. Использование в наборе с патентуемыми олигодезоксирибонуклеотидными праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продукта амплификации в режиме «реального времени».

Перечень графических материалов.

На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность фрагмента гена msp1α A. marginale и отмечены участки гена, к которым подобраны патентуемые олигодезоксирибонуклеотиды.

На фиг. 2 представлен результат электрофоретического разделения ДНК, полученной в результате ПЦР с использованием патентуемых олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и ДНК, выделенной из крови неинфицированной (К-) и инфицированных (1-5) коров. М - маркер длин ДНК 100-1000 п.н.

На фиг. 3 представлены графики накопления продукта ПЦР в режиме «реального времени» с использованием патентуемых олигодезоксирибонуклеотидов и ДНК, выделенной из крови неинфицированной (К-) и инфицированных (1-5) коров. По оси абсцисс отображено количество циклов ПЦР, по оси ординат - интенсивность флуоресценции (F).

Методика конструирования набора олигодезоксирибонуклеотидов. В качестве мишени для ПЦР был выбран ген msp1α, кодирующий иммунодоминантный поверхностный белок msp1α, характерный исключительно для риккетсий вида А. marginale. Анализ нуклеотидной последовательности генома A. marginale показал, что этот ген представлен в одной копии (Brayton КА, Kappmeyer LS, Herndon DR, Dark MJ, Tibbals DL, Palmer GH, McGuire TC, Knowles DP Jr. Complete genome sequencing of Anaplasma marginale reveals that the surface is skewed to two superfamilies of outer membrane proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Jan 18; 102(3):844-9, Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15618402, 2015 г.). N-концевой участок белка MSP1α состоит из тандемных пептидных повторов длиной 23-31 аминокислотных остатков, количество которых отличается у разных изолятов A. marginale, в то время как структура С - концевого участка является высоко консервативной (Functional and Immunological Relevance of Anaplasma marginale Major Surface Protein la Sequence and Structural Analysis. Published: June 11, 2013 DOI: 10.1371/journal.pone.0065243. Сайт Интернет: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0065243, 2015 г.).

Выбор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции фрагмента гена msp1α A. marginale длиной 207 пар нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» осуществляли на основе последовательностей полноразмерного гена msp1α разных изолятов A. marginale, имеющихся в международной базе данных Генбанк (Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, 2015 г.). Выявление характерного для A. marginale консервативного участка гена msp1α для подбора праймеров проводили с помощью сервера ClustalW2 (Сайт Интернет: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/, 2015 г.). Видоспецифичность праймеров была проверена с использованием алгоритма BLASTN (Сайт Интернет: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, 2015 г.). Выбор олигодезоксирибонуклеотидов основывался на следующих критериях: длина 18-25 пар нуклеотидов; температура отжига олигодезоксирибонуклеотидных праймеров сходная и находится в диапазоне 60-65°C; температура отжига ДНК-зонда выше температур отжига олигодезоксирибонуклеотидных праймеров; отсутствие в последовательности олигодезоксирибонуклеотида вторичных структур с температурой плавления выше его температуры отжига; отсутствие само- и взаимокомплементарности между 3′-концами выбранных олигонуклеотидов; отсутствие идентичности с участками геномов других видов анаплазм. В результате сравнительного анализа структуры гена msp1α разных изолятов A. marginale были разработаны и синтезированы олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд для проведения полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» (табл. 1, фиг. 1), которые позволяют проводить дифференциальное выявление A. marginale.

Экстракция ДНК. Экстракцию ДНК из цельной крови коров проводили с использованием набора реагентов с помощью набора Sorb-M (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя.

Проведение полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени». Реакцию амплификации проводили в 10 мкл смеси для ПЦР, содержащей 1 × буфер для амплификации, 3 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов, 1 активную единицу HS Taq ДНК-полимеразы (все реактивы производства ЗАО «Евроген», Россия), 2 мкл ДНК, 0.2 мкМ прямого и 0.2 мкМ обратного олигодезоксирибонуклеотидного праймера, 0.1 мкМ флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.

Отработка условий амплификации проводилась при использовании ДНК, выделенной из крови коров, инфицированных A. marginale. Амплификация проводилась по следующей схеме: денатурация при 95°C - 3 мин (1 цикл); затем 45 циклов: денатурация при 95°C - 15 с, отжиг при 62°C - 15 с, синтез при 72°C - 15 с; синтез при 72°C - 2 мин (1 цикл). Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналу красителя VIC на приборе «LightCycler 98» (Roche, Швейцария). Результаты ПЦР оценивали методом электрофореза в 2% агарозном геле по наличию продукта реакции длиной 207 пар нуклеотидов (фиг. 2) и экспоненциальному росту флюоресценции (фиг. 3).

Апробация патентуемых олигодезоксирибонуклеотидов. Апробацию патентуемых олигодезоксирибонуклеотидов проводили на образцах ДНК, выделенной из цельной крови коров, инфицированных A. marginale. Экспериментально было показано, что выбранные олигодезоксирибонуклеотиды обеспечивают синтез и детекцию целевого фрагмента гена msp1α A. marginale длиной 207 пар нуклеотидов (фиг. 2, 3). Для подтверждения амплификации фрагмента целевого гена полученный фрагмент ДНК был лигирован в вектор pGEM-T Easy (Promega, США) и клонирован в клетках Escherichia coli DH5α. Выделенные плазмиды были секвенированы по методу Сэнгера. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей с помощью программы BLAST (Сайт Интернет: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, 2015 г.) показал, что они имеют 100% идентичности с фрагментом гена msp1α разных изолятов A. marginale.

Для испытания аналитической специфичности праймеров и зонда использовались образцы ДНК овец, зараженных близкородственным видом риккетсий - A. ovis, а также образцы ДНК коров, содержащие ДНК бактерий, не относящихся к роду Anaplasma - Sanguibacter keddieii, Propionibacterium acnes, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia. Анализ результатов ПЦР в режиме «реального времени» показал отсутствие роста флуоресценции, характерного для A. marginale, и отсутствие каких-либо продуктов ПЦР при анализе результатов методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Это свидетельствует об аналитической специфичности ПЦР с патентуемыми олигодезоксирибонуклеотидами.

Таким образом, заявляемый набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов обеспечивает амплификацию и детекцию фрагмента гена msp1α A. marginale методом ПЦР в режиме «реального времени».

Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp1α риккетсии Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени», содержащий два олигодезоксирибонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, которые имеют следующую структуру:
Прямой праймер:
F: 5′-TGTTTGGAACCTAGGCTTATAG-3′
Обратный праймер:
R: 5′-CTTCTGCTGATCTTCCTGTCTC-3′
Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд:
Probe: 5′-VIC-CGCTGATTTGGGGCTGCCTGGCACT-BHQ2



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ амплификации нуклеиновых кислот, в котором наночастицы в объеме реакционной смеси переносят тепло в окружающую их среду посредством возбуждения.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и диагностической медицины. Предложен способ выделения циркулирующих ДНК из плазмы или сыворотки крови.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и представляет собой варианты способов создания совокупности смежных фрагментов исследуемой области генома.

Настоящее изобретение относится к способам и продуктам для локализованной или пространственной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани и, в частности, к способу локализованной детекции нуклеиновой кислоты в образце ткани, включающему: (а) предоставление чипа, содержащего подложку, на которой непосредственно или опосредованно иммобилизованы многочисленные разновидности захватывающих зондов, так что каждая разновидность занимает определенное положение на чипе и ориентирована таким образом, что имеет свободный 3′-конец, позволяющий указанному зонду действовать в качестве праймера в реакции удлинения или лигирования праймера, где каждая разновидность указанного захватывающего зонда содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую в направлении от 5′ к 3′: (1) позиционную область, которая соответствует положению захватывающего зонда на чипе, и (2) захватывающую область; (б) приведение указанного чипа в контакт с образцом ткани таким образом, что положение захватывающего зонда на чипе может быть сопоставлено с положением в образце ткани, и предоставление возможности нуклеиновой кислоте образца ткани гибридизоваться с захватывающей областью в указанных захватывающих зондах; (в) синтез молекул ДНК на основе захваченных молекул нуклеиновой кислоты с использованием указанных захватывающих зондов в качестве праймеров удлинения или лигирования, где указанные удлиненные или лигированные молекулы ДНК являются мечеными благодаря позиционной области; (г) возможно синтез комплементарной нити указанной меченой ДНК и/или возможно амплификацию указанной меченой ДНК; (д) высвобождение по меньшей мере части меченых молекул ДНК и/или их комплементов или ампликонов с поверхности чипа, где указанная часть включает позиционную область или ее комплемент; и (е) прямой или опосредованный анализ последовательности высвобожденных молекул ДНК.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. В группу изобретений входят нуклеиновая кислота, которая кодирует флуоресцентный биосенсор для регистрации изменения рН, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 4, а также кассета экспрессии и эукариотическая клетка, продуцирующая биосенсор.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации растения, способного восстанавливать фертильность при цитоплазматической мужской стерильности С-типа, содержащего функциональный ген-восстановитель для цитоплазматической мужской стерильности С-типа кукурузы, включающему выделение молекул нуклеиновой кислоты из растения и скрининг выделенных молекул нуклеиновых кислот с использованием ПЦР в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-197 и маркеров, обозначаемых как полиморфизмы ID №№1-106 в таблице 3.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии, ветеринарии и медицине и касается способа идентификации РНК вирусов гриппа А и В с одновременным определением вариантов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А, а также генетических маркеров патогенности и устойчивости к противогриппозным препаратам, на биологических микрочипах.

Изобретение относится к области медицины, и касается способа прогнозирования эффективности монотерапии пероральным сахароснижающим препаратом метформином у больных сахарным диабетом 2 типа.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ получения ДНК-праймеров и зондов для малоинвазивной пренатальной ПЦР-диагностики трисомии 21-й хромосомы у плода по крови беременной женщины, характеризующийся тем, что выбирают сайт дифференциального метилирования фетальной ДНК 21-й хромосомы и ДНК 21-й хромосомы взрослого человека, чувствительный к эндонуклеазам, синтезируют прямой и обратный праймер, соответствующие ампликону длиной от 60 до 300 п.н., а также зонд, соответствующий этому ампликону, проводят ПЦР в реальном времени смеси образцов после их обработки эндонуклеазой рестрикции, отбирают пары праймеров и зонды, обеспечивающие эффективность реакции ПЦР в реальном времени выше 90% и линейность при изменении относительной концентрации образцов выше 90%.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и касается способа прогнозирования эффективности профилактики альбендазолом послеоперационного рецидива цистного эхинококкоза.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу определения и секвенирования неизвестных последовательностей ДНК, которые фланкируют известные последовательности в выделенной ДНК. Для осуществления способа сначала проводят гидролиз выделенной ДНК, содержащую часть или всю известную полинуклеотидную последовательность и прилегающую неизвестную полинуклеотидную последовательность, подходящими рестрикционными ферментами. После чего синтезируют цепь комплементарную гидролизованным полинуклеотидным рестрикционным фрагментам с использованием олигонуклеотидной последовательности праймера, имеющей химическую структуру присоединения, связанную с 5′ концом олигонуклеотидной последовательности праймера. Затем выделяют указанную комплементарную цепь. После чего лигируют одноцепочечный адаптер с выделенной комплементарной цепью. В завершении способа выполняют две последовательные ПЦР амплификации выделенной лигированной комплементарной цепи для установления неизвестной полинуклеотидной последовательности. Настоящее изобретение позволяет улучшить чувствительность детекции неизвестных последовательностей ДНК, которые фланкируют известную последовательность ДНК. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 1 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к скринингу веществ, оказывающих регулирующее вес действие, и может быть использовано в медицине. Способ скрининга веществ, оказывающих регулирующее вес действие, включает приведение тестируемого вещества в контакт с клетками, экспрессирующими ген синовиолина, и идентификацию того, имеет или нет указанное тестируемое вещество ингибирующее влияние на экспрессию гена синовиолина. Фармацевтические композиции включают нуклеиновую кислоту, которая подавляет экспрессию гена синовиолина, или ингибитор активности убиквитинирования белка синовиолина. Изобретение позволяет воздействовать на снижение веса за счет ингибирования экспрессии гена или активности белка синовиолина. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 пр.

Настоящее изобретение относится к области биоинформатики. Предложен способ для приготовления улучшенной вычислительной системы, основанной на нуклеиновых кислотах, включающий синтезирование в водном растворе варианта системы молекулярных вычислений, отличающегося включением химической модификации, изменяющей энергию гибридизации молекул нуклеиновых кислот в системе. Также рассмотрена вычислительная система, основанная на нуклеиновых кислотах и содержащая химические модификации в соответствии со способом по настоящему изобретению. Предложенное изобретение позволяет увеличивать вероятность желаемых событий связывания молекул нуклеиновых кислот в составе системы. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 8 ил.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения гетерогенного набора одноцепочечных фрагментов ДНК для мультиплексного генетического анализа. Сущность изобретения заключается в проведении мультиплексной твердофазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) на полисахаридном носителе и последующем отщеплении одной из синтезированных цепей для целей анализа на олигонуклеотидном микрочипе. Мультиплексный характер твердофазной амплификации достигается за счет использования смеси частиц полисахаридного носителя, на каждой из которых иммобилизована индивидуальная пара праймеров для амплификации. Один из праймеров в каждой паре иммобилизованных праймеров содержит отщепляемую группу. Для введения репортерных групп в ДНК-цепь в ходе проведения ПЦР в реакционную смесь добавляется флуоресцентно меченый нуклеозидтрифосфат. Изобретение позволяет проводить параллельный генетический анализ. 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к агенту для придания растению устойчивости к ингибитору 4-HPPD, включающему ДНК, кодирующую белок, обладающий активностью, придающей растению устойчивость к ингибитору 4-HPPD. Изобретение также относится к растению, обладающему повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD, его клетке и материалу для размножения, а также способу его получения. Также раскрыт способ определения устойчивости или чувствительности к ингибитору 4-HPPD у растения. Изобретение позволяет эффективно получать растение, обладающее повышенной устойчивостью к ингибитору 4-HPPD. 9 н.п. ф-лы, 22 ил., 4 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных молекул МНС II класса, и может быть использовано в медицине. Рекомбинантная молекула МНС II класса включает: (i) весь или часть внеклеточного участка α-цепи МНС II класса; (ii) весь или часть внеклеточного участка β-цепи МНС II класса; при этом (i) и (ii) обеспечивают функциональный пептид-связующий домен и при этом (i) и (ii) соединены дисульфидной связью между остатками цистеина, расположенными на α2 домене указанной α-цепи и β2 домене указанной β-цепи, при этом указанные остатки цистеина не присутствуют в нативных доменах α2 и β2 МНС II класса и полученная рекомбинантная молекула не включает мотив лейциновой молнии. Изобретение позволяет получить рекомбинантные молекулы МНС II класса, стабилизированные дисульфидной связью. 11 н. и 21 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к молекулярной биологии. Способ включает: экстракцию препаратов суммарной РНК, получение комплементарной ДНК с помощью реакции обратной транскрипции на РНК-матрице и последующую амплификацию в режиме реального времени с использованием высокоспецифичных праймеров для генов PTEN, CYP1B1 и АСТВ (референтный локус), а также расчет коэффициента относительной экспрессии генов PTEN и CYP1B1 (КPTEN и КCYP1B1) методом RT-PCR. Способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью, его осуществление возможно с операционным биопсийным материалом; способ занимает менее 10 часов. Способ легко воспроизводим в условиях стационара онкологического профиля и позволяет осуществить ранний прогноз вероятности рецидива рак тела матки. 2 табл.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способы определения наличия или отсутствия вставленной нуклеотидной последовательности в определенном сайте вставки в нуклеиновой кислоте включают: выделение нуклеиновой кислоты из одного образца или порций; приведение нуклеиновой кислоты в контакт с прямым праймером, способным связываться с нуклеиновой кислотой выше сайта вставки; первым обратным праймером, специфичным для вставленной нуклеотидной последовательности, и вторым обратным праймером, способным связываться с нуклеиновой кислотой ниже сайта вставки. Реплицированные нуклеиновые кислоты анализируют для определения наличия или отсутствия в образце вставленной нуклеотидной последовательности. Использование способов позволяет с высокой чувствительностью определять зиготность в исследуемой пробе. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для оценки риска прогрессирования хронической болезни почек (ХБП) у детей. У ребенка с подозрением на ХБП забирают кровь из периферической вены и с помощью метода аллель-специфичной полимеразной цепной реакции проводят идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов генов ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) Alu Ins/Del I>D, ангиотензина (AGT) Thr174Met и Met235Thr, рецепторов 1 типа ангиотензина 2 (R1AGT) С1166С и эндотелина-1 (ЕТ-1) Lys198Asn. При выявлении Alu Ins/Ins АСЕ и Thr174Met AGT оценивают риск прогрессирования ХБП как легкий. При выявлении Met174Met AGT и Alu Ins/Del АСЕ оценивают средний риск. При выявлении сочетания однонуклеотидных полиморфизмов Thr235Thr AGT, С1166С R1AGT, Lys198Asn ЕТ-1 и Alu Del/Del АСЕ оценивают высокий риск прогрессирования ХБП. Изобретение позволяет с высокой достоверностью оценивать риск прогрессирования ХБП у детей на основании раннего выявления генетических предикторов - однонуклеотидных полиморфизмов генов. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и молекулярной биологии. Предложен способ диагностики папиллярной почечноклеточной карциномы (ППК), включающий стадии получения исходной пары образцов ткани от пациента, выделение и очистку препаратов РНК, синтез кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, проведение количественной реакции амплификации фрагмента гена CALL и сравнение количества амплифицированного фрагмента CALL для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани. Уменьшение содержания мРНК гена CALL от 4-х до 45-ти раз служит диагностическим признаком ППК. Изобретение позволяет с высокой достоверностью диагностировать ППК, в том числе на ранней стадии опухолевого заболевания. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 6 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2016-11-27 2016-11-28T01:13:35
Наверх