Вакцина против ehrlichia canis

Изобретение касается вакцинной композиции. Охарактеризованная вакцинная композиция содержит эффективное иммунизирующее количество инактивированной Ehrlichia canis (Е. canis), а также неполярный растворитель, который включает липофильный адъювант. Е. canis инактивирована формалином. Неполярный растворитель представляет собой систему хлороформных растворителей. Изобретение может быть использовано против моноцитарного эрлихиоза собак. При ее введении в качестве первичной вакцины у пациента формируется защитный иммунный ответ, представляющий собой минимальный гуморальный ответ. 9 з.п. ф-лы, 5 ил., 18 табл., 2 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В настоящей заявке заявлен приоритет, согласно статье 35, § 119(e) свода законов США, по временной заявке США с серийным номером 61/360969, поданной 2 июля 2010 г., содержание которой в полном объеме включено в настоящее описание в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и к вакцинам против моноцитарного эрлихиоза собак (CME, Canine Monocytic Ehrlichiosis), вызываемого бактерией Ehrlichia canis, и ассоциированным способам.

Моноцитарный эрлихиоз собак (CME) является тяжелым риккетсиозным заболеванием у собак, вызываемым бактерией Ehrlichia canis (E. canis). E. canis передается от собаки к собаке через коричневый собачий клещ (Rhipicephalus sanguineus). По прошествии инкубационного периода в 2-3 недели после инфицирования у собак могут развиваться острая, субклиническая и хроническая фазы указанного заболевания. В острой фазе клинические признаки варьируют от слабой до тяжелой тромбоцитопении, лейкопении, анемии, вялости и потери веса. Через два месяца у большинства собак начинается субклиническая фаза, которая длится месяцы или годы, в течение которых могут стойко держаться низкие показатели крови, но при этом клинические признаки минимальны. У малого процента инфицированных собак может развиться тяжелая форма заболевания, известного как тропическая панцитопения собак (TCP, Tropical Canine Pancytopenia). Стойкая депрессия костного мозга, геморрагии, неврологические нарушения, периферическая эдема и сильная потеря веса являются характеристиками TCP. Может развиться гипотонический шок, приводящий к смерти. Несмотря на опубликованные ранее сообщения об иммуногенных композициях против E. canis [см., например, Mahan et al., Onderstepoort J. Vet. Res. 72(2): 119-128 (2005); заявку США 2006/0188524A1], демонстрации эффективности той или иной вакцины против E. canis представлено не было. Следовательно, есть потребность в вакцинах против CME и/или TCP.

Здесь цитирование какого бы то ни было источника не следует расценивать как допущение, что такой источник доступен в качестве "Предшествующего уровня техники" по отношению к настоящей заявке.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение связано с вакцинами и/или иммуногенными композициями для стимуляции защитного иммунного ответа против причины эрлихиоза. В некоторых вариантах изобретения вакцинная композиция и/или иммуногенная композиция содержит средство, которое при введении пациенту в качестве первичной вакцины вызывает у указанного пациента минимальный гуморальный иммунный ответ, если вообще его вызывает. В некоторых вариантах осуществления указанная иммуногенная композиция включает средство, которое при введении в качестве первичной вакцины вызывает минимальный, если вообще его вызывает, гуморальный иммунный ответ у указанного пациента, но при этом обеспечивает защитную иммунную реакцию. Одним из таких вариантов осуществления является вакцина, которая содержит инактивированную бактерию E. canis, выращенную на линии клеток костного мозга собаки. В некоторых таких вариантах осуществления указанная вакцина может дополнительно включать адъювант. В некоторых вариантах осуществления указанным адъювантом является фактор жгутообразования. В более частных вариантах осуществления адъювант-фактор жгутообразования растворен в системе хлороформных растворителей.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вакцинной композиции и/или иммуногенной композиции, которая содержит антиген из E. canis, который при первоначальном введении пациенту (например, в качестве первичной вакцины) не вызывает продуцирования значительного количества антител против указанного антигена. Соответственно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают иммуногенные композиции и/или вакцинные композиции, которые содержат эффективное для иммунизации количество антигена из E. canis, где первоначальное введение первичной вакцинной композиции пациенту вызывает минимальный гуморальный ответ. В частных вариантах осуществления настоящее изобретение связано с иммуногенной композицией и/или вакциной, которая после первоначального введения/первичной вакцинации не вызывает поддающегося измерению гуморального ответа, в то же время обеспечивая защитную иммунную реакцию у пациента. В некоторых вариантах осуществления вакцина и/или иммуногенная композиция согласно настоящему изобретению при первичной вакцинации/первичном введении вызывает клеточную иммунную реакцию, вызывая при этом минимальный и/или не поддающийся измерению (например, не детектируемый) гуморальный ответ.

Следовательно, в сходном аспекте настоящее изобретение связано с композицией вакцины, которая содержит эффективное для иммунизации количество антигена из E. canis. В некоторых таких вариантах осуществления указанный антиген вызывает защитную иммунную реакцию, но при этом вызывает минимальный гуморальный ответ у пациента, когда указанную вакцину вводят в качестве первичной вакцины. Вакцины и/или иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут включать антиген, который получают из E. canis, выращиваемой и/или пассируемой на клетках, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления E. canis выращивают и/или пассируют на линии собачьих клеток. В более частных вариантах осуществления указанной линией собачьих клеток может быть линия клеток костного мозга собаки. В более частных вариантах осуществления такая клетка имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10545, и/или такой клеткой является клетка, имеющая одну или более, и/или все из идентификационных характеристик клетки, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10545. В частном варианте осуществления указанный антиген E. canis представляет собой клеточно-ассоциированную E. canis, которая имеет одну или более, и/или все из идентификационных характеристик клеточно-ассоциированной E. canis, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10546.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеточно-ассоциированной E. canis, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10546. Настоящее изобретение относится также к клеточно-ассоциированной E. canis, которая имеет одну или более, и/или все из идентификационных характеристик клеточно-ассоциированной E. canis, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10546. Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10545, Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке, которая имеет одну или более, и/или все из идентификационных характеристик клетки, которая имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10545.

Кроме того, антигены E. canis указанных вакцин и/или иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению могут быть инактивированы. В некоторых вариантах осуществления указанный инактивированный антиген E. canis инактивирован формалином.

В другом аспекте настоящее изобретение связано с вакцинами и/или с иммуногенными композициями, которые содержат адъювант. В некоторых вариантах осуществления такого типа, указанным адъювантом является липофильный адъювант. В некоторых вариантах осуществления указанный липофильный адъювант находится внутри неполярного растворителя. В частных вариантах осуществления иммуногенная композиция и/или вакцина согласно настоящему изобретению содержит антиген, который может быть скомбинирован с гидрофобным адъювантом и который способен смешиваться с системой полярных растворителей, составленных вакциной и/или иммуногенной композицией. В более частных вариантах осуществления указанный адъювант содержит фактор жгутообразования, такой как 6,6'-димиколят трегалозы. В частных вариантах осуществления 6,6'-димиколят трегалозы находится внутри неполярного растворителя. В более частных вариантах осуществления указанный адъювант содержит 6,6'-димиколят трегалозы, растворенный в системе хлороформных растворителей, в частных вариантах осуществления указанная система хлороформных растворителей содержит приблизительно 65-95% хлороформа, объем/объем. В более частных вариантах осуществления указанная система хлороформных растворителей содержит приблизительно 80-95% хлороформа, объем/объем. В некоторых вариантах осуществления система хлороформных растворителей содержит приблизительно 5,0-30% метанола, объем/объем. В более частных вариантах осуществления система хлороформных растворителей содержит приблизительно 7,5-15% метанола объем/объем. В некоторых вариантах осуществления система хлороформных растворителей содержит приблизительно 0,5-5,0% воды, объем/объем. В более частных вариантах осуществления система хлороформных растворителей содержит приблизительно 0,75-2,5% воды, объем/объем. В некоторых вариантах осуществления, система хлороформных растворителей содержит приблизительно 90% хлороформа: 10% метанола: 1,0% воды, объем/объем, соответственно. В некоторых вариантах осуществления указанная вакцина и/или иммуногенная композиция содержит инактивированную формалином клеточно-ассоциированную E. canis, выращиваемую в депонированных клетках, имеющих в ATCC номер доступа No. PTA-10545, и адъювант, содержащий 6,6'-димиколят трегалозы, растворенный в соотношении 90:10:1 растворителей хлороформ: метанол: вода. Композиция, содержащая фактор жгутообразования, такая как 6,6'-димиколят трегалозы, растворенная в системе хлороформных растворителей, также составляет часть настоящего изобретения, так как она используется в качестве адъюванта.

Кроме того, настоящее изобретение связано с бактерией E. canis, выращиваемой на клетках и/или клеточных линиях, которые являются особенно подходящими для их роста. Кроме того, настоящее изобретение связано со способами продуцирования антигена для вакцины и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение связано со способами продуцирования антигенов E. canis. В некоторых вариантах осуществления бактерию E. canis выращивают на макрофаге. В некоторых вариантах осуществления бактерию E. canis выращивают на макрофагоподобных линиях клеток. В некоторых вариантах осуществления E. canis выращивают на клеточной линии костного мозга собаки (DBM, Dog Bone Marrow) с целью продуцирования клеточно-ассоциированного антигена E. canis. В некоторых вариантах осуществления бактерию E. canis выращивают на линии клеток DBM. В некоторых вариантах осуществления указанная линия клеток DBM представляет собой DBM (WCS) MCS+12, с номером доступа в ATCC No. PTA-10545. В частных вариантах осуществления E. canis является клеточно-ассоциированной, WS MS+3, 19517-001, с номером доступа в ATCC No. PTA 10546. В альтернативных вариантах осуществления E. canis выращивают на клеточной линии DH-82.

Антиген E. canis согласно настоящему изобретению может представлять собой инактивированную E. canis. В частных вариантах осуществления указанным антигеном E. canis является бактерин. В некоторых вариантах осуществления указанный инактивированный антиген E. canis является клеточно-ассоциированным.

Настоящее изобретение относится также к способам иммунизации пациента против E. canis. Такие способы могут включать введение пациенту вакцинной композиции и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. Некоторые варианты осуществления включают внутрикожное введение пациенту вакцины и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. Другой такой способ включает подкожное введение пациенту вакцины и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. Еще один из таких способов включает пероральное введение пациенту вакцины и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. В таких частных вариантах осуществления животным пациентом является собака. В другом варианте осуществления животным пациентом является кошка (например, домашняя кошка). В частных вариантах осуществления вторую дозу вакцинной композиции и/или иммуногенной композиции вводят в качестве бустера. В некоторых вариантах осуществления указанный бустер вводят приблизительно через 21 день после первоначальной дозы вакцинной композиции.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу изготовления вакцинной композиции и/или иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение связано со способом продуцирования антигена E. canis, как описано в настоящей заявке. Вакцинные композиции и/или иммуногенные композиции получают путем смешивания антигена согласно настоящему изобретению с ветеринарно приемлемым эксципиентом. В таких частных вариантах осуществления указанный антиген является клеточно-ассоциированным бактерином E. canis. В частных вариантах осуществления указанным ветеринарно приемлемым эксципиентом является адъювантный фактор жгутообразования, растворенный в системе хлороформных растворителей.

Указанные выше и другие аспекты настоящего изобретения станут более понятными в совокупности с представленными графическими материалами, подробным описанием и примерами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

На ФИГ. 1 представлено графическое изображение среднего количества лейкоцитов крови, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню лейкоцитов крови, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

На ФИГ. 2 представлено графическое изображение среднего количества эритроцитов крови, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню эритроцитов крови, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

На ФИГ. 3 представлено графическое изображение средних значений гемоглобина, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню гемоглобина, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

На ФИГ. 4 представлено графическое изображение средних значений гематокрита, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню гематокрита, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

На ФИГ. 5 представлено графическое изображение среднего количества тромбоцитов, в зависимости от времени после контрольного заражения, у контрольных животных (треугольники) и у вакцинированных животных (квадраты). Жирная линия соответствует минимальному уровню тромбоцитов, считающемуся нормальным в соответствии с Руководством Merck.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение связано с иммуногенными композициями и вакцинами, которые могут уменьшить частоту возникновения тромбоцитопении, лейкопении, анемии и потери веса после контрольного заражения вирулентным штаммом E. canis. Представленные здесь результаты не соответствуют опубликованным ранее результатам относительно инфицированных собак, которых лечили антибиотиками, но которые были подвержены последующему заболеванию [см., например, Breitschwerdt et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(2) 362-368 (1998)]. В указанных более ранних сообщениях предполагается, что после воздействия указанного организма защитный иммунитет не развивается, в отличие от настоящего изобретения, которое связано со способами облегчения и/или предотвращения моноцитарного эрлихиоза собак (CME) и/или тропической панцитопении собак (TCP) у пациента путем введения указанному пациенту иммуногенной композиции и/или вакцинной композиции согласно настоящему изобретению. Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение связано с эффективной вакциной против E. canis.

Как описано в настоящей заявке, в процессе развития модели контрольного заражения E. canis, у собак быстро развивался гуморальный антительный ответ на E. canis. Появление анти-E. canis-антитела коррелирует с быстрым падением числа тромбоцитов, или тромбоцитопенией, а также с инициацией нескольких других клинических явлений. Однако вакцины, которые индуцируют сильный гуморальный антительный ответ у собак, не способны защитить их от клинических признаков заболевания. Действительно, у вакцинированных собак, у которых провоцируется сильный антительный ответ на E. canis, могут иметь место худшие клинические последствия, чем у невакцинированных особей после контрольного заражения. Не связывая себя какой бы то ни было конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что описанные здесь результаты, по всей видимости, согласуются с таковыми, полученными с использованием антител, продуцируемых против E. canis при получении доступа к внутреннему пространству клеток через процесс опсонизации.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам продуцирования антигена для иммуногенной композиции и/или вакцины как таковых. В частных вариантах осуществления указанные способы включают в себя выращивание E. canis на конкретной клеточной линии, с получением указанного антигена. В некоторых вариантах осуществления указанный антиген смешивают с ветеринарно приемлемым эксципиентом. В более частных вариантах осуществления настоящее изобретение включает в себя композицию, которая содержит инактивированную бактерию E. canis, выращенную на линии клеток костного мозга собак. Иммуногенные композиции и/или вакцины согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать в себя адъювант.

Несмотря на то, что механизм селекции, используемый для выбора клеток, которые будут инфицированы бактерией E. canis, недостаточно известен, клетки, подходящие для инфицирования, обычно экспрессируют рецепторы антигенов класса II Главного Комплекса Гистосовместимости (MHC, Major Histocompatibility Complex). Harris et al. [Vet. Immunol Immunopathol., 96: 239-243 (2003)] продемонстрировали, что организм E. canis располагает механизмом снижения экспрессии рецепторов MHC класса II на поверхности клеток, которые он инфицирует, что можно расценивать как возможный механизм, позволяющий обойти систему иммунного надзора. Хотя и понятно, что клеточные линии, полученные из рода клещей, не экспрессируют рецепторы MHC класса II млекопитающих, Singu et al. [Cellular Microbiology, 8(9), 1475-1487 (2006)] продемонстрировали, что E. canis способствует изменению экспрессии их поверхностных белков, в зависимости от того, инфицируют ли они позвоночного или беспозвоночного хозяина. Соответственно, в другом аспекте, настоящее изобретение связано с клетками и/или клеточными линиями, которые обеспечивают рост E. canis, обеспечивая в то же время выход антигена E. canis, который оптимизирован для применения вакцины.

Здесь термин "пациент" относится к представителю любого вида, который может быть инфицирован бактерией E. canis. В некоторых вариантах осуществления указанным пациентом является животное, не являющееся человеком. В частных вариантах осуществления указанным пациентом является либо собака, либо кошка. В некоторых вариантах осуществления указанным животным-пациентом является собака. В других вариантах осуществления указанным животным-пациентом является кошка.

Здесь термин "собака" включает в себя, если специально не оговорено иное, всех домашних собак, Canis lupus familiaris или Canis familiaris.

Здесь термин "эффективное для иммунизации количество" может варьировать, в зависимости от штамма или штаммов E. canis, используемых для получения вакцины, и может быть любым количеством, достаточным для индукции защитного иммунного ответа.

Хотя используемый здесь термин "защитный иммунный ответ" может быть у пациента иммунным ответом, который приводит к тому, что обеспечивается защита против одного или нескольких признаков инфекции, тем не менее "защитный иммунный ответ" необязательно должен обеспечивать полную защиту от любого признака инфекции. Скорее "защитный иммунный ответ" может быть иммунным ответом, которого достаточно для того, чтобы после контрольного заражения симптомы исходной инфекции были по меньшей мере ослаблены, и/или чтобы одна или несколько из исходных клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, вызывающих симптомы, были ослаблены и/или устранены. Следует понимать, что в данном контексте термин "ослаблены" означает сравнительную степень по отношению к статусу инфекции, включая молекулярный статус инфекции, а не только физиологический статус инфекции. Подразумевается, что вакцины согласно настоящему изобретению обеспечивают защитный иммунный ответ.

Здесь термин "достижение минимального гуморального ответа" означает, что введение вакцинной композиции, содержащей E. canis, при первичной вакцинации пациенту (например, собаке) не приводит к обнаружению антител против E. canis при тестировании сыворотки, полученной от указанного пациента через 21 день после первичного воздействия вакцинной композицией, когда указанное детектирование предпринимают, выполняя следующую процедуру: разведенную 1:40 тестируемую сыворотку приводят в контакт с фиксированной E. canis, в достаточной степени промывают, чтобы удалить весь не связавшийся материал, добавляют флуоресцентно меченное анти-IgG-антитело, соответствующее видовой принадлежности указанного пациента, промывают в достаточной степени, чтобы удалить весь не связавшийся материал, а затем проводят визуальное обследование флуоресценции за счет флуоресцентно меченных анти-IgG-антител, связавшихся с фиксированной E. canis посредством антител, специфичных в отношении E. canis. В частных вариантах осуществления проведение указанному пациенту единственной последующей бустер-вакцинации указанной вакциной все еще не вызывает значительного гуморального ответа против E. canis и требует разведения 1:160 или менее при тестировании сыворотки, полученной от указанного животного пациента после введения указанной бустерной вакцинной композиции, для детектирования антител против E. canis в тестируемой сыворотке, если они вообще поддаются детектированию, при определении способом, предпринимаемым, как описано выше, при первичной вакцинации.

Здесь термин "стабильно инфицированная" клеточная линия относится к линии клеток, которые остаются инфицированными по меньшей мере на протяжении 10 пассажей клеточной культуры.

Антигены

Антигены E. canis согласно настоящему изобретению могут быть выделены из любого количества источников или штаммов E. canis. Примеры таких штаммов E. canis включают в себя, но не ограничены штаммами Ebony, Broadfoot, Florida, Israel 611, Kogashima 1, Louisiana, Oklahoma, Venzuela, штаммом Jake университета штата Северная Каролина (NCSU), а также изолятами NCSU, такими как Demon, D J и Fuzzy. В некоторых вариантах осуществления указанным антигеном может быть бактерин E. canis. В дополнительных вариантах осуществления указанный антиген может быть выделен или получен из бактерий E. canis, инактивированных любым из подходящих доступных способов. Примеры таких способов включают в себя, но не ограничены воздействием тепла, формальдегида, формалина, би-этиленамина, радиации и бета-пропиолактона. В частных вариантах осуществления бактерии E. canis могут быть инактивированы путем обработки формалином.

В частных вариантах осуществления антиген E. canis может включать в себя один или несколько антигенов, которые не будут распознаваться пациентом как чужеродные, когда указанные один или несколько антигенов будут представлены пациенту, то есть либо у указанного пациента не будет развиваться гуморальный ответ, либо это будет минимальный гуморальный ответ на указанные один или несколько антигенов. В некоторых вариантах осуществления указанные один или несколько антигенов E. canis не будут вызывать продукцию антител или, альтернативно, будут вызывать минимальную продукцию антител против указанных одного или нескольких антигенов E. canis. Кроме того, такие антигены E. canis будут вызывать защитный иммунный ответ против указанных одного или нескольких антигенов E. canis. Настоящее изобретение включает в себя иммунную композицию для вакцинации собак против эрлихиоза, при этом указанная иммунная композиция является такого типа композицией, которая включает в себя средство, в ответ на которое у собаки вырабатывается иммунный ответ, и которое используется в качестве агента, который вызывает у собак от слабого гуморального иммунного ответа до отсутствия такового, но при этом вызывает у собаки защитный иммунный ответ. В частных вариантах осуществления указанный защитный иммунный ответ обусловлен, по меньшей мере отчасти, клеточно-опосредованным иммунным ответом.

Клетки

Бактерии E. canis согласно настоящему изобретению могут быть выращены на соответствующих клетках и/или на клеточной линии. Соответственно, антиген из E. canis может быть получен из бактерии E. canis, выращенной или размноженной на клеточной линии. Примеры таких клеток и клеточных линий включают в себя первичные клетки (например, макрофаги) и/или клеточные линии/стабильные клеточные линии, например, перечисленные ниже:

Первичные линии клеток:

· Макрофаги крови собаки, см., например, [Nyindo, et. al. Am. J. Vet. Res. 32: 1651-1658 (1971)].

· Перитонеальные макрофаги, см., например, [Stephenson and Osterman, Am. J. Vet. Res. 38: 1815-1819 (1977)].

Стабильные клеточные линии:

· Гибридная линия клеток человека/собаки, [см., например, Stephenson and Osterman, Am. J. Vet. Res. 41: 234-240 (1980)].

· Макрофагальная линия клеток собаки (DH-82), [см., например, Dawson, et. al., J. Infect. Dis. 163: 564-567 (1991)].

· Мышиные перитонеальные макрофаги; гибридная линия клеток мыши/собаки (MDH-SP), [см., например, Holland and Ristic, Abstr 55, p. 89, in Program and Abstracts of the IVth International Symposium on Rickettsiae and Rickettsial Diseases, Piestany Spa, Czech and Slovak Federal Republics].

· Линия клеток мышиных макрофагов, [см., например, Keysary, et. Al., J VEt Diagn Invest 13: 521-523 (2001)].

· Линия клеток костного мозга собаки (клетки DBM), [см., например, Gaunt et. al. J. Clin Micro. 34 (6): 1429-1432 (1996)].

· Линия клеток кошачьих эмбриональных фибробластов (FEF), [см., например, Battles et. Al., WO 2009/036177 A 1].

· Линии клеток клеща (IDE8 и ISE6), [см., например, Munderloh, et. al. U.S. 5869335].

В одном из аспектов настоящего изобретения клеточной линией является макрофагоподобная клеточная линия, которая экспрессирует поверхностные рецепторы, сходные с таковыми, экспрессируемыми макрофагами собаки. В сходных вариантах осуществления указанной клеточной линией является макрофагальная линия клеток, в таких частных вариантах осуществления используемой клеточной линией является линия клеток DH-82, которая в ATCC имеет номер доступа No. CRL-10389.

Настоящее изобретение включает в себя E. canis, которую выращивают на моноцитарной или макрофагоподобной клеточной линии, в определенных случаях указанные линии клеток иммортализованы таким образом, чтобы обеспечить стабильный и надежный ростовой субстрат для производства вакцин. Иммортализованные клетки могут быть получены из неопластических клеток-предшественников, таких как линия клеток DH-82, описанная Wellman с соавт. [In Vitro Cell Develop Biol. 24: 223-228, (3988)]. Клетки могут быть иммортализованы с помощью вирусных генов. Было показано, что T-антиген обезьяньего вируса 40 (SV40) очень надежным образом способствует созданию иммортализованных клеток, и гибриды соматических клеток перитонеальных макрофагов собаки, гибридизованных с SV40-трансформированными человеческими клетками, были использованы Stephenson et al. [Am J Vet Res 41(2): 234-40, (1980)] для выращивания E. canis в стабильном режиме. Для иммортализации клеток может быть использовано множество средств, включая различные вирусы, рентгеновские лучи, органические растворители, соединения металлов и нуклеиновые кислоты. Указанные способы широко представлены в обзорах Rhim [Annals NY Acad of Sci. 919: 16-25 (2000)]. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения E. canis выращены именно в таких клеточных линиях, а затем инактивированы с образованием бактеринового антигена E. canis.

В некоторых вариантах осуществления указанной линией клеток является линия клеток костного мозга собаки (DBM). В частных вариантах осуществления линией клеток DBM является линия, описанная Gaunt с соавт. [J. Clin. Microbiol., 34 (6): 1429-1432, (1996)]. В частных вариантах осуществления линией клеток DBM является депонированный в ATCC штамм с номером доступа No. PTA-10545. В некоторых вариантах осуществления такой клеточной линией является линия клеток DBM, которая стабильно инфицирована бактерией E. canis. В таком частном варианте осуществления клеточно-ассоциированная E. canis депонирована и имеет в ATCC номер доступа No. PTA-10546. В альтернативных вариантах осуществления указанной клеточной линией является линия клеток насекомых. В таких частных вариантах осуществления клеточной линией насекомых является линия клеток клеща. В одном из конкретных вариантов осуществления указанной клеточной линией является линия клеток клеща IDE8, выделенная из Ixodes scapularis, которая депонирована в ATCC и имеет в ATCC номер доступа No. CRL-11973.

Размножение E. canis

Клеточную культуру, инфицированную E. canis, можно выращивать в культуральных матрасах, а затем переносить в более крупные матрасы для получения больших объемов материала, необходимого для изготовления иммуногенных композиций и/или вакцин. Альтернативно, инфицированную клеточную культуру можно в последующем переносить из матрасов в роллерные бутыли, вращающиеся колбы, клеточные кубы, биореакторы или в любую аппаратуру, пригодную для крупномасштабного выращивания клеточной культуры с целью получения соответствующих количеств материала, необходимых для изготовления смеси иммуногенной композиции и/или вакцины. Инфицированные культуры могут быть заморожены в соответствующей среде и использованы и использованы для инфицирования клеточной культуры в дальнейшем.

Клетки могут быть прилипающими и прикрепленными к культуральному матрасу или аппарату, включая варианты прикрепления к микроносителям, или, альтернативно, плавающими в суспензии. Способы изъятия прилипающих, или адгерентных, клеток включают в себя, но не ограничены соскабливанием их с матрасов с помощью механических скребков для клеток или обработкой раствором трипсина для удаления их из матраса, с дальнейшей нейтрализацией неизрасходованного трипсина белковым раствором. Затем клетки могут быть отцентрифугированы с целью их концентрирования, а потом ресуспендированы в соответствующей замораживающей среде. Замораживающие среды включают в себя, но не ограничены средами, содержащими 10-90% эмбриональной бычьей сыворотки и 1-20% диметилсульфоксида (DMSO). Могут быть использованы и другие подходящие криоконсерванты, которые могут оказаться более соответствующими тем или иным клеточным линиям, и в результате этого может повышаться уровень жизнеспособности клеток при их оттаивании и повторном запуске культуры.

Для запуска инфицированной культуры, неинфицированные клетки могут быть вытащены из морозильной камеры и культивированы в соответствующей среде. Например, 1-мл флакон, содержащий 1×10⁵ клеток DBM, подвергают быстрому оттаиванию и помещают в матрас T-75 для культивирования тканей (с площадью поверхности 75 см²), содержащий среду, подходящую для роста клеток DBM. В одном из конкретных вариантов осуществления такой средой является полная ростовая среда Фишера. Например, один литр полной ростовой среды Фишера для клеток DBM изготавливают путем добавления 200 мл лошадиной сыворотки к 770 мл среды Фишера. Среду доводят до кондиции путем добавления 10 мл раствора гидрокортизона с концентрацией 2 мг/мл, 10 мл 200 мМ раствора глутамина и 10 мл 1 M раствора HEPES.

Как только культура DBM достигает требуемого уровня конфлуэнтности (0-90%), такая культура готова для инфицирования. Пузырек инфицированной культуры достают из морозильной камеры, подвергают быстрому оттаиванию и распределяют поверх растущей культуры. Культуру растят при 36±2°C в закрытых пробками или вентилируемых матрасах с обогащением или без обогащения CO₂. Культуру поддерживают в соответствии с общепринятыми способами, известными специалистам в данной области, путем переноса клеток, по необходимости, в свежую среду. Через несколько недель указанную культуру можно проверить на предмет определения уровня инфицирования путем непрямой флуоресцентной микроскопии с использованием анти-Е. canis-антител или других подходящих методов. Культуры могут достигать уровня инфицирования, составляющего 90% или выше. Более высокий уровень инфицирования является более желательным, поскольку он дает возможность получить более высокий выход антигенного материала на объем культуры. Инфицированную культуру можно переносить в более крупные культуральные объемы путем переноса культуры в более емкие матрасы, роллерные бутыли или другие подходящие культуральные сосуды.

Инфицирование клеточной культуры бактерией E. canis может быть определено несколькими способами, включая, но не ограничиваясь перечисленным, микроскопический анализ клеток, окрашенных красителями, такими как краситель Гимза, краситель Cameo Difquick или акридиновый оранжевый. Кроме того, антитела, специфичные в отношении E. canis, могут быть либо напрямую, либо опосредованно мечены флуоресцентными маркерами, и их изучают во флуоресцентном световом микроскопе и при определенной длине волны в соответствии с конкретным флуоресцентным маркером. Для определения уровня инфицирования культуры могут быть использованы также и другие технологии, включая, но не ограничиваясь перечисленным, количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR), или ПЦР.

При необходимости к культуре могут быть добавлены неинфицированные клетки, чтобы поддержать определенный уровень инфекции в культуре. Когда соответствующий объем инфицированной культуры достигнут, такая культура может быть инактивирована различными способами, включая нагревание или химические способы, но не ограничиваясь перечисленным. Перед инактивацией культура может быть оттитрована с целью определения количества инфекционных частиц в культуре в качестве способа определения того, какое количество пост-инактивированной культуры добавлять к смеси. Способ титрования инфицированной культуры представлен в примере ниже. В некоторых вариантах осуществления к культуре добавляют формалин до конечной концентрации 0,05%, и такую культуру перемешивают в течение трех дней при 36±2°C. Другие такого рода инактиванты, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничены этилениминами (EI, BEI), бета-пропиолактоном и фенолом. Для инактивации такой культуры могут быть использованы также антибиотики, такие как дезоксициклин или любой другой антибиотик, к которому чувствительна бактерия E. canis.

Для определения жизнеспособности культура может быть тестирована любым количеством способов. Такие способы включают в себя, но не ограничены обратным титрованием клеточной культуры, способом определения мембранной целостности по противостоянию проникновению красителя, а также инъекцией собакам и мониторингом на предмет определения типичных признаков инфекции.

Сразу после инактивации культуру можно сконцентрировать любым из множества известных способов. Например, концентрирование нежизнеспособной E. canis может быть достигнуто путем центрифугирования, ультрацентрифугирования или выпаривания. В одном из конкретных вариантов осуществления клетки DBM, которые инфицированы бактерией E. canis, инактивируют, а затем центрифугируют при 1400×g в течение 15 минут для осаждения цельных клеток. Супернатант отбрасывают, а осадок ресуспендируют в среде Фишера, не содержащей сыворотки. После инактивации может быть добавлен гентамицин или сходный с ним антисептик, во избежание контаминирования. Культуру ресуспендируют в бессывороточной среде Фишера в одной десятой первоначального объема, чтобы сконцентрировать инактивированную культуру и облегчить манипуляции с нею. Количество антигена, доступное в инактивированном концентрате, может быть определено любым из многочисленных способов, включая хроматографию, спектроскопию или специфические иммуноанализы разных типов. Массу антигенного материала можно смешать с разбавителями и адъювантом с получением приемлемой вакцины.

Иммуногенные композиции и вакцины

Как указано выше, иммуногенные композиции и/или вакцины, содержащие антиген согласно настоящему изобретению (например, бактерин E. canis), может, но необязательно, дополнительно включать в себя один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов. Примеры фармацевтически приемлемых адъювантов хорошо известны в данной области, см., например, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.), а также GOODMAN AND GILMAN'S, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (10th ed. 2001). В частных вариантах осуществления указанным адъювантом может быть адъювант, который стимулирует клеточно-опосредованный иммунный ответ, но не стимулирует гуморальный иммунный ответ.

Иммуногенные композиции и/или вакцины согласно настоящему изобретению, которые дополнительно включают в себя адъювант, могут содержать один или несколько элементов, обычно нерастворимых в воде. В частных вариантах осуществления указанным адъювантом является неполярное вещество, растворенное в неполярном растворителе. Примеры неполярных растворителей включают в себя, но не ограничены гексаном, бензолом, толуолом, простым диэтиловым эфиром, хлороформом и этилацетатом. В одном из таких вариантов осуществления указанным растворителем является система хлороформных растворителей. Хлороформ в некоторых случаях может быть предпочтителен, поскольку он не воспламеняется и является более подходящим для изготовления биологических препаратов для ветеринарного применения. Иллюстративным адъювантом здесь является 6,6'-димиколят трегалозы в системе хлороформных растворителей.

Обычно неполярные растворители не растворимы в воде, и, следовательно, в системе растворителей может быть использовано применение полярного растворителя с относительно низкой диэлектрической постоянной, но с хорошей растворимостью в воде, с целью повышения растворимости адъювантной смеси в водном растворе. Примеры полярных растворителей включают в себя, но не ограничены метанолом, этанолом, изопропанолом, диметилсульфоксидом и диметилформамидом. В некоторых вариантах осуществления указанным неполярным адъювантом является фактор жгутообразования [например, 6,6'-димиколят трегалозы]. При стимуляции клеточно-опосредованного иммунитета могут быть использованы и другие неполярные растворители, которые включают в себя, но не ограничены гидрофобными фракциями очищенных сапонинов, бактериального липопептида (Pam₃CSK₄) и монофосфориллипида A. В некоторых вариантах осуществления указанный фактор жгутообразования растворим в системе хлороформных растворителей. В частных вариантах осуществления указанная система хлороформных растворителей содержит приблизительно 65-95% хлороформа объем/объем.

Соответственно, некоторые варианты осуществления системы хлороформных растворителей включают в себя, но не ограничены системами растворителей, содержащих хлороформ и метанол. В качестве неограничивающего примера, указанная система хлороформных растворителей может содержать приблизительно от 70% до 95% хлороформа и/или приблизительно от 5% до 30% метанола объем/объем. В определенных такого типа вариантах осуществления, система хлороформных растворителей дополнительно содержит 0,5-5,0% воды объем/объем. В одном из неограничивающих примеров, система хлороформных растворителей может содержать по объему девяносто частей хлороформа, по объему десять частей метанола, и одну по объему часть воды [то есть, соответственно, приблизительно 90% хлороформа: 10% метанола: 1,0% воды, объем/объем]. В частных вариантах осуществления указанный адъювант может содержать фактор жгутообразования и/или любой другой адъювант, растворенный в системе хлороформных растворителей. В одном из таких вариантов осуществления указанным адъювантом является 6,6'-димиколят трегалозы, который растворен в системе хлороформных растворителей: 90 мл хлороформа: 10 мл метанола: 1 мл воды.

В частных вариантах осуществления указанная вакцинная композиция может содержать один или несколько фармацевтически или ветеринарно приемлемых носителей или разбавителей. Неограничивающие примеры носителей или разбавителей, которые могут быть использованы в составе вакцинных композиций, включают в себя воду, растворы глюкозы, декстрозу/физиологический раствор, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), буфер HEPES, среду Фишера, раствор Хэнкса и раствор Рингера. Такие композиции могут содержать фармацевтически приемлемые дополнительные вещества для повышения стабильности, улучшения возможностей доставки или растворимости, например, забуферивающие средства, средства для доведения тоничности раствора, увлажняющие средства, детергенты и т.п. Добавки могут включать в себя также дополнительные активные ингредиенты, такие как бактерицидные средства или стабилизаторы. Например, такой раствор может содержать тимеросал, гентамицин, ацетат натрия, лактат натрия, натрия хлорид, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат или триэтаноламина олеат. Композиции могут быть стерилизованы с использованием обычных общеизвестных технологий стерилизации.

В некоторых вариантах осуществления предусмотрено, что вакцинная композиция может дополнительно включать в себя другие активные компоненты, такие как, но не ограничиваясь перечисленным, антипатогенный компонент или антигенный компонент, направленные против вируса бешенства, болезни Лайма (Borrelia burgdorferi), вируса собачьей чумы, бордетеллиоза собак, парвовируса собак, коронавируса собак, Babesia canis, Anaplasma phagocytophilum, Giardia; leptospira interrogans, например, серологических вариантов canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa или Bratislava и т.п., или любой их комбинации, и/или может включать в себя такие дополнительные активные компоненты как аттенуированный и/или убитый изолят перечисленных выше патогенов.

В некоторых вариантах осуществления указанная вакцина и/или иммуногенная композиция может быть представлена в виде дозированной лекарственной формы для облегчения введения и обеспечения постоянства дозировки. Здесь дозированная лекарственная форма, поскольку она имеет отношение к вакцинной композиции, относится к физически дискретным единичным дозам, подходящим в качестве унитарных доз для пациента, где каждая единичная доза содержит предопределенное количество антигена E. canis, рассчитанное из соображений получения требуемого иммунногенного эффекта, в сочетании с адъювантом, носителем и/или наполнителем. В некоторых вариантах осуществления указанная иммунногенная композиция и/или вакцина являются лиофилизированными.

В некоторых вариантах осуществления вакцина и/или иммунногенная композиция могут быть введены парентерально, например, внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно, интрадермально или пр., или же иммунногенная композиция и/или вакцина могут быть введены орально или интраназально в эффективных количествах, в соответствии со схемой, определяемой временем потенциальной экспозиции носителя E. canis. Таким образом, у обработанного таким образом пациента может хватить времени для выработки иммунитета до естественного контакта [с возбудителем]. Например, типичная схема обработки может включать в себя подкожную инъекцию по меньшей мере за 42 дня до потенциального контакта. В некоторых вариантах осуществления может потребоваться более одного введения пациенту вакцинной композиции. В качестве неограничивающего примера, первое введение пациенту может быть осуществлено приблизительно за 42 дня, а второе - приблизительно за 21 день до потенциального контакта. Однако выработка иммунитета может произойти и в более короткие сроки.

Введение вакцин

Вакцины согласно настоящему изобретению могут быть введены в виде жидкости, эмульсии, сухого порошка, включая лиофилизированный порошок, и/или в виде аэрозоля любым парентеральным путем, внутривенно, внутрибрюшинно, интрадермально, путем скарификации, подкожно, внутримышечно или путем инокуляции слизистых оболочек, например, орально, интраназально, в виде аэрозоля, в виде глазных капель, путем введения in ovo, или же путем имплантации в виде лиофилизированного порошка.

Депонирование в ATCC

Культура следующего биологического материала была депонирована в следующем международном депозитарии с участием наблюдательного Совета: Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College and LSU Agricultural Center, 104 Efferson Hall, Baton Rouge, Louisiana, 70803.

American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., в условиях, которые удовлетворяют требованиям Будапештского Соглашения о Международных правилах депонирования микроорганизмов с целью патентования.

Организм	No. доступа в ATCC	Дата депонирования
Клетки костного мозга собаки	PTA-10545	22 декабря 2009 г.
Клеточно-ассоциированная	E. canis PTA-10546	22 декабря 2009 г.

Настоящее изобретение может быть лучше уяснено с помощью следующих неограничивающих примеров, которые приведены лишь в качестве примеров осуществления настоящего изобретения. Следующие примеры представлены с целью более полной иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Однако их ни в коем случае не следует расценивать как ограничивающие объем, охватываемый настоящим изобретением.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Таблица 1 Вакцинная композиция
Антигенная фракция	Используемый объем/вес
Инактивированный формалином антиген E. canis с титром в 6,5 log10 TCID50/мл	315 мл
Адъювант: 6,6'-димиколят трегалозы 100 мг, растворенных в системе хлороформных растворителей	101 мл
Система хлороформных растворителей
Хлороформ	90 мл
Метанол	10 мл
Вода	1 мл
Среда Фишера	9479 мл
1М буфер HEPES	94,9 мл
10% раствор тимерозала	9,1 мл
Раствор гентамицина	0,96 мл
Общий объем смеси	10 л

ПРИМЕР 2

Постановка исследования и результаты:

Таблица 2 Описание тестируемых животных
Вид	Собака
Исходный возраст	9-11 месяцев
Пол	Самки
Порода	Лабораторные бигли
Исходный интервал веса тела	9,0-16,6 кг в день контрольного заражения
Количество животных	16
Способ идентификации	Татуировка на ухе
Критерии включения	Физический осмотр ветеринара перед исследованием и определение состояния здоровья и соответствия. Серологически отрицательны в отношении антител к E. canis (≤1:40) перед первой вакцинацией, нормальные уровни тромбоцитов перед контрольным заражением (≥ 200000/мкл)
Критерии исключения	Любое животное, не удовлетворяющее критериям включения

РАЗМЕЩЕНИЕ И СОДЕРЖАНИЕ ЖИВОТНЫХ:

Акклиматизация/Адаптация: Животные были взяты из предсуществующего пула, и, таким образом, не было необходимости ни в обработке, ни в адаптации. Животные проходили адаптацию по меньшей мере в течение 7 дней перед началом данного исследования. В течение всего исследования всем животным было предоставлено нормальное хорошее содержание, и всем животным была обеспечена общеустановленная стандартизованная практика ухода за животными.

Размещение: Собак случайным образом разбивали на группы и размещали в загонах (по 4-5 собак на загон), независимо от того, в какую группу обработки они входили.

Диета: всем животным был обеспечен неограниченный доступ к воде. Корм соответствовал минимальным требованиям в отношении поступления питательных веществ для животных данного возраста, и питание подчинялось стандартным процедурам.

Таблица 3 Разделение на группы обработки
Группа обработки	Количество собак	Вакцина	Доза и путь введения	Вакцинация в дни исследования	Контрольное заражение в день исследования
1	8	нет	нет	нет	42
2	8	да	1 мл подкожно	0 и 21	42

Рандомизация: Собак выстраивали в определенном порядке по номерам, присвоенным им внутри этой выборки случайным образом, а затем сортировали на группы с соответствующей меткой ID. Самые маленькие номера внутри этой случайной выборки относили к группе 1, а самые большие номера внутри этой случайной выборки относили к группе 2. Поскольку потеря веса является одним из клинических признаков, ассоциированных с инфекцией E. canis, в процессе рандомизации выборку собак формировали также и с учетом их веса.

Слепой метод исследования: Персонал, тестирующий лабораторные образцы, осуществляющий ежедневный осмотр животных, клиническую оценку и оценку при вскрытии, до полного завершения исследования о принадлежности животных к той или иной группе осведомлен не был.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ:

Предвакцинационный мониторинг/Акклиматизация:

Образцы: Образцы крови отбирали в пробирки для выделения сыворотки в день 0, перед первой вакцинацией, на предмет анализа титра антител.

Физический осмотр: Все животные проходили физический осмотр на день -3, с привлечением испытательного оборудования и под контролем ветеринарного врача, и были признаны здоровыми и подходящими для участия в данном исследовании.

Ежедневный осмотр: Во время акклиматизационного периода всех животных осматривали каждый день, в соответствии с правилами ухода за животными.

Клинические наблюдения: Клинические признаки и ректальную температуру определяли в день 0 и в день 21 перед вакцинацией.

Вакцинация:

Введение биологического продукта: Вакцину вводили подкожно, в дозе 1,0 мл, каждому животному в дни 0 и 21, используя 3-мл шприц и 1-дюймовую иглу 23 калибра. Все вакцины выдерживали во льду в процессе их транспортировки к лабораторным животным и в период введения вакцин. Подкожную вакцинацию осуществляли в правую надлопаточную область во время введения первой дозы и в левую надлопаточную область во время введения второй дозы.

Поствакцинационные процедуры:

Реакции на месте инъекции: Наблюдения за участком, в который была произведена инъекция, проводили в течение 7 дней после каждой вакцинации.

Ежедневный осмотр: Во время поствакцинационного периода всех животных осматривали каждый день, в соответствии с правилами ухода за животными.

Серология: В 21-й день исследования образцы крови отбирали в пробирки для выделения сыворотки на предмет анализа титра антител.

Процедуры, выполняемые перед контрольным заражением:

Клинические наблюдения: Клинические признаки и ректальную температуру определяли в дни 35-й, 39-й и в день 42-й (перед контрольным заражением), чтобы установить базовые уровни.

Образцы крови: Образцы крови отбирали в пробирки для выделения сыворотки на 42-й день исследования (перед контрольным заражением), на предмет анализа титра антител. В дни 35-й, 39-й и в день 42-й исследования (перед контрольным заражением) образцы крови отбирали в пробирки с ЭДТА на предмет осуществления общего анализа крови. На 42-й день исследования (перед контрольным заражением) образцы крови отбирали в пробирки PAX Gene на предмет ПЦР-анализа.

Вес тела животных определяли на 42-й день исследования (перед контрольным заражением) для установления базовых значений.

Контрольное заражение:

Материал для контрольного заражения: Два пузырька с материалом для контрольного заражения E. canis (замороженные кратковременные культуры, перенесенные собакам) извлекали из жидкого азота, подвергали быстрому оттаиванию и разбавляли 1:100 (1 мл+99 мл) средой Фишера. Разбавленный материал для контрольного заражения закрывали пробкой, перемешивали путем переворачивания пузырька, и затем из него отбирали 1 мл для титрования. Пузырек запечатывали алюминиевым колпачком, надписывали и помещали на лед во втором надежно закупоренном контейнере для транспортировки в животноводческое хозяйство.

Осуществление контрольного заражения: На 42-й день исследования всех собак подкожно заражали 2,0 миллилитрами разбавленного материала для контрольного заражения.

Подтверждение контрольного заражения/Обратное титрование: Отбирали образец из разбавленного материала для контрольного заражения и использовали для сиюминутного титрования в день заражения в 24-луночных планшетах для культивирования тканей.

Мониторинг после контрольного заражения:

Вес тела: Вес тела животных определяли еженедельно после контрольного заражения.

Ежедневный осмотр: После контрольного заражения всех животных осматривали каждый день, за исключением тех дней, когда они подвергались клиническому осмотру и измерению температуры, вплоть до 49-го дня данного исследования.

Клинические наблюдения: Начиная с 49-го дня и до конца настоящего исследования ежедневно определяли клинические признаки (депрессию, дегидратацию, носовое кровотечение, а также выделения из носа/из глаз), а два раза в неделю определяли ректальную температуру.

Реакции на месте инъекции: наблюдения за участком, в который была произведена инъекция, проводили в течение 7 дней после контрольного заражения.

Образцы крови:

Кровь на общий анализ (CBC): Образцы крови (ЭДТА) брали два раза в неделю после контрольного заражения для мониторинга профилей CBC.

Образцы сыворотки: У собак один раз в две недели после контрольного заражения брали кровь на серологию.

Вскрытие/проявления: Всех тестируемых животных подвергали гуманной эвтаназии путем внутривенной инъекции Beuthanasia перед вскрытием.

Взятие и обработка образцов:

Взятие крови с ЭДТА на общий анализ крови (CBC): кровь брали путем венепункции яремной вены с помощью вакуумированных трубок, содержащих трикалий-ЭДТА. Кровь помещали на пакеты со льдом, и в тот же день осуществляли анализ профиля крови.

Взятие крови на SST [тест вторичной стимуляции в смешанной культуре лимфоцитов]-анализ антител: кровь отбирали путем венепункции яремной вены с помощью вакуумированных трубок. Кровь центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 минут, сыворотку маркировали и хранили при -10°C или ниже.

Кровь на ПЦР-тестирование: кровь отбирали путем венепункции яремной вены с помощью вакуумированных трубок PAX Gene, и осуществляли анализ ПЦР.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ:

Счет тромбоцитов: Счет тромбоцитов осуществляли традиционными, хорошо известными в данной области методами.

Титрование E. canis: Тестировали время удерживания образца разбавленного материала для контрольного заражения. Вкратце, клетки DBM вносили в 24-луночные планшеты в концентрации 1,0×10⁵ клеток в миллилитре и инкубировали при 36±2 градусах по Цельсию в течение 1 дня перед проведением анализа. Из 1-дневных культур клеток DBM асептически удаляли среду, и к клеткам добавляли разбавленный в результате 10-кратных серийных разведений материал для контрольного заражения, по 1 мл на лунку, по 4 параллельных лунки 24-луночного планшета. Планшеты инкубировали при 36±2 градусах по Цельсию в течение 7 дней. Через 7 дней среду в планшетах заменяли свежей ростовой средой Фишера, по 1 мл на лунку, и вновь инкубировали при 36±2 градусах по Цельсию в течение 7 дней. После 14 дней инкубации планшеты центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 минут, среду отсасывали, и культуры в течение 10 минут фиксировали 100% метанолом (0,5 мл на лунку). Сразу же после высушивания планшетов в них добавляли по 0,5 мл на лунку мышиного моноклонального антитела против Е. canis (разведенного 1:1000 в 0,01M PBS) и инкубировали в течение 30 минут при 36±2 градусах по Цельсию. Планшеты 3 раза промывали 0,01M PBS, и последний раз - водой. Затем добавляли по 0,5 мл на лунку FITC-меченного козьего антимышиного IgG (разведенного 1:100 в 0,01M PBS) и инкубировали в течение 30 минут при 36±2°C. Планшеты вновь промывали и изучали под флуоресцентным микроскопом. Титры рассчитывали для 50% предельных значений, используя метод Спермана-Карбера.

Серология: непрямой иммунофлуоресцентный анализ на антитела (IFA) был использован для детектирования анти-E. canis-антитела в сыворотке собаки. Вкратце, первоначальные разведения сыворотки 1:20 производили в буфере для разведения сыворотки. Отдельные образцы разбавляли 1:40, 1:80, 1:160 и 1:320, и затем добавляли (по 10 мкл на разведение) к 12-луночным предметным стеклам, содержащим фиксированные клетки DBM, инфицированные E. canis, и инкубировали в увлажняемой камере в течение 30 минут при 36±2 градусах Цельсия. Предметные стекла промывали в 0,01M PBS в течение 10 минут, и к каждой лунке на предметном стекле добавляли по 10 мкл FITC-меченного козьего антисобачьего IgG (разведенного 1:100 в 0,01M PBS). Затем предметные стекла помещали в увлажняемую камеру на 30 минут при 36±2 градусах Цельсия, промывали в 0,01M PBS в течение 10 минут, и считывали методом флуоресцентной микроскопии. Титр определяли по максимальному разведению, при котором еще наблюдалась флуоресценция.

ПЦР: ПЦР на образцах крови осуществляли, используя традиционную, хорошо известную в данной области технологию.

Проверка инактивации: Инактивированный формалином антиген тестировали на предмет его полной инактивации. Вкратце, клетки DBM помещали в матрасы в 150 см² за один день до инокуляции, по 1,0×10⁵ клеток в миллилитре и по 60 мл на матрас. 1,0 мл каждого тестируемого образца (включая положительный и отрицательный контроли) инокулировали в матрасы и инкубировали в течение 8 дней при 36±2 градусах Цельсия. Осуществляли два слепых пассажа, при каждом пассаже перенося по 10 мл посевной культуры из прежнего пассажа. На 8-й день после 2-го слепого пассажа материал в каждом матрасе окрашивали специфическим иммунофлуоресцентным красителем. Отсутствие флуоресценции в культурах является показателем полной инактивации.

РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗОВ:

Итоговые отличия: Основным отличием при определении эффективности вакцинной композиции считалось предотвращение тяжелой тромбоцитопении у вакцинированных животных по сравнению с контролем. Процент потери веса, суммарные результаты вскрытия, объемы крови и клинические признаки были признаны результатами, подтверждающими защитное воздействие.

Количественная оценка клинических наблюдений: Клинические признаки ежедневно регистрировали и ежедневно оценивали у каждой собаки в течение 12-недельного периода после контрольного заражения.

Клинические критерии оценки: Установление психологического состояния животных на основании того, как они входят в изолированную комнату и обходят ее. Во время такого первого обхода комнаты можно оценить уровень депрессии у многих животных. Далее можно приступить к клиническим наблюдениям. Потом измеряют температуру тела с последующим получением необходимых образцов крови.

Смерть: 100 баллов (Отсутствие признаков жизни, включая собак, которые агонизируют, и собак, подвергнутых эвтаназии).

Депрессия: Отсутствие (Нормальная активность и поведение). Наличие: вялость, склонность лежать, когда вы находитесь в комнате, неохотное вставание.

Выделения из носа: норма (отсутствуют); обильные (от умеренных до обильных): прозрачная жидкость, часто водянистая, все время стекает ко рту или ниже рта - либо вдоль стенок носа, либо ниже носовой перегородки; слизисто-гнойные (от умеренных до обильных): слизисто-гнойные выделения, непрозрачные, часто окрашенные, все время стекают ко рту или ниже рта - либо вдоль стенок носа, либо ниже носовой перегородки.

Выделения из глаз: норма (отсутствуют); обильные (от умеренных до обильных): прозрачная жидкость, часто водянистая, стекающая до середины носа или окаймляющая глаз плюс скапливающаяся или пропитывающая шерсть у внутреннего или наружного уголка глаза; слизисто-гнойные (от умеренных до обильных): слизисто-гнойные выделения, непрозрачные, часто окрашенные, стекают до середины носа или окаймляют глаз плюс скапливаются или пропитывают шерсть у внутреннего или наружного уголка глаза.

Носовое кровотечение: (Кровотечение из носовых отверстий) - в норме (отсутствует); Наличие: Кровотечение из носовых отверстий.

Дегидратация: в норме (отсутствует); Наличие: образование складок на коже между плечами, соединяющих их или продолжающихся более 3 секунд до их исчезновения.

Таблица 4 Система оценки специфических клинических признаков
Смерть	100
Депрессивное состояние	2
Выделения из носа
Обильные выделения	1
Слизисто-гнойные выделения	2
Носовое кровотечение	2
Дегидратация	1

Вычисление процента потери веса: Каждую собаку взвешивали перед контрольным заражением с целью определения исходного веса. Потерю веса у каждой собаки вычисляли каждую неделю после контрольного заражения с помощью следующей формулы: ((исходный вес - вес в момент взвешивания)/исходный вес)×100=% потери веса.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ:

Сопутствующее заболевание: Одну контрольную собаку пришлось лечить в процессе настоящего исследования. У этой собаки развилось изъязвление в левом глазу, и это веко распухло и закрыло глаз. Применение антибиотиков удалось обойти, чтобы это не отразилось на результатах данного исследования. Указанное состояние было обнаружено в определенный день. В это время глаз промывали изотоническим физиологическим раствором. Через два дня собаке локально ввели подкожную инъекцию атропина. Через пять дней после обнаружения указанного состояния собаку обследовал ветеринарный врач и установил, что она полностью восстановилась. Скорее всего, указанное состояние было вызвано травмой (царапина, полученная от другой собаки), а не от тестируемого в настоящем исследовании продукта или контрольного заражения.

Предвакцинационное тестирование: Осуществляли скрининг собак на предмет наличия антител против E. canis перед вакцинацией. Было обнаружено, что все собаки имеют титр <40 при их тестировании методом иммунофлуоресцентного анализа (IFA) на предмет обнаружения специфичного в отношении E. canis антитела (См. таблицу 5; день 42 является днем контрольного заражения). Клинические наблюдения и измерение ректальной температуры также осуществляли перед вакцинацией. Все собаки были признаны клинически здоровыми.

Таблица 5 Сводные средние данные серологического анализа
Группа обработки	День 0	День 21	День 42	День 56	День 70	День 84
Контроли	<40	<40	<40	<40	≥147	≥320
Вакцинированные	<40	<40	≥123	≥104	≥207	≥207

Ни у одной из вакцинированных собак после вакцинации не было обнаружено реакции на месте инъекции. Всех собак после обеих вакцинаций ежедневно осматривали на предмет обнаружения нежелательных побочных эффектов, ассоциированных с вакциной. Ни у одной из собак после вакцинации не было выявлено каких бы то ни было неблагоприятных клинических признаков.

Образцы крови отбирали на предмет серологического анализа на 21-й день после вакцинации, непосредственно перед второй вакцинацией. Титры определяли путем двойного разведения сыворотки на 12-луночных предметных стеклах, покрытых клетками DBM, инфицированными E. canis. Разведения начинали с 1:40. Ни у одной из собак в группе вакцинированных не было обнаружено титра свыше 1:40 исходно, после первой дозы вакцины (см. таблицу 5).

На 42-й день, непосредственно перед контрольным заражением, распределение титров антител среди вакцинированных E. canis было следующим (см. также таблицу 5):

Титры <40: 0 собак

Титры=80: 4 собаки

Титры=160: 3 собаки

Титры >320: 1 собака

Все невакцинированные контрольные собаки оставались серонегативными (<1:40) до контрольного заражения.

Контрольное заражение: На 42-й день исследования всех собак подкожно заражали, разбавляя оттаявший материал для контрольного заражения средой Фишера 1:100 и вводя подкожно 2,0 миллилитра каждой собаке. Во время введения собакам определяли титр материала для контрольного заражения, и оказалось, что титр составляет 10^3.2 TCID₅₀ на 2-миллилитровую дозу.

Клиническая оценка после контрольного заражения:

Потеря веса тела животных, ассоциированная с контрольным заражением: определяли еженедельно после контрольного заражения. Вес тела животных определяли каждую неделю после контрольного заражения. Полученные результаты суммированы в таблице 6.

Таблица 6 Средние веса животных (кг) после контрольного заражения
	Исходно	Неделя 1	Неделя 2	Неделя 3	Неделя 4	Неделя 5	Неделя 6	Неделя 7	Неделя 8
Группа обработки	День 42	День 49	День 56	День 63	День 70	День 77	День 84	День 91	День 98
Контроли	13,3	13,4	13,4	13,2	12,8	11,9	11,4	11,5	11,5
Средний процент потери веса	3,89%	11,15%	14,83%	16,97%	15,91%
Вакцини- рованные	10,8	10,8	10,9	10,6	10,2	9,9	9,8	9,9	9,9
Средний процент потери веса	4,86%	7,29%	7,88%	7,85%	7,61%

Наиболее высокий процент потери веса наблюдали у контрольных собак в среднем с 16,97% снижением веса тела к 7 неделе после контрольного заражения. В этой точке также наблюдалась самая большая разница между группами обработки, поскольку у вакцинированных собак потеря веса составляла только 7,85%. Потерю веса оценивали статистически. Серьезную потерю веса определяли как таковую, составляющую ≥15% веса тела собаки. У восьмидесяти семи процентов (7/8) контрольных собак потеря веса составляла ≥15% веса их тела, по сравнению с 12% (1/8) вакцинированных. Это различие является в высшей степени значимым (p=0,0042).

Смертность: Две из восьми (25%) собак в контрольной группе были подвергнуты эвтаназии из-за множества клинических признаков. Ни одна из вакцинированных собак не умерла в процессе указанных испытаний. Эвтаназию осуществляли согласно решению ветеринарного врача на основании клинических признаков, потери веса и численности клеток крови, а также уровня электролитов. Обслуживающий ветеринар не был информирован относительно принадлежности собак к той или иной группе. Различия между группами были обоснованными, но статистически не достоверными из-за малого количества собак, участвующих в настоящем исследовании (p=0,2118).

Оценка клинического анализа крови: Образцы крови также брали в 35-й, 39-й и 42-й дни для установления базовых уровней белых и красных клеток крови (WBC и RBC), гематокрита (HCT), гемоглобина (Hgb) и тромбоцитов. Перед контрольным заражением указанные показатели у всех собак были в пределах нормы, в соответствии с Руководством Merck Veterinary Manual, Eighth Edition [Merck and Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA, (1998)].

Образцы крови после контрольного заражения брали два раза в неделю. Результаты CBC включали в себя оценку уровня белых клеток крови (WBC), красных клеток крови (RBC), гемоглобина (Hgb), гематокрита (Hct, или гематокритное число) и тромбоцитов. Поскольку E. canis оказывает такое сильное влияние на показатели крови, была разработана система оценок, позволяющая классифицировать тот или иной случай как "нормальный, аномальный или клинически значимый (или тяжелый). В таблице 7 суммированы показатели, используемые в настоящем исследовании.

Таблица 7 Сводка результатов по образцам крови
	Единицы	Пределы нормы у собак	Аномальные уровни	Клинически значимые "тяжелые" показатели*
WBC	×103/мкл	6-17	<6,0	≤4,5 в течение ряда дней
RBC	×106/мкл	5,5-8,5	<5,5	≤4,0 в течение ряда дней
Hgb	г/дл	12-18	<12	≤8 в течение ряда дней
Hct	%	37-55	<37	≤28 в течение ряда дней
Тромбоциты	×103/мкл	200-900	<200	<150 в течение ряда дней
* Руководство по ветеринарии, Merck Veterinary Manual

Клинически значимыми (или тяжелыми) показателями считали приблизительно 75%-ое отклонение от нижней границы нормы в течение нескольких дней. У собак при таких показателях часто наблюдаются клинические признаки, которые могут непосредственно коррелировать с дефицитом соответствующих клеток крови. Аномальными показателями считались любые показатели, которые были ниже нижней границы нормы.

Тромбоциты: Низкий уровень тромбоцитов является первым клиническим признаком, ассоциированным с риккетсиозными инфекциями. В данном исследовании это был основной вариабельный параметр. E. canis является особенно выраженной причиной очень тяжелого падения уровней тромбоцитов у прореагировавших собак. У всех 8 (100%) контрольных собак и у 5/8 (63%) вакцинированных развивалась тромбоцитопения (уровень тромбоцитов <200000/мкл). На фигуре 5 приведены значения средних уровней тромбоцитов (в контроле против вакцинированных особей) после контрольного заражения, а в таблице 8 представлены сводные данные. Собак, у которых уровень тромбоцитов насчитывал менее 150000 тромбоцитов/мкл крови на протяжении двух или более определений, относили к тяжелой категории и считали подверженными высокому риску развития кровотечений при повреждениях. Сотрудники, осуществляющие уход за животными, могли с легкостью идентифицировать таких собак, поскольку повреждение, связанное с проколом вены (венепункцией), у таких собак продолжается в течение определенного времени после взятия образца крови. В контрольной группе 6 из 8 (75%) собак по уровню тромбоцитов были отнесены к тяжелой категории. Только 2/8 (25%) вакцинированных собак по подсчету тромбоцитов были отнесены к тяжелой категории. Статистически эта разница была не значимой (p=0,0768). Однако смерть по меньшей мере одной из контрольных собак подтвердила эти данные, поскольку собака умерла на ранних этапах данного исследования от проявлений тяжелой тромбоцитопении. Если бы эта собака не умерла, можно было бы сделать заключение, что по меньшей мере у 7/8 контрольных животных развивалась тяжелая тромбоцитопения. Поскольку смертность является значительно более тяжелым клиническим признаком, чем тромбоцитопения, основной вариабельный параметр был пересмотрен, и в качестве основного вариабельного параметра была принята тромбоцитопения или смертность. Если учитывать смертность, разница между контрольными и вакцинированными животными становится значимой (p=0,0213).

Таблица 8 Сводка результатов по тромбоцитам
Класси-фикация	Умеренная выраженность	Аномально низкий уровень*	Клинически значимый уровень
	Процент собак с тромбоцитопенией, определяемой согласно протоколу (<50% от базового уровня)	Процент собак с уровнем тромбоцитов <200*	Процент собак с уровнем тромбоцитов ≤100 в течение более чем одного дня
Контроль	100% (8/8)	100% (8/8)	75% (6/8)
Вакцини-рованные	63% (5/8)	63% (5/8)	25% (2/8)
* В соответствии с Руководством Merck по тромбоцитопении

Эритроциты (красные клетки крови, или RBC): На фигуре 2 представлены данные по усредненному счету эритроцитов в период после контрольного заражения. На фигуре 2 показано, что средний показатель в контрольной группе собак был ниже нормы в течение большей части периода настоящего испытания, тогда как средний показатель в группе вакцинированных животных в течение большей части периода данного испытания оставался в пределах нормы. В таблице 9 проиллюстрирована тяжесть контрольного заражения, поскольку 100% контрольных собак соответствовали определению анемии, согласно Руководству Merck, и у 63% наблюдалась прогрессия в развитии тяжелой категории. Ни у одной из вакцинированных собак не развивалась тяжелая категория анемии. Эта разница оказывается весьма значимой (p=0,0081).

Таблица 9 Сводка результатов по эритроцитам (RBC)
Классификация	Аномально низкий уровень*	Клинически значимый уровень
	Процент собак с уровнем RBC<5,5×106/мкл	Процент собак с уровнем RBC≤4,0×106/мкл в течение более чем одного дня
Контроль	100% (8/8)	63% (5/8)
Вакцинированные	50% (4/8)	0%
* В соответствии с определением анемии, согласно Руководству Merck

Лейкоциты (белые клетки крови, или WBC): На фигуре 1 суммированы результаты подсчета лейкоцитов за период после контрольного заражения. На фигуре 1 представлена тяжелая степень уменьшения количества лейкоцитов, наблюдаемого у контрольных животных. Полученные данные суммированы в таблице 10, при этом у собак наблюдается значительная разница между группами как в отношении умеренной, так и в отношении тяжелой лейкопении. У 38% собак в контрольной группе наблюдалось прогрессирование в сторону развития лейкопении "тяжелой категории", тогда как ни у одной из вакцинированных собак она не развивалась. Указанная разница не является значимой (p=0,0822). В таблице 10 и на фигуре 1 проиллюстрирована разница между средними значениями у вакцинированных и контрольных животных. Среднее значение в контроле падает ниже минимального уровня для нормы, в отличие от среднего значения в случае вакцинированных животных. Такая тенденция свидетельствует о том, что при большем количестве животных в каждой из исследуемых групп разница между группами, вероятнее всего, была бы значимой.

Таблица 10 Сводка результатов по лейкоцитам (WBC)
Классификация	Аномально низкий уровень*	Клинически значимый уровень
	Процент собак с уровнем WBC<6×103/мкл	Процент собак с уровнем WBC≤4,5×103/мкл в течение более чем одного дня
Контроль	88% (7/8)	38% (3/8)
Вакцинированные	50% (4/8)	0%
*В соответствии с определением лейкопении в Руководстве Merck

Оценка уровней гемоглобина: На фигуре 3 суммированы результаты количественного определения гемоглобина за период после контрольного заражения. В соответствии с другими параметрами крови, на фигуре 3 показано, что среднее значение в контроле падает ниже минимальных уровней в течение большей части периода после контрольного заражения. В группе вакцинированных животных среднее значение никогда не опускалось ниже нормы. В таблице 11 показано, что 100% контрольных собак имели низкие уровни гемоглобина, тогда как только у 50% вакцинированных животных этот показатель падал до такого уровня. Ни у одного из вакцинированных животных не наблюдалось прогрессирования в направлении тяжелой категории в отношении уровней гемоглобина. Однако только у 25% контрольных животных наблюдалось прогрессирование в направлении тяжелой категории, и полученная разница оказалась не значимой (p=0,2118).

Таблица 11 Сводка результатов по содержанию гемоглобина
Классификация	Аномально низкий уровень*	Клинически значимый уровень
	Процент собак с уровнем Hgb<12 г/дл	Процент собак с уровнем Hgb≤8 г/дл в течение более чем одного дня
Контроль	100% (8/8)	25% (2/8)
Вакцинированные	50% (4/8)	0%
*В соответствии с определением анемии в Руководстве Merck

Процентное содержание гематокрита: На фигуре 4 суммированы результаты определения уровней гематокрита за период после контрольного заражения. Как и в случае других показателей анемии, на фигуре 4 показано, что среднее значение в контроле падает существенно ниже нормы в течение второй половины периода после контрольного заражения, тогда как среднее значение у вакцинированных собак никогда не опускается ниже нормы. В таблице 12 показано, что вакцинация собак тестируемым продуктом наполовину снижает количество случаев анемии, если судить по гематокритному числу. У шестидесяти трех процентов (5/8) контрольных собак по уровню гематокрита наблюдалось прогрессирование в сторону тяжелой категории, в то время как только 1/8 собак в вакцинированной группе (13%) имела неблагоприятный показатель. Эта разница была очень близка к значимой (p=0,0534).

Таблица 12 Сводка результатов по содержанию гематокрита
Классификация	Аномально низкий уровень*	Клинически значимый уровень
	Процент собак с уровнем Hct <37%	Процент собак с уровнем Hct≤28% в течение более чем одного дня
Контроль	100% (8/8)	63% (5/8)
Вакцинированные	50% (4/8)	13% (1/8)
*В соответствии с определением анемии в Руководстве Merck

Клинические признаки: Ежедневно каждую собаку осматривали на предмет обнаружения клинических признаков тяжелой инфекции. Результаты суммированы в таблице 13. Оценка клинических признаков была основана на слепых наблюдениях персонала, осуществляющего осмотр собак на предмет обнаружения признаков депрессии, выделений из носа, выделений из глаз, кровотечения, дегидратации и смерти. Оценка при каждом осмотре производилась с учетом [пропорционально] степени тяжести клинических признаков. Общая оценка для контрольной группы составила 254 [балла] вместо 28 для группы вакцинированных животных. Средняя оценка для контрольной и вакцинированной групп составила 32 и 4, соответственно. Несмотря на появление весьма заметного защитного эффекта, разница между группами не была значимой (p=0,4364).

Таблица 13 Сводка по результатам клинической оценки
Группа	Общая оценка	Среднее значение	Срединное значение
Контроль	254	32	5
Вакцинированные	28	4	1

Ректальная температура: Ректальную температуру измеряли и записывали два раза в неделю. Считалось, что собаку лихорадит в том случае, если ее температура составляла >39,5 градусов Цельсия. Это соответствует Руководству по ветеринарии, Merck, в котором нормальная температура указана в интервале 38,9±0,5 градусов Цельсия. Известно, что инфекция E. canis вызывает вспышки температуры у пораженных собак. Наблюдения, проведенные в данном исследовании, это подтверждают, и полученные результаты суммированы в таблице 14. Вспышки температуры наблюдались у 87,5% (7/8) контрольных животных и у 50% (4/8) вакцинированных. Проводили статистическую оценку различий в подъемах температуры. У двадцати пяти процентов (2/8) контрольных животных температура держалась в течение двух или более дней, тогда как в группе вакцинированных собак этот процент составил лишь 12,5% (1/8). Это различие оказалось незначимым (p=0,6709).

Таблица 14 Суммарные данные по ректальной температуре
Группа	Процент собак с температурой	Процент собак с температурой в течение нескольких дней
Контроль	87,5% (7/8)	25% (2/8)
Вакцинированные	50% (4/8)	12,5% (1/8)
*Температурой считается ректальная температура ≥39,5°C

Реактивность на месте инъекции при контрольном заражении: Собак обследовали на предмет обнаружения реактивности на месте инъекции при контрольном заражении. Ни у одной из 16 собак из группы вакцинированных или из контрольной группы не было обнаружено никаких признаков реактивности на месте введения инъекции при контрольном заражении.

Результаты ПЦР-детектирования E. canis в крови: Образцы крови отбирали для ПЦР-анализа с целью определения инфекции E. canis непосредственно перед контрольным заражением. Результаты ПЦР представлены в таблице 15. Как и ожидалось, все собаки перед контрольным заражением оставались негативными в отношении инфекции E. canis. Результаты еженедельного анализа ПЦР крови в отношении инфекции E. canis после контрольного заражения представлены в таблице 15. Все контрольные собаки были позитивными в отношении E. canis в крови более чем в одной временной точке. У трех из вакцинированных собак методом ПЦР ни разу не удалось детектировать E. canis. Эти результаты в точности соответствуют результатам, полученным в отношении тромбоцитов, поскольку у этих же самых собак после контрольного заражения не развивалась тромбоцитопения. Разница между контрольными и вакцинированными животными в отношении позитивного результата была недостоверной (p=0,0822).

Таблица 15 Процент животных, инфицированных E. canis после контрольного заражения, на основании ПЦР
			Нед.1	Нед.2	Нед.3	Нед.4	Нед.5	Нед.6	Нед.7	Нед.8
Группа обработки		День 42	День 49	День 56	День 63	День 70	День 77	День 84	День 91	День 98
Контроль	% позитивных	0%	0%	0%	50%	88%	100%	100%	75%	75%
Вакцини-рованные	% позитивных	0%	0%	0%	50%	63%	63%	63%	50%	63%

Серология после контрольного заражения: Серологический анализ проводили каждые две недели после контрольного заражения. Результаты серологического анализа у вакцинированных собак отвечают на вопрос, действительно ли собаки в этой группе, которые по результатам ПЦР были негативными и у которых не развивались клинические признаки, включая тромбоцитопению после контрольного заражения, были в действительности подвержены действию E. canis. В некоторой точке после 42-го дня (день контрольного заражения) у всех трех указанных собак происходил быстрый рост титра, что указывает на их восприимчивость к материалу контрольного заражения. Суммарные усредненные данные по серологии представлены в таблице 5. В данном исследовании не понятна соотносимость титра антител с защитным действием. Вероятно, серологический анализ является хорошим индикатором подверженности вирулентной E. canis.

Результаты вскрытия: Вскрытие всех собак осуществляли во время эвтаназии, и персонал, осуществлявший вскрытие, делал это вслепую [то есть не был осведомлен о том, в какую группу входит та или иная собака]. Для большей части собак это происходило на восьмой неделе после контрольного заражения. Вскрытие тех собак, которых пришлось умерщвлять раньше из-за множества клинических признаков, осуществляли сразу же посмертно. Собак вскрывали и оценивали сразу же после эвтаназии. Спленомегалия является одним из наблюдений, которое может быть четко ассоциировано с инфекцией E. canis. Вакцинация, по-видимому, оказывает влияние на спленомегалию (таблица 16). Ни у одной из вакцинированных собак не наблюдалось спленомегалии, в отличие от 38% (3/8) случаев в контроле. Эта разница была незначимой (0,0822). У собак, которые были подвергнуты эвтаназии до окончания 8-недельного испытания, обслуживающие ветеринары единодушно отмечали накопление жидкости в брюшной полости. Поскольку низкие уровни сывороточного альбумина приводят к осмотическому дисбалансу между кровообращением и тканями, результатом этого может быть накопление жидкости в брюшной полости. На остальной период испытаний были заказаны химические панели для образцов крови, отбираемых раз в две недели и отсылаемых на тестирование. Результаты указанных тестов в отношении уровней сывороточного альбумина суммированы в таблице 17. У половины контрольных животных (4/8) при вскрытии обнаруживалось значительное накопление жидкости в брюшной полости. Среди контрольных животных, у которых обнаруживалось накопление жидкости, у 50% был отмечен высокий рейтинг тех, у кого накапливалось более чем 200 мл жидкости. Ни у одного из вакцинированных животных не было обнаружено накопления жидкости (таблица 16). Эта разница оказалась незначимой (p=0,2118). Имела место интересная корреляция между уровнями сывороточного альбумина и количеством тромбоцитов. У всех собак, у которых развивалась тромбоцитопения, уровни альбумина были ниже нормы. По-видимому, вакцинация определенно оказывала влияние на уровни сывороточного альбумина, поскольку у 6 из 8 животных в контроле (75%) концентрация альбумина в сыворотке падала более чем на 75% по отношению к его минимальному значению в норме, тогда как только у 3 из 8 (25%) вакцинированных животных его содержание падало до указанного уровня (таблица 17).

Таблица 16 Суммарные данные по результатам вскрытия
Внешний вид	Абдоми-нальная жидкость	Селезенка	Легкие	Желудок	Нисходящая ободочная кишка	# Общая оценка при вскрытии
Процент затронутых болезнью контрольных собак
38%	50%	38%	13%	38%	0%	26
Процент затронутых болезнью вакцинированных собак
25%	0%	0%	13%	50%	38%	18
# Общая оценка при вскрытии 8 животных в каждой группе

Таблица 17 Суммарные результаты по сывороточному альбумину
Классификация	Аномальный уровень	Клинически значимый уровень
	Процент собак с альбумином в сыворотке <2,5%*	Процент собак с альбумином в сыворотке <1,9 в течение более одного дня
Контроль	100% (8/8)	50% (4/8)
Вакцинированные	75% (6/8)	38% (3/8)
* В соответствии с нижним пределом, определяемым в Руководстве Merck ** "Клинически значимый" уровень определяется как 75% от минимального значения в течение более чем однодневного периода

Суммарная таблица по всем результатам: В попытке охватить всю картину по полученным комплексным результатам создали суммарную таблицу (таблица 18). В указанной таблице для каждого измеряемого в данном испытании параметра рассмотрены только клинически значимые (серьезные) оценки. Средняя оценка степени тяжести в контроле составляет 14,6, а у вакцинированных животных 3,5. Такая значительная разница подчеркивает эффективность тестируемого продукта у всех вакцинированных, в отличие от контрольных, животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ:

Контрольное заражение было эффективным и более сильным, чем ожидалось, поскольку у 100% контрольных животных развивалась тромбоцитопения, появлялись высокие титры [антител] против E. canis, серьезные клинические признаки, потеря веса, и двух собак из этой группы пришлось подвергнуть эвтаназии.

Если учитывать поправку на смертность, здесь было показано, что случаи тяжелой тромбоцитопении, основного отличия, реже встречаются у вакцинированных, чем у контрольных животных, и что разница между ними является значимой (p=0,0213).

По-видимому, вакцинация влияет на смертность, поскольку после контрольного заражения эвтаназии из соображений гуманности было подвергнуто 25% контрольных животных и ни одно животное из группы вакцинированных.

Серьезную потерю веса испытывали собаки в контрольной группе, при этом некоторые из них теряли почти 25% веса их тела в течение восьми недель после контрольного заражения. Случаев серьезной потери веса было меньше у вакцинированных, чем у контрольных животных, и эта разница была исключительно значимой (p=0,0042).

Разница между вакцинированными и контрольными животными по другим показателям крови, которые достигают серьезных уровней, были недостаточно значимы, хотя по некоторым показателям и были очень близки к тому. В их число входят эритроциты (WBC) (p=0,08221), гематокрит (p=0,0534) и гемоглобин (p=0,2118).

ПЦР-детектирование E. canis в крови в точности соответствовало результатам, полученным в случаях тромбоцитопении.

Три собаки из группы вакцинированных никогда не проявляли никаких клинических признаков инфекции, и у них в крови методом ПЦР не обнаруживали детектируемого уровня E. canis. Однако серологические анализы свидетельствуют о том, что у трех указанных собак после контрольного заражения, по-видимому, развивался вторичный иммунный ответ (анамнестическая реакция) на E. canis, что указывает на то, что они были подвержены действию вирулентного материала контрольного заражения.

Накопление жидкости в брюшной области в результате серьезного дефицита альбумина в крови было обнаружено только у контрольных собак, но не у вакцинированных.

Клинические признаки, включая депрессию, выделения из носа, выделения из глаз, носовые кровотечения, дегидратацию и смерть, были наиболее серьезными у контрольных собак по сравнению с вакцинированными, однако разница между указанными группами оказалась незначимой (p=0,4364).

Подъемы ректальной температуры после контрольного заражения чаще происходили у контрольных собак.

Ни инъекции при вакцинации, ни инъекции при контрольном заражении не вызывали у собак каких бы то ни было заметных реакций.

При вскрытии спленомегалия наблюдалась только в контрольной группе.

Полученные результаты подтверждают эффективность вакцины согласно настоящему изобретению.

Таблица 18 Суммарные результаты оценки из категории серьезных
Группа обработки	Потеря веса	WBC	RBC	PCV	Гемо-глобин	Тром- боциты	Смерт- ность	Лихо- радка	Абдоми-нальная жидкость	Сплено-мегалия	Альбу- мин	ПЦР ±	# Общая оценка
Контроль	21	9	15	15	6	18	да	4	6	3	12	8	117
Вакциниро-ванные	3	0	0	3	0	6	Нет	2	0	0	9	5	28
Потеря веса -> 15% веса тела=3 WBC (лейкоциты) - в течение двух или более дней ≤4,5×103/мкл=3 RBC (эритроциты) - в течение двух или более дней ≤4,0×106/мкл=3 Гематокрит/PCV - в течение двух или более дней ≤28%=3	Гемоглобин - в течение двух или более дней ≤8 г/дл=3 Тромбоциты - в течение двух или более дней ≤100×103/мкл=3 Лихорадка - температура ≥39,5 - в течение двух или более дней=2 Абдоминальная жидкость -> 200 мл=3	Спленомегалия - да=1 Альбумин - в течение двух или более дней ≤1,9 г/дл=3 ПЦР - хотя бы один положительный результат в течение всего исследования=1 # Общая оценка по 8 животным в каждой группе

Следует иметь в виду, что данное изобретение не ограничено рамками конкретных установок, стадий процесса и описанных здесь материалов, и, так же как и сами указанные установки, стадии процесса и материалы, они могут несколько варьировать. Следует понимать также и то, что используемая здесь терминология используется лишь в целях описания частных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем, охватываемый настоящим изобретением, ограничен только прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

1. Вакцинная композиция против моноцитарного эрлихиоза собак, содержащая эффективное иммунизирующее количество инактивированной Ehrlichia canis (Е. canis); причем вакцина включает неполярный растворитель, который включает липофильный адъювант; причем Е. canis инактивирована формалином; причем неполярный растворитель представляет собой систему хлороформных растворителей; и причем инактивированная Е. canis вызывает защитный иммунный ответ, но при этом вызывает минимальный гуморальный ответ у пациента, когда указанную вакцину вводят в качестве первичной вакцины.

2. Вакцинная композиция по п. 1, где Е. canis выращена в клетках собаки.

3. Вакцинная композиция по п. 2, где клетки собаки представляют собой клетки костного мозга собаки.

4. Вакцинная композиция по п. 2, где клетки собаки имеют в АТСС номер доступа No. РТА-10545.

5. Вакцинная композиция по п. 1, где указанный адъювант содержит 6,6′-димиколят трегалозы.

6. Вакцинная композиция по п. 1, в которой система хлороформных растворителей содержит приблизительно 65-95% хлороформа объем/объем.

7. Вакцинная композиция по п. 6, в которой указанная система хлороформных растворителей содержит приблизительно от 5,0 до 30% метанола объем/объем.

8. Вакцинная композиция по п. 7, в которой система хлороформных растворителей содержит приблизительно 90% хлороформа : 10% метанола : 1,0% воды, объем/объем, соответственно.

10. Вакцинная композиция по п. 4, в которой адъювант содержит 6,6′-димиколят трегалозы, растворенный в смеси хлороформ : метанол : вода 90:10:1.