Способ прогнозирования осложненного течения внебольничной пневмонии у детей



Владельцы патента RU 2603476:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования развития осложненного течения внебольничной пневмонии у детей. Для этого исследуют прирост индуцированной S. pneumonae выработки in vitro цитокинов: интерлейкина 1 (IL1, пг/мл), фактора некроза опухолей α (TNFα, пг/мл), интерферона γ (IFN γ, пг/мл), интерлейкина 17 (IL17, пг/мл), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF, пг/мл), хемокина МСР1 (monocyte chemotactic protein-1, пг/мл). При увеличении после стимуляции концентрации интерлейкина 1 (IL 1), фактора некроза опухолей α (αTNF) и), интерферона γ (γIFN) в 1,5 и более раз диагностируют типичное течение внебольничной пневмонии. При отсутствии прироста IL 1 и αTNF и увеличении выработки интерферона γ (γIFN), интерлейкина 1 (IL 17), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и хемокина МСР1 в 1,5 и более раз - прогнозируют развитие осложнений у детей, больных внебольничной пневмонией. Изобретение позволяет повысить эффективность прогнозирования осложненного течения внебольничной пневмонии у детей путем определения иммунологических показателей, что дает возможность определить адекватную тактику ведения для сокращения сроков лечения больного. 2 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, пульмонологии, клинической иммунологии.

Несмотря на совершенствование методов профилактики, диагностики и лечения, до настоящего времени существенных тенденций к снижению удельного веса внебольничных пневмоний (ВП) в заболеваемости детского населения не отмечается [5]. Хотя появилось достаточно много высокоактивных антибиотиков, проблема легочно-плевральных осложнений при ВП сохраняется, при этом первичные симптомы при неосложненной и осложненной пневмонии идентичны [2, 3]. Поэтому поиск ранних маркеров осложненного течения внебольничной пневмонии у детей является актуальным.

Одним из таких показателей является уровень цитокинов. При развитии системной воспалительной реакции (острофазового ответа) цитокины оказывают влияние практически на все органы и системы организма, участвующие в регуляции гомеостаза. Синтез цитокинов сопровождает главные процессы развития защитных реакций, по их появлению в биосредах можно оценить активацию иммунитета. Увеличение концентрации цитокинов безусловно означает, что местная защита не справилась с патогеном и требуется включение системной воспалительной реакции, а повышение уровня цитокинов в плазме крови зачастую опережает клинические проявления заболевания [4]. При этом концентрация цитокинов в крови отражает текущее состояние иммунной системы, а индуцированная продукция цитокинов лимфоцитами периферической крови отражает функциональное состояние клеток и состояние баланса/дисбаланса в цитокиновой системе [1].

В настоящее время проводится разработка прогнозных моделей с небольшим числом наиболее значимых для диагноза переменных, выделение предикторов развития пневмонии для разных уровней оказания медицинской помощи.

Известен способ прогноза развития осложнений пневмонии по данным интегральной оценки биохимических маркеров воспаления (прокальцитонина, фактора некроза опухолей и С-реактивного белка) на основе дискриминантного уравнения прогностической вероятности [RU 2444017 С1 03.12.2010].

Известен способ прогнозирования особенностей течения острых пневмоний на основании комплекса информативных лабораторных показателей и расчетом логистической модели [RU 2084892 С1 14.09.1992].

Известен способ прогноза развития осложнений пневмонии по данным анамнеза по 5-балльной шкале с расчетом прогностической вероятности [RU 2290075 С1 27.06.2005].

Однако в клинической практике это довольно сложные расчеты для постоянного использования без сопутствующего программного обеспечения.

Прототипом избран способ определения тяжести течения внебольничной пневмонии, включающий определение показателей реактивной способности иммунокомпетентных клеток крови с определением системного уровня цитокинов (IL-2, IL-8, α-TNF), и по уровню цитокинов проводят оценку тяжести течения пневмонии [RU 2302637 С1 03.11.2005].

Известный способ имеет следующие недостатки:

1. Алгоритм разработан для юношей, в возрасте от 18 до 21 года, проживающих в организованном коллективе. У детей в различные периоды нормативные показатели цитокинов могут различаться, поэтому невозможно рассчитать статистические уравнения, подходящие для всех возрастных групп;

2. Очень сложно оценить активность механизмов иммунологической защиты иммунной системы по абсолютному показателю цитокина.

Целью изобретения является улучшение диагностики, упрощение интерпретации данных и повышение точности прогноза развития осложнений внебольничной пневмонии у детей с использованием уровня прироста цитокинов в ответ на стимуляцию лимфоцитов.

Технический результат достигается тем, что лимфоциты периферической крови, стимулированные микроорганизмом S. pneumonae, который в 70-88% является этиологическим фактором заболевания [2], демонстируют наличие/отсутствие сдвигов в выработке цитокинов: интерлейкина 1 (IL-1), фактора некроза опухолей α (α-TNF), интерферона γ (γ-IFN), интерлейкина 17 (IL-17), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), хемокина МСР-1 в индуцированной крови in vitro.

Положительный эффект: способ позволяет прогнозировать осложненное течение внебольничной пневмонии у детей на ранней стадии заболевания, что дает возможность определять тактику лечебно-диагностических мероприятий.

Нами не встречено информации об использовании изменений концентрации VEGF и хемокина МСР1 при прогнозировании клинического течения заболеваний бактериальной этиологии у детей, хотя имеются данные об увеличении его экспрессии под влиянием проангиогенных факторов, включая гипоксию.

Способ осуществляется следующим образом.

Для определения спонтанной выработки цитокинов из пробирки с подготовленной кровью (венозная кровь с питательной средой RPMI 1640 в соотношении 1:10) отбирают в первую пробирку 1,0 мл крови и добавляют 0,3 мл среды RPMI 1640. Для определения индуцированной выработки цитокинов из пробирки с подготовленной кровью отбирают 1,0 мл крови во вторую пробирку и добавляют 0,3 мл рабочего раствора S.pneumoniae (серотип 7, 11; штаммы 7С и 11AD) (концентрация рабочего раствора - 106 KOE/мл по стандарту мутности; конечная концентрация - 3*105 KOE/мл). В термостате инкубируют пробирки с кровью в течение 5 часов при температуре 37°С. Центрифугируют пробирки с кровью (800 g) в течение 5 минут.

Затем определяют содержание цитокинов в супернатанте спонтанной и индуцированной крови иммуноферментным методом с помощью наборов ЗАО Вектор-БЕСТ (Россия, г. Новосибирск), и при увеличении концентрации каждого из цитокинов: IL-1, γ-IFN и α-TNF в 1,5 и более раза диагностируют типичное течение внебольничной пневмонии, при отсутствии прироста IL-1 и α-TNF и увеличении в 1,5 и более раз выработки γ-IFN, IL-17, VEGF и МСР-1 - прогнозируют развитие осложнений у детей, больных внебольничной пневмонией.

Для раскрытия сущности изобретения приведены результаты исследования цитокинового статуса у 84 детей с неосложненным течением внебольничной пневмонии и у 24 детей с внебольничной пневмонией осложненной плевритом. В связи с тем, что не у всех рядов было нормальное распределение полученные результаты представлены в виде Me (Q25-Q75), где Me - значение медианы, Q25-Q75 - значения 25-го и 75-го квартилей (табл. 1). Как видно из таблицы, имеются характерные для каждой группы больных изменения в выработке цитокинов: у пациентов с неосложненной ВП индуцированная продукция провоспалительных IL-1, α-TNF и γ-IFN увеличивалась в 1,5 и более раз, по сравнению с детьми с осложненным течением заболевания, где отсутствовал прирост выработки IL-1 и α-TNF, но повысилась в 1,5 и более раз выработка γ-IFN, VEGF, МСР-1 и IL-17.

Т.е. у детей с неосложненной ВП индуцирование иммунокомпетентых клеток цельной крови приводит к увеличению секреции цитокинов «первого поколения» - IL-1, α-NF и γ-FN, в свою очередь, при осложненном течении заболевания превалирует выработка цитокинов «второго поколения» - VEGF, МРС-1 и IL-17.

Способ прост и объективен, обладает высокой информативностью для дифференциальной диагностики развития осложнений у больных с ВП.

Пример 1.

Пациентка Оля Е., 9 лет. Поступила с жалобами: на повышение температуры тела до фебрильных цифр, головные боли, слабость, бледность, повышенную потливость. Состояние при поступлении средней тяжести за счет интоксикационного синдрома. Кожные покровы чистые, бледные, периорбитальный цианоз. Тоны сердца громкие, ритмичные, шума нет, ЧСС 82 в минуту. Аускультативно в легких дыхание жесткое, хрипов нет, ЧД - 25 в мин.

Исследование уровня цитокинов: IL-1 спонтанная выработка - 170,48 пг/мл, индуцированная - 261,35 пг/мл, α-TNF спонтанная - 22,8 пг/мл, индуцированная - 43,76 пг/мл, γ-IFN спонтанная - 2,4 пг/мл, индуцированная - 4,1 пг/мл, IL-17 спонтанная - 1,55 пг/мл, индуцированная - 1,41 пг/мл, VEGF спонтанная - 12,19 пг/мл, индуцированная - 0 пг/мл, МСР-1 спонтанная - 225,36 пг/мл, индуцированная - 202,82 пг/мл.

Диагноз: Пневмония внебольничная, правосторонняя, очаговая нижнедолевая S9,10, острого течения, неуточненной этиологии, средней степени тяжести, неосложненная. Ребенок на 12 день выписан из стационара.

Пример 2.

Ребенок Эдуард Ч., 5 лет. Поступил с жалобами на малоэффективный кашель, повышение температуры тела до фебрильных цифр.

Состояние при поступлении тяжелое, обусловленное интоксикационным синдромом, дыхательной недостаточностью. Кожные покровы чистые, бледные. Тоны сердца громкие, ритмичные, ЧСС 110 в минуту. Аускультативно в легких дыхание жесткое, ослаблено слева в нижних отделах, там же выслушиваются единичные мелкопузырчатые хрипы. ЧД 26 в минуту.

Исследование уровня цитокинов: IL-1 спонтанная выработка - 260,48 пг/мл, индуцированная - 266,43 пг/мл, α-TNF спонтанная - 248,3 пг/мл, индуцированная - 247,11 пг/мл, γ-IFN спонтанная - 3,5 пг/мл, индуцированная - 5,4 пг/мл, IL-17 спонтанная - 0,56 пг/мл, индуцированная - 1,41 пг/мл, VEGF спонтанная - 0 пг/мл, индуцированная - 2,23 пг/мл, МСР-1 спонтанная - 402,64 пг/мл, индуцированная - 1682,0 пг/мл.

На 7 день заболевания внебольничная пневмония осложнилась фибринозным плевритом слева.

Ребенок выписан на 20 день с диагнозом: Пневмония внебольничная, очаговая, в нижней доле слева, острого течения, смешанной этиологии (микоплазма, пневмококк), тяжелого течения. Синпневмонический плеврит слева.

Метод апробирован в клинике НИИ ОМИД. Результаты проверки заявленного способа показали его эффективность. Правильный прогноз определялся в 85,5% случаев.

Таким образом, предлагаемый способ может быть использован в педиатрической практике для развития осложнений у детей, больных внебольничной пневмонией.

Источники информации

1. Аллергия у детей: от теории - к практике / под ред. Л.С. Намазовой-Барановой. - М.: Союз педиатров России, 2010-2011. - 668 с.

2. Внебольничная пневмония у детей: распространенность, диагностика, лечение и профилактика / научно-практическая программа. - М.: Оригинал-макет, 2012. - 64 с.

3. Минаева Н.В. Дифференциально-диагностические критерии пневмонии в условиях реальной клинической практики // Пульмонология детского возраста: проблемы и решения / под ред. Ю.Л. Мизерницкого. - Выпуск 14. - М.: ИД «МЕДПРАКТИКА-М». - 2014. - С. 94-95.

4. Симбирцев А.С. Цитокины: классификация и биологические функции. // Цитокины и воспаление. - 2004. - Т. 3. - №2. - С. 16-23.

5. Таточенко В.К. Пневмония у детей: диагностика и лечение. // Лечащий врач. - 2008. - №8. - С. 5-9.

Способ диагностики развития осложненного течения внебольничной пневмонии у детей, включающий определение концентрации цитокинов интерлейкина 1 (IL1, пг/мл), фактора некроза опухолей α (TNFα, пг/мл), интерферона γ (IFN γ, пг/мл), интерлейкина 17 (IL17, пг/мл), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF, пг/мл), хемокина МСР1 (monocyte chemotactic protein-1, пг/мл) в спонтанной и индуцированной S. pneumonae крови, отличающийся тем, что при индуцированной in vitro выработки лимфоцитами цитокинов приросте концентрации интерлейкина 1 (IL1), фактора некроза опухолей α (αTNF) и интерферона γ (γIFN) в 1,5 и более раз диагностируют типичное течение внебольничной пневмонии, при отсутствии прироста интерлейкина 1 (IL1) и фактора некроза опухолей α (αTNF) и увеличении выработки интерферона γ (γIFN), интерлейкина 17 (IL17), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), хемокина МСР1 (monocyte chemotactic protein) в 1,5 и более раз - прогнозируют развитие осложнений у детей, больных внебольничной пневмонией.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для проведения иммуносупрессивной терапии после трансплантации печени детям раннего возраста.

Данное изобретение относится к области иммунологии. Предложена клеточная линия DSM АСС3076 и полученное из нее моноклональное антитело.

Данное изобретение относится к области иммунологии. Представлены моноклональное антитело и его фрагмент, которые связываются с K11-связанным полиубиквитином, охарактеризованные аминокислотными последовательностями гипервариабельных участков (HVR).

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для выбора тактики лечения у больных впервые выявленным инфильтративным туберкулезом легких.

Изобретение относится к области медицины, а именно к отоларингологии, и может быть использовано для дифференциальной экспресс-диагностики острых вирусных и бактериальных тонзиллитов у взрослых.

Изобретение относится к медицине, в частности - к кардиологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования аспиринорезистентности у больных артериальной гипертонией с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений, длительно принимающих аспирин в профилактической дозе.
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для доклинического определения противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике. Через 3-4 недели после трансплантации печени в плазме крови у детей измеряют концентрацию трансформирующего фактора роста бета 1 (TGF-β1) в нг/мл.

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики степени тяжести атаки у пациентов с болезнью Крона. Сущность способа заключается в том, что определяют скорость оседания эритроцитов (СОЭ), концентрацию С-реактивного белка (СРБ), уровень васкулоэндотелиального фактора (ВЭФ) в сыворотке, рассчитывают количество десквамированных эндотелиоцитов (ДЭЦ) в плазме крови, оценивают концентрацию микроальбумина (МАУ) в моче.

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и касается диагностирования преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты (ПОНРП), вызванной воспалением.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано в технологии изготовления референс-панели сывороток, содержащих антигены и антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности тест-систем иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных и иммуноблотов. Способ получения референс-панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для серологической диагностики маркеров ВИЧ-1, включает отбор иммуноспецифических сывороток, содержащих антитела ко всем основным антигенам вируса и имеющих разную концентрацию этих антител, а также отбор нативных донорских сывороток с нулевым титром. Отбор сывороток для панелей производят по результатам их исследования методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на наличие инфекционного материала и титрования в подтверждающем анализе, тестируют вирусную нагрузку в реактивных сыворотках и в качестве иммуноспецифических сывороток выбирают только те сыворотки, которые в процессе титрования закономерно уменьшают величину оптической плотности (ОП) в ИФА и величину аналитического сигнала в ОТ ПЦР, которые затем аттестуют на количественное содержание в них РНК ВИЧ-1. В качестве донорских сывороток с нулевым титром выбирают только те, которые имеют отрицательный результат в ОТ-ПЦР и в ИФА - значение ОП<ОПкр для всех серологических маркеров. Отобранные реактивные сыворотки развитой стадии ВИЧ-1 инфекции разводят разводящим раствором (РР), не содержащим антитела к тестируемому вирусу, с получением разной концентрации антител ВИЧ-1. Для формирования референс-панели отбирают также 6 сывороток с нулевым титром для контроля специфичности тестов, 12 сывороток с различным титром р24 и 12 сывороток развитой стадии ВИЧ-1 инфекции с титром меньше 1:200, причем часть иммуноспецифических образцов содержат маркеры коинфекции ВИЧ с гепатитами В и С и туберкулеза при общем количестве сывороток в референс-панели не менее 30. Изобретение обеспечивает достоверную оценку качества молекулярных и серологических анализов на стадиях до и в начале сероконверсии в области низких значений оптической плотности, близких к ОПкр, и в присутствии серологических маркеров коинфекции (гепатитов С и В и туберкулеза). 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ количественной оценки силы связывания сенсибилизированной полистироловой микросферы с эукариоцитом линии J-774. Способ включает подготовку культуры адгезированных эукариоцитов J-774, калибровку оптического пинцета, подведение пьезостоликом клетки J-774 к удерживаемой микросфере до их соприкосновения, отведение пьезостолика с автоматической регистрацией динамики взаимодействия между клеткой и микросферой. Прецизионное подведение клетки к микросфере проводится в ручном режиме с пошаговым подведением. Момент контакта микрообъектов устанавливается по наличию на непрерывно регистрируемой силовой кривой изменений, соответствующих показателям достоверности касания. Показатели достоверности касания включают появление на хронограмме сигнала трех инвертированных ступеней повышенной амплитуды в ответ на три последовательных шага столика, а также предшествующее этим признакам изменение амплитуды броуновских смещений микросферы. Величина силы отрыва микросферы от клетки вычисляется автоматически по амплитуде характерного скачка на силовой кривой. Изобретение обеспечивает улучшение контроля над количественной оценкой силы связывания сенсибилизированных микросфер и фиксированных макрофагов, повышение точности изменения параметров, характеризующих упомянутую силу. 2 ил., 3 пр.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ определения болевого синдрома при полинейропатии у больных вибрационной болезнью, включающий забор венозной крови, получение сыворотки крови и определение в ней количественного содержания серотонина. Согласно изобретению дополнительно в сыворотке крови определяют содержание уровня меди методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии и при выявлении снижения уровня меди в сыворотке крови менее 0,7 мкг/л, а уровня серотонина ниже 30 нг/мл определяют наличие болевого синдрома, связанного с полинейропатией у больных вибрационной болезнью. Осуществление изобретения обеспечивает своевременную диагностику болевого синдрома, связанного с полинейропатией у больных вибрационной болезнью, а также позволяет исключить субъективную оценку при постановке диагноза. 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики POEMS-синдрома у больных множественной миеломой или ангиофолликулярной гиперплазией лимфатических узлов. Способ включает биопсию ткани пораженного органа и окраску срезов лимфатического узла гематоксилином и эозином. Далее проводят подсчет на них CD138+ плазматических клеток. Дополнительно рассчитывают площади кровеносных сосудов относительно всей площади обзора среза, и при превышении этого показателя 30% площади обзора среза диагностируется POEMS-синдром. Использование данного способа позволяет проводить раннюю диагностику POEMS-синдрома у больных множественной миеломой или ангиофолликулярной гиперплазией лимфатических узлов для своевременного назначения химиотерапии. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, может быть использовано для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус кори. Для этого проводят разделение типов иммунного ответа на первичный и вторичный, осуществляя на основании рассчитанных с помощью ROC-анализа пороговых критериев для IgG1 и IgG3 субклассов. Определение количества специфических противокоревых антител, принадлежащих к субклассам IgG1 и IgG3, проводят с помощью ИФА-анализа. При получении пороговых значений для IgG1<45,42% и для IgG3>42% от общего количества противокоревых IgG-антител диагностируют первичный иммунный ответ. При получении пороговых значений для IgG1>45,42% и для IgG3<42% от общего количества противокоревых IgG-антител диагностируют вторичный иммунный ответ. Использование данного способа позволяет осуществлять контроль за качеством противокоревого иммунитета и диагностировать случаи первичных и вторичных вакцинальных неудач. 3 табл., 2 ил.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено антитело к человеческому СD52. Антитело применяется для лечения или диагностики заболеваний, связанных с клетками СD52+, таких как ХЛЛ и другие лейкозы, аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата органа, реакция «трансплантат-против-хозяина». Изобретение позволяет эффективно связывать CD52. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл., 11 пр.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для измерения активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта. Для этого проводят контактирование образца цельной крови, представляющего собой источник лимфоцитов, с одним или более агентами, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета. Измерение присутствия или повышения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток, где присутствие или уровень иммунной эффекторной молекулы показывает уровень клеточно-опосредованной реактивности у субъекта. Группа изобретений относится также к применению агентов, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета, в производстве диагностического анализа клеточно-опосредованной иммунологической реактивности, а также к способу, позволяющему пользователю определить статус клеточно-опосредованной иммунологической реактивности у субъекта. Использование данной группы изобретений позволяет выявлять иммунные дисфункции путем использования системы цельной крови и объединения стимуляторов, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитете, обеспечивая синергетический эффект. 3 н. и 29 з.п. ф-лы, 7 пр., 7 ил.,7 табл.

Изобретение относится к психологии. Диагностику школьной дезадаптации у младших школьников осуществляют путем определения методом РИА уровня АКТГ в сыворотке крови ребенка. При значении уровня АКТГ от 16,90 пкг/мл до 19,30 пкг/мл диагностируют школьную дезадаптацию, а при уровне от 11,1 пкг/мл до 16,5 пкг/мл констатируют школьную адаптацию. Способ диагностики обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса психологических мероприятий за счет простоты, высокой специфичности и быстроты диагностики дезадаптации. 1 пр., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикума для определения концентрации лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями. Для этого получают экспериментальные гипериммунные кроличьи сыворотки путем иммунизации кроликов весом от 2,5 до 3 кг с помощью введения препарата «Альтевир» в дозе 100 мкг по белку в паховый лимфатический узел в количестве 3-х инъекций с интервалом в 14 дней, затем через 14 дней после последней инъекции из крови готовят сыворотки с последующим определением титра антител; выделяют иммуноглобулины из кроличьих сывороток, для этого полученную сыворотку в количестве 4 мл соединяют с 2 мл забуференного физиологического раствора, помещают в центрифужные стаканы, ставят на лед и выливают в них сыворотку при температуре 0°С, затем добавляют забуференный физиологический раствор, перемешивают, вливают метанольную воду, при этом понижая температуру до -5°С, после стакан со смесью ставят в холодильник на 30-40 мин, а затем центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин при нулевой температуре, полученную надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в от исходного объема сыворотки, определяют количество белка по методу Лоури, получая в результате сенситин; готовят полимерный носитель, используя метод анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида в водно-щелочной среде с получением монодисперсных частиц сферической формы диаметром 1,2±0,1 мкм, которые окрашивают сафранином, после этого носитель отмывают дистиллированной водой при 100°С и обрабатывают танином; проводят иммобилизацию сенситина на носитель, для этого суспензию микросфер в количестве 100 мг помещают в центрифужный стакан, суспензируют в 5 мл забуферного физиологического раствора и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 20°С, отмытый носитель суспендируют в 2 мл забуференного физиологического раствора и при постоянном перемешивании соединяют с сенситином в количестве 1,2 мг белка, оставляют для контакта в течение 2-х ч при комнатной температуре, при этом дальнейшую иммобилизацию осуществляют при температуре 4-5°С в течение 16-18 ч; блокируют свободные альдегидные группы путем добавления к суспензии носителя с сенситином 2 мл 0,5% раствора желатозы в забуференном физиологическом растворе при рН 7,1, оставляют на 2 ч при помешивании на электромешалке при комнатной температуре; трижды отмывают полученный диагностикум забуференным физиологическим раствором при рН 7,1, предварительно центрифугируя при 3000 об/мин в течение 10 мин, конечный осадок суспендируют в 8 мл 0,1% раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе при рН 7,1; определяют чувствительность препарата, для этого в лунки планшета вносят 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку первого ряда вносят 50 мкл «Альтевира» с содержанием белка 60 мкл/мл и двукратно титруют до 22-й лунки включительно, причем из последней 22-й лунки удаляют 50 мкл жидкости, 23-я и 24-я лунки служат контролем на спонтанную агглютинацию диагностикума, при этом во все лунки двух рядов вносят по 25 мкл взвеси диагностикума, через 2,5 ч инкубации при комнатной температуре проводят учет результатов реакции визуально, при этом последняя лунка, а именно 19-я, дающая положительный результат - розовый агломерат, разведение которой равно 23,5 пг белка/мл, что соответствует чувствительности диагностического препарата, а активность и специфичность жидкого антигенного препарата проверяют в реакции агломерации объемной (РАО); лиофилизацию диагностикума осуществляют путем суспендирования препарата в 20 мл 3% желатозно-сахарозной среды, затем суспензию разливают в ампулы по 1 мл с последующим высушиванием при комнатной температуре в течение суток. Использование данного диагностикума позволяет определить концентрацию лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями, что дает возможность оценить эффективность лечения. 2 з.п. ф-лы, 7 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикума для определения концентрации лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями. Для этого получают экспериментальные гипериммунные кроличьи сыворотки путем иммунизации кроликов весом от 2,5 до 3 кг с помощью введения препарата «Альтевир» в дозе 100 мкг по белку в паховый лимфатический узел в количестве 3-х инъекций с интервалом в 14 дней, затем через 14 дней после последней инъекции из крови готовят сыворотки с последующим определением титра антител; выделяют иммуноглобулины из кроличьих сывороток, для этого полученную сыворотку в количестве 4 мл соединяют с 2 мл забуференного физиологического раствора, помещают в центрифужные стаканы, ставят на лед и выливают в них сыворотку при температуре 0°С, затем добавляют забуференный физиологический раствор, перемешивают, вливают метанольную воду, при этом понижая температуру до -5°С, после стакан со смесью ставят в холодильник на 30-40 мин, а затем центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин при нулевой температуре, полученную надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в от исходного объема сыворотки, определяют количество белка по методу Лоури, получая в результате сенситин; готовят полимерный носитель, используя метод анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида в водно-щелочной среде с получением монодисперсных частиц сферической формы диаметром 1,2±0,1 мкм, которые окрашивают сафранином, после этого носитель отмывают дистиллированной водой при 100°С и обрабатывают танином; проводят иммобилизацию сенситина на носитель, для этого суспензию микросфер в количестве 100 мг помещают в центрифужный стакан, суспензируют в 5 мл забуферного физиологического раствора и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 20°С, отмытый носитель суспендируют в 2 мл забуференного физиологического раствора и при постоянном перемешивании соединяют с сенситином в количестве 1,2 мг белка, оставляют для контакта в течение 2-х ч при комнатной температуре, при этом дальнейшую иммобилизацию осуществляют при температуре 4-5°С в течение 16-18 ч; блокируют свободные альдегидные группы путем добавления к суспензии носителя с сенситином 2 мл 0,5% раствора желатозы в забуференном физиологическом растворе при рН 7,1, оставляют на 2 ч при помешивании на электромешалке при комнатной температуре; трижды отмывают полученный диагностикум забуференным физиологическим раствором при рН 7,1, предварительно центрифугируя при 3000 об/мин в течение 10 мин, конечный осадок суспендируют в 8 мл 0,1% раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе при рН 7,1; определяют чувствительность препарата, для этого в лунки планшета вносят 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку первого ряда вносят 50 мкл «Альтевира» с содержанием белка 60 мкл/мл и двукратно титруют до 22-й лунки включительно, причем из последней 22-й лунки удаляют 50 мкл жидкости, 23-я и 24-я лунки служат контролем на спонтанную агглютинацию диагностикума, при этом во все лунки двух рядов вносят по 25 мкл взвеси диагностикума, через 2,5 ч инкубации при комнатной температуре проводят учет результатов реакции визуально, при этом последняя лунка, а именно 19-я, дающая положительный результат - розовый агломерат, разведение которой равно 23,5 пг белка/мл, что соответствует чувствительности диагностического препарата, а активность и специфичность жидкого антигенного препарата проверяют в реакции агломерации объемной (РАО); лиофилизацию диагностикума осуществляют путем суспендирования препарата в 20 мл 3% желатозно-сахарозной среды, затем суспензию разливают в ампулы по 1 мл с последующим высушиванием при комнатной температуре в течение суток. Использование данного диагностикума позволяет определить концентрацию лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями, что дает возможность оценить эффективность лечения. 2 з.п. ф-лы, 7 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2016-11-27 2016-11-28T01:13:35
Наверх