Способ производства пригодного для использования в двигателе сложного метилового эфира жирных кислот

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу производства пригодного для использования в двигателе сложного метилового эфира жирных кислот (СМЭЖК). Собирают тину морских микроводорослей, выбранных из группы, состоящей из Microspora sp., Cladophora sp. и культивированной Chlorella variabilis для получения биомассы водорослей. Сушат биомассу на солнце до остаточной влажности 5-10%. Обрабатывают биомассу струей пара или осмотическим шоком для разрушения клеточных стенок. Экстрагируют липиды из биомассы гексаном с получением сырого масла. Удаляют гексан и сырое масло фуллеровой землей. Либо по выбору, обрабатывают экстракт после разрушения клеточных стенок непосредственно фуллеровой землей для удаления фосфолипидов, пигментов и других примесей. Фильтруют, чтобы удалить суспендированные твердые вещества. Обрабатывают масло экстракта щелочным раствором для уменьшения содержание свободных жирных кислот. Проводят катализируемую щелочью переэтерификацию очищенного масла. Отделяют СМЭЖК и дополнительно очищают. Полученный СМЭЖК пригоден для использования в двигателе в качестве биодизеля. 8 з.п. ф-лы, 19 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к использованию липидсодержащей встречающейся в природе тины микроводорослей, собранной на западном побережье Индии для производства сложного метилового эфира жирных кислот (СМЭЖК) и демонстрации пригодности последнего для работы стандартного автомобиля. Изобретение также относится к выращиванию легко получаемой липидсодержащей биомассы микроводорослей (выращенной из Chlorella variabilis, регистрационный номер РТА-12198) в прудах для выпаривания соли на солнце и ее дальнейшему превращению в СМЭЖК, который также пригоден для использования в двигателе.

Уровень техники

Ссылка может быть сделана на статью Daemon Fairless, Biofuel: The little shrub that could - may be. Nature (2007) 449, 652-655 и Laurent Lardon et al, Life-Cycle Assessment of Biodiesel Production from Microalgae, Environmental Science & Technology (2009) 43:17, 6475-6481, где главное место уделяется сложной проблеме "Пища или топливо?", и подчеркивается потребность в таком источнике биомассы, который не пересекался бы с производством продуктов питания.

Ссылка может быть также сделана на D.H. Lee, Algal biodiesel economy and competition among bio-fuels, Bioresource Technology (2011) 102, 43-49, из-за недостатка орошаемых земель и потребности в альтернативных местах размещения производства биомассы, полезной для производства топлива, при этом выращивание микроводорослей не требует наличия больших площадей орошаемой земли. Кроме того, пункты выращивания могут находиться или в пустынных областях, или на прибрежных мелководьях.

Ссылка может быть сделана на патент США Ghosh et al. 7666234, в котором раскрывается использование малоплодородных земель для производства биодизеля, пригодного для использования в двигателе. Обсуждаемая биомасса имеет наземное происхождение.

Ссылка может быть сделана на работу, озаглавленную "Biodiesel production by simultaneous extraction and conversion of total lipids from microalgae, cyanobacteria, and wild mixed-cultures" (B.D. Wahlen et al. Bioresource Technol, 2011, 102, 2724-2730).

Ссылка может быть сделана на статьи Doan et al, Screening of marine microalgae for biodiesel feedstock, Biomass and Bioenergy (2011) 35:7; 2534-2544 и Matsunaga et al. Characterization of marine microalga, Scenedesmus sp. strain JPCC GA0024 toward biofuel production. Biotechnology Letters (2009) 31: 1367-1372, где сообщается, что виды морских микроводорослей содержат липиды, которые могли бы служить источником биодизеля.

Ссылка может быть сделана на патент США 7977076; Nasrin Moazami et al. Biomass and lipid productivities of marine microalgae isolated from the Persian Gulf and the Qeshm Island.

Ссылка может быть также сделана на статью Brennan et al, Biofuels from microalgae: A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable and Sustainable Energy Reviews (2010) 14: 557-577, которая устанавливает, что микроводоросли обычно культивируют ради небольшого объема высокоценных продуктов, нуждаясь в ограниченной площади земли, или что биомасса может быть выращена в помещении в фотобиореакторах.

Ссылка может быть сделана на статьи Hankamer et al, Photosynthetic biomass and H₂ production by green algae: from bioengineering to bioreactor scale-up Physiologia Plantarum (2007) 131: 10-21 и Wang et al, CO₂ bio-mitigation using microalgae. Applied Microbiology and Biotechnology (2008) 79:5; 707-718; в которых подчеркивается важность фотосинтетического получения биомассы микроводорослей для производства биотоплива.

Ссылка может быть сделана на статью Douskova et al, Simultaneous flue gas bioremediation and reduction of microalgal biomass production costs, Applied Microbiology & Biotechnology (2009), 82:179-185 в которой утверждается, что продуктивность биомассы микроводорослей может быть увеличена посредством использования выхлопного газа как богатого источника СО₂.

Ссылка может быть сделана на множество статей, таких как Griffiths et al Lipid productivity as a key characteristic for choosing algal species for biodiesel production. Journal of Applied Phycology 2009, 21:493-507 и Report prepared for Sustainable Energy Ireland by Tom Bruton et al. A Review of the Potential of Marine Algae as a Source of Biofuel in Ireland (2009), которые упоминают важность морских микроводорослей как источника биодизеля, но не раскрывают, где или как такое культивирование будет размещено в масштабе, соответствующем крупномасштабному производству биодизеля.

Ссылка может быть сделана на обзор Pittman et al The potential of sustainable algal biofuel production using wastewater resources, Bioresource Technology (2011) 102, 17-25. Однако, там не упоминалось об их использовании для производства биодизеля, более того, Microspora sp. смешанной культуры из сельскохозяйственных отходов никогда ни определялась, ни использовалась для получения липидов.

Ссылка может быть сделана на работу Syed Zahir Shah & Habib-ur-Rehman Khattak (Some Green Algae from Paddy Fields of Mathra (District Peshawar), Syed Zahir Shah & Habib-ur-Rehman Khattak, Department of Botany, Islamia College, Peshawar), раскрывающей присутствие Microspora sp.в окрестностях реки Инд как части исследования биоразнообразия. Там не упоминается о каком-либо использовании биомассы.

Ссылка может быть сделана на работу, озаглавленную Cell division and wall structure in Microspora (Picketts-Heaps. New Phytologist, (1973) 72,347-355), в которой обсуждается цитология Microspora sp. Там установлено, что такие водоросли могут встречаться в форме тины. Также утверждается, что водоросли могут содержать или не содержать липиды. Ссылки на какие-либо попытки использовать такую тину для получения биодизеля отсутствуют.

Ссылка может быть сделана на статью Mata et al, Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews (2010) 14: 217-232; в которой перечисляются различные виды морских микроводорослей, которые содержат липиды и в этой связи потенциально интересны как источник биодизеля.

Ссылка может быть также сделана на статью Greenwell et al., placing microalgae on the biofuels priority list: a review of the technological challenges. Journal of the royal society interface (2010), 7: 703-726, в которой заявляется, что различные микроводоросли растут с различной скоростью, и, несмотря на то, что некоторые имеют высокое содержание масла, они бесполезны для использования по другим причинам, например из-за медленного роста, сложности сбора биомассы и т.д.

Ссылка может быть сделана на заявку US 2009/0298159 А1, в которой предлагается способ производства биодизеля из водорослей, используя двуэтапные, автотрофную и гетеротрофную, фазы роста Chlorella variabilis для производства биодизеля; способ включает в себя последовательность операций: культивирование фотоавтотрофных водорослей, концентрирование клеток и затем перенос их в ферментер для гетеротрофного культивирования. На стадии гетеротрофного культивирования добавляют органический углерод. Очевидно, что процесс проводят в закрытой системе, и он требует концентрирования клеток, что является энергоемкой процедурой. Кроме того, отсутствуют упоминания о характеристиках биодизеля и каких-либо испытаниях, проведенных на автомобилях.

Ссылка может быть сделана на сайт www.treehugger.com/chevron-backs-solazyme-to-develop-algal-biodiesel-technology.html, на статью, озаглавленную "Chevron Backs Solazyme to Develop Algal Biodiesel Technology", датированную 2 февраля 2008 г., в которой компания Solazyme производит биодизель из источников сахара посредством ферментации в темноте.

Из предшествующего уровня техники будет очевидно, что не имеется раскрытых рентабельных способов производства сложных метиловых эфиров жирных кислот из такой культивируемой или собираемой биомассы, полученной из встречающейся в природе тины микроводорослей. Настоящее изобретение ищет способы преодоления всех этих основных ограничений и выявляет новый, упрощенный и экономичный способ для производства сложного метилового эфира жирных кислот из тин микроводорослей наряду с ценными дополнительными побочными продуктами из побочных фракций отходов. Обнаружено, что суммарное содержание углерода воды в пункте снижается с каждым последующим сбором. Это может относиться к частым сборам из одного и того же пункта.

Ссылка может быть сделана на патентную заявку PCT/IN2010/000192 by Ghosh et al., которая раскрывает культивирование видов морской микроводоросли p. Chlorella и преимущества миксотрофного роста. Там не сделано ссылок ни на производство биодизеля из биомассы, ни на их практическое крупномасштабное культивирование, так что биомасса воспринимается как недорогое сырье большого объема.

Ссылка может быть сделана на статью Greenwell et al placing microalgae on the biofuels priority list: a review of the technological challenges. Journal of the royal society interface (2010), 7: 703-726 и Chisti, Y et al; Biotechnology Advances (2003), которая выявляет трудности последовательной переработки биомассы микроводорослей и высокое потребление энергии в результате. Самой главной среди них является трудность сбора биомассы из сильно разбавленных суспензий.

Ссылка может быть сделана на статьи http://www.treehugger.com/renewable-energy/chevron-backs-solazyme-to-develop-algal-biodiesel-technology.html & http://www.treehugger.com/cars/solazyme-b100-algae-biodiesel-goes-on-the-road.html раскрывающие работу автомобиля на биодизеле из микроводорослей В100. Однако статья констатирует, что биомассу выращивали в гетеротрофных условиях, используя сахара как источник органического углерода.

Не имеется сообщений о характеристиках какого-либо биодизеля, полученного из встречающейся в природе тины морских микроводорослей или биомассы термоустойчивых морских микроводорослей, выращенной в реальных условиях автотрофного роста в прудах для выпаривания соли на солнце.

Во время поиска потенциальных микроводорослей на западном побережье наша команда нашла несколько мест, показывающих возможность получения некоторых желаемых микроводорослей, путем просмотра изображений через программу Google earth. Один из пунктов, который мы нашли, был расположен на долготе 70°54.959' в.д. и широте 20°42.391 с.ш. (точка 1), и другой пункт расположен на долготе 68°59.876' и широте 22°23.975' (точка 2), Индия, он показывал плотную тину микроводорослей.

При микроскопическом исследовании (морфологии) тины подтвердилось, что тина содержала различные виды водорослей, среди которых, как было установлено, преобладала Microspora sp. Доступный способ получения биодизеля из водорослей очень энергоемкий. Следовательно, предпринимались попытки разработать экономически эффективный способ получения биодизеля из морских микроводорослей.

Ссылка может быть сделана на Bligh, E.G., Dyer, W.J., A rapid method for total lipid extraction and purification, Canadian Journal of Biochemistry and Physiology (1959). 37, 911-917. Lee et al. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae, Bioresource Technology 101 (2010) S75-S7, способ экстрагирования липидов из биомассы морских микроводорослей, который обычно предусматривает экстракцию полярными растворителями и помимо триглицеридов дает на выходе большие количества фосфолипидов, последние нежелательны для производства биодизеля.

Задачи изобретения

Основной задачей настоящего изобретения является использовать встречающуюся в природе тину консорциума морских микроводорослей и самооседающие морские микроводоросли, выращенные в прудах для выпаривания соли на солнце, как источники пригодного для использования в двигателе сложного метилового эфира жирных кислот (биодизеля).

Другой задачей является идентифицировать Cladophora sp. (регистрационный номер АТСС (американская коллекция типовых культур) РТА-12199) и Microspora sp.(регистрационный номер АТСС РТА-12197) как преобладающие виды в тине консорциума морских микроводорослей, о которых шла речь выше.

Другой задачей является искусственно культивировать такую плавающую тину в прудах для выпаривания соли на солнце и/или повысить содержание липидов путем применения стрессовых условий.

Другой задачей является использовать Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА-12198), изолированные с западного побережья Индии, как самооседающий и термоустойчивый штамм морских микроводорослей, идеальный для выращивания в прудах для выпаривания соли на солнце в летних условиях шт. Гуджарат, Индия.

Другой задачей является минимизировать повышенный расход энергии, связанный с извлечением липидов из биомассы.

Другой задачей является использовать легко собираемую биомассу как средство уменьшения повышенного расхода энергии.

Другой задачей является создать возможность выращивать биомассу морских микроводорослей в крупных масштабах, используя около 0,1 миллиона акров излишней земли, доступной для производства соли на солнце.

Другой задачей является минимизировать производственные затраты на культивирование, используя морскую воду, дешевые неорганические питательные вещества, и избегая механических приспособлений для перемешивания культуральной среды, наряду с этим еще достигая максимальной дневной интенсивности роста 45 г (по сухой основе)/м²/день во время летних месяцев.

Другой задачей является собрать сведения об основных процессах, сопровождающих производство соли выпариванием на солнце, например, подаче самотеком и перемещении жидкостей от пруда к пруду.

Другой задачей является высушить на солнце собранную биомассу.

Другой задачей является экстрагировать липиды из высушенной на солнце биомассы, используя летучие неполярные растворители, например, гексан, чтобы минимизировать долю нежелательных липидов в общей экстрагируемой липидной массе.

Другой задачей является по выбору использовать дизельное топливо, полученное из полезных ископаемых, для процессов экстракции, в которых используется смешанный биодизель.

Другой задачей является использовать солнечную термальную энергию для процессов экстракции и выделения липидов, чтобы максимизировать соотношение затраченной и выработанной энергии.

Другой задачей является извлечь максимальную пользу из отработанной биомассы.

Другой задачей является очистить сырое масло простыми и рентабельными средствами.

Другой задачей является после этого осуществить известный способ производства СМЭЖК, как раскрыто в патенте США 7666234.

Другой задачей является продемонстрировать производство СМЭЖК из морских микроводорослей с заданными требованиями к основным характеристикам, таким, как вязкость, содержание свободных жирных кислот, устойчивость к окислению, свободный и общий глицерин, содержание фосфора, содержание влаги и т.д.

Другой задачей является продемонстрировать работу стандартного автомобиля на биодизеле В20, произведенном из тины морских микроводорослей и на биодизеле В100, произведенном из Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА-12198).

Другой задачей является использовать фракцию побочного продукта неочищенного глицерина для ускоренного роста и более высокого содержания липидов в культивируемых микроводорослях, как раскрыто в предшествующем уровне техники.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение предоставляет сложные метиловые эфиры жирных кислот (СМЭЖК) для использования в качестве биодизеля, которые произведены из естественно плавающей тины морских микроводорослей или толстых слоев осевших морских водорослей, сформировавшихся во время культивирования в прудах для выпаривания соли на солнце, или их смеси.

В одном варианте реализации настоящего изобретения раскрываются сложные метиловые эфиры жирных кислот (СМЭЖК) 1, в которых тина, использованная для получения биодизеля, содержит липидсодержащие Microspora sp. (регистрационный номер АТСС РТА-12197) или Cladophora sp.(регистрационный номер АТСС РТА 12199) как преобладающие штаммы, и толстый слой морских микроводорослей, культивированный в пруду для выпаривания соли на солнце, содержащий термоустойчивую Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА 12198).

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором липид экстрагирован из тины морских микроводорослей, содержащей Microspora sp.(регистрационный номер АТСС РТА-12197) посредством экстракции гексаном, причем указанный липид имеет состав, по данным ГХ-МС (газовой хроматографии-масс-спектрометрии), 0,6% 14:0 жирной кислоты, 9,4% 16:0 жирной кислоты, 0,7% 16:1 жирной кислоты, 3,7% 18:0 жирной кислоты, 33,2% 18:1 жирной кислоты, 50,4% 18:2 жирной кислоты, 0,7% 20:0 жирной кислоты, 1,3% 22:0 жирной кислоты.

В другом варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором липид экстрагирован из морской микроводоросли Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА 12198) посредством экстракции гексаном, причем указанный липид имеет состав, по данным ГХ-МС, 0,4% 14:0 жирной кислоты, 12,1% 16:0 жирной кислоты, 1,0% 16:1, 1,0% 16:2 жирной кислоты, 4,2% 18:0 жирной кислоты, 29,4% 8:1, 45,7% 18:2 жирной кислоты, 4,8% 18:3 жирной кислоты, 1,4% 22:0.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором липид экстрагирован из тины морских микроводорослей, содержащей Cladophora sp. (регистрационный номер АТСС РТА 12199) посредством экстракции гексаном, причем указанный липид имеет состав, по данным ГХ-МС, 0,9% 14:0 жирной кислоты, 0,4% 15:0 жирной кислоты, 21,5% 16:0 жирной кислоты, 1% 16:1 жирной кислоты, 2,9% 18:0 жирной кислоты, 21,2% 18:1 жирной кислоты, 22,3% 18:2 жирной кислоты, 0,5% 20:0 жирной кислоты, 16,3% 20:1 жирной кислоты, 0,4% 22:0 жирной кислоты, 11,4% 22:1 жирной кислоты, 0,7% 24:0 жирной кислоты, 0,6% 24:1 жирной кислоты.

В другом варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором липидная фракция, полученная из Microspora sp., очищена и переэтерифицирована, чтобы получить СМЭЖК, имеющий состав, по данным ГХ-МС, содержащий 9,92% 16:0 жирной кислоты, 2,44% 18:0 жирной кислоты, 28,27% 18:1 жирной кислоты, 59,37% 18:2 жирной кислоты, и 5-30 ч./млн антиоксиданта бутилгидрокситолуола (БГТ).

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК из Micorspora sp., который представляет собой прозрачную желтую жидкость, имеющую плотность 0,872 г/мл, вязкость 4,5 сСт (при 40°С), общий глицерин 0,1014% и свободный глицерин 0,0086%.

В другом варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК для использования в стандартном немодифицированном дизельном автомобиле в виде смеси В20 в условиях полной загрузки и соответствия требованиям по выхлопу.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором липидная фракция, полученная из Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА 12198), очищена и переэтерифицирована, чтобы получить СМЭЖК, имеющий состав, по данным ГХ-МС, содержащий 6,9% 16:0 жирной кислоты, 3,1% 18:0 жирной кислоты; 32,6% 18:1 жирной кислоты, и 57,3% 18:2 жирной кислоты, и 5-30 ч./млн антиоксиданта БГТ.

В другом варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК из Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА 12198), который представляет собой прозрачную горчично-желтую жидкость, имеющую плотность при 25°С и 40°С, 0,8704 и 0,8591 г/см³, соответственно; вязкость при 40°С, 4,8 сСт; общий глицерин 0,15%; свободный глицерин 0,02%; предельную температуру фильтруемости (ПТФ) -5°С; содержание влаги 0,029%; фосфор 5,1 ч./млн; устойчивость к окислению 0,43 года (25°С) и 0,12 года (40°С) и энергетическую ценность, измеренную стандартной калориметрической пробой, 9842 ккал/кг.

В другом варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК для использования в том же самом немодифицированном дизельном автомобиле по п.8 в виде биодизеля В100 в условиях полной загрузки и соответствия требованиям по выхлопу.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором тина морских микроводорослей с преобладанием Microspora sp. была собрана в течение июля-декабря в пункте с координатами 70° 54.959' в.д. 20° 42.391' с.ш.

В другом дополнительном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА 12198) была культивирована в соляных прудах, расположенных: 72° 07.316' в.д. 21° 47.4888' с.ш.; на высоте 28 футов, в автотрофных условиях в течение января-июня.

В другом варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором интенсивность роста Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА 12198) в прудах для выпаривания соли на солнце находилась в интервале 11,67-45,56 г/м²/день.

В другом дополнительном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором выход липидов при экстракции гексаном из тины Microspora sp. находился в пределах 5,22-16,32%.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором выход липидов при экстракции гексаном для культивируемой Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА 12198) находился в пределах 11,11-11,21%.

В другом дополнительном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором на интенсивность роста и выход липидов Chlorella variabilis влияли добавлением 3-6 кг бикарбоната натрия, 1-2 кг нитрата натрия и 0,01-0,02 кг сульфата железа на 1000 л культуральной среды на основе морской воды.

В другом дополнительном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором фракции неочищенного глицеринового побочного продукта процесса получения СМЭЖК добавляют при желании, чтобы увеличить выработку биомассы на 50-200%.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором солнечные рефлекторы были использованы для увеличения интенсивности роста и выхода липидов Chlorella variabilis в течение не-летнего периода при открытом культивировании.

В другом дополнительном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором оставшуюся биомассу после экстракции липидов растворителями используют в производстве биоудобрений, корма для аквакультуры, источника каротиноидов и источника энергии.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается СМЭЖК, в котором фракции побочного продукта неочищенного глицерина используют для выработки водорослей посредством миксотрофного роста и/или для биоразлагаемого биополимера.

Другой объект настоящего изобретения предоставляет интегрированный способ получения пригодного для использования в двигателе сложного метилового эфира жирных кислот (биодизеля) из естественным образом собранной плавающей тины с консорциумом Microspora (регистрационный номер АТСС РТА-12197) и Cladophora (регистрационный номер АТСС РТА-12199) и культивируемую тину микроводорослей наряду с массово культивируемым отселектированным термоустойчивым штаммом Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА-12198) микроводорослей и использование побочных продуктов из массы микроводорослей, а также побочных продуктов из сложных метиловых эфиров жирных кислот, при этом указанный способ включает стадии:

a) сбора консорциумов микроводорослевых тин из различных пунктов и промывки для удаления налипших частиц песка и грязи и) идентификации видов микроводорослей, присутствующих в тине, и культивирования тины в лабораторных условиях, используя морскую воду и морскую соль с экспериментальной соляной фермы центрального исследовательского института соли и морских химикатов (CSMCRI) для имитации естественных условий в резервуарах для дальнейшей пролиферации.

b) выделения маслосодержащих видов микроводорослей (Microspora, Rhizoclonium, Spirulina, Chlorella, Cladophora, Diatoms, Oscillatoria spp., и т.п.) из тины.

c) массового культивирования на открытом воздухе маслосодержащих видов микроводорослей на экспериментальной соляной ферме в резервуарах площадью 18 м² и 90 м² и самопроизвольного оседания биомассы, которое облегчает простой сбор и повторное использование супернатанта (надосадочной жидкости) как питательной среды для инокулюма следующей партии.

d) сушки тин микроводорослей, с последующим измельчением высушенных тин микроводорослей в порошок тонкого помола.

e) эффективной экстракции масла из биомассы, которая включает в себя предобработку биомассы, используя шаровую мельницу/пар, за которой следует экстракция неполярным растворителем/по Сокслету, и т.д. и рециркуляция растворителя.

f) очистки сырого масла

g) последующих известных процессов переэтерификации, чтобы получить пригодный для использования в двигателе биодизель, как в предшествующем уровне техники.

h) использования фракций побочных продуктов биодизеля, чтобы повысить продуктивность водорослей посредством миксотрофного роста, как раскрыто в предшествующем уровне техники (Патентная заявка PCT/IN2011/000655) и/или или для получения других полезных материалов, например, биоразлагаемого биополимера (Патентная заявка WIPO WO/2011/027353).

i) использования отработанной биомассы и сточных вод, образованных при синтезе биодизеля, для производства биогаза.

j) использования отработанной биомассы в качестве корма для аквакультуры и в качестве биоудобрения.

k) использования остатка биомассы и обезжиренного жмыха для получения брикетов.

l) экстракции каротиноидов из обезжиренного остатка биомассы.

m) составления смесей В20 и В100, пригодных для работы автомобиля (Chevrolet Tavera) с полной загрузкой без каких-либо модификаций двигателя.

В одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается способ производства пригодного для использования в двигателе сложного метилового эфира жирных кислот для использования в качестве биодизеля, способ включает стадии:

(i) сбора встречающихся в природе тин микроводорослей, содержащих консорциум Microspora sp. и Cladophora sp., и культивированной Chlorella variabilis, чтобы получить биомассу водорослей;

(ii) сушки биомассы на солнце до уровня остаточной влажности 5-10%;

(iii) предварительной обработки биомассы со стадии (ii) струей пара или осмотическим шоком, чтобы разрушить клеточные стенки;

(iv) экстрагирования липидов из биомассы водорослей со стадии (iii), используя гексан как растворитель, или, по выбору, дизельным топливом, когда топливо должно быть использовано в смешанной форме, чтобы получить сырое масло;

(v) удаления гексана и обработки полученного в результате сырого масла фуллеровой землей или, по выбору, обработки экстракта со стадии (ii) непосредственно фуллеровой землей, чтобы удалить фосфолипиды, пигменты и другие примеси;

(vi) фильтрования, чтобы удалить суспендированные твердые вещества и дополнительно обработки масла экстракта со стадии (v), чтобы уменьшить содержание свободных жирных кислот (СЖК), если требуется получить очищенное масло;

(vii) проведения катализируемой щелочью переэтерификации очищенного масла со стадии (vi), отделения СМЭЖК, и его дополнительной очистки, чтобы получить пригодный для использования в двигателе СМЭЖК.

В другом варианте реализации настоящего изобретения раскрывается способ получения СМЭЖК, в котором СМЭЖК, полученный из Microspora sp., имеет состав, по данным ГХ-МС, содержащий 9,92% 16:0 жирной кислоты, 2,44% 18:0 жирной кислоты, 28,27%) 18:1 жирной кислоты, 59,37% 18:2 жирной кислоты, и 5-30 ч./млн антиоксиданта БГТ.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения раскрывается способ, в котором СМЭЖК, полученный из Chlorella variabilis имеет состав, по данным ГХ-МС, содержащий 6,9% 16:0 жирной кислоты, 3,1% 18:0 жирной кислоты; 32,6% 18:1 жирной кислоты, и 57,3% 18:2 жирной кислоты и 5-30 ч./млн антиоксиданта БГТ

В одном варианте реализации настоящего изобретения настоящее изобретение предоставляет интегрированный способ получения пригодного для использования в двигателе сложного метилового эфира жирных кислот (биодизеля) из природной или культивируемой тины микроводорослей наряду с массово культивируемым отселектированным штаммом микроводорослей и использование побочных продуктов из массы микроводорослей, а также побочных продуктов из сложных метиловых эфиров жирных кислот.

В другом варианте реализации настоящего изобретения тина микроводорослей является консорциумом различных видов микроводорослей с преобладанием видов Microspora и Cladophora spp. регистрационный номер АТСС РТА-12199.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения морскую воду с незаменимыми микронутриентами/соль от центрального исследовательского института соли и морских химикатов - экспериментальная соляная ферма (CSMCRI-ESF) используют для культивирования массы микроводорослей на открытом воздухе.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения экстракцию масла осуществляли, используя растворители, выбранные из группы, состоящей из гексана, хлороформа, метанола, ацетона, тетрагидрофурана, диэтилэфира; предпочтительно гексан, хлороформ и метанол.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения фракции побочного продукта биодизеля использовали для производства полигидроксиауканоатных (ПГА)-биополимеров, биогаза, газификации, удобрения, корма для аквакультуры, каротиноидов и для изготовления брикетов.

Осуществление изобретения Несколько пунктов, показывающих возможность получения некоторых желаемых микроводорослей, были отобраны путем просмотра изображений через программу Google earth. Одна из точек расположена на долготе 70° 54.959' в.д. и широте 20°42.391 с.ш. (пункт 1), и другая точка расположена на долготе 68° 59.876' и широте 22° 23.975' (пункт 2), Индия. Показана плотная плавающая тина микроводорослей. При микроскопическом исследовании (морфологии) тины, выявлено, что тина содержала различные виды водорослей, среди которых, как было установлено, преобладали Microspora sp. и Cladophora sp. регистрационный номер АТСС РТА-12199. Доступные способы получения биодизеля из водорослей очень энергоемкие. Следовательно, предпринимаются попытки разработать экономичный способ получения биодизеля из консорциума тины морских микроводорослей, а также из изолированного и массово культивируемого штамма Chlorella variabilis регистрационный номер АТСС РТА-12198.

Использование тин микроводорослей, содержащих Microspora и Cladophora spp. регистрационный номер АТСС РТА-12199 (преобладающих в точках 1 и 2 соответственно), для производства биодизеля интегрированным способом является уникальным. Природная тина широко распространена и, как установлено, способна регенерировать в течение нескольких недель после того, как ее собрали. Кроме того, способность регенерировать также наблюдали в других пунктах эксперимента. Тины консорциума с преобладанием Microspora и Cladophora spp., регистрационный номер АТСС РТА-12199, как установлено, могут выживать и расти в широком спектре характеристик окружающей среды.

Отличительные признаки изобретения:

Основные изобретательские шаги были следующие:

- Осознание того, что сбор урожая микроводорослей является энергоемким, и пользование преимуществом мастерства природы в создании липидсодержащих плавающих тин морских микроводорослей, например, содержащих Microspora sp. (регистрационный номер АТСС РТА-12197) и Cladophora sp. (РТА 12199) как преобладающие виды, которые могут быть просто отделены от воды и переработаны дальше.

- Осознание, что, несмотря на то, что некоторые условия в природе благоприятны для естественного роста тин морских микроводорослей, этот тип естественного роста ограничен некоторыми конкретными периодами, например, несколькими месяцами, следующими за муссонами, и их распространенность редка во время других месяцев, например, летних месяцев. Дальнейшее осознание после больших усилий того, что не всегда легко имитировать такие природные условия, и что другие разновидности морских микроводорослей могут быть более пригодными для культивирования.

- Осознание того, что если есть необходимость культивировать морские микроводоросли для дополнения натурального сырья и также собирать урожай круглый год, то целесообразным подходом является собирать их в природе подходящим способом в течение послемуссонного периода и, соответственно, получать ресурс для культивирования морских микроводорослей в прудах для выпаривания соли на солнце, которые могут предоставить идеальную возможность для крупномасштабного культивирования; учитывая, что до 50% доступных участков для производства соли в Индии простаивают, они могут быть включены в производственное использование.

- Идентификация Chlorella variabilis из индийских вод (регистрационный номер АТСС РТА 12198) как термоустойчивой разновидности, которая хорошо растет в автотрофных условиях в течение летних месяцев с максимумом наблюдаемой выработки сухой биомассы 45 г/м²/день, с минимальными затратами питательных веществ и также не требующей энергоемких процедур, например, непрерывного перемешивания, как принято в искусственных прудах.

- Также наблюдение, что в преимущественно жарких условиях в течение летних месяцев отселектированный штамм Chlorella растет и оседает, тем самым формируя толстый слой на дне, который легко собирается после удаления супернатанта, который служит инокулюмом для следующей партии культивирования.

- Осознание, что может быть реальным выращивать Chlorella даже в нелетние месяцы путем использования солнечных рефлекторов, расположенных в соляных прудах, которые увеличивают интенсивность облучения пруда, и, следовательно, повышают температуру и частоту облучения фотонами, оба эти фактора оказывают положительное влияние на выработку биомассы и выход липидов.

- Осознание, что существуют липиды как полярного, так и неполярного типа, и что этот последний требуется для пригодного для использования в двигателе биодизеля, и тем самым жертвование высоким выходом липидов ради желаемой липидной фракции и экстрагирование биомассы неполярными растворителями, например, гексаном и дизельным топливом вместо обычно используемых полярных растворителей, таких, как метанол/хлороформ.

- Дальнейшее осознание, что хотя использование неполярных растворителей для экстракции дает более чистую фракцию масла, выделение клеточных стенок микроводоросли менее эффективно; следовательно, нужна подача потока пара в качестве предварительной обработки перед экстракцией; осознание что такие способы могут быть более энергосберегающими, если они проводятся на солнце.

- Использование простых средств, таких, как фильтрация через фуллерову землю, чтобы очистить сырое масло и посредством этого использование обычных способов катализируемой щелочью переэтерификации, такого, как раскрытый в предшествующем уровне техники для производства пригодного для использования в двигателе сложного метилового эфира жирных кислот.

- Производство сложных метиловых эфиров как из собранных в природе, так и из культивируемых морских микроводорослей, которые были пригодны по качеству для использования в стандартном дизельном автомобиле.

- Использование фракции побочного продукта глицерина от производства биодизеля из морских водорослей как питательного вещества, чтобы улучшить выработку биомассы и содержание липидов в миксотрофных условиях, как раскрыто в предшествующем уровне техники.

- Использование биомассы, оставшейся после экстракции липидов, разнообразными способами, например, в качестве органического удобрения, источника каротиноидов, корма для аквакультуры, источника энергии, и т.п.

- Местные сточные воды и неочищенные морские соли с низким содержанием NaCl, но богатые питательными веществами, такими, как кальций, магний и сульфат, используют как обогатитель среды для роста тины микроводорослей и изолированных культур морских микроводорослей.

Пример 1

С помощью карт Гугл (Google Maps™) был предпринят поиск зеленых пятен в прибрежных водах, которые могли помочь нам идентифицировать возможные плавающие тины микроводорослей. Некоторые из выделяющихся обнаруженных зеленых пятен находились в прибрежных зонах штатов Гоа (Madkai; 15° 41.0616' с.ш., 73° 95.6227' в.д.), Керала (Vellanathuruthu Road; 9°01.6659' с.ш., 76° 52.5022' в.д.), Западная Бенгалия (Port Canning, 22° 31.5577' с.ш., 88°67.3307' в.д.;, Dongajora, 22° 13.2696' с.ш., 88° 60.2676' в.д.; Haldia refinery, 22° 04.9408' с.ш., 88° 07.308' в.д.), Диу (Nagoa road side, 70° 54.959' в.д., 20°42.391 с.ш.) и Гуджарат (Okha, 68° 59.876', 22° 23.975'). Были предприняты наземные проверки пунктов, идентифицированных в Диу и Гуджарат, и действительно, были обнаружены плавающие тины микроводорослей зеленого цвета.

Пример 2

Тины примера 1 собирали и наблюдали под микроскопом (Carl Zeiss Axio Imager при увеличении 40х) для таксономической идентификации. В обеих тинах был обнаружен консорциум микроводорослей, в котором преобладали представители семейства Chlorophycae. Одна тина, собранная в 70° 54.959' в.д., 20° 42.391 с.ш., как преобладающую форму содержала Microspora, в то время как в другой, собранной в 68° 59.876', 22° 23.975', преобладали Cladophora. Изоляцию ассоциированных видов консорциума проводили, используя метод последовательных разбавлений. Пленку водорослей промывали дистиллированной водой, чтобы удалить налипшую грязь и примеси, и далее подвергали центрифугированию. Супернатант собирали и тщательно инокулировали в 24 чашки для культуры тканей с различными культуральными средами (BG-11, ВВМ, Zarrouk's, ASN-III, и т.д.). Последовательное разбавление осуществляли, используя разбавление 1:10. Чашки для культуры тканей выдерживали при искусственном освещении (300 лк) с циклами света и темноты по 12 ч при 25°С. После этапа видимого роста, обогащенную культуру наносили на твердые подложки 1% агарозы. Чашки Петри инкубировали при искусственном освещении (300 лк) с циклами света и темноты по 12 ч при 25°С. Изолированную культуру инокулировали асептически в жидкой среде и выдерживали при искусственном освещении (300 лк) с циклами света и темноты по 12 ч при 25°С. Тины из двух вышеупомянутых пунктов лиофилизировали и направляли в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) для тестирования жизнеспособности перед предоставлением регистрационных номеров. Одной из тин, содержащей Cladophora как преобладающий липидсодержащий штамм, был присвоен регистрационный номер АТСС РТА-12199, в то время как тестирование жизнеспособности другой тины, содержащей Microspora как преобладающий липидсодержащий штамм, находится в процессе.

Пример 3

Тину морских микроводорослей природного происхождения отделяли в пункте преобладания микроводорослей на долготе 70° 54.959' в.д. и широте 20° 42.391 с.ш. Пункт посещали каждые 3-4 недели на регулярной основе, чтобы изучить отрастание тины. В течение летнего сезона выработка биомассы составляла 22,22 г/м²/день и суммарное содержание липидов составляло 10%; в течение сезона муссонов выработка биомассы составляла 6,03 г/м²/день и суммарное содержание липидов составляло 9,61%, и в течение зимы были достигнуты выработка биомассы 16 г/м²/день и суммарное содержание липидов 12,85%). Этот пример показывает, что практически осуществимо собирать тины микроводорослей в природе подходящим способом.

Пример 4

Влияние повышенной солнечной радиации на выработку биомассы Chlorella variabilis изучали зимой (температура воздуха 25-30°C) в открытых резервуарах. Два резервуара, имеющие площадь 1,51 м² и глубину 0,3 м, содержащие 200 л культуральной среды на основе морской воды, инокулировали 10% инокулюма культуры Chlorella (оптическая плотность: ОП_540нм=1,65) Выход сухой биомассы после 14 дней составил 5,03 г/л с рефлекторами, в то время как в контрольном резервуаре выход составил 4,07 г/л. Этот пример показывает нам положительный эффект, который солнечные рефлекторы могут оказывать на процесс культивирования, особенно когда температура окружающей среды меньше оптимальной.

Пример 5

Культивирование массы Chlorella variabilis регистрационный номер АТСС РТА-12198 проводили на экспериментальной соляной ферме института (21°47.488' с.ш. 72°07.316' в.д. Высота: 28 футов). Культивирование проводили в течение марта-июня. Наружная температура в период культивирования составляла 45±3°С. Культуру, необходимую для этих целей, сначала вырастили в двух резервуарах площадью 18 м² каждый, которые изначально использовались как резервуары для инокулюма. Резервуары регулярно контролировали, измеряя pH, ОП при 540 нм и выход биомассы. После того, как была достигнута концентрация клеток 5 г/л (по влажной основе), культуру использовали, чтобы инокулировать 7 дополнительных резервуаров площадью 18 м² каждый и 3 резервуара площадью 90 м каждый. Регулярно отслеживали pH, ОП при 540 нм, выход биомассы и характеристики окружающей среды. Содержимое резервуаров перемешивали вручную (трижды в день), используя полую трубку с веревкой на конце вплоть до 18 дней. После 20 дней культивирования наблюдали, что биомасса самопроизвольно оседает, формируя толстый слой на дне резервуаров. Данные по выработке биомассы приведены в таблице ниже.

Супернатант из каждого резервуара переносили в пустой резервуар и осевшую биомассу собирали и сушили на солнце. Этот пример показывает нам осуществимость культивирования Chlorella variabilis (регистрационный номер АТСС РТА-12198,) в прудах для выпаривания соли на солнце.

Пример 6

Эксперименты примера 5 повторяли в двух дополнительных прудах. 25 кг бикарбоната натрия, 6 кг нитрата натрия и 62,5 г сульфата железа добавляли в 5000 л культуральной среды на основе морской воды. Было обнаружено, что выработка биомассы повышалась, как можно видеть из таблицы ниже.

Этот пример показывает, что выработка биомассы может быть увеличена путем добавления некоторых необходимых питательных веществ в среду на основе морской воды.

Пример 7

Экстракцию липидов гексаном проводили на тинах микроводорослей, собранных в природе. Гексан использовали как растворитель. Данные предоставлены в таблице ниже. Как можно видеть, содержание липидов варьировало от 5 до 16%.

Пример 8

Исследование примера 7 повторили на биомассе Chlorella variabilis примеров 5 и 6. Данные предоставлены в таблице ниже. Этот пример показывает, что культивируемая биомасса дает более стабильный выход масла.

Пример 9

Таблица ниже приводит значимые данные, относящиеся к составу жирных кислот масла-сырца примеров 7 и 8 по данным ГХ-МС выше.

Пример 10

18,738 кг масла, полученного в партии 1 примера 8, помещали в сосуд из нержавеющей стали и нагревали до 90°С. 1,8 кг фуллеровой земли добавляли к нему. Масло фильтровали, чтобы получить 15,916 кг осветленного масла. Осветленное масло анализировали на содержание СЖК и было установлено, что оно содержит 0,6% СЖК. Брали 13 г NaOH и растворяли в 65 мл воды. Приготовленный таким образом щелочной раствор добавляли к осветленному маслу и перемешивали в течение 15 минут. Фильтровали, чтобы удалить мыло. Масса фильтрата прозрачного масла составила 15,210 кг. Очищенное масло переэтерифицировали, используя 2,92 кг (3,756 л) метанола и 399,24 г KOH. Содержимое перемешивали в течение 90 минут при обычной температуре и оставляли на 60 минут. Отделяли слой глицерина, в избытке содержащий спирт и KOH; масса слоя глицерина составляла 4 кг. Слой биодизеля промывали 682 г глицерина и оставляли для осаждения на 60 минут. Масса промывочного глицерина составила 687 г. Слой биодизеля затем промывали 1 л воды до достижения pH 7. Сушили нагреванием содержимого при 110°C. 13,35 кг полученного таким способом биодизеля анализировали на свободный глицерин, общий глицерин, влажность, вязкость и плотность. Данные представлены в таблице ниже.

Пример 11

Исследование примера 10 было также проведено на масле, полученном из партии 2 в примере 7. Данные предоставлены в таблице ниже.

Пример 12

Таблица ниже предоставляет состав жирных кислот сложных метиловых эфиров жирных кислот примеров 10 и 11, соответственно по данным ГХ-МС. Будет очевидно, что композиции очень качественные.

Пример 13

Данные примера 12 доказывают, что биодизели из морских микроводорослей примеров 10 и 11 могут быть пригодными для использования в двигателе. Биодизель B₂O, произведенный из сложных метиловых эфиров жирных кислот примера 11, и биодизель В100 примера 10 использовали непосредственно в стандартном автомобиле TAVERA без какой бы то ни было модификации. Было установлено, что не наблюдалось каких-либо трудностей в работе автомобиля и пробеге на единицу расхода горючего, сходного с таковыми при работе на топливе из полезных ископаемых. Журналист сказал это о работе автомобиля на биодизеле В100 примера 11: "Этот корреспондент прокатился на автомобиле Tavera в тестовой поездке, которая проводилась министром. Ощущения были сходны с таковыми от любого другого дизельного автомобиля, сопровождались монотонным гулом дизельного двигателя. Двухкилометровая поездка вокруг района Центрального Секретариата была гладкой и без каких-либо сбоев." (Dinsa Sachan, "Biodiesel from microalgae becomes a reality", Down to Earth, March 30, 2012; www.downtoearth.org.in).

Пример 14

Пар при 121°C под давлением 15 фунтов на кв. дюйм проходил через слой 30 г биомассы Chlorella энергетической ценностью 4590 ккал/кг в течение 15 минут. 10,1 г этого обработанного паром образца помещали в целлюлозный стаканчик для экстракции липидов в аппарате Сокслета с растворяющей способностью 150 мл за 4 часа, используя 100 мл гексана при 80°C. Исследование показывает, что экстракция гексаном становится более эффективной после предварительной обработки паром, и полная экстракция требует 10 часов по сравнению с 16 часами, необходимыми обычно.

Пример 15

Экстракцию каротиноидов осуществляли в узком реакционном сосуде емкостью 1 л из 50 г обезжиренной биомассы микроводорослей примера 8. Экстракцию проводили 500 мл 80% (об./об.) ацетона и выдерживали в темном помещении при постоянном магнитном перемешивании со скоростью 200 об./мин. После непрерывного магнитного перемешивания в течение 3 часов раствор выпаривали и свободный от ацетона экстракт фильтровали через фильтровальную бумагу, чтобы получить каротиноиды как ретентат. Количество полученных каротиноидов колебалось в пределах 2-4%.

Пример 16

Производство биогаза из обезжиренного остатка биомассы тины и Chlorella Остаток биомассы из примеров 7 и 8 использовали для производства биогаза. После получения биогаза суспензия биомассы, которая содержит множество микроэлементов, углерод и азот, может быть использована как биоудобрение. Остаток биомассы может также быть использован как корм для аквакультуры; он содержит белки, углеводы и незаменимые микроэлементы. Могут быть изготовлены брикеты остатка биомассы. Производство биогаза из отходов биомассы микроводорослей после экстрагирования масла потенциально осуществимо и может значительно повысить выход энергии из биомассы. Следовательно, это учитывалось как необходимый этап, чтобы сделать производство биодизеля из микроводорослей энергетически эффективным. (Torres и Jeison, 2010)

Был взят обезжиренный остаток биомассы, имеющий энергетическую ценность 1884,52 ккал/кг для обезжиренного жмыха примера 7 и 1679,00 ккал/кг для обезжиренного жмыха примера 8. Отработанная суспензия с предприятия по производству биогаза была использована как инокулюм для производства биогаза. Прибор был поделен на три части: (1) реактор (5,0 л), (2) газоудерживающая бутыль (1,0 л) и (3) бутыль для вытеснения жидкости (1,0 л). Реактор маркировали при емкости 4,0 л и его стыки сделали воздухонепроницаемыми применением силиконовой ленты и вакуумной смазки. Газоудерживающую бутыль емкостью 1,0 л наполняли цветным реагентом вплоть до ее отметки на уровне 1,0 л. В нее вставляли градуированную шкалу, чтобы тщательно измерить выработку газа. Эксперименты по биогазу проводили в непрерывном и периодическом режимах для каждого опыта (остатка биомассы) и использовали по одному контрольному реактору для непрерывного и периодического способов. Время гидравлического удержания (ВГУ) для этого эксперимента составило 30 дней и подача субстрата составляла 5%; для непрерывного реактора 134 мл (4,0 л/30 дней = 0,1333 или 134 мл) образца заменяли на 134 мл экспериментального [как 5% (6,7 г) биомассы +67 мл суспензии +67 мл t/w] ежедневно через подающую трубку, тогда как в реактор периодического действия добавляли непосредственно 200 г биомассы (5% для 4,0 л). Разбавленный активационный раствор в соотношении 1:10 (таблетка поливитамина и цистеина гидрохлорид) использовали, чтобы индуцировать рост микрофлоры для производства биогаза и поддержания анаэробных условий. Получаемые в результате жидкие стоки анализировали каждый день по таким показателям, как общее содержание сухих веществ, общее содержание летучих сухих веществ, pH, электрическая проводимость, общее содержание органического углерода, доступный азот и доступный фосфор. Суммарную выработку биогаза также измеряли каждый день. Средняя дневная выработка биогаза в реакторе обезжиренной биомассы примера 7 и 8 составила 426,26 и 446,02 мл д^-1, соответственно, для периодического способа и 270,51 и 473,15 мл д^-1 для непрерывного способа.

Пример 17

Побочный продукт производства биодизеля из микроводорослей, содержащий неочищенный глицерин, был использован как источник питательных веществ для миксотрофного и гетеротрофного роста Chlorella variabilis, где все колбы содержали 100 мл культуральной среды на основе морской воды с различным количеством остатка отходов биодизеля из водорослей (ООБВ) для миксотрофного роста при комнатной температуре. После инокуляции ОП при 540 нм составила 0,5. Наблюдали, что после 8 дней выработка биомассы была максимальной при 5 г/л ООБВ (миксотрофный). Этот пример демонстрирует использование фракции неочищенного глицерина в повышении выработки биомассы.

Пример 18

Отработанная биомасса микроводорослей используется как биоудобрение для стимуляции роста и может заменить химические удобрения. Содержание NPK. составляет 1,2:0,03:0,6 (%) для Cladophora, 1,4:0,01:1,1 (%) для Microspora и 2,19:0,01:1,0 (%) для Chlorella. Эксперименты проводили на двух делянках на кукурузе с 6 рядками в контроле (K₂O) и 4 рядками для каждой из Cladophora, Microspora и Chlorella на основе эквивалентного количества удобрения (K₂O). Высоту растений, количество листьев на растение, количество початков на растение, длину и ширину початков и индекс хлорофилла измеряли после 8 недель роста. Результаты показывают, что Chlorella давала лучшие результаты при средней высоте растений 167,8±7,34 см, 14,8±0,583 листьях на растение, 2 початках на растение, длине початка 32,0±0,84 см, ширине початка 7,24±0,24 см и индексе хлорофилла 49,31±0,03 (Opti-Sciences ССМ-200, USA) по сравнению с контролем (химическое удобрение K₂O): высота растений 158,4±2,79 см, количество листьев на растение 13,6±0,4, количество початков на растение 1,6±0,25, длина початка 28,6±0,75 см, ширина початка 7,24±0,24 см и индекс хлорофилла 40,25±1,97. Повышение урожая на 16,43% наблюдали, если Chlorella использовали как биоудобрение вместо K₂O (контроль). Этот пример показывает дополнительную полезность обезжиренного жмыха.

Пример 19

Обезжиренный жмых примера 8 имел энергетическую ценность 1765,91 ккал/кг. Водоросли смешивали с 10% по массе влажного коровьего навоза, вручную формировали брикеты диаметром 4 см и толщиной 2 см и подвергали сушке на открытом солнце. 30 кг такой высушенной биомассы затем загружали в газификатор биомассы, установленный на экспериментальной соляной ферме института, со скоростью 15 кг/ч. После около 10 минут работы газификатора отмечали появление горючего компонента регенераторного газа с использованием подключенного газоанализатора. Газ горел желтым пламенем. Этот пример показывает, что обезжиренный жмых также может быть использован в газификаторе биомассы.

Преимуществами настоящего изобретения являются:

- Настоящее изобретение предоставляет экономичный вариант для получения биомассы морских микроводорослей путем сбора встречающейся в природе тины таких водорослей подходящим способом.

- Преимущество изобретения также в обнаружении того, что термоустойчивая Chlorella sp. пригодна для культивирования в открытых солнечных соляных прудах даже в условиях жаркого лета с высокой выработкой биомассы и хорошим содержанием липидов.

- Изобретение имеет дополнительное преимущество в том, что для культивирования биомассы требуются минимальные затраты питательных веществ и энергии.

- Преимущество изобретения также в том, что биомасса легко собираема.

- Изобретение имеет дополнительное преимущество в том, что только полезную часть липидов, пригодных для производства биодизеля, избирательно экстрагируют с помощью неполярного растворителя.

- Изобретение имеет дополнительное преимущество в том, что используются простые способы для очистки сырого масла, получаемого экстракцией неполярным растворителем, и поэтому масло легко перерабатывается в высококачественный биодизель известными способами.

- Изобретение имеет дополнительное преимущество демонстрации того, что такой сложный метиловый эфир, полученный из источника морских микроводорослей, может быть использован даже в беспримесных условиях (В 100) для эксплуатации стандартного дизельного автомобиля без какой-либо модификации двигателя.

- Изобретение имеет дополнительное преимущество демонстрации непосредственной пользы и/или ценных добавок некоторых фракций побочного продукта.

1. Способ производства пригодного для использования в двигателе сложного метилового эфира жирных кислот (СМЭЖК) для использования в качестве биодизеля, который включает стадии:
(i) сбора встречающихся в природе тин морских микроводорослей, выбранных из группы, состоящей из Microspora sp., Cladophora sp. и культивированной Chlorella variabilis, чтобы получить биомассу водорослей;
(ii) сушки биомассы водорослей на солнце до уровня остаточной влажности 5-10%;
(iii) предварительной обработки биомассы водорослей со стадии (ii) струей пара или осмотическим шоком, чтобы разрушить клеточные стенки;
(iv) экстрагирования липидов из биомассы водорослей со стадии (iii), используя гексан как растворитель, чтобы получить сырое масло;
(v) удаления гексана и обработки полученного в результате сырого масла фуллеровой землей или, по выбору, обработки экстракта со стадии (iii) непосредственно фуллеровой землей, чтобы удалить фосфолипиды, пигменты и другие примеси;
(vi) фильтрования, чтобы удалить суспендированные твердые вещества, и обработки масла экстракта со стадии (v) щелочным раствором, чтобы уменьшить содержание свободных жирных кислот (СЖК), если требуется получить очищенное масло;
(vii) проведения катализируемой щелочью переэтерификации очищенного масла со стадии (vi), отделения СМЭЖК, и его дополнительной очистки, чтобы получить пригодный для использования в двигателе СМЭЖК.

2. Способ по п. 1, в котором тину морских микроводорослей с преобладанием Microspora sp. собирают в течение июля-декабря в пункте 70° 54.959′ в.д., 20° 42.391′ с.ш.

3. Способ по п. 1, в котором Chlorella variabilis, регистрационный номер АТСС РТА-12198, культивируют в соляных прудах, расположенных на 72° 07.316′ в.д., 21° 47.4888′ с.ш., на высоте 28 футов, в автотрофных условиях в течение января-июня.

4. Способ по п. 3, в котором интенсивность роста Chlorella variabilis, регистрационный номер АТСС РТА-12198, в прудах для выпаривания соли на солнце находится в пределах 11,67-45,56 г/м²/день.

5. Способ по п. 3, в котором на интенсивность роста и выход липидов Chlorella variabilis влияют добавлением 3-6 кг бикарбоната натрия, 1-2 кг нитрата натрия и 0,01-0,02 сульфата железа на 1000 л культуральной среды на основе морской воды.

6. Способ по п. 1, в котором неочищенный глицерин из фракции побочного продукта процесса получения СМЭЖК добавляют при желании, чтобы повысить выработку биомассы на 50-200%.

7. Способ по п. 3, в котором солнечные рефлекторы увеличивают интенсивность роста и выход липидов Chlorella variabilis в течение нелетнего периода при открытом культивировании.

8. Способ по п. 1, в котором остаток биомассы после экстракции липидов растворителем используют в производстве биоудобрения, корма для аквакультуры, источника каротиноидов или источника энергии.

9. Способ по п. 1, в котором фракции побочного продукта неочищенного глицерина используют для выработки водорослей посредством миксотрофного роста и/или для производства биоразлагаемого биополимера.