Комбинированная терапия противоопухолевым алкалоидом

Группа изобретений относится к способам лечения рака, включающим введение синергитической комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с терапевтически эффективным количеством антиметаболита, в котором антиметаболит выбран из 5-фторурацила, гемцитабина, цитарабина, капецитабина, децитабина, флоксуридина, аминоптерина, метотрексата, пеметрекседа и ралтитрекседа, а также к применению указанных синергитических комбинаций для лечения рака и производства лекарственного средства для лечения рака. Группа изобретений эффективна в лечении рака. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 296 ил., 26 табл., 21 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 с другими противораковыми лекарственными средствами, выбранными из противоопухолевых платиновых координационных комплексов, антиметаболитов, ингибиторов митоза, противораковых антибиотиков, ингибиторов топоизомеразы I и/или II, ингибиторов протеасом, ингибиторов деацетилазы гистонов, алкилирующих агентов, являющихся азотистыми производными горчичного газа, алкилирующих агентов группы нитрозомочевины, неклассических алкилирующих агентов, антагонистов эстрогенов, антагонистов андрогенов, ингибиторов mTOR, ингибиторов тирозинкиназы и других агентов, выбранных из аплидина, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104, и к применению указанных комбинаций для лечения рака.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак развивается, когда клетки в части тела начинают бесконтрольно размножаться. Хотя существует множество видов рака, все они возникают вследствие бесконтрольного роста ненормальных клеток. Раковые клетки могут проникать в близлежащие ткани и могут распространяться с кровотоком и через лимфатическую систему в другие части тела. Существует несколько главных типов рака. Карцинома представляет собой злокачественное новообразование, которое представляет собой неконтролируемый и прогрессирующий патологический рост, возникающих из эпителиальных клеток. Эпителиальные клетки покрывают внутренние и внешние поверхности тела, включая органы, выстилку сосудов и других малых полостей. Саркома представляет собой рак, возникающий из клеток кости, хряща, жира, мышц, кровеносных сосудов или другой соединительной или опорной ткани. Лейкоз представляет собой рак, который возникает в кроветворящей ткани, такой как костный мозг, и вызывает появление и проникновение в кровоток больших количеств патологических клеток крови. Лимфома и множественная миелома представляют собой раки, которые возникают из клеток иммунной системы.

Кроме того, рак является инвазивным и имеет тенденцию инфильтрировать окружающие ткани и образовывать метастазы. Он может распространяться непосредственно в окружающие ткани, а также распространяться через лимфатическую и кровеносную системы в другие части тела.

Существует множество способов лечения рака, включая хирургические вмешательства и облучение при локализованных заболеваниях, а также химиотерапию. Однако эффективность существующих способов лечения многих типов рака является ограниченной, и существует потребность в новых, улучшенных формах лечения, демонстрирующих клинически благоприятное действие. Это особенно относится к тем пациентам, у которых имеется запущенное и/или метастатическое заболевание, а также к пациентам, имеющим рецидив в виде прогрессирующего заболевания после ранее проводившегося стандартного лечения, которое стало неэффективным или непереносимым благодаря приобретенной резистентности или ограничениям в использовании лекарственных средств из-за токсичности.

С 1950-х гг. химиотерапевтическое лечение рака значительно продвинулось. К сожалению, более 50% всех раковых пациентов не реагируют на первоначальную терапию или переносят рецидив после первоначального ответа на лечение, и, в конечном итоге, умирают от прогрессирующего заболевания с метастазами. Таким образом, современная политика по разработке и открытию новых противораковых агентов является критически важной.

Химиотерапия, в ее классической форме, фокусируется, прежде всего, на уничтожении быстро пролиферирующих раковых клеток путем нацеливания на главные клеточные метаболические процессы, включая биосинтез ДНК, РНК и белков. Химиотерапевтические лекарственные средства разделяются на несколько групп в зависимости от того, как они воздействуют на специфические химические вещества в раковых клетках, с какими клеточными функциями или процессами взаимодействует лекарственное средство и на какие конкретно фазы клеточного цикла влияет лекарственное средство. Наиболее распространенные типы химиотерапевтических лекарственных средств включают в себя: ДНК-алкилирующие лекарственные средства (такие как циклофосфамид, ифосфамид, цисплатин, карбоплатин, дакарбазин), антиметаболиты (5-фторурацил, капецитабин, 6-меркаптопурин, метотрексат, гемцитабин, цитарабин, флударабин), ингибиторы митоза (такие как паклитаксел, доцетаксел, винбластин, винкристин), противораковые антибиотики (такие как даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон), ингибиторы топоизомеразы I и/или II (такие как топотекан, иринотекан, этопозид, тенипозид) и гормональные лекарственные средства (такие как тамоксифен, флутамид).

Идеальное противоопухолевое лекарственное средство должно убивать раковые клетки селективно, с широким индексом относительно его токсичности в отношении нераковых клеток, и оно также должно сохранять свою эффективность против раковых клеток даже после продолжительного воздействия лекарственного средства. К сожалению, ни один из современных химиотерапевтических агентов не обладает идеальным профилем. Большинство из них имеют очень узкие терапевтические индексы, и, кроме того, раковые клетки, подвергшиеся воздействию незначительно сублетальных концентраций химиотерапевтического агента, могут развивать резистентность к данному агенту и, довольно часто, перекрестную резистентность к нескольким другим противоопухолевым агентам.

РМ01183, также известный как триптамицидин, представляет собой синтетический алкалоид, который в настоящее время проходит клинические испытания для лечения рака и имеет следующую химическую структуру:

РМ01183 показал весьма мощную активность in vitro против клеточных линий солидных и несолидных опухолей, а также значительную активность in vivo в отношении нескольких ксенотрансплантатов человеческих опухолевых клеточных линий у мышей, таких как рак молочной железы, почки и яичника. РМ01183 оказывает свое противораковое действие через ковалентную модификацию гуанинов в малой борозде ДНК, которая в итоге вызывает двухнитевой разрыв ДНК, остановку S-фазы и апоптоз в раковых клетках. Дополнительную информацию, касающуюся данного соединения, можно найти в WO 03/01427; 100-й ежегодный съезд AACR, 18-22 апреля 2009 г., Денвер, CO, реферат № 2679 и реферат № 4525 и в Leal JFM et al., Br.J.Pharmacol., 2010, 161, 1099-1110.

Поскольку рак является главной причиной смерти у животных и человека, осуществлялось и до сих пор осуществляется несколько попыток получения лекарственного средства, активного и безопасного для введения пациентам, страдающим раком. Проблемой, которую должно решить настоящее изобретение, является создание противораковых лекарственных средств, которые являются пригодными для лечения рака.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение утверждает, что РМ01183 потенцирует противоопухолевую активность других противораковых агентов, в частности других противораковых лекарственных средств, выбранных из противоопухолевых платиновых координационных комплексов, антиметаболитов, ингибиторов митоза, противораковых антибиотиков, ингибиторов топоизомеразы I и/или II, ингибиторов протеасом, ингибиторов деацетилазы гистонов, алкилирующих агентов, являющихся азотистыми производными горчичного газа, алкилирующих агентов группы нитрозомочевины, неклассических алкилирующих агентов, антагонистов эстрогенов, антагонистов андрогенов, ингибиторов mTOR, ингибиторов тирозинкиназы и других агентов, выбранных из аплидина, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104. Таким образом, РМ01183 и указанные другие противораковые агенты можно успешно применять в комбинированной терапии для лечения рака.

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, наборам и способам для лечения рака с использованием указанной комбинированной терапии и к применению обоих лекарственных средств для лечения рака и для производства лекарственных средств для комбинированной терапии.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к эффективной комбинированной терапии для лечения рака на основе РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с использованием другого противоракового лекарственного средства, как определено выше.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли для применения для лечения рака, включающего в себя введение терапевтически эффективного количества РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с терапевтически эффективным количеством другого противоракового лекарственного средства.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему в себя введение пациенту, который нуждается в указанном лечении, терапевтически эффективного количества РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и терапевтически эффективного количества другого противоракового лекарственного средства.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу увеличения или потенцирования терапевтической эффективности противоракового лекарственного средства для лечения рака, который включает в себя введение пациенту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в сочетании с указанным другим противораковым лекарственным средством.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения рака путем комбинированной терапии с использованием РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и другого противоракового лекарственного средства.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в себя РМ01183 или его фармацевтически приемлемую соль и/или другое противораковое лекарственное средство и фармацевтически приемлемый носитель, для использования в комбинированной терапии для лечения рака.

Изобретение относится также к набору для применения для лечения рака, который включает в себя лекарственную форму РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и/или лекарственную форму другого противоракового лекарственного средства и инструкции по применению обоих лекарственных средств в комбинации.

В одном предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к синергическим комбинациям РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с другим противоракового лекарственным средством.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1-20. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с оксалиплатином, 5-фторурацилом, гемцитабином, паклитакселом, доцетакселом, винкристином, даунорубицином, митомицином С, актиномицином D, топотеканом, этопозидом, бортезомибом, вориностатом, циклофосфамидом, кармустином, дакарбазином, темсиролимусом, эрлотинибом, ЕТ-743 и РМ00104 соответственно.

Фиг. 21-41. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, оксалиплатином, цитарабином, гемцитабином, доцетакселом, винкристином, винорелбином, даунорубицином, митомицином С, актиномицином D, топотеканом, этопозидом, вориностатом, циклофосфамидом, дакарбазином, темсиролимусом, эрлотинибом, аплидином, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 соответственно против клеток А673.

Фиг. 42-56. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, 5-фторурацилом, цитарабином, метотрексатом, даунорубицином, доксорубицином, митомицином С, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, дакарбазином, темсиролимусом, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 соответственно против клеток SK-MEL-2.

Фиг. 57-80. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, оксалиплатином, 5-фторурацилом, цитарабином, гемцитабином, метотрексатом, доцетакселом, паклитакселом, винорелбином, даунорубицином, доксорубицином, митомицином С, актиномицином D, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, бортезомибом, вориностатом, флутамидом, темсиролимусом, эрлотинибом, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 соответственно против клеток РС-3.

Фиг. 81-98. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, оксалиплатином, цитарабином, гемцитабином, метотрексатом, даунорубицином, доксорубицином, актиномицином D, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, бортезомибом, вориностатом, темсиролимусом, эрлотинибом, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 соответственно против клеток PANC-1.

Фиг. 99-123. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, оксалиплатином, 5-фторурацилом, цитарабином, гемцитабином, метотрексатом, паклитакселом, винкристином, винорелбином, даунорубицином, доксорубицином, актиномицином D, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, бортезомибом, вориностатом, циклофосфамидом, дакарбазином, темсиролимусом, эрлотинибом, аплидином, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 соответственно против клеток HGC-27.

Фиг. 124-150. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, оксалиплатином, 5-фторурацилом, цитарабином, гемцитабином, метотрексатом, доцетакселом, паклитакселом, винкристином, винорелбином, даунорубицином, доксорубицином, актиномицином D, митомицином С, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, вориностатом, циклофосфамидом, кармустином, дакарбазином, темсиролимусом, эрлотинибом, аплидином, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 соответственно против клеток IGROV-1.

Фиг. 151-170. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, оксалиплатином, 5-фторурацилом, цитарабином, гемцитабином, метотрексатом, доцетакселом, паклитакселом, винкристином, винорелбином, даунорубицином, доксорубицином, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, бортезомибом, циклофосфамидом, эрлотинибом, ЕТ-743 и РМ00104 соответственно против клеток HEP-G2.

Фиг. 171-197. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, оксалиплатином, 5-фторурацилом, цитарабином, гемцитабином, метотрексатом, доцетакселом, паклитакселом, винкристином, винорелбином, даунорубицином, доксорубицином, актиномицином D, митомицином С, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, вориностатом, циклофосфамидом, кармустином, дакарбазином, тамоксифеном, темсиролимусом, эрлотинибом, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 соответственно против клеток MDA-MB-231.

Фиг. 198-219. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, оксалиплатином, 5-фторурацилом, цитарабином, гемцитабином, доцетакселом, винорелбином, даунорубицином, доксорубицином, актиномицином D, митомицином С, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, бортезомибом, вориностатом, циклофосфамидом, дакарбазином, темсиролимусом, эрлотинибом, аплидином и РМ02734 соответственно против клеток НТ-29.

Фиг. 220-242. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, 5-фторурацилом, цитарабином, гемцитабином, метотрексатом, доцетакселом, винкристином, винорелбином, даунорубицином, доксорубицином, актиномицином D, митомицином С, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, вориностатом, циклофосфамидом, дакарбазином, эрлотинибом, аплидином, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 соответственно против клеток RXF-393.

Фиг. 243-262. Данные по активности in vitro РМ01183 в комбинации с цисплатином, оксалиплатином, 5-фторурацилом, гемцитабином, метотрексатом, доцетакселом, винкристином, даунорубицином, доксорубицином, топотеканом, иринотеканом, этопозидом, бортезомибом, вориностатом, дакарбазином, темсиролимусом, эрлотинибом, аплидином, ЕТ-743 и РМ02734 соответственно против клеток U87-MG.

Фиг. 263. Оценка объема опухолей А2780 у мышей, леченных плацебо, РМ01183, паклитакселом и РМ01183 плюс паклитаксел.

Фиг. 264. Оценка объема опухолей А2780 у мышей, леченных плацебо, РМ01183, винорелбином и РМ01183 плюс винорелбин.

Фиг. 265. Оценка объема опухолей А2780 у мышей, леченных плацебо, РМ01183, доксорубицином и РМ01183 плюс доксорубицин.

Фиг. 266. Оценка объема опухолей HGC-27 у мышей, леченных плацебо, РМ01183, цисплатином и РМ01183 плюс цисплатин.

Фиг. 267. Оценка объема опухолей HGC-27 у мышей, леченных плацебо, РМ01183, 5-фторурацилом и РМ01183 плюс 5-фторурацил.

Фиг. 268. Оценка объема опухолей SW1990 у мышей, леченных плацебо, РМ01183, гемцитабином и РМ01183 плюс гемцитабин.

Фиг. 269. Оценка объема опухолей U87-MG у мышей, леченных плацебо, РМ01183, темозоломидом и РМ01183 плюс темозоломид.

Фиг. 270. Оценка объема опухолей Н460 у мышей, леченных плацебо, РМ01183, иринотеканом и РМ01183 плюс иринотекан.

Фиг. 271. Оценка объема опухолей НТ1080 у мышей, леченных плацебо, РМ01183, дакарбазином и РМ01183 плюс дакарбазин.

Фиг. 272. Оценка объема опухолей НТ-29 у мышей, леченных плацебо, РМ01183, иринотеканом и РМ01183 плюс иринотекан.

Фиг. 273. Эффекты комбинации РМ01183 с метотрексатом на клеточной линии JURKAT.

Фиг. 274. Эффекты комбинации РМ01183 с метотрексатом на клеточной линии MOLT-4.

Фиг. 275. Эффекты комбинации РМ01183 с даунорубицином на клеточной линии JURKAT.

Фиг. 276. Эффекты комбинации РМ01183 с аплидином на клеточной линии JURKAT.

Фиг. 277. Эффекты комбинации РМ01183 с аплидином на клеточной линии MOLT-4.

Фиг. 278. Эффекты комбинации РМ01183 с ЕТ-743 на клеточной линии JURKAT.

Фиг. 279. Эффекты комбинации РМ01183 с ЕТ-743 на клеточной линии MOLT-4.

Фиг. 280. Эффекты комбинации РМ01183 с РМ00104 на клеточной линии JURKAT.

Фиг. 281. Эффекты комбинации РМ01183 с РМ00104 на клеточной линии MOLT-4.

Фиг. 282. Эффекты комбинации РМ01183 с РМ02734 на клеточной линии JURKAT.

Фиг. 283. Эффекты комбинации РМ01183 с РМ02734 на клеточной линии MOLT-4.

Фиг. 284. Эффекты комбинации РМ01183 с цитарабином на клеточной линии RAMOS.

Фиг. 285. Эффекты комбинации РМ01183 с метотрексатом на клеточной линии RAMOS.

Фиг. 286. Эффекты комбинации РМ01183 с метотрексатом на клеточной линии U-937.

Фиг. 287. Эффекты комбинации РМ01183 с гемцитабином на клеточной линии RAMOS.

Фиг. 288. Эффекты комбинации РМ01183 с гемцитабином на клеточной линии U-937.

Фиг. 289. Эффекты комбинации РМ01183 с даунорубицином на клеточной линии RAMOS.

Фиг. 290. Эффекты комбинации РМ01183 с даунорубицином на клеточной линии U-937.

Фиг. 291. Эффекты комбинации РМ01183 с ЕТ-743 на клеточной линии RAMOS.

Фиг. 292. Эффекты комбинации РМ01183 с ЕТ-743 на клеточной линии U-937.

Фиг. 293. Эффекты комбинации РМ01183 с РМ00104 на клеточной линии RAMOS.

Фиг. 294. Эффекты комбинации РМ01183 с РМ00104 на клеточной линии U-937.

Фиг. 295. Эффекты комбинации РМ01183 с РМ02734 на клеточной линии RAMOS.

Фиг. 296. Эффекты комбинации РМ01183 с РМ02734 на клеточной линии U-937.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявители неожиданно установили, что РМ01183 в высокой степени усиливает противораковую активность других противораковых лекарственных средств, когда указанные противораковые лекарственные средства комбинируют с РМ01183. Таким образом, настоящее изобретение относится к эффективному лечению рака на основе комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с другим противораковым лекарственным средством.

В настоящей заявке под «раком» подразумеваются опухоли, новообразования и любые другие злокачественные заболевания, причиной которых являются злокачественные ткани или клетки.

Термин «процесс лечения», используемый в настоящем документе, если не указано иное, означает обеспечение обратного развития, облегчение или ингибирование прогрессирования заболевания или состояния, к которому применяется указанный термин, или одного или более симптомов указанного заболевания или состояния. Термин «лечение», если не указано иное, относится к акту процесса лечения, определенного непосредственно выше.

Термин «комбинация», используемый в настоящем описании, означает введение пациенту, страдающему раком, указанных терапевтических агентов в одной и той же или отдельных фармацевтических композициях и в одно и то же или в разное время. Если терапевтические агенты вводят в разное время, их следует вводить достаточно близко по времени, чтобы гарантировать потенцирование или синергический ответ.

Как упоминалось выше, РМ01183 представляет собой синтетический алкалоид, имеющий следующую структуру:

Термин «РМ01183» относится и к любым его фармацевтически приемлемым солям, сольватам, гидратам, пролекарствам или любым другим соединениям, которые, после введения пациенту, способны образовывать (прямо или опосредованно) описанное в настоящем документе соединение. Получение солей, сольватов, гидратов и пролекарств можно легко осуществить способами, известными специалистам.

Фармацевтически приемлемые соли можно синтезировать из родительского соединения, которое содержит основную или кислотную часть, обычными химическими способами. Обычно указанные соли получают, например, реакцией свободных кислотных или основных форм указанных соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе или их смеси. Обычно предпочтительными являются неводные среды, такие как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Примеры кислотно-аддитивных солей включают в себя минеральные кислотно-аддитивные соли, такие как, например, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, сульфат, нитрат, фосфат, органические кислотно-аддитивные соли, такие как, например, ацетат, трифторацетат, малеат, фумарат, цитрат, оксалат, сукцинат, тартрат, малат, манделат, метансульфонат и п-толуолсульфонат. Примеры основно-аддитивных солей включают в себя неорганические соли, такие как, например, натриевые, калиевые, кальциевые и аммонийные соли, и соли с органическими основаниями, такие как, например, соли с этилендиамином, этаноламином, N,N-диалкиленэтаноламином, триэтаноламином и основными аминокислотами.

Любое соединение, которое представляет собой пролекарство РМ01183, подпадает под объем и идею настоящего изобретения. Термин «пролекарство» используется в самом широком смысле и включает в себя такие производные, которые in vivo конвертируются в РМ01183. Пролекарство может гидролизироваться, окисляться или как-либо иначе реагировать в биологических условиях с образованием РМ01183. Примеры пролекарств включают в себя, без ограничения, производные и метаболиты РМ01183, которые включают в себя биогидролизуемые части, такие как биогидролизуемые амины, биогидролизуемые сложные эфиры, биогидролизуемые карбаматы, биогидролизуемые карбонаты, биогидролизуемые уреиды и биогидролизуемые фосфатные аналоги. Пролекарства обычно можно изготовить с использованием хорошо известных способов, таких, которые описаны Burger в «Medicinal Chemistry and Drug Discovery», 6-е изд. (Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley) и «Design and Applications of Prodrugs» (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers).

Помимо этого, любое лекарственное средство, упомянутое в настоящем документе, может быть в аморфной форме или в кристаллической форме как в виде свободного соединения, так и в виде сольватов (например, гидратов), и подразумевается, что обе формы входят в объем настоящего изобретения.

Кроме того, РМ01183 для применения по настоящему изобретению можно получать с использованием процесса синтеза, такого, который описан в WO 03/014127, включенном в настоящий документ в качестве ссылки.

Фармацевтические композиции РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли, которые можно использовать, включают в себя растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизированные композиции и т.п. с подходящими наполнителями для внутривенного введения. Предпочтительно, РМ01183 может поставляться и храниться в виде стерильного лиофилизированного продукта, включающего в себя РМ01183 и наполнители, в форме, подходящей для терапевтического применения. Для дальнейшего руководства, касающегося фармацевтических композиций РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли, см., например, композиции, описанные в WO 2006/046079, включенном в настоящий документ в качестве ссылки.

Введение РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтических композиций, включающих указанное соединение, предпочтительно, осуществляют внутривенной инфузией. Можно использовать время инфузии до 72 часов, более предпочтительно, от 1 до 24 часов, наиболее предпочтительно, приблизительно от 1 часа до 3 часов. Непродолжительное время инфузии, которое позволяет пациенту осуществлять лечение, не оставаясь в больнице на ночь, является особенно желательным. Однако инфузия может продолжаться около 24 часов или даже дольше, если это требуется.

Предпочтительно, введение РМ01183 осуществляют циклами. В соответствии с предпочтительной схемой введения внутривенную инфузию РМ01183 проводят пациентам в течение первой недели каждого цикла, а оставшуюся часть цикла пациенты восстанавливаются. Предпочтительная продолжительность каждого цикла составляет 3 или 4 недели. Если требуется, можно проводиться множество циклов. Введение РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли путем внутривенной инфузии в течение 1 часа один раз в 3 недели является наиболее предпочтительной схемой введения, хотя и другие протоколы можно рекомендовать в качестве вариаций.

В настоящем изобретении особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с другим противораковым лекарственным средством, выбранным из противоопухолевых платиновых координационных комплексов, антиметаболитов, ингибиторов митоза, противораковых антибиотиков, ингибиторов топоизомеразы I и/или II, ингибиторов протеасом, ингибиторов деацетилазы гистонов, алкилирующих агентов, являющихся азотистыми производными горчичного газа, алкилирующих агентов группы нитрозомочевины, неклассических алкилирующих агентов, антагонистов эстрогенов, антагонистов андрогенов, ингибиторов mTOR, ингибиторов тирозинкиназы и других агентов, выбранных из аплидина, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104, для лечения рака.

Особенно предпочтительными типами рака являются типы рака, выбранные из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы (также известной как рак печени), рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака пищевода, нейробластомы, рака головного мозга, рака шейки матки, анального рака, рака яичка, лейкоза, множественной миеломы и лимфомы.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с противоопухолевым платиновым координационным комплексом для лечения рака, более конкретно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака головного мозга и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, тетранитрат платины (BBR3464), сатраплатин, тетраплатин, ормиплатин, ипроплатин, недаплатин и лобаплатин. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином, тетранитратом платины, сатраплатином, тетраплатином, ормиплатином, ипроплатином, недаплатином и лобаплатином и еще более предпочтительной является комбинация с цисплатином и оксалиплатином для лечения рака, более конкретно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки и рака головного мозга.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с антиметаболитом для лечения рака, более конкретно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака пищевода, рака головного мозга, анального рака, лейкоза и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, 5-фторурацил, гемцитабин, цитарабин, капецитабин, децицитабин, флоксуридин, флударабин, аминоптерин, метотрексат, пеметрексед, ралтитрексед, кладрибин, клофарабин, меркаптопурин, пентостатин и тиогуанин. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с 5-фторурацилом, гемцитабином, цитарабином, капецитабином, децитабином, флоксуридином, флударабином, аминоптерином, метотрексатом, пеметрекседом, ралтитрекседом, кладрибином, клофарабином, меркаптопурином, пентостатином и тиогуанином и еще более предпочтительной является комбинация с 5-фторурацилом, гемцитабином, цитарабином и метотрексатом для лечения рака, более предпочтительно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака головного мозга, лейкоза и лимфомы.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с ингибитором митоза для лечения рака, более конкретно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, рака предстательной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака головного мозга, лейкоза и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, паклитаксел, доцетаксел, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с паклитакселом, доцетакселом, винбластином, винкристином, виндезином и винорелбином и еще более предпочтительной является комбинация с паклитакселом, доцетакселом, винкристином и винорелбином для лечения рака, более предпочтительно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, рака предстательной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки и рака головного мозга.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с противораковым антибиотиком для лечения рака, более конкретно для лечения рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, нейробластомы, рака головного мозга, анального рака, рака яичка, лейкоза, множественной миеломы и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон, пиксантрон, валрубицин, митомицин С, блеомицин, актиномицин D и митрамицин. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с даунорубицином, доксорубицином, эпирубицином, идарубицином, митоксантроном, пиксантроном, валрубицином, митомицином С, актиномицином D и митрамицином и еще более предпочтительной является комбинация с даунорубицином, доксорубицином, митомицином С и актиномицином В для лечения рака, более предпочтительно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака головного мозга, лейкоза и лимфомы.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с ингибитором топоизомеразы I и/или II для лечения рака, более конкретно для лечения рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, нейробластомы, рака головного мозга, рака шейки матки, рака яичка, лейкоза и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, топотекан, SN-38, иринотекан, камптотецин, рубитекан, этопозид, амсакрин и тенипозид. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с топотеканом, SN-38, иринотеканом, камптотецином, рубитеканом, этопозидом, амсакрином и тенипозидом и еще более предпочтительной является комбинация с топотеканом, иринотеканом и этопозидом для лечения рака, более предпочтительно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки и рака головного мозга.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с ингибитором протеосом для лечения рака, более конкретно для лечения рака легкого, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, гепатомы, колоректального рака, рака головного мозга, множественной миеломы и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, бортезомиб, дисульфирам, галлат эпигаллокатехина и салиноспорамид А. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с бортезомибом, дисульфирамом, галлатом эпигаллокатехина и салиноспорамидом А и еще более предпочтительной является комбинация с бортезомибом для лечения рака, более предпочтительно для лечения рака, выбранного из рака легкого, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, гепатомы, колоректального рака и рака головного мозга.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с ингибитором деацетилазы гистонов, для лечения рака, более конкретно для лечения рака легкого, саркомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака головного мозга и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, ромидепсин, панобиностат, вориностат, моцетиностат, белиностат, энтиностат, ресминостат, PCI-24781, AR-42, CUDC-101 и вальпроевую кислоту. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с ромидепсином, панобиностатом, вориностатом, моцетиностатом, белиностатом, энтиностатом, ресминостатом, PCI-24781, AR-42, CUDC-101 и вальпроевой кислотой и еще более предпочтительной является комбинация с вориностатом для лечения рака, более предпочтительно для лечения рака легкого, саркомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки и рака головного мозга.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с алкилирующим агентом, являющимся азотистым производным горчичного газа, для лечения рака, более конкретно для лечения рака легкого, саркомы, рака мочевого пузыря, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, лейкоза, множественной миеломы и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, мелфалан, ифосфамид, хлорамбуцил, циклофосфамид, мехлоретамин, урамустин, эстрамустин и бендамустин. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с мелфаланом, ифосфамидом, хлорамбуцилом, циклофосфамидом, мехлоретамином, урамустином, эстрамустином и бендамустином и еще более предпочтительной является комбинация с циклофосфамидом для лечения рака, более предпочтительно для лечения рака легкого, саркомы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака и рака почки.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с алкилирующим агентом группы нитрозомочевины для лечения рака, более конкретно для лечения рака легкого, рака яичника, рака молочной железы, рака головного мозга, множественной миеломы и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, ломустин, сумустин, кармустин, фотемустин и стрептозоцин. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с ломустином, семустином, кармустином, фотемустином и стрептозоцином и еще более предпочтительной является комбинация с кармустином для лечения рака, более предпочтительно рака легкого, рака яичника и рака молочной железы.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с неклассическим алкилирующим агентом для лечения рака, более конкретно для лечения рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака головного мозга, лейкоза и лимфомы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, прокарбазин, дакарбазин, темозоломид и алтретамин. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с прокарбазином, дакарбазином, темозоломидом и алтретамином и еще более предпочтительной является комбинация с дакарбазином и тезоломидом для лечения рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака желудка, рака яичника, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки и рака головного мозга.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с антагонистом эстрогенов для лечения рака, более конкретно для лечения рака молочной железы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, торемифен, фулвестрант, тамоксифен и нафоксидин. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с торемифеном, фулвестрантом, тамоксифеном и нафоксидином и еще более предпочтительной является комбинация с тамоксифеном для лечения рака молочной железы.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с антагонистом андрогенов для лечения рака, более конкретно для лечения рака предстательной железы. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, бикалутамид, флутамид, MDV3100 и нилутамид. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с бикалутамидом, флутамидом, MDV3100 и нилутамидом и еще более предпочтительной является комбинация с флутамидом для лечения рака предстательной железы.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с ингибитором mTOR для лечения рака, более конкретно для лечения рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки и рака головного мозга. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, сиролимус, темсиролимус, эверолимус, ридафоролимус, KU-0063794 и WYE-354. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с сиролимусом, темсиролимусом, эверолимусом, ридафоролимусом KU-0063794 и WYE-354 и еще более предпочтительной является комбинация с темсиролимусом для лечения рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, рака молочной железы, колоректального рака и рака головного мозга.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с ингибитором тирозинкиназы для лечения рака, более конкретно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки и рака головного мозга. Указанная химиотерапевтическая группа включает в себя, без ограничения, эрлотиниб, сорафениб, акситиниб, бозутиниб, седираниб, кризотиниб, дасатиниб, гефитиниб, иматиниб, канертиниб, лапатиниб, лестауртиниб, нератиниб, нилотиниб, семаксаниб, сунитиниб, ваталаниб и вандетаниб. Особенно предпочтительной является комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с эрлотинибом, сорафенибом, акситинибом, бозутинибом, седиранибом, кризотинибом, дасатинибом, гефитинибом, иматинибом, канертинибом, лапатинибом, лестауртинибом, нератинибом, нилотинибом, семаксанибом, сунитинибом, ваталанибом и вандетанибом и еще более предпочтительной является комбинация с эрлотинибом для лечения рака, более конкретно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки и рака головного мозга.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с аплидином для лечения рака, более конкретно для лечения рака, выбранного из саркомы, рака желудка, рака яичника, колоректального рака, рака почки, рака головного мозга и лейкоза.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с ЕТ-743 (трабектедином) для лечения рака, более конкретно для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, рака почки, лейкоза и лимфомы.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с РМ02734 для лечения рака, более конкретно для лечения рака, выбранного из саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака головного мозга, лейкоза и лимфомы.

РМ02734 ((4S)-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-Ile-cyclo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-L-Phe-Z-Dhb-L-Val)) представляет собой синтетический депсипептид, относящийся к семейству кахалалидовых соединений, который в настоящее время проходит клинические испытания для лечения рака. Указанное соединение является предметом WO 2004/035613 и имеет следующую структуру:

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с РМ00104 для лечения рака и, более конкретно, для лечения рака, выбранного из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, рака почки, лейкоза и лимфомы.

РМ00104 представляет собой синтетический алкалоид, относящийся к джорумицину и рениерамицинам, а также к сафрамицину и сафрамициновым соединениям, который в настоящее время проходит клинические испытания для лечения рака и имеет следующую структуру:

Дополнительные подробности о РМ00104 см. в WO 01/87894.

Изобретение включает в себя любую фармацевтически приемлемую соль любого лекарственного средства, упомянутого в настоящем документе, которая может быть синтезирована из родительского соединения любыми обычными способами, как было описано ранее.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к синергическим комбинациям РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с другим противораковым лекарственным средством, выбранным из перечня лекарственных средств, представленного выше. Доказательства синергизма можно получить тестированием комбинаций и анализом результатов, например, способом Чоу-Талалая или любым другим подходящим способом, таким как способы, представленные в разделе «Примеры».

Возможные благоприятные результаты синергизма включают в себя: 1) повышение эффективности терапевтического воздействия, 2) уменьшение дозировки при повышении или сохранении такой же эффективности для избежания токсичности, 3) минимизацию или замедление развития резистентности к лекарственным средствам и 4) обеспечение селективного синергизма в отношении мишени (или синергизма эффективности) по сравнению с хозяином (или антагонизм токсичности). Соответственно, при использовании комбинации двух химиотерапевтических агентов, обладающих синергизмом, схема лечения будет отличаться от схемы, при которой комбинация двух лекарственных средств демонстрирует только аддитивный эффект. С указанной точки зрения, если имеет место синергизм, может потребоваться более низкая доза одного или обоих агентов (по сравнению с количествами, которые используются при терапии одним лекарственным средством) для обеспечения такой же или даже большей эффективности, а возможные токсические эффекты могут быть уменьшены или даже отсутствовать. Альтернативно, если доза обоих лекарственных средств в комбинации является такой же, как при использовании по отдельности (в качестве единственных агентов), можно ожидать повышения эффективности комбинации. Таким образом, наличие синергизма в данной комбинации лекарственных средств будет изменять продолжительность лечения и/или схему лечения.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу увеличения или потенцирования терапевтической эффективности противоракового лекарственного средства, выбранного из перечня лекарственных средств, представленного выше, для лечения рака, который включает в себя введение пациенту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в сочетании с указанным другим противораковым лекарственным средством. Доказательства увеличения или потенцирования терапевтической эффективности можно получить тестированием комбинаций и анализом результатов, например ингибирования опухолевого роста. Указанное ингибирование опухолевого роста можно оценить сравнением среднего объема опухоли при лечении, объединяющем два лекарственных средства (РМ01183 и другое лекарственное средство), со средним объемом опухоли при монотерапии другим лекарственным средством. С данной точки зрения увеличение или потенцирование терапевтической эффективности определяется, когда ответ на комбинированное лечение превышает самый лучший ответ на наиболее активное лекарственное средство, введенное как единственный агент (монотерапия) по той же схеме и при той же дозе, которые используются в комбинированном лечении. Указанный аспект изобретения далее иллюстрируется в разделе «Примеры», особенно в примерах 13-19.

В другом аспекте изобретение относится к применению РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения рака путем комбинированной терапии с использованием РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и другого противоракового лекарственного средства, выбранного из перечня лекарственных средств, представленного выше.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения рака, включающему в себя введение пациенту, который нуждается в указанном лечении, терапевтически эффективного количества РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с терапевтически эффективным количеством другого противоракового лекарственного средства, выбранного из перечня лекарственных средств, представленного выше.

В другом аспекте изобретение относится к РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли для применения для лечения рака, включающего в себя введение терапевтически эффективного количества РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с терапевтически эффективным количеством другого противоракового лекарственного средства, выбранного из перечня лекарственных средств, представленного выше.

Согласно настоящему изобретению РМ01183 или его фармацевтически приемлемая соль и другое противораковое лекарственное средство может поставляться в одном и том же лекарственном препарате или в виде различных лекарственных препаратов для введения в одно и то же время или в разное время. Предпочтительно, РМ01183 или его фармацевтически приемлемую соль и другое противораковое лекарственное средство поставляют в виде различных лекарственных препаратов для введения в разное время. При раздельном введении в разное время первым можно вводить или РМ01183 или его фармацевтически приемлемая соль, или другое противораковое лекарственное средство. Помимо этого, оба лекарственных средства можно вводить в один и тот же день или в разные дни, и их можно вводить с использованием одной и той же схемы или различающихся схем в течение цикла лечения. Кроме того, введение обоих лекарственных средств можно осуществлять с использованием одного и того же пути введения или различных путей введения. Например, оба лекарственных средства можно вводить внутривенно или, альтернативно, одно лекарственное средство можно вводить перорально, а другое - внутривенным путем.

Таким образом, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать в себя все компоненты (лекарственные средства) в единой фармацевтически приемлемой композиции, или, альтернативно, компоненты могут помещаться в разные композиции и вводиться в комбинации друг с другом. Различные фармацевтически приемлемые композиции, хорошо известные специалистам, можно использовать в настоящем изобретении. Более того, специалист может осуществлять выбор подходящей композиции для использования в настоящем изобретении с учетом пути введения и характеристик растворимости компонентом композиции.

Корректные дозировки обоих лекарственных средств в комбинации будут варьироваться в соответствии с конкретной композицией, способом применения и конкретной области, пациента и опухоли, подвергаемых лечению. Другие факторы, такие как возраст, масса тела, пол, диета, время введения, скорость экскреции, состояние пациента, другие лекарственные комбинации, реакции чувствительности и тяжесть заболевания, должны приниматься во внимание. Введение можно осуществлять непрерывно или периодически в пределах переносимой дозы.

Комбинацию по настоящему изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с одним или более из ряда противораковых агентов или агентов для поддерживающего лечения.

Помимо этого, в зависимости от типа опухоли и стадии развития заболевания, противораковые эффекты лечения по настоящему изобретению включают в себя, без ограничения, ингибирование опухолевого роста, задержку опухолевого роста, регрессию опухоли, уменьшение размеров опухоли, увеличение интервала времени до повторного роста опухоли после прекращения лечения, замедление прогрессирования заболевания и предотвращение появления метастазов. Ожидается, что когда лечение по настоящему изобретению проводится пациенту, такому как пациент-человек, указанное лечение будет оказывать действие, по измерению, например, длительностью противоракового эффекта, степенью ответа, временем до прогрессирования заболевания или коэффициентом выживания. В частности, лечение по настоящему изобретению подходит для пациентов-людей, особенно для тех, у которых наблюдаются рецидивы или рефрактерность к ранее проводившейся химиотерапии. Рассматривается также первая линия терапии.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору для применения для лечения рака, включающему в себя РМ01183 или его фармацевтически приемлемую соль в виде дозированных единиц для по меньшей мере одного цикла, и напечатанные инструкции для применения РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли с другим противораковым лекарственным средством, выбранным из представленного выше перечня, в комбинации.

В родственном аспекте настоящее изобретение относится к набору для применения для лечения рака, включающему в себя РМ01183 или его фармацевтически приемлемую соль в виде дозированных единиц для по меньшей мере одного цикла, другое противораковое лекарственное средство, выбранное из представленного выше перечня, в виде дозированных единиц для по меньшей мере одного цикла, и напечатанные инструкции для применения обоих лекарственных средств в комбинации.

В другом аспекте настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, включающей в себя РМ01183 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, для применения в комбинации с другим противораковым лекарственным средством, выбранным из представленного выше перечня лекарственных средств, для лечения рака.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, включающей в себя РМ01183 или его фармацевтически приемлемую соль, другое противораковое лекарственное средство, выбранное из представленного выше перечня лекарственных средств, и фармацевтически приемлемый носитель. Указанная фармацевтическая композиция является предпочтительной для применения для лечения рака.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления композиции для применения в комбинации с другим противораковым лекарственным средством, выбранным из представленного выше перечня лекарственных средств, для лечения рака.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака в комбинированной терапии с другим противораковым лекарственным средством, выбранным из представленного выше перечня лекарственных средств.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения раковые клетки подвергаются контакту или какому-либо другому воздействию комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и другого противоракового лекарственного средства, выбранного из представленного выше перечня лекарственных средств. Раковые клетки предпочтительно являются человеческими и включают в себя клетки карциномы, клетки саркомы, клетки лейкоза, клетки лимфомы и клетки миеломы. Более предпочтительно, раковые клетки представляют собой клетки рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака пищевода, нейробластомы, рака головного мозга, рака шейки матки, анального рака, рака яичка, лейкоза, множественной миеломы и лимфомы. Помимо этого, комбинация оказывает синергическое ингибирующее действие против раковых клеток, особенно против человеческих раковых клеток, упомянутых выше.

Например, комбинация ингибирует пролиферацию или выживание контактировавших раковых клеток. Более низкий уровень пролиферации или выживания контактировавших раковых клеток по сравнению с неконтактировавшими раковыми клетками подтверждает эффективность комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и другого противоракового лекарственного средства, выбранного из представленного выше перечня лекарственных средств, для лечения пациента, страдающего раком.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста раковых клеток, включающему в себя контактирование указанных раковых клеток с эффективным количеством РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с другим противораковым лекарственным средством, выбранным из представленного выше перечня лекарственных средств.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста раковых клеток, включающему в себя контактирование указанных раковых клеток с синергической комбинацией РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и другого противоракового лекарственного средства, выбранного из представленного выше перечня лекарственных средств, в котором указанная комбинация обеспечивает улучшенное ингибирование роста раковых клеток по сравнению (i) с РМ01183 или его фармацевтически приемлемой солью в отсутствие другого противоракового лекарственного средства или (ii) с другим противораковым лекарственным средством в отсутствие РМ01183.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в себя синергическую комбинацию РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и другого противоракового лекарственного средства, выбранного из представленного выше перечня лекарственных средств, для ингибирования роста раковых клеток, в которой указанная комбинация обеспечивает улучшенное ингибирование роста раковых клеток по сравнению (i) с РМ01183 или его фармацевтически приемлемой солью в отсутствие другого противоракового лекарственного средства или (ii) с другим противораковым лекарственным средством в отсутствие РМ01183.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения комбинация РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и другого противоракового лекарственного средства, выбранного из представленного выше перечня лекарственных средств, ингибирует опухолевый рост или уменьшает размеры опухоли in vivo. В частности, комбинация ингибирует in vivo рост и/или уменьшает размеры карциномы, саркомы, лейкоза, лимфомы и миеломы. Предпочтительно, комбинация ингибирует in vivo рост опухолей легкого, саркомы, злокачественной меланомы, мочевого пузыря, предстательной железы, поджелудочной железы, щитовидной железы, желудка, яичника, гепатомы, молочной железы, колоректального рака, почки, пищеводы, нейробластомы, головного мозга, шейки матки, анального рака, яичка, лейкоза, множественной миеломы и лимфомы.

Например, указанные комбинации ингибируют опухолевый рост или уменьшают размеры человеческих раковых ксенотрансплантатов, особенно человеческих опухолевых ксенотрансплантатов желудка, поджелудочной железы, саркомы, легкого, колоректального рака и яичника, у экспериментальных животных. Уменьшение роста или размеров человеческих раковых ксенотрансплантатов у экспериментальных животных указанными комбинациями дополнительно подтверждает эффективность комбинации РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли и другого противоракового лекарственного средства, выбранного из представленного выше перечня лекарственных средств, для лечения пациента, страдающего раком.

Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения размеров опухоли, включающему в себя введение эффективного количества РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с другим противораковым лекарственным средством, выбранным из представленного выше перечня лекарственных средств.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования опухолевого роста, включающему в себя введение эффективного количества РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с другим противораковым лекарственным средством, выбранным из представленного выше перечня лекарственных средств.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение. Указанные примеры не следует интерпретировать как ограничение объема изобретения.

Для более краткого описания некоторые количественные выражения в настоящем документе не квалифицируются термином «приблизительно». Понятно, что, используется ли термин «приблизительно» однозначно или нет, подразумевается, что каждое количество, приведенное в настоящем документе, относится к истинной данной величине, а также подразумевается, что оно относится к приближению к данной величине, что понятно специалисту, включая эквиваленты и приближения, вытекающие из условий эксперимента и/или измерения для указанной данной величины.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии карциномы легкого

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения карциномы легкого.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: оксалиплатин, кармустин, циклофосфамид, митомицин С (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил (5-FU), гемцитабин, паклитаксел, доцетаксел, винкристин, даунорубицин, актиномицин D, топотекан, этопозид, бортезомиб, вориностат, дакарбазин, темсиролимус, эрлотиниб, ЕТ-743 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия карциномы легкого А549. Клетки А549 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на клетках А549 после 72 часов воздействия лекарственного средства. Кратко, клетки собирали и засевали на 96-луночные микротитрационные планшеты с плотностью 5000 клеток в 150 мкл культуральной среды и инкубировали в течение 24 часов в среде, не содержавшей лекарственного средства, до обработки только носителем или испытуемыми соединениями в течение 72 часов.

Цитотоксический эффект измеряли анализом восстановления MTT, в котором использовали бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия, тетразол, который восстанавливается до пурпурного формазана в митохондриях живых клеток. МТТ (50 мкл 1 мг/мл маточного раствора) добавляли в лунки и инкубировали в течение 8 часов при 37°С до образования кристаллов формазана. После осторожного удаления культуральной среды добавляли DMSO для растворения нерастворимого пурпурного формазана с получением окрашенного раствора. Спектральную поглощательную способность лунок оценивали количественно измерением оптической плотности на 540 нм. Результаты выражали в процентных долях от контрольного клеточного роста. Величины IC₅₀ (концентрацию лекарственного средства, которая вызывает 50% ингибирование клеточного роста), использовавшиеся для исследований комбинаций, рассчитывали с использованием компьютерной программы Prism v5.02 (GraphPad). Результаты выражали как молярную концентрацию и представляли среднюю величину от 2-4 независимых анализов.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии А549 представлены в таблице 1.

Таблица 1 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	3,60E-09	Оксалиплатин	9,00E-04	5-FU	9,23E-05
Гемцитабин	2,80E-10	Паклитаксел	4,00E-08	Доцетаксел	3,00E-09
Винкристин	2,50E-07	Даунорубицин	3,55E-07	Митомицин С	2,49E-04
Актиномицин D	4,70E-09	Топотекан	8,00E-07	Этопозид	7,82E-07
Бортезомиб	3,10E-09	Вориностат	6,81E-06	Циклофосфамид	1,00E-03
Кармустин	1,00E-03	Дакарбазин	6,00E-04	Темсиролимус	3,29E-06
Эрлотиниб	1,00E-05	ЕТ-743	2,25E-08	РМ00104	7,00E-09

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки А549 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше. Ранее полученные величины IC₅₀ использовали в качестве исходных концентраций для каждого соединения (100% концентрация). Произвольные разведения как процентные доли от исходной величины IC₅₀ (100%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25% и 0%) осуществляли для каждой пары соединений и тестировали в объединенных комплементарных (противоположные концентрации) кривых доза-ответ следующим образом:

IC50 РМ01183	IC50 агента
100%	0%
75%	25%
70%	30%
60%	40%
50%	50%
40%	60%
30%	70%
25%	75%
0%	100%

В качестве визуального средства величины ответов наносили на график рассеяния с соотношениями доз по оси х и % ответа по оси y. Горизонтальная линия была проведена между двумя конечными величинами ответа (например, между величинами ответа для 100% IC₅₀ РМ01183 и 100% IC₅₀ стандартного химиотерапевтического агента). В случаях, когда величины ответа в двух конечных точках были приблизительно эквивалентными, точки, лежавшие выше или ниже указанной расчетной линии аддитивности, можно было интерпретировать как представляющие антагонистическое или синергическое взаимодействие лекарственных средств соответственно.

In vitro комбинации каждого лекарственного средства с РМ01183 обладают потенциалом синергизма, аддитивности или антагонизма. Синергическая цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам представляет собой оптимальный эффект и подразумевает, что комбинация РМ01183 с другим лекарственным средством является более эффективной, чем каждое из лекарственных средств по отдельности.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии карциномы легкого А549:

а. Комбинация РМ01183 с оксалиплатином продемонстрировала сильный синергизм (фигура 1).

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 2) и РМ01183 с гемцитабином (фигура 3) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

с. Комбинация РМ01183 с паклитакселом показала синергизм (фигура 4) при соотношениях доз 50/50-40/60, в то время как комбинация РМ01183 с доцетакселом показала синергизм (фигура 5) при соотношениях доз 75/25 и 50/50, а комбинация РМ01183 с винкристином (фигура 6) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 7), РМ01183 с митомицином С (фигура 8) и РМ01183 с актиномицином D (фигура 9) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом показала сильный синергизм (фигура 10), в то время как комбинация РМ01183 с этопозидом показала синергизм (фигура 11) при соотношениях доз 60/40 и 25/75.

f. Комбинация РМ01183 с бортезомибом показала синергизм (фигура 12) при соотношениях доз 40/60-30/70.

g. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 13) показала сильный синергизм почти при всех соотношениях доз.

h. Комбинация РМ01183 с циклофосфамидом (фигура 14) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

i. Комбинация РМ01183 с кармустином показала сильный синергизм (фигура 15).

j. Комбинация РМ01183 с дакарбазином показала сильный синергизм (фигура 16).

k. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом показала синергизм (фигура 17) почти при всех соотношениях доз.

l. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом показала сильный синергизм (фигура 18).

m. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 показала синергизм (фигура 19) при соотношениях доз 75/25-60/40 и 30/70.

n. Комбинация РМ01183 с РМ00104 (фигура 20) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

ПРИМЕР 2. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии саркомы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения саркомы.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, оксалиплатин, циклофосфамид, митомицин С (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), гемцитабин, доцетаксел, винкристин, винорелбин, даунорубицин, цитарабин, актиномицин D, топотекан, этопозид, вориностат, дакарбазин, темсиролимус, эрлотиниб, аплидин, РМ02734, ЕТ-743 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия рабдомиосаркомы А673. Клетки А673 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии А673 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии А673 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 2.

Таблица 2 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	2,20E-09	Цисплатин	3,03Е-05	Оксалиплатин	7,80E-05
Цитарабин	1,97E-07	Гемцитабин	4,34E-10	Доцетаксел	6,50E-10
Винкристин	8,60E-09	Винорелбин	5,00E-08	Даунорубицин	5,20E-07
Митомицин С	2,99E-06	Актиномицин D	9,56E-10	Топотекан	2,40E-08
Этопозид	1,55E-06	Вориностат	2,16E-06	Циклофосфамид	1,00E-03
Дакарбазин	3,00E-04	Темсиролимус	1,00E-06	Эрлотиниб	5,00E-05
Аплидин	2,16E-09	ЕТ-743	1,90E-09	РМ02734	3,60E-06
РМ00104	3,00E-09

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки А673 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии саркомы А673:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 21) и РМ01183 с оксалиплатином (фигура 22) продемонстрировала сильный синергизм.

b. Комбинация РМ01183 с цитарабином продемонстрировала сильный синергизм (фигура 23), в то время как комбинация РМ01183 с гемцитабином показала синергизм (фигура 24) при соотношениях доз 75/25-70/30.

с. Комбинация РМ01183 с доцетакселом (фигура 25), РМ01183 с винкристином (фигура 26) и РМ01183 с винорелбином (фигура 27) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 28) и РМ01183 с актиномицином D (фигура 30) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с митомицином С (фигура 29) показала сильный синергизм.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 31) и РМ01183 с этопозидом (фигура 32) показала сильный синергизм почти при всех соотношениях доз.

f. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 33) показала сильный синергизм

g. Комбинация РМ01183 с циклофосфамидом (фигура 34) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

h. Комбинация РМ01183 с дакарбазином показала синергизм (фигура 35) при соотношениях доз 75/25-70/30 и 40/60.

i. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом показала сильный синергизм (фигура 36).

j. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом показала сильный синергизм (фигура 37).

k. Комбинация РМ01183 с аплидином показала синергизм (фигура 38) при соотношениях доз 50/50-30/70.

l. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 (фигура 39) показала синергизм при соотношениях доз 30/70-25/75.

m. Комбинация РМ01183 с РМ02734 (фигура 40) показала синергизм при соотношениях доз 75/25 и 40/60.

n. Комбинация РМ01183 с РМ00104 показала синергизм (фигура 41).

ПРИМЕР 3. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии злокачественной меланомы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения злокачественной меланомы.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, митомицин С (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил, доксорубицин, даунорубицин, цитарабин, топотекан, иринотекан, метотрексат, этопозид, дакарбазин, темсиролимус, РМ02734, ЕТ-743 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия меланомы SK-MEL-2. Клетки SK-MEL-2 культивировали в минимальной эссенциальной среде Игла (МЕМЕ) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии SK-MEL-2 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии SK-MEL-2 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 3.

Таблица 3 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	2,00E-09	Цисплатин	1,60E-04	5-FU	7,00E-04
Цитарабин	3,89E-06	Метотрексат	1,00E-04	Даунорубицин	1,77E-07
Доксорубицин	3,00E-07	Митомицин С	9,00E-07	Топотекан	4,37E-07
Иринотекан	1,80E-05	Этопозид	2,89E-06	Дакарбазин	6,30E-04
Темсиролимус	5,00E-05	ЕТ-743	2,00E-09	РМ02734	1,76E-06
РМ00104	2,00E-09

b. Во второй серии исследований опухолевые клетки SK-MEL-2 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии меланомы SK-MEL-2:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 42) показала синергизм при соотношениях доз 75/25, 50/50 и 30/70.

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 43), РМ01183 с цитарабином (фигура 44) и РМ01183 с метотрексатом (фигура 45) продемонстрировала сильный синергизм.

с. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 46) и РМ01183 с доксорубицином (фигура 47) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с митомицином С (фигура 48) показала сильный синергизм.

d. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 49), РМ01183 с иринотеканом (фигура 50) и РМ01183 с этопозидом (фигура 51) показала синергизм и даже сильный синергизм при нескольких соотношениях доз.

е. Комбинация РМ01183 с дакарбазином показала синергизм (фигура 52).

f. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом показала сильный синергизм (фигура 53).

g. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 (фигура 54) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

h. Комбинация РМ01183 с РМ02734 (фигура 55) показала синергизм при соотношениях доз 25/75-50/50.

i. Комбинация РМ01183 с РМ00104 (фигура 56) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

ПРИМЕР 4. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии карциномы предстательной железы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения рака предстательной железы.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, оксалиплатин, митомицин С (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил, гемцитабин, доцетаксел, паклитаксел, винорелбин, даунорубицин, цитарабин, доксорубицин, актиномицин D, топотекан, иринотекан, метотрексат, этопозид, вориностат, темсиролимус, бортезомиб, эрлотиниб, флутамид, РМ02734, ЕТ-743 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия аденокарциномы предстательной железы РС-3. Клетки РС-3 культивировали в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии РС-3 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии РС-3 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 4.

Таблица 4 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	2,60E-09	Цисплатин	1,10E-04	Оксалиплатин	1,71E-04
5-FU	1,00E-03	Цитарабин	4,00E-05	Гемцитабин	4,00E-07
Метотрексат	1,20E-04	Доцетаксел	1,86E-08	Паклитаксел	9,00E-08
Винорелбин	1,00E-05	Даунорубицин	1,15E-06	Доксорубицин	1,48E-06
Митомицин С	1,00E-05	Актиномицин D	1,00E-08	Топотекан	6,33E-07
Иринотекан	7,00E-05	Этопозид	4,80E-05	Бортезомиб	8,00E-07
Вориностат	3,90E-06	Флутамид	4,90E-05	Темсиролимус	5,00E-07
Эрлотиниб	2,33E-04	ЕТ-743	8,00E-09	РМ02734	5,40E-07
РМ00104	7,10E-09

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки РС-3 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии рака предстательной железы РС-3:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 57) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с оксалиплатином (фигура 58) продемонстрировала сильный синергизм.

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 59) и РМ01183 с цитарабином (фигура 60) продемонстрировала синергизм почти при всех соотношениях доз, а комбинация РМ01183 с гемцитабином показала сильный синергизм (фигура 61). И, наконец, комбинация РМ01183 с метотрексатом показала синергизм (фигура 62) при соотношениях доз 30/70-25/75.

с. Комбинация РМ01183 с доцетакселом показала синергизм (фигура 63) почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с паклитакселом (фигура 64) показала синергизм при соотношениях доз 40/60-30/70. Комбинация РМ01183 с винорелбином (фигура 65) показала сильный синергизм.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 66) и РМ01183 с доксорубицином (фигура 67) показала сильный синергизм. Комбинация РМ01183 с митомицином С (фигура 68) и РМ01183 с актиномицином D (фигура 69) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 70) и РМ01183 с иринотеканом (фигура 71) показала сильный синергизм, в то время как комбинация РМ01183 с этопозидом (фигура 72) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

f. Комбинация РМ01183 с бортезомибом (фигура 73) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

g. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 74) показала синергизм.

h. Комбинация РМ01183 с флутамидом (фигура 75) показала синергизм при соотношениях доз 40/60-25/75.

i. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом показала сильный синергизм (фигура 76).

j. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом (фигура 77) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

k. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 (фигура 78) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

l. Комбинация РМ01183 с РМ02734 (фигура 79) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-70/30 и 30/70.

m. Комбинация РМ01183 с РМ00104 показала сильный синергизм (фигура 80).

ПРИМЕР 5. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии карциномы поджелудочной железы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения карциномы поджелудочной железы.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, оксалиплатин (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), гемцитабин, даунорубицин, цитарабин, доксорубицин, актиномицин D, топотекан, иринотекан, метотрексат, этопозид, вориностат, темсиролимус, бортезомиб, эрлотиниб, РМ02734, ЕТ-743 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия карциномы поджелудочной железы PANC-1. Клетки PANC-1 культивировали в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии PANC-1 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии PANC-1 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 5.

Таблица 5 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	2,80E-09	Цисплатин	1,47E-04	Оксалиплатин	1,84E-04
Цитарабин	9,00E-05	Гемцитабин	1,00E-06	Метотрексат	1,00E-05
Даунорубицин	8,69E-07	Доксорубицин	3,45E-06	Актиномицин D	2,20E-08
Топотекан	4,37E-06	Иринотекан	9,00E-05	Этопозид	1,00E-05
Бортезомиб	4,16E-07	Вориностат	6,05E-06	Темсиролимус	1,00E-05
Эрлотиниб	4,16E-07	ЕТ-743	2,10E-08	РМ02734	9,00E-06
РМ00104	7,89E-09

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки PANC-1 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии рака поджелудочной железы PANC-1:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 81) и РМ01183 с оксалиплатином (фигура 82) продемонстрировала сильный синергизм.

b. Комбинация РМ01183 с цитарабином (фигура 83) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с гемцитабином (фигура 84) и РМ01183 с метотрексатом (фигура 85) показала сильный синергизм.

с. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 86) и РМ01183 с доксорубицином (фигура 87) показала синергизм, в то время как комбинация РМ01183 с актиномицином D (фигура 88) показала синергизм при соотношениях доз 75/25 и 30/70-25/75.

d. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 89) и РМ01183 с иринотеканом (фигура 90) показала сильный синергизм, в то время как комбинация РМ01183 с этопозидом (фигура 91) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

е. Комбинация РМ01183 с бортезомибом (фигура 92) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-70/30 и 50/50.

f. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 93) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

g. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом показала сильный синергизм (фигура 94).

h. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом показала сильный синергизм (фигура 95).

i. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 (фигура 96) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

j. Комбинация РМ01183 с РМ02734 (фигура 97) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

k. Комбинация РМ01183 с РМ00104 показала синергизм (фигура 98) при соотношениях доз 75/25 и 50/50.

ПРИМЕР 6. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии карциномы желудка

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения рака желудка.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, оксалиплатин, циклофосфамид (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил, гемцитабин, паклитаксел, винкристин, винорелбин, даунорубицин, дакарбазин, цитарабин, доксорубицин, актиномицин D, топотекан, иринотекан, метотрексат, этопозид, вориностат, темсиролимус, бортезомиб, эрлотиниб, аплидин, РМ02734, ЕТ-743 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия карциномы желудка HGC-27. Клетки HGC-27культивировали в среде Дульбекко в модификации Исков (IDMD) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии HGC-27 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии HGC-27 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 6.

Таблица 6 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	8,50E-10	Цисплатин	8,00-E-05	Оксалиплатин	1,06E-04
5-FU	1,00E-05	Цитарабин	5,00E-05	Гемцитабин	5,34E-10
Метотрексат	3,30E-08	Паклитаксел	5,00E-09	Винкристин	1,25E-08
Винорелбин	6,50E-08	Даунорубицин	3,72E-07	Доксорубицин	5,40E-08
Актиномицин D	3,74E-09	Топотекан	8,08E-07	Иринотекан	4,00E-06
Этопозид	2,90E-06	Бортезомиб	5,60E-09	Вориностат	1,20E-06
Циклофосфамид	1,00E-03	Дакарбазин	3,46E-04	Темсиролимус	1,50E-07
Эрлотиниб	7,50E-06	Аплидин	9,00E-09	ЕТ-743	5,80E-09
РМ02734	9,50E-07	РМ00104	3,20E-09

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки HGC-27 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии карциномы желудка HGC-27:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 99) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с оксалиплатином (фигура 100) продемонстрировала сильный синергизм.

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 101) и РМ01183 с цитарабином (фигура 102) продемонстрировала синергизм, иногда даже сильный при тех же самых соотношениях доз. Комбинация РМ01183 с гемцитабином (фигура 103) и РМ01183 с метотрексатом (фигура 104) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

с. Комбинация РМ01183 с паклитакселом показала сильный синергизм (фигура 105). Комбинация РМ01183 с винкристином (фигура 106) и РМ01183 с винорелбином (фигура 107) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 108) и РМ01183 с актиномицином D (фигура 110) показала сильный синергизм. Комбинация РМ01183 доксорубицином (фигура 109) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-60/40.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 71) показала сильный синергизм (фигура 111). Комбинация РМ01183 с иринотеканом (фигура 112) показала синергизм при соотношениях доз 70/30-60/40 и 40/60, в то время как комбинация РМ01183 с этопозидом (фигура 113) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

f. Комбинация РМ01183 с бортезомибом показала сильный синергизм (фигура 114).

g. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 115) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

h. Комбинация РМ01183 с циклофосфамидом показала сильный синергизм (фигура 116).

i. Комбинация РМ01183 с дакарбазином показала сильный синергизм (фигура 117).

j. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом показала сильный синергизм (фигура 118).

k. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом показала сильный синергизм (фигура 119).

l. Комбинация РМ01183 с аплидином показала сильный синергизм (фигура 120).

m. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 (фигура 121) показала синергизм при соотношениях доз 50/50 и 75/25.

n. Комбинация РМ01183 с РМ02734 показала сильный синергизм (фигура 122).

о. Комбинация РМ01183 с РМ00104 (фигура 123) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

ПРИМЕР 7. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии карциномы яичника

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения рака яичника.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, оксалиплатин, циклофосфамид, кармустин, митомицин С (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил, гемцитабин, доцетаксел, паклитаксел, винкристин, винорелбин, даунорубицин, дакарбазин, цитарабин, доксорубицин, актиномицин D, топотекан, иринотекан, метотрексат, этопозид, вориностат, темсиролимус, эрлотиниб, аплидин, РМ02734, ЕТ-743 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия аденокарциномы яичника IGROV-1. Клетки IGROV-1 культивировали в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии IGROV-1 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии IGROV-1 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 7.

Таблица 7 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	3,20E-09	Цисплатин	7,00E-05	Оксалиплатин	8,50E-06
5-FU	9,00E-05	Цитарабин	1,17E-05	Гемцитабин	6,34E-09
Метотрексат	1,00E-04	Доцетаксел	5,01E-08	Паклитаксел	9,50E-08
Винкристин	3,79E-07	Винорелбин	1,39E-06	Даунорубицин	3,55E-07
Доксорубицин	2,59E-07	Актиномицин D	3,29E-09	Митомицин С	3,00E-06
Топотекан	3,00E-07	Иринотекан	1,00E-05	Этопозид	3,06E-06
Вориностат	2,88E-06	Кармустин	7,12E-04	Циклофосфамид	1,00E-03
Дакарбазин	3,98E-04	Темсиролимус	1,27E-07	Эрлотиниб	7,91E-06
Аплидин	1,50E-09	ЕТ-743	6,45E-09	РМ02734	3,33E-07
РМ00104	3,30E-09

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки IGROV-1 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии карциномы яичника IGROV-1:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 124) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с оксалиплатином продемонстрировала сильный синергизм (фигура 125).

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 126) и РМ01183 с цитарабином (фигура 127) продемонстрировала синергизм почти при всех соотношениях доз. Комбинация РМ01183 с гемцитабином (фигура 128) и РМ01183 с метотрексатом (фигура 129) показала синергизм.

с. Комбинация РМ01183 с доцетакселом (фигура 130), РМ01183 с паклитакселом (фигура 131) и РМ01183 с винкристином (фигура 132) показала сильный синергизм, в то время как комбинация РМ01183 с винорелбином (фигура 133) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 134) показала синергизм. Комбинация РМ01183 с доксорубицином (фигура 135) и РМ01183 с актиномицином D (фигура 136) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с митомицином С (фигура 137) показала синергизм при соотношениях доз 50/50 и 30/70-25/75.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 138), РМ01183 с иринотеканом (фигура 139) и РМ01183 с этопозидом (фигура 140) показала синергизм.

f. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 114) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

g. Комбинация РМ01183 с циклофосфамидом (фигура 142) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

h. Комбинация РМ01183 с кармустином (фигура 143) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

i. Комбинация РМ01183 с дакарбазином (фигура 144) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

j. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом показала синергизм (фигура 145).

k. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом показала синергизм (фигура 146).

l. Комбинация РМ01183 с аплидином (фигура 147) показала синергизм при соотношениях доз 70/30-60/40.

m. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 (фигура 148) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-60/40.

n. Комбинация РМ01183 с РМ02734 показала сильный синергизм (фигура 149).

о. Комбинация РМ01183 с РМ00104 (фигура 150) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

ПРИМЕР 8. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии печеночно-клеточной карциномы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения печеночно-клеточного рака.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, оксалиплатин, циклофосфамид (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил, гемцитабин, паклитаксел, доцетаксел, винкристин, винорелбин, даунорубицин, цитарабин, доксорубицин, топотекан, иринотекан, метотрексат, этопозид, бортезомиб, эрлотиниб, ЕТ-743 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия печеночно-клеточной карциномы HepG2. Клетки HepG2 культивировали в минимальной эссенциальной среде Игла (МЕМЕ) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии HepG2 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии HepG2 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 8.

Таблица 8 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	2,50E-09	Цисплатин	5,00E-05	Оксалиплатин	2,80E-05
5-FU	4,50E-06	Цитарабин	2,06E-05	Гемцитабин	5,34E-09
Метотрексат	3,96E-08	Доцетаксел	5,00E-07	Паклитаксел	5,70E-08
Винкристин	6,00E-08	Винорелбин	1,02E-06	Даунорубицин	3,00E-07
Доксорубицин	2,00E-07	Топотекан	1,00E-06	Иринотекан	1,00E-06
Этопозид	1,04E-05	Бортезомиб	3,90E-07	Циклофосфамид	1,00E-03
Эрлотиниб	8,60E-06	ЕТ-743	7,21E-09	РМ00104	3,00E-09

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки HepG2 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии печеночно-клеточного рака HepG2:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 151) и РМ01183 с оксалиплатином (фигура 152) продемонстрировала сильный синергизм.

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 153) показала синергизм при соотношениях доз 75/25, 50/50 и 30/70. Комбинация РМ01183 с цитарабином (фигура 154), РМ01183 с гемцитабином)фигура 155) и РМ01183 с метотрексатом (фигура 156) показала сильный синергизм.

с. Комбинация РМ01183 с доцетакселом (фигура 157) показала сильный синергизм. Комбинация РМ01183 с паклитакселом (фигура 158) и РМ01183 с винкристином (фигура 159) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с винорелбином (фигура 160) показала синергизм при соотношениях доз 50/50 и 30/70-25/75.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 161) и РМ01183 с доксорубицином (фигура 162) показала почти при всех соотношениях доз.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 163) и РМ01183 с этопозидом (фигура 165) показала сильный синергизм. Комбинация РМ01183 с иринотеканом (фигура 164) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

f. Комбинация РМ01183 с бортезомибом (фигура 166) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-60/40.

g. Комбинация РМ01183 с циклофосфамидом (фигура 167) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

h. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом (фигура 168) показала сильный синергизм.

i. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 (фигура 169) показала сильный синергизм при соотношениях доз 60/40-50/50.

j. Комбинация РМ01183 с РМ00104 (фигура 170) показала сильный синергизм.

ПРИМЕР 9. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии карциномы молочной железы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения рака молочной железы.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, оксалиплатин, циклофосфамид, кармустин, митомицин С (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил, гемцитабин, паклитаксел, доцетаксел, винкристин, винорелбин, даунорубицин, дакарбазин, цитарабин, доксорубицин, актиномицин D, топотекан, иринотекан, метотрексат, этопозид, вориностат, темсиролимус, эрлотиниб, тамоксифен, РМ02734, ЕТ-743 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия аденокарциномы молочной железы MDA-MB-231. Клетки MDA-MB-231 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии MDA-MB-231 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии MDA-MB-231 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 9.

Таблица 9 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	3,50E-09	Цисплатин	1,53E-04	Оксалиплатин	1,08E-04
5-FU	9,00E-05	Цитарабин	9,57E-06	Гемцитабин	8,50E-09
Метотрексат	5,94E-06	Доцетаксел	2,50E-09	Паклитаксел	8,50E-09
Винкристин	5,00E-08	Винорелбин	1,20E-05	Даунорубицин	3,70E-07
Доксорубицин	6,00E-07	Актиномицин D	4,54E-10	Митомицин С	2,00E-06
Топотекан	1,66E-07	Иринотекан	8,50E-06	Этопозид	4,80E-06
Вориностат	1,70E-06	Циклофосфамид	1,00E-03	Кармустин	9,00E-04
Дакарбазин	1,92E-05	Тамоксифен	1,30E-05	Темсиролимус	1,20E-05
Эрлотиниб	1,00E-04	ЕТ-743	2,00E-09	РМ02734	2,80E-06
РМ00104	1,00E-09

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки MDA-MB-231 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии карциномы молочной железы MDA-MB-231:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 171) и РМ01183 с оксалиплатином (фигура 172) показала сильный синергизм.

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 173) продемонстрировала синергизм почти при всех соотношениях доз. Комбинация РМ01183 с цитарабином (фигура 174) и РМ01183 с гемцитабином (фигура 175) показала сильный синергизм, в то время как комбинация РМ01183 с метотрексатом (фигура 176) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-70/30 и 50/50.

с. Комбинация РМ01183 с доцетакселом (фигура 177) и РМ01183 с паклитакселом (фигура 178) показала синергизм. Комбинация РМ01183 с винкристином (фигура 179) показала синергизм при соотношениях доз 75/25 и 50/50, в то время как комбинация РМ01183 с винорелбином (фигура 180) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 181) и РМ01183 с митомицином С (фигура 184) показала синергизм почти при всех соотношениях доз. Комбинация РМ01183 с доксорубицином (фигура 182) показала сильный синергизм, а комбинация РМ01183 с актиномицином D (фигура 183) показала синергизм.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 185) показала синергизм почти при всех соотношениях доз. Комбинация РМ01183 с иринотеканом (фигура 186) и РМ01183 с этопозидом (фигура 187) показала синергизм.

f. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 188) показала синергизм при соотношениях доз 75/25 и 50/50-40/60,

g. Комбинация РМ01183 с циклофосфамидом (фигура 189) показала сильный синергизм.

h. Комбинация РМ01183 с кармустином (фигура 190) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

i. Комбинация РМ01183 с дакарбазином (фигура 191) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

j. Комбинация РМ01183 с тамоксифеном (фигура 192) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

k. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом показала сильный синергизм (фигура 193).

l. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом показала сильный синергизм (фигура 194).

m. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 показала сильный синергизм (фигура 195).

n. Комбинация РМ01183 с РМ02734 (фигура 196) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

о. Комбинация РМ01183 с РМ00104 (фигура 197) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

ПРИМЕР 10. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии колоректальной карциномы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения колоректального рака.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, оксалиплатин, циклофосфамид, митомицин С (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил, гемцитабин, доцетаксел, винорелбин, даунорубицин, дакарбазин, цитарабин, доксорубицин, актиномицин D, топотекан, иринотекан, этопозид, вориностат, бортезомиб, темсиролимус, эрлотиниб, РМ02734 и аплидин (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия аденокарциномы толстой кишки НТ-29. Клетки НТ-29 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии НТ-29 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии НТ-29 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 10.

Таблица 10 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	3,70E-09	Цисплатин	2,20E-04	Оксалиплатин	1,03E-04
5-FU	9,00E-06	Цитарабин	7,80E-06	Гемцитабин	4,00E-07
Доцетаксел	3,20E-10	Винорелбин	3,00E-08	Даунорубицин	5,32E-07
Доксорубицин	9,00E-07	Актиномицин D	3,27E-09	Митомицин С	2,00E-06
Топотекан	3,28E-07	Иринотекан	9,00E-06	Этопозид	5,44E-06
Бортезомиб	6,15E-09	Вориностат	2,76E-06	Циклофосфамид	1,00E-03
Дакарбазин	2,47E-05	Темсиролимус	3,50E-06	Эрлотиниб	2,56E-05
Аплидин	1,76E-09	Рм02734	2,14E-07

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки НТ-29 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии колоректальной карциномы НТ-29:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 198) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-70/30, в то время как комбинация РМ01183 с оксалиплатином (фигура 199) продемонстрировала сильный синергизм.

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 200) и РМ01183 с гемцитабином (фигура 202) продемонстрировала синергизм почти при всех соотношениях доз, а комбинация РМ01183 с цитарабином (фигура 201) показала сильный синергизм.

с. Комбинация РМ01183 с доцетакселом (фигура 203) показала синергизм при соотношениях доз 50/50 и 75/25, в то время как комбинация РМ01183 с винорелбином (фигура 204) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 205) и РМ01183 с митомицином С (фигура 208) показала сильный синергизм. Комбинация РМ01183 с доксорубицином (фигура 206) и РМ01183 с актиномицином D (фигура 207) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 209) и РМ01183 с этопозидом (фигура 211) показала сильный синергизм. Комбинация РМ01183 с иринотеканом (фигура 210) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

f. Комбинация РМ01183 с бортезомибом (фигура 212) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

g. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 213) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

h. Комбинация РМ01183 с циклофосфамидом (фигура 214) показала синергизм при соотношениях доз 40/60-25/75.

i. Комбинация РМ01183 с дакарбазином (фигура 215) показала сильный синергизм.

j. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом показала сильный синергизм (фигура 216).

k. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом показала синергизм почти при всех соотношениях доз (фигура 217).

l. Комбинация РМ01183 с аплидином (фигура 218) показала синергизм при соотношениях доз 40/60-25/75.

m. Комбинация РМ01183 с РМ02734 (фигура 219) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

ПРИМЕР 11. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии карциномы почки

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения рака почки.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, циклофосфамид, митомицин С (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил, гемцитабин, метотрексат, доцетаксел, винкристин, винорелбин, даунорубицин, дакарбазин, цитарабин, доксорубицин, актиномицин D, топотекан, иринотекан, этопозид, вориностат, эрлотиниб, РМ02734, ЕТ-743, РМ00104 и аплидин (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия карциномы почки RXF-393. Клетки RXF-393 культивировали в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии RXF-393 после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии RXF-393 рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 11.

Таблица 11 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	5,00E-09	Цисплатин	6,67E-05	5-FU	3,00E-04
Цитарабин	5,00E-05	Гемцитабин	5,00E-07	Метотрексат	1,75E-04
Доцетаксел	5,94E-10	Винкристин	1,73E-08	Винорелбин	8,50E-06
Даунорубицин	6,20E-07	Доксорубицин	8,00E-07	Актиномицин D	7,09E-10
Митомицин С	9,00E-06	Топотекан	3,93E-07	Иринотекан	1,40E-05
Этопозид	2,00E-05	Вориностат	4,10E-06	Циклофосфамид	1,00E-03
Дакарбазин	7,94E-04	Эрлотиниб	4,80E-06	Аплидин	1,50E-09
ЕТ-743	9,60E-09	РМ02734	5,00E-06	РМ00104	5,40E-09

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки RXF-393 инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии карциномы почки RXF-393:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 220) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 221), РМ01183 с цитарабином (фигура 222), РМ01183 с гемцитабином (фигура 223) и РМ01183 с метотрексатом (фигура 224) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

с. Комбинация РМ01183 с доцетакселом (фигура 225), РМ01183 с винкристином (фигура 226) и РМ01183 с винорелбином (фигура 227) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 228) показала синергизм почти при всех соотношениях доз. Комбинация РМ01183 с доксорубицином (фигура 229) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-60/40, в то время как комбинация РМ01183 с актиномицином D (фигура 230) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-70/30 и 30/70. Комбинация РМ01183 с митомицином С (фигура 231) показала сильный синергизм.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 232) показала сильный синергизм. Комбинация РМ01183 с иринотеканом (фигура 233) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с этопозидом (фигура 234) показала синергизм при соотношениях доз 75/25 и 40/60-30/70.

f. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 235) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

g. Комбинация РМ01183 с циклофосфамидом (фигура 236) показала синергизм при соотношениях доз 75/25-70/30 и 25/75.

h. Комбинация РМ01183 с дакарбазином (фигура 237) показала синергизм при соотношениях доз 60/40-50/50.

i. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом показала сильный синергизм (фигура 238).

j. Комбинация РМ01183 с аплидином (фигура 239) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

k. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 (фигура 240) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

l. Комбинация РМ01183 с РМ02734 (фигура 241) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

m. Комбинация РМ01183 с РМ00104 (фигура 242) показала сильный синергизм.

ПРИМЕР 12. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии глиобластомы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность химиотерапевтических агентов, используемых для лечения глиобластомы.

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: цисплатин, оксалиплатин (маточные растворы указанных соединений изготавливали в стерильной воде двойной дистилляции и хранили при -20°С), 5-фторурацил, гемцитабин, доцетаксел, винкристин, даунорубицин, дакарбазин, доксорубицин, топотекан, иринотекан, метотрексат, этопозид, вориностат, темсиролимус, бортезомиб, эрлотиниб, РМ02734, ЕТ-743 и аплидин (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования была выбрана человеческая клеточная линия глиобластомы U87-MG. Клетки U87-MG культивировали в минимальной эссенциальной среде Игла (МЕМЕ) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 1:

а. В первой серии исследований величины IC₅₀ определяли для каждого лекарственного средства на опухолевой клеточной линии U87-MG после 72 часов воздействия лекарственного средства.

Величины IC₅₀ (72 часа воздействия лекарственного средства) каждого отдельного агента для опухолевой клеточной линии U87-MG рассчитаны по той же методике, которая описана в примере 1, и представлены в таблице 12.

Таблица 12 Величины IC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента
Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)	Соединение	IC50 (М)
РМ01183	4,50E-09	Цисплатин	4,40E-05	Оксалиплатин	1,90E-04
5-FU	1,00E-03	Гемцитабин	4,50E-07	Метотрексат	5,00E-05
Доцетаксел	1,00E-07	Винкристин	1,00E-07	Даунорубицин	2,84E-07
Доксорубицин	3,00E-07	Топотекан	7,50E-07	Иринотекан	7,54E-06
Этопозид	1,85E-05	Бортезомиб	4,00E-07	Вориностат	1,60E-05
Дакарбазин	7,00E-04	Темсиролимус	3,50E-06	Эрлотиниб	1,49E-04
Аплидин	3,80E-09	ЕТ-743	5,00E-09	РМ02734	4,08E-06

b. Во второй серии исследований человеческие опухолевые клетки U87-MG инкубировали с РМ01183 в комбинации с каждым из агентов, указанных выше, в той же комбинации уникальных концентраций IC₅₀, как описано в примере 1.

Культивирование клеток и засевание клеток на планшеты осуществляли, как описано ранее, и цитотоксический эффект измеряли с использованием анализа МТТ, как описано в примере 1.

Согласно данному исследованию было установлено, что в отношении человеческой клеточной линии глиобластомы U87-MG:

а. Комбинация РМ01183 с цисплатином (фигура 243) показала синергизм при соотношениях доз 70/30 и 50/50, в то время как комбинация РМ01183 с оксалиплатином (фигура 244) продемонстрировала сильный синергизм.

b. Комбинация РМ01183 с 5-фторурацилом (фигура 245) и РМ01183 с метотрексатом (фигура 247) показала синергизм. Комбинация РМ01183 с гемцитабином (фигура 246) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

с. Комбинация РМ01183 с доцетакселом (фигура 248) и РМ01183 с винкристином (фигура 249) показала сильный синергизм.

d. Комбинация РМ01183 с даунорубицином (фигура 250) показала синергизм почти при всех соотношениях доз, в то время как комбинация РМ01183 с доксорубицином (фигура 251) показала синергизм при соотношениях доз 75/25 и 60/40.

е. Комбинация РМ01183 с топотеканом (фигура 252) и РМ01183 с этопозидом (фигура 254) показала сильный синергизм. Комбинация РМ01183 с иринотеканом (фигура 253) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

f. Комбинация РМ01183 с бортезомибом (фигура 255) показала синергизм почти при всех соотношениях доз.

g. Комбинация РМ01183 с вориностатом (фигура 256) показала сильный синергизм.

h. Комбинация РМ01183 с дакарбазином (фигура 257) показала синергизм.

i. Комбинация РМ01183 с темсиролимусом (фигура 258) показала синергизм при соотношениях доз 50/50 и 30/70.

j. Комбинация РМ01183 с эрлотинибом (фигура 259) показала синергизм при соотношениях доз 40/60-25/75.

k. Комбинация РМ01183 с аплидином (фигура 260) показала синергизм при соотношениях доз 50/50-25/75.

l. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 (фигура 261) показала сильный синергизм.

m. Комбинация РМ01183 с РМ02734 (фигура 262) показала сильный синергизм.

ПРИМЕР 13 . Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с паклитакселом, винорелбином и доксорубицином на человеческие ксенотрансплантаты опухоли яичника

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность паклитаксела, винорелбина и доксорубицина с использованием ксенотрансплантата человеческой карциномы яичника.

Для всех экспериментов использовали самок бестимусных мышей (Harlan Laboratories Models, S.L. (Барселона, Испания). Животных содержали в отдельно вентилируемых клетках, до десяти животных в клетке, с 12-часовым циклом света-темноты, при 21-23°С и 40-60% влажности. Мыши имели свободный доступ к облученному стандартному корму для грызунов и стерилизованной воде. Животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 5 дней до имплантации опухоли с использованием суспензии опухолевых клеток.

Модель опухоли в указанных исследованиях представляла собой клеточную линию А2780, которая была получена из Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС № 93112519).

Клетки А2780 выращивали при 37°С с 5% СО₂ на среде RPMI-1640. Каждому животному на правом боку подкожно имплантировали 1х10⁷ клеток А2780 с помощью 1-кубового шприца с иглой 26G (из in vitro пассажа 5 в исследовании РМ01183 и доксорубицина и РМ01183 и винорелбина и из пассажа 9 в исследовании РМ01183 и паклитаксела), в 0,05 мл суспензии 50% Matrigel и 50% не содержащей сыворотки среды без антибиотиков.

Измерения размеров опухоли осуществляли с использованием штангенциркуля с цифровой индикацией (Fowler Sylvac, S235PAT). Для оценки объема опухоли (мм³) по 2-мерным измерениям опухоли использовали формулу для расчета объема сжатого эллипсоида: объем опухоли (мм³)=[L×W²]+2, где L представляет собой длину, и она является самым длинным диаметром в мм, а W представляет собой ширину, и она является самым коротким диаметром опухоли в мм. Принимая во внимание единицу плотности, объем опухоли конвертировали в массу (т.е. 1 мм³=1 мг). Объем опухоли и массу тела животных измеряли 2-3 раза в неделю, начиная с первого дня лечения (день 0).

Переносимость лечения оценивали путем мониторинга эволюции массы тела, клинических признаков, а также свидетельств локального повреждения в месте инъекции.

Когда опухоли достигали объема приблизительно 195 мм³ в исследовании РМ01183 с паклитакселом, объема приблизительно 158 мм³ в исследовании РМ01183 с винорелбином и объема приблизительно 163,5 мм³ в исследовании РМ01183 с доксорубицином, мышей случайным образом распределяли на группы лечения и контроля (N=5-7 на группу) на основании массы тела и измерений объема опухоли с использованием компьютерной программы NewLab Oncology (версия 2.25.06.00).

РМ01183 поставлялся в форме флаконов с лиофилизированным сухим осадком РМ01183, который повторно растворяли в воде для инфузий до концентрации 0,2 мг/мл. Маточный раствор РМ01183 далее разводили в 5% растворе глюкозы для инъекций до требующихся концентраций. Доксорубицин поставлялся в форме твердого порошка, содержащего доксорубицин HCl, который повторно растворяли в физиологическом растворе. Винорелбин поставлялся в форме раствора, изготовленного разбавлением продукта физиологическим раствором. Паклитаксел поставлялся в форме раствора, изготовленного разбавлением продукта 5% раствором глюкозы для инъекций до требующейся конечной концентрации.

В указанных экспериментах лечение РМ01183 и паклитакселом, РМ01183 и винорелбином и РМ01183 и доксорубицином, а также плацебо осуществляли путем внутривенного введения один раз в неделю до 2 недель подряд на день 0 и 7. Группам одного уровня дозы вводили или один агент, или комбинацию.

Сравнение медианы объема опухоли в группах, получавших лечение (T), с медианой объема опухоли в контрольной группе (Т/С х 100%) использовали для оценки противоопухолевой эффективности. Кроме того, потенцирование определяли, когда ответ в группе комбинированной терапии был больше, чем лучший ответ наиболее активного агента, введенного в качестве единственного агента (монотерапии) по той же схеме и в той же дозе, которые использовались в комбинированной терапии.

Наконец, индекс комбинирования (CI), который количественно измеряет степень лекарственных взаимодействий, получали из фракций, на которые влияло лечение, Fa (определенный как 1-Т/С) для каждой экспериментальной группы в последний день измерения (день 10 для комбинированного исследования РМ01183 и паклитаксела и исследования РМ01183 и доксорубицина и день 9 для исследования РМ01183 и винорелбина) с использованием принципа медиана-эффект (Chou T.C. Pharmacol. Rev., 2006, 58, 621-681).

Таблица 13 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и паклитаксела, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 263 показывает эволюцию объема опухолей А2780 у мышей, получавших плацебо, РМ01183, паклитаксел и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 13
% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	3	5	7	10
G01 (Контрольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	101,6	68,9	83,1	69,1	52,8
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	101,2	89,9	99,8	84,5	61,2
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	94,2	88,5	114,1	103,3	88,0
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	94,0	91,1	99,6	88,0	73,1
G06	25 мг/кг	Паклитаксел	95,3	49,3	42,9	34,0	19,8
G07	18,75 мг/кг	Паклитаксел	95,0	60,4	43,2	41,5	31,1
G08	12,5 мг/кг	Паклитаксел	96,2	62,5	73,9	62,5	50,8
G09	6,25 мг/кг	Паклитаксел	94,3	60,2	79,7	81,3	59,2
G10	0,18 мг/кг 25мг/кг	РМ01183 Паклитаксел	93,3	45,9	28,8	20,9	9,2
G11	0,135 мг/кг 18,75мг/кг	РМ01183 Паклитаксел	93,4	40,5	37,1	36,0	22,6
G12	0,09 мг/кг 12,5мг/кг	РМ01183 Паклитаксел	96,5	64,3	67,7	73,2	49,0
G13	0,045 мг/кг 6,25 мг/кг	РМ01183 Паклитаксел	96,2	78,6	89,1	91,1	77,2

Плацебо: лиофилизированный сухой осадок, содержащий 100 мг сахарозы + дигидрофосфат калия 6,8 мг + фосфорная кислота q.s. до рН 3,8-4,5, который повторно растворяли в 1 мл воды для инфузии.

Таблица 14 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и винорелбина, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 264 показывает эволюцию объема опухолей А2780 у мышей, получавших плацебо, РМ01183, винорелбин и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 14
% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	2	5	7	9
G01 (Контрольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	98,9	101,6	72,2	61,3	62,8
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	98,3	105,3	77,2	79,1	78,7
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	98,0	88,6	61,2	87,6	94,5
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	97,8	107,5	93,6	92,5	97,1
G06	16,0 мг/кг	Винорелбин	99,0	62,5	20,8	24,5	20,0
G07	12,0 мг/кг	Винорелбин	97,4	67,2	39,1	43,0	36,1
G08	8,0 мг/кг	Винорелбин	97,6	79,5	45,0	54,2	47,9
G09	4,0 мг/кг	Винорелбин	97,2	88,6	69,3	81,7	77,3
G010	0,18 мг/кг 16,0 мг/кг	РМ01183 Винорелбин	97,3	50,1	10,9	10,6	8,6
G011	0,135 мг/кг 12,0 мг/кг	РМ01183 Винорелбин	97,2	74,0	29,6	31,2	26,8
G012	0,09 мг/кг 8,0 мг/кг	РМ01183 Винорелбин	96,8	69,3	48,3	56,5	49,8
G013	0,045 мг/кг 4,0 мг/кг	РМ01183 Винорелбин	97,1	85,6	61,7	74,2	81,6
Плацебо: как описано в таблице 13

Таблица 15 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и доксорубицина, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 265 показывает эволюцию объема опухолей А2780 у мышей, получавших плацебо, РМ01183, доксорубицин и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 15
% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	3	5	7	9
G01 (Контрольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	100,9	70,2	68,5	69,3	62,1
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	102,2	82,4	86,6	89,2	82,4
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	100,2	93,3	95,2	93,5	87,7
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	100,1	98,2	98,6	97,7	90,0
G06	8,0 мг/кг	Доксорубицин	99,5	60,8	49,8	48,1	39,4
G07	6,0 мг/кг	Доксорубицин	99,4	71,0	60,3	56,8	54,3
G08	4,0 мг/кг	Доксорубицин	102,0	82,9	75,1	75,0	68,9
G09	2,0 мг/кг	Доксорубицин	99,8	91,5	93,1	94,2	86,2
G10	0,18 мг/кг 8,0 мг/кг	РМ01183 Доксорубицин	99,7	47,6	32,6	30,3	21,1
G11	0,135 мг/кг 6,0 мг/кг	РМ01183 Доксорубицин	100,6	67,0	54,9	53,9	44,9
G12	0,09 мг/кг 4,0 мг/кг	РМ01183 Доксорубицин	98,3	74,7	69,0	63,1	64,4
G13	0,045 мг/кг 2,0 мг/кг	РМ01183 Доксорубицин	98,1	83,1	86,6	78,1	79,2
Плацебо: как описано в таблице 13

В результате описанных исследований было установлено, что:

а. Комбинированное лечение РМ01183 и паклитакселом было эффективным в отношении ингибирования роста клеток опухоли яичника А2780, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении опухоли по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 9,2% и 22,6% (день 10) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и паклитаксела давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (паклитаксел в дозах 25 мг/кг и 18,75 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (25 мг/кг паклитаксела + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с паклитакселом в отдельности (25 мг/кг паклитаксела) составляли 28,8 против 42,9 (день 5), 20,9 против 34,0 (день 7) и 9,2 против 19,8 (день 10), а значения ТС (%) комбинации (18,75 мг/кг паклитаксела + 0,135 мг/кг РМ01183) по сравнению с паклитакселом в отдельности (18,75 мг/кг паклитаксела) составляли 37,1 против 43,2 (день 5), 36,0 против 41,5 (день 7) и 22,6 против 31,1 (день 10). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с паклитакселом, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

Помимо этого, на основе принципа медиана-эффект, комбинация РМ01183 и паклитаксела давала величины CI менее 1 (при Fa выше 0,8), что указывает на синергизм у мышей с ксенотрансплантатами опухоли яичника А2780.

b. Комбинированное лечение РМ01183 и винорелбином было эффективным в отношении ингибирования роста клеток опухоли яичника А2780, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении опухоли по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 8,6% и 26,8% (день 9) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и винорелбина давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (винорелбин в дозах 16 мг/кг и 12 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (16 мг/кг винорелбина + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с винорелбином в отдельности (16 мг/кг винорелбина) составляли 10,9 против 20,8 (день 5), 10,6 против 24,5 (день 7) и 8,6 против 20,0 (день 9), а значения ТС (%) комбинации (12 мг/кг винорелбина + 0,135 мг/кг РМ01183) по сравнению с винорелбином в отдельности (12 мг/кг винорелбина) составляли 29,6 против 39,1 (день 5), 31,2 против 43 (день 7) и 26,8 против 36,1 (день 9). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с винорелбином, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

Помимо этого, на основе принципа медиана-эффект, комбинация РМ01183 и винорелбина давала величины CI 0,75 (при Fa равном 0,97), что указывает на синергизм у мышей с ксенотрансплантатами опухоли яичника А2780.

с. Комбинированное лечение РМ01183 и доксорубицином было эффективным в отношении ингибирования роста клеток опухоли яичника А2780, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении опухоли по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 21,1% и 44,9% (день 10) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и доксорубицина давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (доксорубицин в дозе 8 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (8 мг/кг доксорубицина + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с доксорубицином в отдельности (8 мг/кг доксорубицина) составляли 32,6 против 49,8 (день 5), 30,3 против 48,1 (день 7) и 21,1 против 39,4 (день 10). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с доксорубицином, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

Помимо этого, на основе принципа медиана-эффект, комбинация РМ01183 и доксорубицина давала величины CI менее 1 (при Fa выше 0,8), что указывает на синергизм у мышей с ксенотрансплантатами опухоли яичника А2780.

ПРИМЕР 14. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с цисплатином и 5-фторурацилом на человеческие ксенотрансплантаты опухоли желудка

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность цисплатина и 5-фторурацила с использованием ксенотрансплантата человеческой карциномы желудка.

Для всех экспериментов использовали самок бестимусных мышей (Harlan Laboratories Models, S.L. (Барселона, Испания). Животных содержали в отдельно вентилируемых клетках, до десяти животных в клетке, с 12-часовым циклом света-темноты, при 21-23°С и 40-60% влажности. Мыши имели свободный доступ к облученному стандартному корму для грызунов и стерилизованной воде. Животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 5 дней до имплантации опухоли с использованием суспензии опухолевых клеток.

Модель опухоли в указанных исследованиях представляла собой клеточную линию HGC-27, которая была получена из Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС № 94042256).

Клетки HGC-27 выращивали при 37°С с 5% СО₂ на среде Дульбекко в модификации Исков (IDMD). Каждому животному на правом боку подкожно имплантировали 5×10⁶ клеток HGC-27 с помощью 1-кубового шприца с иглой 26G (из in vitro пассажа 4 в исследовании РМ01183 и цисплатина и из пассажа 6 в исследовании РМ01183 и 5-фторурацила), в 0,05 мл суспензии 50% Matrigel и 50% не содержащей сыворотки среды без антибиотиков.

Измерения размеров опухоли и переносимость лечения осуществляли и определяли, как описано в примере 13.

Когда опухоли достигали объема приблизительно 165,5 мм³ в исследовании РМ01183 с цисплатином и объема приблизительно 170 мм³ в исследовании РМ01183 с 5-фторурацилом, мышей случайным образом распределяли на группы лечения и контроля (N=5-7 на группу) на основании массы тела и измерений объема опухоли с использованием компьютерной программы NewLab Oncology (версия 2.25.06.00).

РМ01183 поставлялся в форме флаконов с лиофилизированным сухим осадком РМ01183, который повторно растворяли в воде для инфузий до концентрации 0,2 мг/мл. Маточный раствор РМ01183 далее разводили в 5% растворе глюкозы для инъекций до требующихся концентраций. Цисплатин и 5-фторурацил поставлялись в форме растворов, изготовленных разбавлением продукта физиологическим раствором до требующейся конечной концентрации.

В указанных экспериментах лечение РМ01183 и цисплатином и РМ01183 и 5-фторурацилом, а также плацебо осуществляли путем внутривенного введения один раз в неделю до 2 недель подряд на день 0 и 7. Группам одного уровня дозы вводили или один агент, или комбинацию.

Сравнение медианы объема опухоли в группах, получавших лечение (T), с медианой объема опухоли в контрольной группе (Т/С х 100%) использовали для оценки противоопухолевой эффективности. Помимо этого, потенцирование и индекс комбинирования (CI) определяли, как описано в примере 13.

Таблица 16 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и цисплатина, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 266 показывает эволюцию объема опухолей HGC-27 у мышей, получавших плацебо, РМ01183, цисплатин и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 16
% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	3	5	7	10	12	14
G01 (Конт-рольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	99,6	65,9	55,6	38,7	33,5	24,3	24,3
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	97,9	71,6	59,9	47,8	39,3	37,1	38,3
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	98,6	67,5	67,9	66,1	70,2	60,3	65,0
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	98,9	85,9	83,1	92,1	76,4	81,6	88,5
G06	6,0 мг/кг	Цисплатин	97,7	76,1	79,0	75,1	64,4	61,3	72,7
G07	4,5 мг/кг	Цисплатин	98,5	90,5	94,5	90,2	75,7	73,7	81,1
G08	3,0 мг/кг	Цисплатин	99,0	78,6	80,0	78,7	81,3	82,8	85,1
G09	1,5 мг/кг	Цисплатин	99,3	78,1	78,8	82,6	83,5	86,6	89,9
G10	0,18 мг/кг 6,0 мг/кг	РМ01183 Цисплатин	95,7	55,0	42,4	22,3	12,9	7,6	4,6
G11	0,135 мг/кг 4,5 мг/кг	РМ01183 Цисплатин	99,2	67,7	42,7	28,6	17,3	12,1	9,8
G12	0,09 мг/кг 3,0 мг/кг	РМ01183 Цисплатин	99,9	80,0	64,3	45,7	47,2	42,4	56,7
G13	0,045 мг/кг 1,5 мг/кг	РМ01183 Цисплатин	99,9	93,3	83,0	75,9	69,3	70,3	80,0
Плацебо: как описано в примере 13

Таблица 17 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и 5-фторурацила, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 267 показывает эволюцию объема опухолей HGC-27 у мышей, получавших плацебо, РМ01183, 5-фторурацил и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 17
% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	2	5	7	9	12	14
G01 (Конт-рольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	99,6	78,6	50,9	43,3	41,0	33,0	29,2
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	100,2	81,5	58,7	61,4	60,2	54,6	55,1
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	100,6	90,5	87,6	83,4	82,6	76,7	67,7
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	99,9	84,3	103,2	104,6	103,5	101,6	85,0
G06	50,0 мг/кг	5-фторурацил	100,3	81,2	82,3	81,1	75,6	69,6	60,7
G07	37,5 мг/кг	5-фторурацил	99,4	86,9	86,9	78,6	73,2	76,7	83,1
G08	25,0 мг/кг	5-фторурацил	100,6	89,8	97,0	111,4	102,6	93,9	82,8
G09	12,5 мг/кг	5-фторурацил	100,7	81,7	101,3	102,8	98,6	90,5	83,8
G10	0,18 мг/кг 50,0 мг/кг	РМ01183 5-фторурацил	99,6	73,0	44,2	35,9	31,5	25,3	22,0
G11	0,135 мг/кг 37,5 мг/кг	РМ01183 5-фторурацил	100,8	73,4	63,5	53,1	50,6	42,8	51,1
G12	0,09 мг/кг 25,0 мг/кг	РМ01183 5-фторурацил	99,6	95,8	97,7	98,9	90,0	74,7	69,9
G13	0,045 мг/кг 12,5 мг/кг	РМ01183 5-фторурацил	99,5	80,6	87,3	88,5	99,3	87,1	84,2
Плацебо: как описано в таблице 13

В результате описанных исследований было установлено, что:

а. Комбинированное лечение РМ01183 и цисплатином было эффективным в отношении ингибирования роста клеток опухоли желудка HGC-27, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении опухоли по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 4,6% и 9,8% (день 14) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и цисплатина давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (РМ01183 в дозах 0,18 мг/кг и 0,135 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (6 мг/кг цисплатина + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с РМ01183 в отдельности (0,18 мг/кг РМ01183) составляли 12,9 против 33,5 (день 10), 7,6 против 24,3 (день 12) и 4,6 против 24,3 (день 14), а значения ТС (%) комбинации (4,5 мг/кг цисплатина + 0,135 мг/кг РМ01183) по сравнению с РМ01183 в отдельности (0,135 мг/кг РМ01183) составляли 17,3 против 39,3 (день 10), 12,1 против 37,1 (день 12) и 9,8 против 38,3 (день 14). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с цисплатином, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

Помимо этого, на основе принципа медиана-эффект, комбинация РМ01183 и цисплатина давала величины CI менее 1 (при Fa выше 0,8), что указывает на синергизм у мышей с ксенотрансплантатами опухоли желудка HGC-27.

b. Комбинированное лечение РМ01183 и 5-фторурацилом было эффективным в отношении ингибирования роста клеток опухоли желудка HGC-27, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении опухоли по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 22,0% и 51,1% (день 14) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и 5-фторурацила давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (РМ01183 в дозе 0,18 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (50 мг/кг 5-фторурацила + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с РМ01183 в отдельности (0,18 мг/кг РМ01183) составляли 35,9 против 43,3 (день 7), 31,5 против 41,0 (день 9), 25,3 против 33,0 (день 12) и 22,0 против 29,2 (день 14). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с 5-фторурацилом, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

Помимо этого, на основе принципа медиана-эффект, комбинация РМ01183 и 5-фторурацила давала величины CI 0,78 (при Fa равном 0,97), что указывает на умеренный синергизм у мышей с ксенотрансплантатами опухоли желудка HGC-27.

ПРИМЕР 15. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с гемцитабином на человеческие ксенотрансплантаты опухоли поджелудочной железы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность гемцитабина с использованием ксенотрансплантата человеческого рака поджелудочной железы.

Для всех экспериментов использовали самок бестимусных мышей (Harlan Laboratories Models, S.L. (Барселона, Испания). Животных содержали в отдельно вентилируемых клетках, до десяти животных в клетке, с 12-часовым циклом света-темноты, при 21-23°С и 40-60% влажности. Мыши имели свободный доступ к облученному стандартному корму для грызунов и стерилизованной воде. Животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 5 дней до имплантации опухоли с использованием суспензии опухолевых клеток.

Модель опухоли в указанных исследованиях представляла собой клеточную линию SW1990, которая была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС: CRL-2172^ТМ).

Клетки SW1990 выращивали при 37°С с 5% СО₂ на среде RPMI-1640. Каждому животному на правом боку подкожно имплантировали 5х10⁶ клеток SW1990 с помощью 1-кубового шприца с иглой 26G, из in vitro пассажа 12, в 0,05 мл суспензии 50% Matrigel и 50% не содержащей сыворотки среды без антибиотиков.

Измерения размеров опухоли и переносимость лечения осуществляли и определяли, как описано в примере 13.

Когда опухоли достигали объема приблизительно 210 мм³, мышей случайным образом распределяли на группы лечения и контроля (N = 5-7 на группу) на основании массы тела и измерений объема опухоли с использованием компьютерной программы NewLab Oncology (версия 2.25.06.00).

РМ01183 поставлялся в форме флаконов с лиофилизированным сухим осадком РМ01183, который повторно растворяли в воде для инфузий до концентрации 0,2 мг/мл. Маточный раствор РМ01183 далее разводили в 5% растворе глюкозы для инъекций до требующихся концентраций. Гемцитабин поставлялся в форме раствора, изготовленного разбавлением продукта физиологическом раствором для инъекций до концентрации маточного раствора 40 мг/мл. Маточный раствор гемцитабина далее разводили физиологическом раствором для инъекций до требующейся конечной концентрации.

В указанных экспериментах лечение РМ01183 и гемцитабином, а также плацебо осуществляли путем внутривенного введения один раз в неделю до 3 недель подряд на день 0, 7 и 14. Группам одного уровня дозы вводили или один агент, или комбинацию.

Сравнение медианы объема опухоли в группах, получавших лечение (T), с медианой объема опухоли в контрольной группе (Т/С х 100%) использовали для оценки противоопухолевой эффективности. Помимо этого, потенцирование и индекс комбинирования (CI) определяли, как описано в примере 13.

Таблица 18 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и гемцитабина, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 268 показывает эволюцию объема опухолей SW1990 у мышей, получавших плацебо, РМ01183, гемцитабин и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 18
% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	3	6	8	10	13
G01 (Конт-рольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	100,0	74,3	61,3	59,4	56,7	56,1
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	99,6	81,3	71,0	73,1	65,6	63,1
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	101,1	81,5	72,8	68,7	68,4	74,4
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	100,2	83,6	82,8	93,3	82,9	88,1
G06	180,0 мг/кг	Гемцитабин	102,2	84,1	73,9	66,1	60,9	59,4
G07	135,0 мг/кг	Гемцитабин	102,3	78,3	71,9	63,7	55,4	52,7
G08	90,0 мг/кг	Гемцитабин	103,8	70,0	73,8	63,3	55,6	54,8
G09	45,0 мг/кг	Гемцитабин	102,3	85,5	70,3	70,5	63,3	64,8
G10	0,18 мг/кг 180,0 мг/кг	РМ01183 Гемцитабин	102,1	69,7	51,2	46,2	36,0	34,1
G11	0,135 мг/кг 135,0 мг/кг	РМ01183 Гемцитабин	100,4	64,6	52,8	51,5	48,9	46,0
G12	0,09 мг/кг 90,0 мг/кг	РМ01183 Гемцитабин	98,2	83,2	64,4	59,7	50,6	49,6
G13	0,045 мг/кг 45,0 мг/кг	РМ01183 Гемцитабин	97,7	81,6	70,9	68,8	65,9	65,7
Плацебо: как описано в примере 13

Таблица 18 (продолжение)
% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	15	17	20	22	24	28
G01 (Контрольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	53,2	47,8	44,2	45,3	44,8	38,9
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	56,3	56,7	56,9	56,5	53,0	51,7
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	74,7	80,7	71,9	75,4	77,3	63,9
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	92,6	86,5	85,1	84,5	85,8	85,4
G06	180,0 мг/кг	Гемцитабин	58,5	52,1	49,1	48,6	46,9	39,3
G07	135,0 мг/кг	Гемцитабин	54,8	51,2	49,5	48,7	49,8	49,5
G08	90,0 мг/кг	Гемцитабин	49,9	47,4	47,6	47,0	45,9	49,2
G09	45,0 мг/кг	Гемцитабин	63,1	58,5	58,7	57,3	65,2	59,3
G10	0,18 мг/кг 180,0 мг/кг	РМ01183 Гемцитабин	34,7	31,6	31,7	28,0	26,0	22,7
G11	0,135 мг/кг 135,0 мг/кг	РМ01183 Гемцитабин	42,4	38,2	36,6	34,6	31,5	25,8
G12	0,09 мг/кг 90,0 мг/кг	РМ01183 Гемцитабин	47,4	46,0	43,8	49,1	46,0	42,9
G13	0,045 мг/кг 45,0 мг/кг	РМ01183 Гемцитабин	57,9	59,9	55,9	54,9	52,1	50,5
Плацебо: как описано в примере 13

В результате описанных исследований было установлено, что:

а. Комбинированное лечение РМ01183 и гемцитабином было эффективным в отношении ингибирования роста клеток опухоли поджелудочной железы SW 1990, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении опухоли по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 22,7% и 25,8% (день 28) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и гемцитабина давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (РМ01183 в дозе 0,18 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (180 мг/кг гемцитабина + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с РМ01183 в отдельности (0,18 мг/кг РМ01183) составляли 31,7 против 44,2 (день 20), 28,0 против 45,3 (день 22), 26,0 против 44,8 (день 24) и 22,7 против 38,9 (день 28). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с гемцитабином, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

Помимо этого, на основе принципа медиана-эффект, комбинация РМ01183 и гемцитабина давала величины CI менее 1 (при Fa выше 0,8), что указывает на синергизм у мышей с ксенотрансплантатами опухоли поджелудочной железы SW1990.

ПРИМЕР 16. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с темозоломидом на человеческие ксенотрансплантаты опухоли головного мозга

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность темозоломида с использованием ксенотрансплантата человеческой опухоли головного мозга.

Для всех экспериментов использовали самок бестимусных мышей (Harlan Laboratories Models, S.L. (Барселона, Испания). Животных содержали в отдельно вентилируемых клетках, до десяти животных в клетке, с 12-часовым циклом света-темноты, при 21-23°С и 40-60% влажности. Мыши имели свободный доступ к облученному стандартному корму для грызунов и стерилизованной воде. Животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 5 дней до имплантации опухоли с использованием суспензии опухолевых клеток.

Модель опухоли в указанных исследованиях представляла собой клеточную линию U87-MG, которая была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС: НТВ-14^ТМ).

Клетки U87-MG выращивали при 37°С с 5% СО₂ на минимальной эссенциальной среде Игла (МЕМЕ). Каждому животному на правом боку подкожно имплантировали 5х10⁶ клеток U87-MG с помощью 1-кубового шприца с иглой 26G, из in vitro пассажа 5, в 0,05 мл суспензии 50% Matrigel и 50% не содержащей сыворотки среды без антибиотиков.

Измерения размеров опухоли и переносимость лечения осуществляли и определяли, как описано в примере 13.

Когда опухоли достигали объема приблизительно 139 мм³, мышей случайным образом распределяли на группы лечения и контроля (N = 5-7 на группу) на основании массы тела и измерений объема опухоли с использованием компьютерной программы NewLab Oncology (версия 2.25.06.00).

РМ01183 поставлялся в форме флаконов с лиофилизированным сухим осадком РМ01183, который повторно растворяли в воде для инфузий до концентрации 0,2 мг/мл. Маточный раствор РМ01183 далее разводили в 5% растворе глюкозы для инъекций до требующихся концентраций. Темозоломид поставлялся в форме раствора, изготовленного разбавлением продукта в DMSO 10% в физиологическом растворе для инъекций до требующейся конечной концентрации.

В указанных экспериментах лечение РМ01183 и темозоломидом, а также плацебо осуществляли следующим образом: РМ01183, внутривенно один раз в неделю до 3 недель подряд, на день 0, 7 и 14; темозоломид перорально, на ежедневной основе в течение 8 дней подряд (дни с 0 по 7), а плацебо вводили по той же схеме, как РМ01183 и темозоломид. Группам одного уровня дозы вводили или один агент, или комбинацию.

Сравнение медианы объема опухоли в группах, получавших лечение (T), с медианой объема опухоли в контрольной группе (Т/С х 100%) использовали для оценки противоопухолевой эффективности. Помимо этого, потенцирование и индекс комбинирования (CI) определяли, как описано в примере 13.

Таблица 19 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и темозоломида, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 269 показывает эволюцию объема опухолей U87-MG у мышей, получавших плацебо, РМ01183, темозоломид и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 19
	% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	2	4	7	9	11	14	16
G01 (Контрольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	99,8	95,5	64,8	63,2	52,0	44,1	38,5	37,1
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	98,5	90,5	61,2	71,3	67,7	65,3	64,2	63,6
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	97,9	99,5	74,4	85,1	69,4	71,8	74,1	73,5
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	98,2	101,0	80,4	83,8	78,8	77,7	76,7	82,5
G06	3,0 мг/кг	Темозоломид	97,1	95,5	67,3	39,4	25,3	22,9	28,4	31,5
G07	1,5 мг/кг	Темозоломид	94,1	96,9	75,6	73,0	56,5	59,3	50,0	53,5
G08	1,0 мг/кг	Темозоломид	98,2	100,2	65,1	81,2	55,0	63,5	73,1	75,0
G09	0,75 мг/кг	Темозоломид	97,7	98,9	76,3	77,3	64,4	63,1	62,8	72,7
G10	0,18 мг/кг 3,0 мг/кг	РМ01183 Темозоломид	97,8	95,0	50,9	33,1	21,0	18,3	16,6	17,4
G11	0,135 мг/кг 1,5 мг/кг	РМ01183 Темозоломид	98,7	102,4	62,7	42,0	30,3	29,1	29,0	30,9
G12	0,09 мг/кг 1,0 мг/кг	РМ01183 Темозоломид	96,2	101,0	79,3	76,1	49,8	51,2	57,6	56,5
G13	0,045 мг/кг 0,75 мг/кг	РМ01183 Темозоломид	101	106,0	67,4	73,0	57,8	59,0	69,3	72,2
Плацебо: как описано в примере 13

В результате описанных исследований было установлено, что:

а. Комбинированное лечение РМ01183 и темозоломидом было эффективным в отношении ингибирования роста клеток опухоли головного мозга U87-MG, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении опухоли по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 17,4% и 30,9% (день 16) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и темозоломида давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (темозоломид в дозах 3 мг/кг и 1,5 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (3 мг/кг темозоломида + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с темозоломидом в отдельности (3 мг/кг темозоломида) составляли 18,3 против 22,9 (день 11), 16,6 против 28,4 (день 14) и 17,4 против 31,5 (день 16), а значения ТС (%) комбинации (1,5 мг/кг темозоломида + 0,135 мг/кг РМ01183) по сравнению с темозоломидом в отдельности (1,5 мг/кг темозоломида) составляли 29,1 против 59,3 (день 11), 29,0 против 50,0 (день 14) и 30,9 против 53,5 (день 16). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с темозоломидом, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

Помимо этого, на основе принципа медиана-эффект, комбинация РМ01183 и темозоломида давала величины CI менее 1 (при Fa выше 0,8), что указывает на синергизм у мышей с ксенотрансплантатами опухоли головного мозга U87-MG.

ПРИМЕР 17. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с иринотеканом на человеческие ксенотрансплантаты опухоли легкого

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность иринотекана с использованием ксенотрансплантата человеческого рака легкого.

Для всех экспериментов использовали самок бестимусных мышей (Harlan Laboratories Models, S.L. (Барселона, Испания). Животных содержали в отдельно вентилируемых клетках, до десяти животных в клетке, с 12-часовым циклом света-темноты, при 21-23°С и 40-60% влажности. Мыши имели свободный доступ к облученному стандартному корму для грызунов и стерилизованной воде. Животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 5 дней до имплантации опухоли с использованием суспензии опухолевых клеток.

Модель опухоли в указанных исследованиях представляла собой клеточную линию Н460, которая была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС ref. НТВ-177^ТМ).

Клетки Н460 выращивали при 37°С с 5% СО₂ на среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM). Каждому животному на правом боку подкожно имплантировали 5х10⁶ клеток Н460 с помощью 1-кубового шприца с иглой 26G, из in vitro пассажа 10, в 0,05 мл суспензии 50% Matrigel и 50% не содержащей сыворотки среды без антибиотиков.

Измерения размеров опухоли и переносимость лечения осуществляли и определяли, как описано в примере 13.

Когда опухоли достигали объема приблизительно 177 мм³, мышей случайным образом распределяли на группы лечения и контроля (N = 5-7 на группу) на основании массы тела и измерений объема опухоли с использованием компьютерной программы NewLab Oncology (версия 2.25.06.00).

РМ01183 поставлялся в форме флаконов с лиофилизированным сухим осадком РМ01183, который повторно растворяли в воде для инфузий до концентрации 0,2 мг/мл. Маточный раствор РМ01183 далее разводили в 5% растворе глюкозы для инъекций до требующихся концентраций. Иринотекан поставлялся в форме раствора, изготовленного разбавлением продукта физиологическом раствором для инъекций до концентрации маточного раствора 40 мг/мл. Маточный раствор гемцитабина далее разводили 5% раствором глюкозы для инъекций до требующейся конечной концентрации.

В указанных экспериментах лечение РМ01183 и иринотеканом, а также плацебо осуществляли путем внутривенного введения следующим образом: РМ01183 один раз в неделю до 2 недель подряд на день 0 и 7; иринотекан вводили раз в 4 дня, на день 0, 4 и 8, и плацебо вводили по той же схеме, что РМ01183 и иринотекан. Группам одного уровня дозы вводили или один агент, или комбинацию.

Сравнение медианы объема опухоли в группах, получавших лечение (T), с медианой объема опухоли в контрольной группе (Т/С х 100%) использовали для оценки противоопухолевой эффективности. Помимо этого, потенцирование и индекс комбинирования (CI) определяли, как описано в примере 13.

Таблица 20 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и иринотекана, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 270 показывает эволюцию объема опухолей Н460 у мышей, получавших плацебо, РМ01183, иринотекан и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 20
	% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	2	5	7	9	12
G01 (Конт-рольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	114,4	79,6	74,7	75,0	69,1	64,9
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	117,6	77,4	67,5	71,7	66,7	52,9
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	116,9	83,1	83,9	76,9	80,6	84,9
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	108,3	78,7	61,2	67,2	78,8	87,9
G06	50,0 мг/кг	Иринотекан	112,1	54,9	34,7	27,5	24,8	22,9
G07	37,5 мг/кг	Иринотекан	114,9	51,9	44,0	36,7	35,6	37,0
G08	25,0 мг/кг	Иринотекан	112,0	55,6	54,9	49,6	53,1	51,8
G09	12,5 мг/кг	Иринотекан	97,5	50,3	44,4	48,6	50,0	51,5
G10	0,18 мг/кг 50,0 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	117,1	44,3	19,4	13,4	10,9	9,0
G11	0,135 мг/кг 37,5 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	111,2	51,7	23,8	18,4	15,7	15,3
G12	0,09 мг/кг 25,0 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	110,0	53,2	38,1	26,6	28,0	27,1
G13	0,045 мг/кг 12,5 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	109,0	60,4	60,1	56,5	60,0	58,5
Плацебо: как описано в примере 13

В результате описанных исследований было установлено, что:

а. Комбинированное лечение РМ01183 и иринотеканом было эффективным в отношении ингибирования роста клеток опухоли легкого Н460, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении опухоли по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 9,0% и 15,3% (день 12) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и иринотекана давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (иринотекан в дозах 50 мг/кг и 37,5 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (50 мг/кг иринотекана + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с иринотеканом в отдельности (50 мг/кг иринотекана) составляли 19,4 против 34,7 (день 5), 13,4 против 27,5 (день 7), 10,9 против 24,8 (день 9) и 9,0 против 22,9 (день 12), а значения ТС (%) комбинации (37,5 мг/кг иринотекана + 0,135 мг/кг РМ01183) по сравнению с иринотеканом в отдельности (37,5 мг/кг иринотекана) составляли 23,8 против 44,0 (день 5), 18,4 против 36,7 (день 7), 15,7 против 35,6 (день 9) и 15,3 против 37,0 (день 12). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с иринотеканом, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

Помимо этого, на основе принципа медиана-эффект, комбинация РМ01183 и иринотекана давала величины CI менее 1 (при Fa выше 0,8), что указывает на синергизм или сильный синергизм у мышей с ксенотрансплантатами опухоли легкого Н460.

ПРИМЕР 18. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с дакарбазином на человеческие ксенотрансплантаты фибросаркомы

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность дакарбазина с использованием ксенотрансплантата человеческой фибросаркомы.

Для всех экспериментов использовали самок бестимусных мышей (Harlan Laboratories Models, S.L. (Барселона, Испания). Животных содержали в отдельно вентилируемых клетках, до десяти животных в клетке, с 12-часовым циклом света-темноты, при 21-23°С и 40-60% влажности. Мыши имели свободный доступ к облученному стандартному корму для грызунов и стерилизованной воде. Животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 5 дней до имплантации опухоли с использованием суспензии опухолевых клеток.

Модель опухоли в указанных исследованиях представляла собой клеточную линию НТ1080, которая была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС ref. CCL-121^ТМ).

Клетки НТ1080 выращивали при 37°С с 5% СО₂ на минимальной эссенциальной среде Игла (MEME). Каждому животному ортотопически имплантировали в икроножную мышцу путем внутримышечной инъекции с помощью 1-кубового шприца с иглой 26G 5х10⁶ клеток НТ1080, из in vitro пассажа 9, суспендированные в не содержащей сыворотки среде без антибиотиков.

Общий диаметр (опухоль+конечность) измеряли с использованием штангенциркуля с цифровой индикацией (Fowler Sylvac, S235PAT). Указанные общий диаметр и массу тела животных измеряли 2-3 раза в неделю, начиная с первого дня лечения.

Переносимость лечения оценивали путем мониторинга эволюции массы тела, клинических признаков, а также свидетельств локального повреждения в месте инъекции.

Когда общий диаметр достигал приблизительно 11,3 мм, мышей случайным образом распределяли на группы лечения и контроля (N = 5-7 на группу) на основании массы тела и измерений опухоли с использованием компьютерной программы NewLab Oncology (версия 2.25.06.00).

РМ01183 поставлялся в форме флаконов с лиофилизированным сухим осадком РМ01183, который повторно растворяли в воде для инфузий до концентрации 0,2 мг/мл. Маточный раствор РМ01183 далее разводили в 5% растворе глюкозы для инъекций до требующихся концентраций. Дакарбазин поставлялся в форме раствора, изготовленного разбавлением продукта 5% раствором глюкозы для инъекций до требующейся конечной концентрации.

В указанных экспериментах лечение РМ01183 и дакарбазином, а также плацебо осуществляли путем внутривенного введения один раз в неделю до 2 недель подряд на день 0 и 7. Группам одного уровня дозы вводили или один агент, или комбинацию.

Сравнение медианы общего диаметра (опухоль + конечность) в группах, получавших лечение (T), с медианой общего диаметра (опухоль+конечность) в контрольной группе (Т/Сх100%) использовали для оценки противоопухолевой эффективности. Помимо этого, потенцирование и индекс комбинирования (CI) определяли, как описано в примере 13.

Таблица 21 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и дакарбазина, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 271 показывает эволюцию общего диаметра (опухоль + конечность) опухолей НТ1080 у мышей, получавших плацебо, РМ01183, дакарбазин и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 21
	% ТС на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	2	4	7	9	11	14	16
G01 (контрольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	100	59,3	40,0	26,9	26,7	11,5	21,2	30,6
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	100	63,0	62,9	48,1	36,0	30,2	33,0	41,9
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	100	66,7	57,1	65,4	48,0	42,7	45,8	56,4
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	100	77,8	74,3	94,2	80,0	74,0	80,5	91,1
G06	150 мг/кг	Дакарбазин	100	40,7	28,6	30,8	44,0	37,5	44,9	57,3
G07	112,5 мг/кг	Дакарбазин	100	48,1	34,3	53,8	48,0	37,5	43,2	53,2
G08	75,0 мг/кг	Дакарбазин	100	74,1	65,7	69,2	58,7	45,8	46,6	51,6
G09	37,5 мг/кг	Дакарбазин	100	51,8	54,3	65,4	61,3	47,9	55,1	62,1
G10	0,18 мг/кг 150,0 мг/кг	РМ01183 Дакарбазин	100	37,0	22,9	17,3	4,0	10,4	-4,2	1,0
G11	0,135 мг/кг 112,5 мг/кг	РМ01183 Дакарбазин	100	29,6	25,7	11,5	-8,0	-17,7	-6,8	7,3
G12	0,09 мг/кг 75,0 мг/кг	РМ01183 Дакарбазин	100	37,0	31,4	28,8	52,0	43,7	50,8	64,5
G13	0,045 мг/кг 37,5 мг/кг	РМ01183 Дакарбазин	100	55,6	51,4	67,3	70,7	62,5	59,3	62,1
Плацебо: как описано в примере 13

В результате описанных исследований было установлено, что:

а. Комбинированное лечение РМ01183 и дакарбазином было эффективным в отношении ингибирования роста клеток фибросаркомы НТ1080, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении общего диаметра (опухоль+конечность) по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 1,0% и 7,3% (день 16) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и дакарбазина давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (РМ01183 в дозах 0,18 мг/кг и 0,135 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (150 мг/кг дакарбазина + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с РМ01183 в отдельности (0,18 мг/кг РМ01183) составляли 4,0 против 26,7 (день 9), 10,4 против 11,5 (день 11), -4,2 против 21,2 (день 14) и 1,0 против 30,6 (день 16), а значения ТС (%) комбинации (112,5 мг/кг дакарбазина + 0,135 мг/кг РМ01183) по сравнению с РМ01183 в отдельности (0,135 мг/кг РМ01183) составляли -8,0 против 36,0 (день 9), -17,7 против 30,2 (день 11), -6,8 против 33,0 (день 14) и 7,3 против 41,9 (день 16). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с дакарбазином, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

Помимо этого, на основе принципа медиана-эффект, комбинация РМ01183 и дакарбазина давала величины CI 0,28 (при Fa равном 0,97), что указывает на сильный синергизм у мышей с ортотопически имплантированными опухолями фибросаркомы НТ1080.

ПРИМЕР 19. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с иринотеканом на человеческие ксенотрансплантаты колоректальной опухоли

Целью данного исследования было определение способности РМ01183 потенцировать противоопухолевую активность иринотекана с использованием ксенотрансплантата человеческой колоректальной карциномы.

Для всех экспериментов использовали самок бестимусных мышей (Harlan Laboratories Models, S.L. (Барселона, Испания). Животных содержали в отдельно вентилируемых клетках, до десяти животных в клетке, с 12-часовым циклом света-темноты, при 21-23°С и 40-60% влажности. Мыши имели свободный доступ к облученному стандартному корму для грызунов и стерилизованной воде. Животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 5 дней до имплантации опухоли с использованием суспензии опухолевых клеток.

Модель опухоли в указанных исследованиях представляла собой клеточную линию НТ-29, которая была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС ref. НТВ-38^ТМ).

Клетки НТ-29 выращивали при 37°С с 5% СО₂ на среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM). Каждому животному на правом боку подкожно имплантировали 5х10⁶ клеток НТ-29 с помощью 1-кубового шприца с иглой 26G, из in vitro пассажа 10, в 0,05 мл физиологического раствора для инъекций.

Измерения размеров опухоли и переносимость лечения осуществляли и определяли, как описано в примере 13. Переносимость лечения оценивали путем мониторинга эволюции массы тела, клинических признаков, а также свидетельств локального повреждения в месте инъекции.

Когда опухоли достигали объема приблизительно 180 мм³, мышей случайным образом распределяли на группы лечения и контроля (N = 5-7 на группу) на основании массы тела и измерений объема опухоли с использованием компьютерной программы NewLab Oncology (версия 2.25.06.00).

РМ01183 поставлялся в форме флаконов с лиофилизированным сухим осадком РМ01183, который повторно растворяли в воде для инфузий до концентрации 0,2 мг/мл. Маточный раствор РМ01183 далее разводили в 5% растворе глюкозы для инъекций до требующихся концентраций. Иринотекан поставлялся в форме раствора, изготовленного разбавлением продукта 5% раствором глюкозы для инъекций до требующейся конечной концентрации.

В указанных экспериментах лечение РМ01183 и иринотеканом, а также плацебо осуществляли путем внутривенного введения следующим образом: РМ01183 один раз в неделю до 3 недель подряд на день 0, 7 и 14; иринотекан вводили раз в 4 дня, на день 0, 4, 8, 12 и 16, и плацебо вводили по той же схеме, что РМ01183 и иринотекан. Группам одного уровня дозы вводили или один агент, или комбинацию.

Сравнение медианы объема опухоли в группах, получавших лечение (T), с медианой объема опухоли в контрольной группе (Т/С х 100%) использовали для оценки противоопухолевой эффективности. Помимо этого, потенцирование определяли, как описано в примере 13.

Таблица 22 представляет величины % Т/С, полученные в исследовании РМ01183 и иринотекана, введенных как в виде единственных агентов, так и в комбинации для каждого уровня дозы, а фигура 272 показывает эволюцию объема опухолей НТ-29 у мышей, получавших плацебо, РМ01183, иринотекан и соответствующие комбинации для групп, получавших два высших соотношения доз.

Таблица 22
	% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	0	3	5	7	10
G01 (Контрольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	100,4	108,4	86,5	101,1	116,5
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	98,4	106,4	95,3	116,6	115,2
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	98,4	100,9	88,7	121,9	129,8
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	99,8	103,7	100,6	111,1	135,8
G06	50,0 мг/кг	Иринотекан	100,1	114,7	93,7	96,1	70,5
G07	37,5 мг/кг	Иринотекан	98,4	108,1	97,5	99,2	84,3
G08	25,0 мг/кг	Иринотекан	98,8	108,6	97,2	101,4	96,5
G09	12,5 мг/кг	Иринотекан	99,0	99,1	90,6	97,4	92,7
G10	0,18 мг/кг 50,0 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	99,5	101,8	78,3	77,5	51,6
G11	0,135 мг/кг 37,5 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	98,4	98,0	85,2	85,4	60,7
G12	0,09 мг/кг 25,0 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	99,7	96,4	71,7	77,0	62,7
G13	0,045 мг/кг 12,5 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	100,7	104,8	104,3	116,0	98,8
Плацебо: как описано в примере 13

Таблица 22 (продолжение)

	% Т/С на день
Группа	Доза	Тест-материалы	12	14	17	20
G01 (Контрольная группа)	10 мл/кг	Плацебо	-	-	-	-
G02	0,18 мг/кг	РМ01183	115,4	123,4	86,7	77,5
G03	0,135 мг/кг	РМ01183	119,1	121,5	133,1	105,2
G04	0,09 мг/кг	РМ01183	114,1	109,4	116,1	93,4
G05	0,045 мг/кг	РМ01183	125,1	109,3
G06	50,0 мг/кг	Иринотекан	61,7	51,7	41,4	33,3
G07	37,5 мг/кг	Иринотекан	77,4	65,0	58,4	49,4
G08	25,0 мг/кг	Иринотекан	79,3	82,5	76,3	60,3
G09	12,5 мг/кг	Иринотекан	90,8	89,4	102,6	93,4
G10	0,18 мг/кг 50,0 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	43,8	30,4	21,7	15,6
G11	0,135 мг/кг 37,5 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	51,9	40,1	39,2	28,7
G12	0,09 мг/кг 25,0 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	57,7	50,1	47,2	40,7
G13	0,045 мг/кг 12,5 мг/кг	РМ01183 Иринотекан	85,5	90,5	88,1	76,5
Плацебо: как описано в примере 13

В результате описанных исследований было установлено, что:

а. Комбинированное лечение РМ01183 и иринотеканом было эффективным в отношении ингибирования роста клеток человеческой колоректальной карциномы НТ-29, что выражалось в статистически значимом (P<0,01) уменьшении опухоли по сравнению с контрольной группой, с величинами Т/С 15,6% и 28,7% (день 20) в двух группах, получавших высокие дозы. Помимо этого, комбинация РМ01183 и иринотекана давала более низкие значения Т/С, чем более активный единственный агент в данном эксперименте (иринотекан в дозах 50 мг/кг и 37,5 мг/кг). Конкретно, значения ТС (%) комбинации (50 мг/кг иринотекана + 0,18 мг/кг РМ01183) по сравнению с иринотеканом в отдельности (50 мг/кг иринотекана) составляли 30,4 против 51,7 (день 14), 21,7 против 41,4 (день 17) и 15,6 против 33,3 (день 20), а значения ТС (%) комбинации (37,5 мг/кг иринотекана + 0,135 мг/кг РМ01183) по сравнению с иринотеканом в отдельности (37,5 мг/кг иринотекана) составляли 40,1 против 65,0 (день 14), 39,2 против 58,4 (день 17) и 28,7 против 49,4 (день 20). Таким образом, в случае, когда РМ01183 комбинируют с иринотеканом, ясно наблюдается потенцирование противоопухолевой активности.

ПРИМЕР 20. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие лейкозные клеточные линии

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: метотрексат, даунорубицин, аплидин, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до достижения конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования были выбраны человеческие лейкозные клеточные линии JURCAT и MOLT-4, которые были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Клетки JURCAT и MOLT-4 выращивали на не содержащей фенолового красного среде RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа:

а. В первой серии исследований величины относительную активность каждого соединения против различных клеточных линий с помощью цитотоксического исследования in vitro определяли для каждого лекарственного средства на клетках А549 после 72 часов воздействия.

Кратко, клетки засевали на 96-луночные микротитрационные планшеты с плотностью 50000 клеток в 150 мкл культуральной среды и инкубировали в течение 4-6 часов в среде, не содержавшей лекарственного средства, до обработки только носителем или испытуемыми соединениями в течение 72 часов.

После инкубации цитотоксический эффект измеряли анализом восстановления MTT. 50 мкл раствора МТТ (1 мг/мл) добавляли в лунки и инкубировали в течение 15-17 часов при 37°С до образования кристаллов формазана. После осторожного удаления культуральной среды добавляли DMSO для растворения нерастворимого пурпурного формазана с получением окрашенного раствора. Спектральную поглощательную способность лунок оценивали количественно измерением оптической плотности на 540 нм. Результаты выражали в процентных долях от контрольного клеточного роста. Величины ЕС₅₀ (половина максимальной эффективной концентрации), использовавшиеся для исследований комбинаций, рассчитывали с использованием компьютерной программы Prism v5.02 (GraphPad). Результаты выражали как молярную концентрацию и представляли среднюю величину по меньшей мере от трех независимых анализов.

Индивидуальные величины EC₅₀, полученные для каждого лекарственного средства, представлены в таблицах 23 и 24.

Таблица 23 Величины EC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента на опухолевой клеточной линии JURCAT
Соединение	EC50 (М)	Соединение	EC50 (М)	Соединение	EC50 (М)
Метотрексат	1,45E-07	Даунорубицин	7,92E-07	Аплидин	1,38E-08
ЕТ-743	6,96E-09	РМ00104	4,83E-09	РМ01183	1,55E-09
РМ02734	5,50E-06

Таблица 24 Величины EC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента на опухолевой клеточной линии MOLT-4
Соединение	EC50 (М)	Соединение	EC50 (М)	Соединение	EC50 (М)
Метотрексат	4,39E-08	Аплидин	1,27E-09	ЕТ-743	3,84E-09
РМ00104	1,55E-09	РМ01183	8,57E-10	РМ02734	1,44E-05

b. Во второй серии исследований получали кривые доза-ответ для агентов по отдельности или в комбинации двух лекарственных средств с использованием методики, описанной в предыдущем абзаце.

При установленных значимых различиях между соответствующими величинами ЕС₅₀ для РМ01183 и других стандартных лекарственных средств в данном исследовании использовались различные соотношения фиксированных концентраций для двух лекарственных средств. Обычно выбор фиксированных соотношений концентраций падал на эквипотентное соотношение (1:1) при величине ЕС₅₀ для каждого лекарственного средства, а также некоторые другие соотношения, представляющие различные процентные доли соответствующих величин ЕС₅₀ для каждого лекарственного средства, выше или ниже него. Используя указанные исходные концентрации, осуществляли непрерывные серийные разведения для получения кривых доза-ответ для каждой серии лекарственных средств, по отдельности или в комбинации.

Эффект двухлекарственной комбинации по сравнению с эффектом каждого лекарственного средства по отдельности оценивали с использованием способа Чоу и Талалая, который основан на принципе медиана-эффект (Chou and Talalay, Adv. Enzyme Regul. 1984, 22, 27-55). Уравнение медиана-эффект: f_a/f_u=(C/C_m)^m (где С представляет собой концентрацию лекарственного средства, C_m представляет собой концентрацию медиана-эффект (т.е. IC₅₀, ED₅₀ или LD₅₀, которая ингибирует систему в исследовании на 50%), f_a представляет собой клеточную фракцию, на которую оказала воздействие концентрация лекарственного средства С, f_u представляет собой фракцию, на которую не оказала воздействие концентрация лекарственного средства, а m представляет собой коэффициент сигмовидности кривой концентрация-ответ) описывает взаимоотношения между концентрацией и эффектом лекарственного средства в данной биологической системе.

На основе указанного уравнения термин «индекс комбинирования» (CI) используется как количественная мера степени лекарственных взаимодействий. Индекс комбинирования (CI) определяется уравнением:

CI=(C)₁/(C_x)₁+(C)₂/(C_x)₂,

где (C_x)₁ представляет собой концентрацию лекарственного средства 1 в отдельности, которая ингибирует процентную долю системы х, (C_x)₂ представляет собой концентрацию лекарственного средства 2 в отдельности, которая ингибирует процентную долю системы х, а (C)₁+(C)₂ представляют собой концентрации лекарственного средства 1 и лекарственного средства 2, которые в комбинации также ингибируют процентную долю системы х. Величины CI рассчитывали путем решения уравнения для различных величин f_a (т.е. для различных степеней ингибирования клеточного роста). Величины CI<1 указывают на синергизм, величина 1 указывает на аддитивные эффекты, а величины >1 указывают на антагонизм.

Данные анализировали с помощью компьютерной программы CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK). Для статистического анализа и графиков использовали компьютерную программу Prism (GraphPad, San Diego, USA). Все результаты представляют собой среднюю величину по меньшей мере из трех независимых экспериментов.

Влияние испытуемых комбинаций лекарственных средств на пролиферацию клеток показано на фигурах 273-283:

- Комбинация РМ01183 с метотрексатом. Комбинация РМ01183 с метотрексатом на клеточной линии JURCAT (фигура 273) оказывала некоторое синергическое действие (CI<1) при определенных концентрациях обоих лекарственных средств. Эффекты РМ01183 в комбинации с метотрексатом на клетках MOLT-4 (фигура 274) были, главным образом, аддитивными.

- Комбинация РМ01183 с даунорубицином. Комбинация РМ01183 с даунорубицином на клеточной линии JURCAT (фигура 275) была аддитивной или синергической (CI<1) при определенных концентрациях соединений.

- Комбинация РМ01183 с аплидином. Комбинация РМ01183 с аплидином на клеточной линии JURCAT (фигура 276) и MOLT-4 (фигура 277) оказывала некоторое синергическое действие (CI<1) при определенных концентрациях обоих лекарственных средств.

- Комбинация РМ01183 с ЕТ-743. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 на клеточной линии JURCAT (фигура 278) была аддитивной или синергической (CI<1) при определенных концентрациях обоих лекарственных средств. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 на клетках MOLT-4 (фигура 279) была, главным образом, аддитивной.

- Комбинация РМ01183 с РМ00104. Комбинация РМ01183 с РМ00104 на клеточной линии JURCAT (фигура 280) была по меньшей мере аддитивной, приводящей к некоторым синергическим эффектам (CI<1). Комбинация РМ01183 с РМ00104 на клетках MOLT-4 (фигура 281) оказывала синергическое действие (CI<1).

- Комбинация РМ01183 с РМ02734. Комбинация РМ01183 с РМ02734 на клеточной линии JURCAT (фигура 282) была, главным образом, аддитивной, приводящей к некоторым синергическим эффектам (CI<1) при определенных концентрациях обоих лекарственных средств. Комбинация РМ01183 с РМ02734 на клетках MOLT-4 (фигура 283) оказывала синергическое действие (CI<1).

ПРИМЕР 21. Исследования in vitro для определения влияния РМ01183 в комбинации с химиотерапевтическими агентами на человеческие клеточные линии лимфомы

Следующие агенты оценивали в комбинации с РМ01183: гемцитабин, цитарабин, метотрексат, даунорубицин, ЕТ-743, РМ02734 и РМ00104 (маточные растворы указанных соединений изготавливали в чистом DMSO и хранили при -20°С). Дополнительные серийные разведения осуществляли не содержащей сыворотки культуральной средой до достижения конечной 4Х концентрации. В лунки добавляли аликвоты по 50 мкл каждого разведенного соединения.

Для данного исследования были выбраны человеческие клеточные линии лимфомы RAMOS и U-937, которые были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Клетки RAMOS и U-937выращивали на не содержащей фенолового красного среде RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 100 единиц/мл пенициллина-стрептомицина, при 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности.

Скрининг осуществляли в два этапа, как описано в примере 20:

а. В первой серии исследований определяли индивидуальные величины ЕС₅₀ для каждого лекарственного средства, как показано в таблицах 25 и 26.

Таблица 25 Величины EC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента на опухолевой клеточной линии RAMOS
Соединение	EC50 (М)	Соединение	EC50 (М)	Соединение	EC50 (М)
Гемцитабин	2,51E-08	Цитарабин	3,64E-08	Метотрексат	5,02E-06
Даунорубицин	3,15E-07	ЕТ-743	9,55E-09	РМ00104	4,35E-09
РМ01183	1,39E-09	РМ02734	1,364E-05

Таблица 26 Величины EC50 в молярной концентрации (М) для каждого агента на опухолевой клеточной линии U-937
Соединение	EC50 (М)	Соединение	EC50 (М)	Соединение	EC50 (М)
Гемцитабин	3,27E-08	Метотрексат	2,63E-08	Даунорубицин	3,04E-07
ЕТ-743	8,62E-09	РМ00104	4,50E-09	РМ01183	1,03E-09
РМ02734	6,85E-06

b. Во второй серии исследований получали кривые доза-ответ для агентов по отдельности или в комбинации двух лекарственных средств. Эффекты комбинаций лекарственных средств оценивали с использованием способа Чоу и Талалая, как описано в примере 20.

Влияние испытуемых комбинаций лекарственных средств на пролиферацию клеток показано на фигурах 284-296:

- Комбинация РМ01183 с цитарабином. Комбинация РМ01183 с цитарабином на клеточной линии RAMOS (фигура 284) оказывала некоторое синергическое действие (CI<1).

- Комбинация РМ01183 с метотрексатом. Комбинация РМ01183 с метотрексатом на клеточной линии RAMOS (фигура 285) оказывала некоторое синергическое действие (CI<1) при определенных концентрациях обоих лекарственных средств. Комбинация РМ01183 с метотрексатом на клеточной линии U-937 (фигура 286) оказывала некоторое синергическое действие при определенных концентрациях.

- Комбинация РМ01183 с гемцитабином. Комбинация РМ01183 с гемцитабином на клеточной линии RAMOS (фигура 287) была аддитивной или синергической (CI<1) при определенных концентрациях обоих лекарственных средств. Комбинация РМ01183 с гемцитабином на клеточной линии U-937 (фигура 288) оказывала синергическое действие (CI<1).

- Комбинация РМ01183 с даунорубицином. Комбинация РМ01183 с даунорубицином на клеточной линии RAMOS (фигура 289) и клеточной линии U-937 (фигура 290) была по меньшей мере аддитивной, приводящей к некоторым синергическим эффектам (CI<1).

- Комбинация РМ01183 с ЕТ-743. Комбинация РМ01183 с ЕТ-743 на клеточной линии RAMOS (фигура 291) и клеточной линии U-937 (фигура 292) оказывала синергическое действие (CI<1) при определенных концентрациях соединений.

- Комбинация РМ01183 с РМ00104. Комбинация РМ01183 с РМ00104 на клеточной линии RAMOS (фигура 293) оказывала синергическое действие (CI<1). Комбинация РМ01183 с РМ00104 на клетках U-937 (фигура 294) оказывала некоторое синергическое действие (CI<1) при определенных концентрациях обоих лекарственных средств.

- Комбинация РМ01183 с РМ02734. Комбинация РМ01183 с РМ02734 на клеточной линии RAMOS (фигура 295) оказывала синергическое действие (CI<1), в то время как комбинация РМ01183 с РМ02734 на клетках U-937 (фигура 296) была по меньшей мере аддитивной, приводящей к некоторым синергическим эффектам (CI<1) при высоких концентрациях обоих лекарственных средств.

1. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, который нуждается в указанном лечении, терапевтически эффективного количества РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в синергической комбинации с терапевтически эффективным количеством антиметаболита, в котором антиметаболит выбран из 5-фторурацила, гемцитабина, цитарабина, капецитабина, децитабина, флоксуридина, аминоптерина, метотрексата, пеметрекседа и ралтитрекседа.

2. Способ по п. 1, в котором рак, подлежащий лечению, выбран из рака легкого, саркомы, злокачественной меланомы, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака желудка, рака яичника, гепатомы, рака молочной железы, колоректального рака, рака почки, рака пищевода, нейробластомы, рака головного мозга, рака шейки матки, анального рака, рака яичка, лейкоза, множественной миеломы и лимфомы.

3. Способ по п. 2, в котором РМ01183 или его фармацевтически приемлемая соль и антиметаболит образуют часть одного и того же лекарственного препарата.

4. Способ по п. 2, в котором РМ01183 или его фармацевтически приемлемая соль и антиметаболит поставляются в форме отдельных лекарственных препаратов для введения в одно и то же время или в разное время.

5. Способ по п. 4, в котором РМ01183 или его фармацевтически приемлемая соль и антиметаболит поставляются в форме отдельных лекарственных препаратов для введения в разное время.

6. Способ по п. 1, в котором антиметаболит выбран из 5-фторурацила, капецитабина, гемцитабина, цитарабина и метотрексата.

7. Применение РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в синергической комбинации с антиметаболитом, в котором антиметаболит выбран из 5-фторурацила, гемцитабина, цитарабина, капецитабина, децитабина, флоксуридина, аминоптерина, метотрексата, пеметрекседа и ралтитрекседа, в лечении рака.

8. Применение РМ01183 или его фармацевтически приемлемой соли в синергической комбинации с антиметаболитом, в котором антиметаболит выбран из 5-фторурацила, гемцитабина, цитарабина, капецитабина, децитабина, флоксуридина, аминоптерина, метотрексата, пеметрекседа и ралтитрекседа, в производстве лекарственного средства для лечения рака.