Способ оценки биосовместимости имплантируемых изделий



Владельцы патента RU 2605821:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине и биологии, и может быть использовано для оценки биосовместимости имплантируемых изделий. Для этого получают клетки с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости. Животному после анестезии выполняют средне-срединную лапаротомию, в брюшную полость имплантируют тестируемый образец материала, укладывая его на петли тонкой кишки и укрывая большим сальником, рану послойно ушивают. Через 52 часа выполняют релапаротомию, тестируемый образец материала извлекают, обрабатывают 0.25% раствором трипсина "Gibco" с этилендиаминтетрауксусной кислотой in vitro. Снимают адгезированные клетки, которые затем трижды промывают средой DMEM/F12+HEPES, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотке и осаждают центрифугированием при 1000 оборотах в минуту, а осадок ресуспендируют эмбриональной телячьей сывороткой. Использование данного способа позволяет получить культуру клеток для комплексной оценки биосовместимости имплантируемых изделий в условиях для взаимодействия макрофагов с тестируемым материалом in vivo и оценить морфо-функциональные показатели клеток после такого взаимодействия в условиях in vitro.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине и биологии, клеточным технологиям, патологической анатомии, фармакологии, токсикологии, и может быть использовано для оценки биосовместимости имплантируемых изделий на этапе их разработки и создания, а также для постмаркетинговой оценки и углубленного изучения зарегистрированных и применяемых имплантируемых изделий медицинского назначения с целью улучшения их биосовместимости. В качестве тестируемых изделий могут быть использованы любые синтетические материалы для имплантации: дентальные имплантаты, эндопротезы для герниопластики, эндопротезы суставов, пластины для нейрохирургии, дренажные системы, стенты, шовный материал.

Оценка биосовместимости изделий медицинского назначения проводится как in vitro, так и in vivo [1, 2]. Тестирование in vitro подразумевает получение той или иной популяции клеток в виде прикрепленных культур - фибробластов, мезенхимально-стромальных клеток или неприкрепленных суспензионных культур и т.д. с последующей оценкой необходимых морфо-функциональных показателей клеток в присутствии тестируемого материала. При таком виде тестирования материала или изделия невозможно получить необходимой и достоверной информации в полном объеме в силу отсутствия всех необходимых взаимодействий между выбранными в качестве тест-системы клетками и другими клетками, отсутствующими в тест-системе, что ограничивает возможности и эффективность такого анализа.

Поэтому любое исследование in vitro с применением клеток требует последующих этапов исследований in vivo, в результате которых возможно получение результата в основном на уровне тканей, что иногда требует длительного периода наблюдения.

В настоящее время ведущая роль в оценке биосовместимости материалов принадлежит макрофагам. В организме функции макрофагов очень разнообразны. Они осуществляют не только фагоцитоз чужеродного материала, клеточно-тканевого детрита, но и стимуляцию и регуляцию иммунного ответа, индукцию воспаления, участвуют в репаративных процессах и обмене компонентов внеклеточного матрикса в физиологических условиях. Именно поэтому разнообразие их функций определяет реакцию тканей при имплантации изделий, т.е. биосовместимость, что может быть использовано для ее оценки.

Известен способ получения резидентных макрофагов путем выращивания их из моноцитов крови в присутствии GM-CSF, после чего возможна оценка морфо-функциональных показателей клеток на тестируемое изделие [3]. Метод очень трудоемкий, недостаточно количество клеток, необходимых для тестирования, а дифференцировка моноцита требует длительной культивации в течение 7-9 дней до начала тестирование материала, результаты которого можно интерпретировать как скрининговые.

Известен способ получения резидентных макрофагов из перитонеального экссудата мыши с целью использования выделенной популяции клеток для оценки биосовместимости материалов. Для этого животных эвтаназируют цервикальной дислокацией. В брюшную полость вводят 3-4 мл изотонического буфера с добавлением 5000 ЕД гепарина и 20 мл сыворотки эмбрионов коров из расчета на 1 л. Перитонеальную жидкость медленно аспирируют шприцем. Собранный перитонеальный экссудат помещают в охлажденные до 0°C силиконизированные центрифужные пробирки. Клетки осаждают, ресуспендируют осадок в растворе Хенкса. До засева культуры клетки сохраняют на льду. С целью увеличения количества клеток иногда используют предварительное введение в брюшную полость животного раздражающих веществ. Через 3-4 суток выполняют эвтаназию мыши и аспирацию ее перитонеального экссудата. Полученные перитонеальные макрофаги культивируют в течение 4 суток в специальных условиях, затем приступают к тестированию материалов [4, 5].

Данный способ взят за прототип.

Недостатком способа является необходимость эвтаназии животного, длительность его реализации в условиях in vitro, недостаточное количество получаемых для тестирования клеток, изменение функциональной активности клеток после введения в брюшную полость животного раздражающих веществ, а в некоторых случаях изменение их морфологических характеристик, исключение возможности взаимодействия макрофагов с другими клетками, оказывающих регуляторную функцию. Способ не во всех случаях позволяет получить достоверные результаты.

Целью изобретения является разработка способа получения клеток с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости.

Эта цель достигается тем, что животному после анестезии выполняют средне-срединную лапаротомию, в брюшную полость имплантируют тестируемый образец материала, укладывая его на петли тонкой кишки и укрывая большим сальником, рану послойно ушивают; через 52 часа выполняют релапаротомию, тестируемый образец материала извлекают, обрабатывают 0.25% раствором трипсина "Gibco" с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) in vitro, снимая адгезированные клетки, которые затем трижды промывают средой DMEM/F12+HEPES, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и осаждают центрифугированием при 1000 оборотах в минуту, а осадок ресуспендируют ЭТС.

Техническим результатом предлагаемого способа является возможность получения клеток с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости.

Способ позволяет не только выделить клетки с поверхности образца тестируемого материала, но и оценить изменение их морфо-функциональных характеристик под действием имплантируемого изделия. Полученные результаты являются достоверными, поскольку при его реализации происходят естественные процессы взаимодействия макрофагов с другими клетками в течение 56 часов in vivo, присутствует «среда» сигнальных молекул и регуляторных белков в брюшной полости и нет необходимости в эвтаназии животного.

Способ получения клеток с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости реализуется следующим образом. На этапе in vivo мелкому грызуну (мыши, крысе) под анестезией (рометар + золетил, в/м) после предварительной обработки операционного поля выполняют средне-срединную лапаротомию с протяженность разреза от 1 см до 4 см. В брюшную полость на петли тонкой кишки помещают стерильный тестируемый материал, укрывают его большим сальником, который является источником тканевых макрофагов. Размеры образца тестируемого материала предварительно подбирают в зависимости от веса животного и объема его брюшной полости. Рану послойно ушивают. Через 52 часа выполняют релапаротомию, тестируемый образец материала извлекают, обрабатывают 0.25% раствором трипсина "Gibco" с ЭДТА in vitro, снимая адгезированные клетки, которые затем трижды промывают средой DMEM/F12+HEPES, содержащей 10% ЭТС и осаждают центрифугированием при 1000 оборотах в минуту, а осадок ресуспендируют ЭТС.

Данный способ лишен недостатков известных способов, поскольку прост в реализации, не требует последующей эвтаназии животного. Способ иллюстрируется следующим примером, реализованным на базе ИЭМБ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России.

Эксперименты выполнены на 46-ти белых крысах обоего пола весом 180-250 г, которые в зависимости от вида имплантируемого изделия были разделены на 2 группы. В брюшную полость крыс первой группы в асептических условиях под общим обезболиванием (золетил - 3 мг/кг + рометар - 2 мг/кг, внутримышечно) были установлены фрагменты стандартных (50-70 г/м2) полипропиленовых эндопротезов для герниопластики. Животным второй группы аналогичным образом были установлены титановые эндопротезы. Площадь имплантируемого материала составляла 12-20 см2 в зависимости от размера животного и объема его брюшной полости. Через 52 часа в асептических условиях образцы эндопротезов извлекали, обрабатывали 0.25% раствором трипсина "Gibco" c ЭДТА («Invitrogen»), снимая адгезированные клетки, которые затем трижды промывали инкубационной средой и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин, а осадок ресуспендировали в ЭТС. Для оценки морфо-функциональных показателей макрофагов из полученной суспензии делали мазки, которые фиксировали абсолютным этиловым спиртом и окрашивали азур-эозином по Романовскому. Данные мазки позволили определить соотношение тучных клеток, эозинофилов, полиморфноядерных лейкоцитов, лимфоцитов и макрофагов. Также выполнено иммуноцитохимическое исследование полученных клеток (активность миелопероксидазы), НСТ-тест.

Среди адгезированных на поверхности полипропилена клеток чаще встречали крупные и базофильные формы, а также двух- и трехядерные клетки. В среднем число макрофагов, содержащих более одного ядра, составляло 1.27% на полипропиленовых эндопротезах, 0.67% - на титановых (p<0,01). Митозы обнаружены в трех из пятнадцати (20%) снятых с титановых и в восьми из четырнадцати (57%) снятых с полипропиленовых эндопротезов клеточных популяциях (p<0,05). Выявлены существенные различия между полипропиленовыми и титановыми эндопротезами в отношении активности адгезированных к ним клеток. Доля НСТ-позитивных макрофагов среди мононуклеаров на полипропиленовых образцах значительно выше, чем на титановых. Гранулы продукта реакции видны и в многоядерных клетках, но активность в них по сравнению с одноядерными ниже. На титановых поверхностях они в большинстве случаев НСТ-отрицательны. Все адгезированные к поверхности эндопротезов нейтрофильные лейкоциты и часть макрофагов обладали миелопероксидазной активностью. Продукт реакции часто обнаруживали в митотически делящихся клетках. Относительное количество макрофагов с миелопероксидазной активностью было больше на полипропиленовых образцах, чем на титановых. Полученные результаты позволили установить, что изделия для герниопластики на основе титана обладают лучшей биосовместимостью по сравнению с полипропиленовыми изделиями.

Данный способ может найти широкое применение в экспериментальной медицине.

ИСТОЧНИКИИНФОРМАЦИИ

1. Eddouks M., Chattopadhyay D., Zeggwagh N. Ali. Animal Models as Tools to Investigate Antidiabetic and Anti-Inflammatory Plants. Evid Based Complement Alternat. Med. 2012; 2012: 142087. Published online 2012 July 29. doi: 10.1155/2012/142087.

2. Liao J-C., Deng J-S, Chiu C-S, Hou W-C, Huang S-S, Shie P-H, Huang G-J. Anti-Inflammatory Activities of Cinnamomum cassia Constituents In Vitro and In Vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 429320. Published online 2012. March 27. doi: 10.1155/2012/429320.

3. Anderesen R, Scheibenbogen C, Brugger W, Krause S, Meerpohl HG, Leser HG, Engler H, GW. Adoptive transfer of tumor cytotoxic macrophages generated in vitro from circulating blood monocytes: a new approach to cancer immunotherapy. Cancer Res. 1990. Dec. 1; 50(23):7450-6.

4. Hogg N, Parish CR. Surface antigens of the murine cytostatic peritoneal macrophage. Immunology. 1980 Sep; 41(1):187-93.

5. Kohn F.R., Kung A.H. Role of endotoxin in acute inflammation induced by gram-negative bacteria: specific inhibition of lipopolysaccharide-mediated responses with an amino-terminal fragment of bactericidal/permeability-increasing protein. Infect Immun. 1995. January; 63(1): 333-339.

Способ получения клеток с поверхности имплантируемого изделия для оценки его биосовместимости, включающий забор биологического материала из брюшной полости мелких грызунов с последующим его исследованием, отличающийся тем, что животному после анестезии выполняют средне-срединную лапаротомию, в брюшную полость имплантируют тестируемый образец материала, укладывая его на петли тонкой кишки и укрывая большим сальником, рану послойно ушивают; через 52 часа выполняют релапаротомию, тестируемый образец материала извлекают, обрабатывают 0.25% раствором трипсина "Gibco" с этилендиаминтетрауксусной кислотой in vitro, снимая адгезированные клетки, которые затем трижды промывают средой DMEM/F12+HEPES, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и осаждают центрифугированием при 1000 оборотах в минуту, а осадок ресуспендируют эмбриональной телячьей сывороткой.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикума для определения концентрации лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикума для определения концентрации лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями.

Изобретение относится к психологии. Диагностику школьной дезадаптации у младших школьников осуществляют путем определения методом РИА уровня АКТГ в сыворотке крови ребенка.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для измерения активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено антитело к человеческому СD52.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, может быть использовано для дифференциальной диагностики первичного и вторичного иммунного ответа на вирус кори.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики POEMS-синдрома у больных множественной миеломой или ангиофолликулярной гиперплазией лимфатических узлов.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ определения болевого синдрома при полинейропатии у больных вибрационной болезнью, включающий забор венозной крови, получение сыворотки крови и определение в ней количественного содержания серотонина.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ количественной оценки силы связывания сенсибилизированной полистироловой микросферы с эукариоцитом линии J-774.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано в технологии изготовления референс-панели сывороток, содержащих антигены и антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности тест-систем иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных и иммуноблотов.
Изобретение относится к области медицины и найдет применение в онкоурологии, в частности, при лечении рака предстательной железы для прогнозирования риска развития биохимического рецидива у больных. Сущность способа: в ядрах эпителиальных клеток предстательной железы иммуногистохимическим способом определяют экспрессию антител к AT2-рецептору, подсчитывают долю иммунопозитивных клеток от общего числа опухолевых клеток в поле зрения микроскопа ×40. При значениях этой доли менее 0,7 прогнозируют возникновение биохимического рецидива рака предстательной железы. Использование предлагаемого способа позволяет эффективно, с высокой точностью прогнозировать биохимический рецидив рака предстательной железы, дает возможность на дооперационном этапе проводить комплексную оценку наиболее информативных факторов риска в числовом эквиваленте, в том числе при низких значениях простостатического специфического антигена, учитывая индивидуальную клиническую значимость каждого фактора риска. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансфузиологии, и может быть использовано для получения плазмы крови доноров с содержанием дефензинов, обладающих наибольшей чувствительностью к бактериальной культуре. Для этого в плазме выявляют содержание антимикробных пептидов дефензинов и при титре дефензинов свыше 50 пг/мл осуществляют забор крови. Выделяют бактериальную культуру от пациентов с осложненными инфекциями, вызванными протеем, синегнойной и кишечной палочками, стафилококком и клебсиеллой, определяют чувствительность данной культуры к полученным дефензинам, а затем для получения плазмы отбирают доноров с дефензинами, обладающими наибольшей чувствительностью к выделенной бактериальной культуре. Использование данного способа позволяет получить плазму крови доноров с содержанием дефензинов, обладающих наибольшей чувствительностью к бактериальной культуре, для лечения внутрибольничной инфекции. 1 ил.

Группа изобретений относится к медицине и касается системы детекции для электрохимического выявления белкового аналита, включающей наноструктурированный микроэлектрод, содержащий линкер на своей поверхности, где линкер присоединен к антителу или его фрагменту, способным связывать белковый аналит; и редокс-репортер, способный к переносу электронов с указанным наноструктурированным микроэлектродом, где связывание белкового аналита с указанными антителом или его фрагментом препятствует переносу электронов между указанным редокс-репортером и указанным наноструктурированным микроэлектродом. Группа изобретений также касается способа электрохимической детекции белкового аналита; способа электрохимической детекции множества белковых аналитов; способа мониторинга прогрессирования или ответа у субъекта, имеющего злокачественную опухоль; набора для электрохимической детекции белкового аналита. Группа изобретений обеспечивает создание простого и надежного анализа белков на основе электрохимической детекции. 5 н. и 65 з.п. ф-лы, 3 пр., 5 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ проверки безопасности исследуемого антитела, связывающегося с бета-амилоидом. Инкубируют глиальные макрофаги с олигомерами Аβ1-42: i) в присутствии исследуемого антитела, ii) в присутствии антитела IgG1 против бета-амилоида, включающего константную область IgG1 человека, и iii) без антитела. Затем измеряют активацию р38 МАР-киназы в глиальных макрофагах. Идентифицируют исследуемое антитело как безопасное, если оно индуцирует промежуточный уровень активации р38 МАР-киназы, т.е. уровень активации выше чем в присутствии олигомеров Аβ1-42 без антитела, но ниже чем в присутствии олигомеров Аβ1-42 и антитела IgG1. Также предложен способ контролирования безопасности курса лечения амилоидоза исследуемым антителом против бета-амилоида, включающий определение уровня активации р38 МАР-киназы в глиальных макрофагах, полученных от пациента, и, при необходимости, корректировку курса лечения так, чтобы активация р38 МАР-киназы была на промежуточных уровнях. Изобретение обеспечивает нейропротекцию, опосредуемую антителом против бета-амилоида, без вызова патогенетического воспалительного состояния. 2 н. и 57 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и санитарной эпидемиологии. Предложен способ получения имитаторов патогенных биологических агентов путем обработки суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания СВЧ-облучением с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Вт/см3 двукратно по 5 минут. Инактивированные бактерии стабилизировали защитной средой и высушивали в сублимационной камерной установке до остаточной влажности 2-5%. Целевой продукт состоит из сухой культуры инактивированных бактерий (91,5%), талька (8%) и аэросила (0,5%). Способ обеспечивает получение безопасного при использовании и длительно сохраняющего свои индикационные свойства имитатора патогенного биологического агента. 2 табл., 5 пр.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для тестирования образца, полученного от человека. Для этого проводят измерение первого сигнала, полученного вследствие связывания первой части указанного образца с бактериальным липополисахаридом, и измерение второго сигнала, полученного вследствие связывания второй части указанного образца с нативным антигеном, выбранным по меньшей мере из одного из: (а) относящегося к кишечнику антигена и (б) относящегося к гематоэнцефалическому барьеру антигена. Также предложена диагностика заболевания, связанного с синдромом повышенной кишечной проницаемости у субъекта, способ диагностики заболевания, связанного с проницаемостью гематоэнцефалического барьера у субъекта, и тестовый планшет. Группа изобретений обеспечивает диагностику заболеваний, связанных с синдромом повышенной кишечной проницаемости (независимо от того, развился он посредством парацеллюлярного или трансцеллюлярного пути, и независимо от того, был ли он вызван бактериальными токсинами или другими причинами), и/или заболеваний, связанных с чрезмерной проницаемостью гематоэнцефалического барьера, таких как: нейровоспаление и/или нейроаутоиммуннные реакции, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера или периферическая невропатия и большое депрессивное расстройство. 5 н. и 21 з.п. ф-лы, 9 ил., 9 табл.

Группа изобретений предлагает связанные со стрептавидином магнитные частицы, имеющие высокую способность связывания биотина, и способ их изготовления. Связанная со стрептавидином магнитная частица имеет структуру, в которой молекулы стрептавидина сшиты друг с другом на магнитной частице, где связанную со стрептавидином магнитную частицу изготавливают способом, включающим следующие стадии: (1) изготовление суспензии, содержащей магнитные частицы, на поверхности которых находятся аминогруппы; и (2) реакция магнитных частиц со стрептавидином и глутаральдегидом путем введения глутаральдегида в присутствии стрептавидина в суспензию, изготовленную на стадии (1). Настоящая группа изобретений может быть эффективно использована в клинической диагностике. 9 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано при получении эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных. Для этого получают антигенную фракцию путем культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы и ресуспендированием 0,8-1,2% раствором дезмола до концентрации 4-10 млрд/мл микробных тел. Далее прогревают в течение 55-65 мин при температуре 93-98°C и смесь центрифугируют при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин. К супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 суток. Затем к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9-12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40-46°C в течение 1,5-2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры и отмывкой. Использование данного способа - получение эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных - позволяет увеличить срок хранения целевого продукта при сохранении его специфической активности. 3 з.п. ф-лы, 7 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано при дифференциальной диагностике гиперреактивности (ГР) к яду пчел. Для этого выявляют в анамнезе пациента контакта с пчелой Apis mellifera. Определяют уровень общего IgE, уровень специфичного IgE к яду пчелы, гистамина, лейкотриенов, базальной триптазы, экспрессии CD63+ и CD203c при контакте базофилов крови с аллергенами яда пчелы, гистамина, лейкотриенов. При наличии в анамнезе контакта с пчелой Apis mellifera с последующими реакциями различной степени тяжести, уровне общего IgE более 100 МЕ/мл, уровне специфических IgE более 0,7 МЕ/мл, CD63+ более 10%, CD203c более 10%, уровне лейкотриенов более 200 пкг/мл, уровне гистаминолиберации от 10±3,2% до 50±5,3%, повышенном уровне базальной триптазы диагностируют IgE-опосредованную реакцию. При наличии в анамнезе контакта с пчелой Apis mellifera с последующими реакциями различной степени тяжести, уровне общего IgE менее 100 МЕ/мл, уровне специфических IgE менее 0,7 МЕ/мл, CD63+ менее 10%, CD203c более 10%, уровне лейкотриенов менее 200 пкг/мл, уровне гистаминолиберации до 15%, нормальном уровне базальной триптазы диагностируют не IgE-опосредованную реакцию. Разработанный комплексный метод позволяет осуществить дифдиагностику истинных и псевдоаллергических реакций на яд пчел, что в последующем позволит назначить адекватное специфическое лечение с учетом формирования блокирующих (защитных) антител. 2 пр., 3 табл.

Изобретение относится к способу получения сульфатированной формы тиреоидного гормона формулы II (T3S) по следующей реакции: Технический результат: полученное соединение T3S можно легко выделить в чистом виде в виде твердого вещества с хорошими выходами. 15 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 6 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2016-12-27 2016-12-27T11:49:11
Наверх