Штамм вируса гриппа a/common muskrat/chany lake/226/05 h2n2-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами ртга и пцр и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo
Владельцы патента RU 2606030:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины" (НИИЭКМ) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма вируса гриппа. Представленный штамм вируса гриппа птиц A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа, депонированный в Коллекции микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-623. Изобретение может быть использовано для исследования эффективности лечебных и профилактических препаратов против гриппа, для приготовления антигенсодержащего субстрата и сыворотки для серодиагностики гриппа Н2-субтипа в РТГА, для применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, а также для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo. 4 табл., 4 пр.
Изобретение относится к штаммам вируса гриппа H2N2-субтипа и может быть использовано в медицине, ветеринарии и микробиологии. Указанный штамм предназначен для приготовления антигенсодержащего препарата и сыворотки для серодиагностики гриппа Н2-субтипа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), как компонента панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа А (H1-H18) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в РТГА, а также выявления антител к вирусу гриппа Н2-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА. Штамм может быть применен в качестве контрольного референс-штамма Н2 при проведении диагностических работ методом ПЦР. Штамм также может быть использован для эффективности лечебных и профилактических препаратов против гриппа.
Вирусы гриппа A (Orthomyxoviridae, Influenzavirus А) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их основным резервуаром в природе являются дикие птицы околоводного комплекса (Львов, Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А - животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2005. - №4. - С. 4-11) [1]. Вирусы гриппа А подразделяются на субтипы на основании антигенных свойств их поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина и нейраминидазы. На сегодняшний день известно 17 субтипов гемагглютинина (Н) и 10 субтипов нейраминидазы (N) [1, 2]. К настоящему моменту циркуляция вирусов гриппа А со всеми известными подтипами гемагглютинина и нейраминидазы, кроме H17N10, зарегистрирована только среди птиц. В процессе эволюции нередко возникают высокопатогенные для человека и животных варианты вируса гриппа. Яркий пример - возникновение нового азиатского варианта вируса H5N1-субтипа, впервые зарегистрированного у домашних птиц в 1996 (Львов Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А - животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2005. - №4. - С. 4-11), (Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13; 109(11):4269-74). [1, 2].
У человека сезонные эпидемии гриппа ежегодно наносят значительный ущерб. Пандемии гриппа происходили четыре раза в течение последнего столетия. Для них были характерны очень быстрое распространение, вовлечение всех континентов, высокий процент заболеваемости и высокая смертность в некоторых группах населения. Это подчеркивает серьезность проблемы диагностики вируса для человечества.
Чтобы подготовиться к будущим пандемиям, организации мер профилактики и диагностики на Международной конференции по вакцине против пандемического гриппа в 2003 году был предложен приоритетный план и классификация кандидатных пандемических вирусов. При этом, субтипы H1, Н2 и Н3, которые, как известно, привели к предыдущим пандемиям, имеют самый высокий уровень; субтипы Н5, Н6, Н7, Н9 имеют второй по важности уровень приоритета (Isakova-Sivak I, de Jonge J, Smolonogina T, Rekstin A, van Amerongen G, van Dijken H, Mouthaan J, Roholl P, Kuznetsova V, Doroshenko E, Tsvetnitsky V, Rudenko L. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. PLoS One. 2014 Jul 24; 9(7):e102339) [3].
Вирус гриппа H2N2-субтипа представляет собой один из наиболее актуальных и потенциально опасных для человека вирусов. H2N2 вирусы гриппа не циркулировали в человеческой популяции, начиная с 1968 года, поэтому люди, родившиеся после этого года, не имеют иммунитета к ним и поэтому они будут уязвимы к этому вирусу при новой пандемии
(Nabel GJ, Wei CJ, Ledgerwood JE. Vaccinate for the next H2N2 pandemic now. Nature, 2011. 471: 157-158). [4]. Согласно архивным данным, этот подтип вызвал пандемию 1889 и был распространен до 1901 года, после чего она был вытеснен «Испанкой» H1N1. Тем не менее, 56 лет спустя, вирусы H2N2 в 1957 году вернулись, вызвав пандемию "Азиатского гриппа", унесшую более двух миллионов жизней (Pappas С, Yang Н, Carney PJ, Pearce MB, Katz JM, Stevens J, Tumpey TM. Assessment of transmission, pathogenesis and adaptation of H2 subtype influenza viruses in ferrets. Virology. 2015 Mar; 477:61-71. doi: 10.1016/j.virol.2015.01.002. Epub 2015 Feb 5) [5], (Jones JC, Baranovich T, Marathe BM, Danner AF, Seiler JP, Franks J, Govorkova EA, Krauss S, Webster RG. Risk assessment of H2N2 influenza viruses from the avian reservoir. J Virol. 2014 Jan; 88(2): 1175-88. doi: 10.1128/JVI.02526-13. Epub 2013 Nov 13) [6].
В настоящее время H2N2 вирусы гриппа продолжают постоянно циркулировать среди птиц, подчеркивая вероятность их возвращения к человеческой популяции.
Так, было показано на хорьковой модели, что ряд птичьих вирусов Н2 субтипа эффективно передаются между млекопитающими аэрозольно и очень быстро адаптируются к этим животным [5].
В течение двух последних лет проводились серьезные исследования H2N2-субтипа вируса в отношении антигенных и генетических свойств, специфичности связывания с рецепторами, первичной репликации в нормальных человеческих клетках эпителия бронхов (NHBE) и клеток трахеи свиньи, патогенности и передачи в животных моделях, и чувствительности к противовирусным препаратам [6]. В связи с этим ведущие вирусологи рекомендуют проводить разработки по совершенствованию диагностики, профилактики и лечения данного субтипа вируса.
Большинство имеющихся сегодня коммерческих штаммов вируса H2N2 субтипа устарели (выделены более 30 лет назад) и имеют длительную пассажную историю. Они являются антигенно отличными от циркулирующих в настоящее время в природе вариантов и непригодны для использования в диагностике. Эффективная диагностика вируса требует комбинирования различных методов с использованием адекватных контролей (референс-штаммов), таких как анализ клинических симптомов (в том числе и гистологический анализ), выделение и наработка вирусного материала, серологический анализ, молекулярно-биологические методы на основе ПЦР.
Таким образом, очевидна необходимость создания современного референс-штамма вируса гриппа H2N2-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами РТГА и ПЦР и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo.
Предлагаемый в качестве изобретения штамм является уникальным птичьим вариантом вируса гриппа H2N2-субтипа, выделенным от млекопитающего ондатры (Ondatra zibethicus). Новый вирус гриппа был выделен от околоводного вида, обитающего в тесном контакте с птицами-носителями. Наиболее вероятно, что этот вариант вируса, циркулирующий в диких водоплавающих птицах, пересек видовой барьер, закрепился в новом хозяине, обладает способностью реплицироваться в легких млекопитающих и вызывать патологические изменения. В связи с этим целесообразно использовать этот современный штамм с особенными характеристиками для разработки методов диагностики и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo.
Источники содержат информацию о нескольких штаммах, использовавшихся ранее в диагностике, в том числе с использованием метода РТГА и медицинских исследованиях.
Однако в указанных ниже источниках литературы присутствует информация только о некоторых свойствах вируса гриппа Н2-субтипа, которой недостаточно для использования штаммов при создании на их основе диагностических препаратов, в частности методами РТГА и ПЦР. Вместе с тем, описанные штаммы по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А могут значительно отличаться антигенно от современных вариантов вируса гриппа Н2-субтипа. При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа Н2-субтипа, как компоненты диагностических тест-систем. Все отечественные штаммы имеют ряд недостатков. Одним из основных является отсутствие данных о возможности использования в диагностике методами РТГА и ПЦР.
Существует штамм вируса гриппа А/Япония/1/57(H2N1) для моделирования инфекции у мышей (Патент SU 1735363; Львов Д.К. с соавторами) [7]. Адаптирован к размножению в легких мышей.
Существует холодоадаптированный штамм вируса гриппа А/Краснодар/101/59/35 (H2N2) для получения реассортантных штаммов живой гриппозной вакцины штамм (патент РФ №2354695; Гендон Ю.З. с соавторами) [8]. Он предназначен в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантных холодоадаптированных вакцинных штаммов для живой гриппозной вакцины, изготавливают при использовании в качестве субстрата как куриных эмбрионов, так и линии клеток MDCK. Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа.
Существует также Штамм вируса гриппа A(H2N3) ГКВ 2237 птиц для моделирования инфекции гриппа (Патент RU 2021354; Смирнов Ю.А. с соавторами; от 05.05.1991) [9]. Изобретение относится к вирусологии и представляет собой штамм вируса гриппа А птиц (А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78), вызывающий у мышей манифестную инфекцию, регистрируемую по вирусологическим и серологическим показателям. Возможно его использование для экологических наблюдений над вирусами гриппа А, предусматривающих моделирование экспериментальной гриппозной инфекции.
Он является наиболее близким аналогом, является штаммом-прототипом. Однако недостатком является невозможность его использования для приготовления антигенсодержащего субстрата и применения в диагностике методами РТГА и ПЦР. Он был выделен от дикой птицы.
Поэтому предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа Н2-субтипа, выделенным от млекопитающего на территории России и единственным известным в мире штаммом вируса гриппа H2N3-субтипа от околоводного млекопитающего с опубликованной последовательностью нуклеотидных остатков всех сегментов генома. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа Н2-субтипа в России в РТГА не существует.
За рубежом для РТГА в основном используются следующий референс-штамм A/Singapore/1/57 (H2N2), выделенный более полувека назад (Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, Bestebroer ТМ, Herfst S, Smith D, Rimmelzwaan GF, Olsen B, Osterhaus AD. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 2005 Mar; 79(5):2814-2) [10]. Он является человеческим и непригоден для использования в диагностике гриппа птиц вследствие антигенного отличия. По причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности, поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. Наряду с ним ранее использовался птичий А/mallard/Alberta/77/1977 (H2N3). Однако он антигенно устарел, не является адекватным в настоящий момент.
В настоящее время в основном используются тест-системы для определения субтипов вируса гриппа на основе полимеразной цепной реакции и на основе микрочипов (В.А. Рябинин, Е.В. Костина, Г.А. Максакова, А.Н. Синяков. Типирование гемагглютинина вируса гриппа а с использованием гибридизационного микрочипа // Биоорганическая Химия, 2010, том 36, №6, с. 849-852; Михайлович В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: дис. … доктор, биол. наук / В.М. Михайлович. - Москва, 2009. - 197 с) [11], (Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr; 27(2): 120-31). [12], (Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar; 54(3):129-34) [13], (Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep; 160(1-2):163-6.) [14],
Однако при апробации этих тест-систем, необходимо применять контрольный референс-штамм Н2 субтипа, наиболее близкий к циркулирующим в настоящее время в природе. В вышеупомянутых исследованиях проверки систем в отношении штамма вируса гриппа Н2 проведено не было. Это связано, в том числе, с отсутствием на отечественном рынке коммерческого референс-штамма Н2.
За рубежом для исследований и в качестве компонента панели референс-штаммов для РТГА и ПЦР применяют целый ряд вирусов.
Штаммы H2N2 CK/NY/3749-7/96 и H2N4 DK/LA/8174/86 применялись как контрольные при апробации ПЦР-системы детекции вирусов гриппа А и В в реальном времени (Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and В viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul; 1(4): 167-75) [15].
При проведении исследований методом нейтрализации с моноклональными антителами к H5N1 (ELISA), в качестве контрольного был использован также штамм A/Duck/Hokkaido/95/2001 (H2N2) (Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell СJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies) [16].
Другой штамм H2N3 A/Duck/Germany/1215/73 был использован в качестве контрольного для разработки и исследования иммуномагнитной ПЦР ловушки вируса гриппа (Dhumpa R, Handberg KJ, Jørgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar; 69(3):258-65) [17].
Для апробации тест-системы экспресс-диагностики высокопатогенного вируса гриппа Н7 была применена панель контрольных штаммов вируса гриппа различных субтипов, которая включала штамм A/duck/Hokkaido/17/2001 (H2N3). Нуклеотидная последовательность этого же штамма была использована для филогенетического анализа штаммов вируса гриппа, выделенных на территории Японии (Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP. P. 4-21 [18].
Для апробации экспресс тест-системы Н5 Dot ELISA на основе двух комплементарных моноклональных антител к вирусу гриппа Н5 субтипа в качестве контроля был использован штамм A/duck/Nanchang/4-184/2000 (H2N9) (Не F, Soejoedono RD, Murtini S, Goutama M, Kwang J. Complementary monoclonal antibody-based dot ELISA for universal detection of H5 avian influenza virus. BMC Microbiol. 2010 Dec 30; 10:330 [19].
На мировом рынке компания Sino Biological Inc. предлагает продукцию, компонентом которой являются рекомбинантные штаммы H2N2:
Influenza A H2N2 (A/Japan/305/1957)
Influenza A H2N2 (A/Canada/720/2005)
Influenza A H2N2 (A/Guiyang/1/1957)
Таким образом, для производства коммерческих систем и наборов, а также для научных исследований ранее использовалось несколько штаммов вируса гриппа Н2 субтипа. Однако все они имеют ряд недостатков. Основная масса штаммов была выделена более двадцати лет назад, и антигенно может быть отличным от ныне существующих вариантов (данные о сравнительных исследованиях отсутствуют). Отсутствует и подробная антигенная характеристика, поэтому применение их в дальнейшем как компонента диагностических систем является нецелесообразным.
Предлагаемый штамм отличается от ближайшего аналога (штамм вируса гриппа A(H2N3) ГКВ 2237 птиц для моделирования инфекции гриппа; Патент RU 2021354; Смирнов Ю.А. с соавторами; от 05.05.1991) [9] тем, что в нем отсутствуют указанные недостатки и он пригоден для использования в заявляемой области.
Задачей настоящего изобретения получение оригинального штамма-продуцента вируса гриппа H2N2-субтипа, который обладает по сравнению с аналогами следующими преимуществами:
1. Антигенными характеристиками, позволяющими проводить реакцию торможения гемагглютинации для диагностики современных штаммов вируса гриппа.
2. Нуклеотидными последовательностями генов НА и NA, обладающими более 95% идентичности с другими вирусами H2N2 субтипа, выделенными за последние 10 лет, что позволит использовать штамм как контрольный при проведении диагностики.
3. Выделен от млекопитающих и способен размножаться на моделях in vivo и in vitro (культура клеток MDCK, мышиная экспериментальная модель, куры); достигать высоких титров - не менее 5 lg TCID50/ml.
Указанная задача решена выделением, детальной характеристикой и использованием оригинального паспортизованного штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа.
Технический результат достигается получением штамма вируса гриппа птиц A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа, используемого для приготовления антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, для применения его в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, а также для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo, депонированный в государственной Коллекции вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области) под регистрационным номером V-623.
Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа Н2-субтипа, выделенным от млекопитающего за последние 10 лет. Этот факт подчеркивает важность его использования для тестирования лекарственных препаратов на животной модели (мыши, хорьки). Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.
По причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности, поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа Н2-субтипа в России в РТГА не существует.
Характеристика штамма:
Штамм принят на патентное депонирование под номером V-623 в Коллекцию микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, Новосибирская область).
Штамм был выделен от околоводного млекопитающего ондатры (Ondatra zibethicus) на территории Новосибирской области. Принадлежность к H2N2-субтипу определена методом PCR. Подтвержден в реакции PCR с типирующими праймерами на гемагглютинин (H1-H16) и нейраминидазу (N1-N9) (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105P) [20], (Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P. 193-198). [21].
Принадлежность гемагглютинина штамма к Н2-субтипу подтверждена определением и сравнительным анализом нуклеотидной последовательности фрагмента гена гемагглютинина (1701 н.о.).
Определены первичные последовательности полного генома исследуемого штамма (табл. 1).
Был проведен филогенетический анализ гена геагглютинина методом максимального правдоподобия с бутстреп анализом (1000 повторов). Ниже представлено филогенетическое дерево гена гемагглютинина Н2-субтипа, исследуемый штамм отмечен. Как видно из дендрограммы, наиболее родственен штамма, выделенным ранее на территории Европы, Монголии, стран Юго-Восточной Азии. Данный результат может свидетельствовать о персистенции данной генетический линии Н2-субтипа на территории Евразийского континента. При сравнении исследуемого штамма с ранними референс-штаммами было показано, что штаммы филогенетически различны. Штаммы не только принадлежат генетически к отдаленным линиям вируса, но и разделены достаточно длительным промежутком времени. А в связи с быстрой изменчивостью вируса гриппа, это может приводить к значительным генетическим изменениям. Что и показано с помощью филогенетического анализа.
Анализ показывает актуальность, и целесообразность использования штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа для создания антигенсодержащего препарата вируса гриппа Н2-субтипа, который далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа Н2-субтипа.
При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) данного штамма инфекционный титр достигал 6,4 lg EID50/мл, в культуре клеток MDCK 5,375 TCID50/ml. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2.
В эксперименте штамм имеет одинаковые, титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Получение поликлональной сыворотки на штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 вируса гриппа H2N2-субтипа.
Трем 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. Жидкость представляла собой раствор вируссодержащей аллантоисной жидкости в физиологическом растворе (1:1). Объем вируссодержащего раствора составил 2,5 мл на каждое животное. До заражения у каждого животного была отобрана кровь (1 мл) для контрольной постановки РТГА сыворотки с антигеном штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. РТГА дала отрицательный результат. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного.
После 10 суток после инфицирования была отобрана кровь для постановки промежуточной реакции торможения гемагглютинации.
Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (табл. 2). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 [21]. Таким образом, при заражении кур получена сыворотка, которая может использоваться для определения принадлежности к Н2-субтипу вариантов вируса гриппа, антигенно близких штамму A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. Для серодиагностики необходимо использовать поликлональную сыворотку в паре с антигеном данного штамма (см. пример 2).
Пример 2. Приготовление антигенсодержащего диагностического препарата на основе штамма вируса гриппа A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа.
Для приготовления антигенсодержащего препарата вируссодержащую аллантоисную жидкость инактивируют 0,05% β-пропиолактоном при температуре 37 С в течение 2 ч. Далее необходимо подтвердить инактивацию вируса заражением чувствительной системы-3 пассажа (РКЭ). Полученный антигенсодержащий субстрат хранится при температуре +4-+7С, без снижения гемагглютинирующего титра в течение 12 месяцев.
Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа Н2-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа Н2-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 1 (табл. 2).
Пример 3. Подтверждение специфичности разработанного праймера, предназначенного для диагностики Н2-субтипа гемагглютинина методом ПЦР.
Для типирования изолятов методом ПЦР амплификацию проводили набором Fast PCR Mix (Fermentas, США) с парами подтипспецифичных праймеров - для определения подтипов изолятов
Состав реакционной смеси:
1) MasterMix - 10 мкл
2) кДНК - 2 мкл
3) Прямой праймер (2 o.u) - 1 мкл
4) Обратный праймер (2 o.u) - 1 мкл
5) Вода Nuclease-free - 4 мкл
Для наработки ПЦР продукта для определения первичной последовательности проводили амплификацию с праймерами, специфичными к генам НА и NA.
Программа для амплификатора
1) T=95°C, 10 секунд,
2) T=52°C, 30 секунд
3) T=72°C, 20 секунд
4) T=4°C хранение.
В таблице 3 приведены результаты контрольной реакции ПЦР с использованием разработанного праймера Н2. В качестве контрольных используются штаммы референс-панели (St. Jude Research Hospital, США) и предлагаемый штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2.
Таким образом, штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа был использован как контрольный при постановке реакции ПЦР с использованием разработанного праймера для субтипирования Н2 гемагглютинина. Положительный результат получен исключительно со штаммом A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. Праймер не проявил специфичности к контрольным референс-штаммам всех остальных субтипов (H1-H15).
Пример 4. Адаптация штамма вируса гриппа A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 и моделирование летальной гриппозной инфекции у мышей линии BALB/c.
Штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 адаптировали в серии последовательных пассажей через легкие мышей линии BALB/c. Для чего по три мыши заражали интраназально 50 мкл физиологического раствора, содержащего 103 TCID50 вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. Эта доза заражения выбрана, исходя из того, что в предварительных экспериментах было показано наличие выраженных симптомов заболевания на третьи-четвертые сутки после инфицирования мышей в этом диапазоне концентраций. На третьи сутки после инфицирования мышей умерщвляли и из их легких готовили 10%-ные гомогенаты на физиологическом растворе. После этого вновь проводили интраназальное заражение мышей 10%-ми гомогенатами легких в объеме 50 мкл. Параллельно инфекционные титры вируса в легких мышей определяли титрованием 10%-го гомогената на клетках MDCK (табл. 4).
Как следует из данных, представленных в табл. 4, инфекционный титр вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 увеличивался от пассажа к пассажу. После того как вирус прошел восемь пассажей на мышах, был наработан его пул на клетках MDCK. Инфекционный титр пула вируса сравнялся с титром исходного вируса и составил 5,65±0,24 lg TCID50/мл. При этом 50%-ная летальная для мышей доза (MLD50) составила 1,6±0,1 lg TCID50/мл.
Поскольку доклинические испытания противогриппозных лекарственных препаратов проводят, главным образом, на мышах, патогенность полученного штамма была тщательно исследована в экспериментах на этих животных с использованием различных доз заражения.
Пул вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 использовали для интраназального заражения мышей линии BALB/c. На растворе Хенкса готовили десятичные разведения вируса в диапазоне концентраций 10-1-10-5. Под легким эфирным наркозом по 10 мышей заражали подготовленными разведениями вируса в объеме 50 мкл. В течение 21 сут вели наблюдение за мышами: ежедневно проводили учет павших животных. Дозу вируса, вызывающую 50%-ую гибель мышей, рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина (Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - М.:, Медгиз, 1962. - 179 с) [22]. Рассчитанное значение MLD50 составило 1,6±0,1 lg TCID50/мл.
После определения MLD50 были проведены эксперименты по моделированию гриппозной пневмонии мышей с различной степенью летальности. Для этого мышей заражали 0,5 и 10 MLD50. Наблюдение за мышами вели в течение 16 дней после инфицирования. Мышей взвешивали через день. Ежедневно учитывали павших животных и высчитывали среднюю продолжительность жизни мышей (MSD) по формуле: MSD=Σf(d-1)/n, где f - количество мышей умерших на день d, а также мыши, выжившие на момент завершения эксперимента (d в этом случае - 15), n - количество мышей в группе.
При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 0,5MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости на 7-8 день после инфицирования наблюдали клинические симптомы заболевания (снижение активности, потеря аппетита, одышка, тремор, изменение качества шерсти), а также снижение массы тела на 12±7%. На 14 день после заражения две мыши погибли (MSD - 14,6 дней). Снижение массы тела прекратилось после 13-го дня наблюдения
При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 10MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости первые признаки заболевания, а также снижение массы тела на 14±4% наблюдали уже на 3-4 сутки после инфицирования. Гибель мышей регистрировали, начиная с шестого дня после заражения. Потеря массы тела быстро прогрессировала и доходила до 35%. К 10 сут наблюдения все 10 мышей погибли, а средняя продолжительность жизни мышей составила 6,1±0,6 дней.
В то же время дикий штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 в эквивалентных в пересчете на TCID50 дозах не оказывал видимого негативного воздействия на мышей. Однако при заражении мышей линии BALB/c штаммом A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 в диапазоне концентраций 104-106 TCID50/мышь через 2-3 сут после инфицирования отмечали описанные выше симптомы заболевания, а на 4 сут от момента инфицирования наблюдали полное клиническое выздоровление животных.
Была определена кинетика репликации дикого и адаптированного штаммов в легких подопытных животных. Гомогенаты легких мышей, зараженных 10 MLD50 штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 - ADAPT и 106 TCID50 штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2, титровали через 1, 3, 6 и 9 сут после заражения. Титр адаптированого вируса в течение всего периода наблюдения был на 1-2 lg выше титра вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. Вирус адаптированный реплицировался в легких мышей вплоть до 9 сут. В то же время на 9-е сут нам не удалось зарегистрировать размножения вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 в культуре клеток MDCK. Надо отметить, что к этому времени у мышей исчезли клинические симптомы заболевания, что, видимо, напрямую связано со снижением эффективности репликации вируса в легких животных.
Таким образом, при адаптации вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 к легким мышей, был получен летальный вариант вируса. При помощи модели гриппозной пневмонии мышей, созданной с использованием адаптированного штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2, можно осуществлять оценку эффективности противогриппозных лекарственных препаратов in vivo.
Использованные источники информации
1. Львов, Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А - животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2005. - №4. - С. 4-11.
2. Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht СЕ, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13; 109(11):4269-74).
3. Isakova-Sivak I, de Jonge J, Smolonogina T, Rekstin A, van Amerongen G, van Dijken H, Mouthaan J, Roholl P, Kuznetsova V, Doroshenko E, Tsvetnitsky V, Rudenko L. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. PLoS One. 2014 Jul 24; 9(7):e102339.
4. Nabel GJ, Wei CJ, Ledgerwood JE. Vaccinate for the next H2N2 pandemic now. Nature, 2011. 471: 157-158.
5. Pappas C, Yang H, Carney PJ, Pearce MB, Katz JM, Stevens J, Tumpey TM. Assessment of transmission, pathogenesis and adaptation of H2 subtype influenza viruses in ferrets. Virology. 2015 Mar; 477:61-71. doi: 10.1016/j.virol.2015.01.002. Epub 2015 Feb 5.
6. Jones JC, Baranovich T, Marathe BM, Danner AF, Seiler JP, Franks J, Govorkova EA, Krauss S, Webster RG. Risk assessment of H2N2 influenza viruses from the avian reservoir. J Virol. 2014 Jan; 88(2): 1175-88. doi: 10.1128/JVI.02526-13. Epub 2013 Nov 13.
7. Патент SU 1735363 от 09.07.1990, патентообладатель Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского
8. Патент РФ №2354695 от 07.07.2007, патентообладатель ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова
9. Патент RU 2021354 от 05.05.1991. патентообладатель НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского РАМН
10. Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, Bestebroer TM, Herfst S, Smith D, Rimmelzwaan GF, Olsen B, Osterhaus AD. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 2005 Mar; 79(5):2814-22
11. В.А. Рябинин, E.В. Костина, Г.А. Максакова, A.H. Синяков. Типирование гемагглютинина вируса гриппа А с использованием гибридизационного микрочипа // Биоорганическая Химия, 2010, том 36, №6, с. 849-852; Михайлович, В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: дис. … доктор, биол. наук / В.М. Михайлович. - Москва, 2009. - 197 с.
12. Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr; 27(2):120-31.
13. Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar; 54(3):129-34.
14. Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep; 160(1-2):163-6.).
15. Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and В viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul; 1(4):167-75.
16. Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell CJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies to different clades of Influenza A H5N1 viruses. J Virol Methods. 2009 May; 157(2):161-7.
17. Dhumpa R, Handberg KJ, Jørgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar; 69(3):258-65.
18. Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP. P. 4-21.
19. He F, Soejoedono RD, Murtini S, Goutama M, Kwang J. Complementary monoclonal antibody-based dot ELISA for universal detection of H5 avian influenza virus. BMC Microbiol. 2010 Dec 30; 10:330.
20. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105 P.;
21. Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P. 193-198.).
22. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - М.:, Медгиз, 1962. - 179 с.
Штамм вируса гриппа птиц A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа для приготовления антигенсодержащего субстрата и сыворотки для серодиагностики гриппа Н2-субтипа в РТГА, для применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, а также для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo, депонированный в Коллекции микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-623.
