Короткие биоактивные пептиды для ускорения заживления ран

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано для ухода за кожей или для лечения раны кожи или ткани слизистой оболочки млекопитающего. Получают пептиды EKMG, MGRN и KMGRN - короткие фрагменты пептида HB-107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN), который сам по себе является фрагментом противомикробного белка цекропина B и проявляет свойства стимуляции миграции клеток. Пептиды могут быть амидированными на С-конце или липидизированными на N-конце. Настоящее изобретение позволяет получить пептид, обладающий улучшенной активностью в стимуляции фибробластов кожи человека по сравнению с пептидом НВ107 - фрагментом цекропина В. 5 н. и 11 з.п.ф-лы, 3 табл., 4 пр.

 

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США №61/764913, поданной 14 февраля 2013 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Изобретение относится к пептидам, обладающим биологической, косметической и терапевтической активностью. В частности, изобретение относится к коротким пептидам, имеющим от четырех до шести последовательно расположенных аминокислотных остатков SEQ ID NO: 1 (EKMGRN), которые стимулируют пролиферацию и миграцию кератиноцитов. Кроме того, изобретение относится к способам применения этих пептидов для ускорения заживления ран и лечения различных повреждений, поражающих кожу и другие сходные поверхности тела, такие как полость рта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0003] Кожа является наиболее крупным органом человека и границей между внешней средой и нашей внутренней биологией. Она состоит из двух основных слоев: эпидермиса, который является самым наружным слоем кожи; и дермы, которая находится непосредственно под эпидермисом. Кератиноциты представляют собой основные клетки, составляющие 95% эпидермиса. Надбазальные кератиноциты дифференцируются в химически и физически устойчивый роговой слой, окруженный белками и липидами, включающими церамиды, холестерин и жирные кислоты. Естественное или принудительное удаление верхних слоев этого ороговевшего эпителия стимулирует обновление нижележащих клеток для замены поврежденных или утраченных клеток. Этот ороговевший слой обеспечивает защитную функцию и функцию барьера для воды между организмом и внешней средой. Основной функцией кератиноцитов является формирование барьера для защиты организма против химических, физических и механических факторов риска, инвазии микроорганизмов, тепла, УФ-излучения и потери воды (Proksch et al., 2008). Кератиноциты также являются основным компонентом тканей слизистых оболочек, которые являются смежными с эпидермисом (Presland and Dale, 2000).

[0004] Рану определяют как нарушение целостности эпителия кожи. Нормальное заживление ран вовлекает комплексную и динамически, но превосходно регулируемую серию событий, включающих воспаление, образование новых тканей и ремоделирование тканей. Заживление тканей начинается в момент повреждения ткани, и оно требует точной координации эпителизации и репарации дермы, причем процесс эпителизации в конечном итоге зависит от способности кератиноцитов к миграции, пролиферации и дифференцировке (Singer and Clark, 1999). В процессе эпителизации, кератиноциты, находящиеся по периметру раны, мигрируют и пролиферируют с образованием единичного слоя над раной. Дальнейшая пролиферация и дифференцировка кератиноцитов приводит к образованию эпидермального слоя, содержащего нормальные стратифицированные слои. Также кератиноциты с нормальными фибробластами дермы обеспечивают активацию мРНК коллагена типа I и III, увеличение пролиферации фибробластов и накопление и ремоделирование внеклеточного матрикса для завершения заживления восстановлением структуры и функции ткани (Bergers G and Coussens LM, 2000). Таким образом, способность кератиноцитов к пролиферации и миграции является необходимой для осуществления этих процессов на поверхности кожи. Учитывая информацию, что определенные факторы роста естественным образом вовлечены в заживление раны, была осуществлена работа, направленная на разработку способов лечения ран на основе факторов роста (Mustoe et al., 1994; Steed, 1995). Однако, большинство попыток, в которых использовалась такая стратегия, оне обеспечили достижение клинически значимых результатов, частично вследствие затруднений, связанных с использованием терапевтических белков, таких как большой размер вовлеченных белков. Использование терапии факторами роста также имеет недостатки, состоящие в сложности и высокой стоимости получения крупных белков. Пептиды иммунной защиты (HDP), также известные как противомикробные пептиды, вовлечены в заживление ран кожи в качестве регуляторов. Вследствие их небольших размеров эти короткие активные пептиды привлекали внимание для терапевтической разработки (Zhang and Falla, 2006).

[0005] HDP повсеместно распространены в природе, и они формируют центральные компоненты врожденной иммунной системы эукариот. Они необходимы для врожденной защиты хозяина в качестве эффекторов выведения патогенов, а также модулирования поведения клеток хозяина для ускорения регенерации и репарации ткани. Нормальное заживление раны вовлекает точную координацию воспаления, эпителизации, грануляции ткани и ремоделирования. Было показано, что пептиды иммунной защиты влияют на все эти процессы. Кателицидин PR-39 обладает противовоспалительной функцией посредством ингибирования активности оксидазы нейтрофилов и индуцирует синдеканы - гепаринсульфатпротеогликаны, важные для заживления раны (Gallo et al., 1994; Shi J., Ross, CR. et al., 1996). Также было показано, что другой представитель пептидов иммунной защиты семейства кателицидинов LL-37 влияет на реэпителизацию ран кожи человека в культуре органов (Heilborn JD, et al., 2003). Дефензин нейтрофилов человека стимулирует экспрессию коллагена типа I, одновременно ингибируя экспрессию интерстициальной коллагеназы (Oono T., et al., 2002). Более того, кателицидин человека LL-37 и P-дефензин-3 человека, которые являются чрезвычайно разнообразными, стимулируют активность, включающую стимуляцию миграции эпителиальных клеток, стимуляцию ангиогенеза и подавление провоспалительных ответов (Steinstraesser et al., 2008, 2009). Они привлекают нейтрофилы, моноциты, тучные клетки и T-лимфоциты, а также индуцируют продукцию нейтрофильных и моноцитарных хемоаттрактантов во многих типах клеток. Недавно также было показано вовлечение HDP в заживление кожных ран в качестве регуляторов путем модулирования воспаления, ангиогенеза и накопления внеклеточного матрикса в ткани и ремоделирования. Было показано, что влияние HDP на заживление ран не зависит от противомикробной функции и обеспечивает потенциально новое клиническое применение HDP. Авторы настоящего изобретения ранее сообщали, что не являющийся противомикробным пептид иммунной защиты HB107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN), происходящий из цекропина B, сохранял способность способствовать заживлению ран в модели на мышах и наблюдаемая польза HB107 была неотличимой от пользы в случае обработки раны фактором роста rhPDGF (Lee, et al., 2004). Гистологический анализ обработанных HB107 ран указывает на то, что эпидермальная гиперплазия была увеличена в обработанных HB107 ранах, что является признаком того, что HB107 может влиять на пролиферацию или миграцию кератиноцитов (Lee PH., et al., 2004). Недавно была описана новая группа синтетических вариантов HDP, названных регуляторами врожденной защиты (IDR), которые обеспечивают защиту широкого спектра против системных инфекций бактериями с множественной устойчивостью к лекарственным средствам (Easton DM., et al., 2009). Например, IDR-1 и IDR 1002 обеспечивают защиту от микробной нагрузки путем усиления врожденной иммунной защиты хозяина при подавлении потенциально вредоносных чрезмерных воспалительных ответов (Easton et al., 2009; Nijnik A., et al., 2010).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Настоящее изобретение относится к коротким биоактивным пептидам, которые являются пригодными для ускорения заживления ран у млекопитающих. Раны, на которые предпочтительно нацелены выделенные пептиды, представляют собой раны, поражающие кожу и прилегающие к ней поверхности слизистых оболочек. Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом, пептиды по изобретению способны влиять на заживление раны путем стимуляции пролиферации и миграции клеток. Пептиды по изобретению являются пригодными как для способов in vitro, так и для способов in vivo, и они способны индуцировать упомянутую выше активность в кератиноцитах.

[0007] Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенным пептидам, которые содержат от четырех до шести последовательно расположенных аминокислотных остатков, находящихся между положениями 11 и 16 HB107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN), а именно, EKMGRN (SEQ ID NO: 1). Выделенные пептиды могут содержать либо L-, либо D-энантиомерные формы аминокислот, или их комбинации. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения выделенные пептиды могут быть конъюгированы с белком-носителем или модифицированы посредством C-концевого амидирования или N-концевого ацетилирования жирными кислотами (т.е. липидизация). Эти вставки усиливают биологическую активность пептидов при нанесении на кожу и ее раны.

[0008] В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения все выделенные пептиды содержат метионин. Конкретные варианты осуществления выделенных пептидов включают SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5, все из которых демонстрируют активность стимуляции пролиферации и миграции клеток и влияют на заживление ран.

SEQ ID NO.	HB №	Последовательность
1	HB2265	EKMGRN
2	HB2262	KMGRN
3	HB2263	EKMGR
4	HB2234	EKMG
5	HB2235	MGRN

[0009] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к изготовлению лекарственного средства для терапевтических или косметических композиций, которые содержат фармацевтически или косметически приемлемый носитель и один или несколько из упомянутых выше пептидов. Упомянутые выше композиции могут быть использованы в качестве медикамента или для косметического применения при ранах кожи млекопитающих. Концентрация пептида в таких композициях предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 500 мкг/мл, или от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 20 мг/мл. Предпочтительными формами композиции являются аэрозоли, эмульсии, жидкости, растворы, лосьоны, кремы, пасты, мази, порошки, гели и пены.

[0010] Кроме того, пептиды по настоящему изобретению и композиции, содержащие их, могут обеспечить полезные признаки при включении в обычные составы для ухода за кожей или косметические составы, такие как различные косметические средства для кожи, кремы для кожи, лосьоны, кремы или лосьоны от загара и терапевтические лосьоны или кремы, такие как составы против угревой сыпи для ухода после лазерной процедуры.

[0011] Настоящее изобретение также относится к способам применения упомянутых выше композиций для заживления ран у млекопитающих. Как правило, способ лечения охватывает введение эффективного количества содержащих пептид композиций в раны, особенно в раны кожи (эпидермис) и прилегающие к ним слизистые ткани, на эффективный период времени. Такие раны включают хирургические раны, царапины, волдыри, ожоги, изъязвления, язвы, кровоподтеки, сыпь, рубцы, растяжки и повреждение кожи вследствие внутренних и внешних эффектов старения и воздействия окружающей среды, включая образование морщин, обвисание кожи и световое повреждение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] В патентах США №5962410, 5861478 и 7696174 представлено описание, полезное для понимания настоящего изобретения и, таким образом, они включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Пептид HB107 (MPKEKVFLKIEKMGRNIRN) (SEQ ID NO: 10) сам по себе представляет собой фрагмент цекропина B, который является противомикробным белком, присутствующим в видах моли. Хотя HB-107 не проявляет бактериостатического эффекта белка, из которого он происходит, он проявляет качества заживления ран эпидермиса (Lee et al., 2004). Этот пептид из 19 аминокислотных остатков представляет собой многофункциональный иммунный модулятор, который стимулирует пролиферацию, миграцию кератиноцитов, закрытие царапин и противовоспалительную активность, которая необходима для заживления ран.

[0013] Исходя из этого, авторы настоящего изобретения сфокусировались в данном исследовании на участке HB107 из шести аминокислот, соответствующем SEQ ID NO: 1 (HB2265), EKMGRN, находящемся в положениях 11-16.

Схематическая иллюстрация пептидов, содержащих 4-6 последовательно расположенных аминокислотных остатков, находящихся в HB107

[0014] Кроме того, авторы настоящего изобретения получили пептиды, содержащие 3-5 последовательно расположенных аминокислотных остатков из SEQ ID NO: 1, соответствующие SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9. Для оценки того, обладают ли вновь полученные пептиды активностью заживления ран, пептиды SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 подвергали испытанию кератиноцитов при царапине, которое является общепризнанным анализом для оценки способности активного соединения ускорять закрытие раны. В таблице 1 показано, что пептиды SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5 в значительной степени индуцируют закрытие царапины в концентрации от 10 до 20 мкг/мл. Процент закрытия раны, индуцированный SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5, находился в диапазоне 182-218% по сравнению с обработкой PBS, которая была принята за 100%. Однако трипептиды, соответствующие SEQ ID NO: 6 (HB2268) и SEQ ID NO: 7 (HB2269), и тетрапептид HB2232, не индуцировали закрытие царапины (таблица 1). Также было показано, что другой пептид SEQ ID NO: 9 (HB1062), лишенный аминокислотного остатка метионина (GRNIRN), был неспособен ускорять закрытие царапины в том же испытании кератинов с царапиной (таблица 1). Таким образом, существует два ключевых элемента, требуемых для наблюдаемой активности заживления ран. Во-первых, должно быть минимум четыре последовательно расположенных аминокислотных остатка; и, во-вторых, в сконструированных последовательностях должен содержаться остаток метионина. Тот факт, что как HB2232 (KIEK), так и HB1062 (GRNIRN) являются неактивными в отношении ускорения закрытия царапины, указывает на то, что остаток метионина является незаменимой аминокислотой, которая должна присутствовать в качестве одной из аминокислот в четырех или более последовательно расположенных остатках для активности ускорения заживления ран. Таким образом, авторы настоящего изобретения сделали заключение, что от четырех до шести последовательно расположенных аминокислотных остатков, которые должны содержать остаток метионина, расположенный в центральной области HB107 в положениях от 11 до 16 в EKMGRN, ускоряют заживление ран. Для подтверждения того, что активность не была следствием токсичности пептидов в отношении кератиноцитов, все пептиды подвергали MTT-тесту цитотоксичности. Ни один из исследованных пептидов не был цитотоксическим в отношении нормальных кератиноцитов кожи in vitro в концентрациях вплоть до 500 мкг/мл (таблица 1).

[0015] Наблюдаемая активность в отношении закрытия царапины in vitro тесно коррелировала с активностью пептидов в отношении пролиферации, как показано в анализе пролиферации кератиноцитов in vitro (таблица 2). Пролиферативная активность является более выраженной при более низких концентрациях. Оптимальная концентрация, требуемая для стимуляции пролиферативной активности кератиноцитов для каждого пептида, варьирует, однако, как правило, она находится в диапазоне от 0,625 до 5 мкг/мл (таблица 2). В SEQ ID NO 1 (HB2265) представлена активность при 2,5 и 5 мкг/мл и SEQ ID NO 2 (HB2262) стимулирует пролиферацию кератиноцитов при всех исследованных концентрациях от 0,625 до 5 мкг/мл. SEQ ID 3 (HB2263), SEQ ID 4 (HB2234) и SEQ ID 5 (HB2235) сообщают такую активность при относительно более низких концентрациях от 0,625 до 2,5 мкг/мл. Оказалось, что трипептиды HB2268 (KMG) и HB2269 (GRN) не демонстрируют активности в отношении пролиферации при всех исследованных концентрациях. Также тетрапептид HB2232 не индуцирует пролиферацию кератиноцитов (таблица 2). В заключение, пептиды по настоящему изобретению обладают модулирующей активностью в отношении пролиферации кератиноцитов кожи, и такая активность является необходимой для заживления кожных ран.

[0016] Для лучшего понимания этого механизма авторы настоящего изобретения провели испытание по определению профиля генов для одного репрезентативного пептида SEQ ID NO: 3, HB2235, путем определения профиля генов SUNNY BIODISCOVERY™ (Santa Paula, CA) с использованием заменителей тканей EPIDERM™ (MatTek, Ashland MA). Заменители кожи уравновешивали в течение ночи, а затем наносили пункционные раны на всю толщину с использованием иглы 20G перед обработкой пептидом или водным контролем в двух экземплярах в течение 24 ч. Также в качестве контроля использовали набор из двух нормальных тканей, чтобы определить изменение профиля генов между тканями с ранами и нормальными тканями. В конце обработки РНК экстрагировали и подвергали ПЦР-анализу на чипах. Первое сравнение проводили между необработанными тканями с ранами против необработанных тканей без ран, чтобы определить профиль экспрессии генов в ответ на повреждение, а затем проводили сравнение между необработанными тканями с ранами против тканей с ранами, обработанных HB2235. В таблице 3 приведены некоторые из генов, которые являются значительно измененными среди различных путей передачи сигнала каскадов заживления ран. Измененные гены соответствуют генам, кодирующим белки матрикса, такие как коллагены и интегрины, генам провоспалительного каскада, таким как гены цитокинов и рецепторов хемокинов, генам, вовлеченным в процесс ремоделирования тканей, таким как гены матрискных металлопротеиназ, активаторов плазминогена и ингибиторов протеаз, и другим генам, которые вовлечены в заживление ран. Успешное заживление ран является тщательно регулируемым процессом, вовлекающим множество типов клеток, неклеточных компонентов, таких как фибрин и коллаген, и коктейль биологически активных химических соединений. Хотя оно представляет собой непрерывный каскад перекрывающихся процессов, его часто подразделяют на три фазы: воспаление; пролиферация и ремоделирование. Как показано в таблице 3, после острого нанесения раны или повреждения по сравнению с нормальной тканью кожи без раны происходит выраженная активация генов, которые обычно ассоциированы с провоспалительными цитокинами и рецепторами хемокинов. Например, лиганды 2 и 5 C-X-C-хемокинов активировались в 4,29 и 2,93 раза, соответственно (таблица 3). Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор 2 и белок, передающий сигнал интерлейкина-6, также активировались в 1,87 и 1,93 раза, соответственно. В ходе фазы воспаления после агрегации тромбоцитов в области повреждения следует инфильтрация лейкоцитов, таких как нейтрофилы и макрофаги, в область раны, в процессе которой образуется богатый фибрином сгусток для предупреждения дальнейшей потери крови, и он действует в качестве каркаса для ранней миграции клеток в рану. Воспалительные сигналы, наблюдаемые через 24 ч после повреждения (такни с ранами против нормальных тканей), согласуются с и являются необходимыми для привлечения нейтрофилов и макрофагов в область повреждения в физиологическом состоянии. Богатый фибрином сгусток в конечном итоге разрушается на более поздней стадии белками, такими как плазмины. Продуцирование плазмина контролируется присутствием тканевого активатора плазминогена - белка, который конвертирует плазминоген в плазмин в тесной связи с функцией матриксных металлопротеиназ (MMP). Из таблицы 3 отчетливо видно, что происходит активация генов, кодирующих как тканевые, так и урокиназные активаторы плазминогена (PLAT и PLAU), а также MMP (MMP-1) через 24 ч после повреждения. В нормальном процессе заживления ран стадия ремоделирования происходит более длительно, часто отнимая недели для завершения, что вовлекает фазу быстрой пролиферации кератиноцитов и фибробластов, которые синтезируют и ремоделируют коллагены. При тщательном исследовании обработанных HB2235 тканей с ранами авторы настоящего изобретения наблюдали, что существует несколько ключевых стадий в каскаде заживления ран, на которые влияет HB2235 или которые модулируются HB2235. Во-первых, пептид отчетливо укорачивает продолжительность первоначальной воспалительной фазы, на что указывает то, что гены, кодирующие провоспалительные цитокины и рецепторы хемокинов, значительно ингибировались через 24 ч после обработки HB2235 (таблица 3). В соответствии с подавлением воспалительных сигналов, противовоспалительный цитокин IL-10 активируется (таблица 3). Это является существенным, поскольку в многочисленных исследованиях было показано, что снижение протяженности или продолжительности процесса воспаления может значительно облегчать заживление раны, поскольку очевидно, что замедленное заживление ран ассоциировано со значительным воспалением на протяжении всех стадий заживления ран (Leitch et al., 2009; Wang et al., 2006). Во-вторых, HB2235 значительно подавляет гены, кодирующие активаторы плазминогена и MMP через 24 ч после обработки, что указывает на то, что он может ускорять процесс грануляции ткани. В третьих, вследствие модулирования генов, кодирующих факторы роста, такие как TGF-β 1, PDGF, EGF, которые необходимы для активности в отношении миграции и пролиферации клеток, пептид, очевидно, вовлечен в процесс ускорения реэпителизации и ремоделирования ткани, в ходе которого вновь образованные ткани начинают покрывать область раны, завершая репарацию ткани. Наиболее существенно, обработанные HB2235 ткани продемонстрировали активацию витронектина (VTN) более чем в 5 раз (таблица 3). VTN является распространенным гликопротеином, встречающимся во внеклеточном матриксе, и хорошо известно, что он стимулирует адгезию, пролиферацию и миграцию кератиноцитов (Upton et al., 2008). В четвертых, в соответствии с активностью в отношении пролиферации и миграции клеток, HB2235 стимулирует активацию генов, кодирующих матриксные белки, такие как коллагены и интегрины, которые необходимы для реэпителизации и ремоделирования ткани (таблице 3). Анализ на генных чипах убедительно подтверждает, что пептид ускоряет процесс эпителизации путем ускорения пролиферации и миграции клеток, а также путем ремоделирования матрикса и стимуляции коллагена.

[0017] Пептиды по настоящему изобретению, включая SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 и 5, проявляют активность, которая является важной для активации миграции и пролиферации кератиноцитов, которые являются необходимыми для процессов заживления ран в эпидермальных тканях, в которых находятся кератиноциты. Пептиды, описанные в рамках настоящего изобретения, являются новыми и они короче ранее описанных последовательностей. Виды биологической активности, индуцируемые пептидами по настоящему изобретению, представляют собой миграцию и пролиферацию клеток, обе из которых играют большую роль в опосредовании функции заживления ран.

[0018] Вследствие меньшего размера пептиды, например, имеющие четыре аминокислотных остатка, по настоящему изобретению легче получать и, таким образом, их изготовление является значительно более экономичным. Также, в противоположность более крупным пептидам, описанными пептидами легче манипулировать для химических модификаций и они имеют меньше проблем с растворимостью. Простота обращения с ними обеспечивает большее количество возможностей для доставки лекарственных средств, таких как используемый носитель и то, как его применяют. Небольшой размер и более высокая растворимость пептидов по изобретению обеспечивают их увеличенную эффективность заживления ран вследствие увеличенного всасывания и удержания в области раны; локальные кератиноциты и другие клетки подвергаются воздействию более высоких концентраций пептидов в течение более длительного периода времени.

[0019] Все описанные пептиды можно синтезировать с использованием стандартной твердофазной химии Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил). Каждый из описанных выше пептидов может содержать L- или D-энантиомеры аминокислот. С-конец пептидов может быть кислотным (-COOH) или он может быть амидированным (например, -CONH2, -CONHR или -CONR2). Амидирование С-конца может сообщать пептидам по изобретению меньшую чувствительность к деградации протеазами и может увеличивать их полярность по сравнению с формами свободных кислот, таким образом, обеспечивая увеличенную терапевтическую эффективность. Обсуждается, что N-концевая липидизация или ацетилирование могут увеличить проникновение пептида через кожу без изменения биологически активной функции пептида (Samah A, 2011). Таким образом, пептиды также могут быть липидизированными, что может обеспечить повышение проникновения через кожу. Примеры насыщенных или ненасыщенных жирных кислот, которые можно использовать для обеспечения C12-18 липидного компонента соединений по изобретению, включают лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, миристолеиновую кислоту, пальмитоолеиновую кислоту, олеиновую кислоту и линолеиновую кислоту.

[0020] Пептиды могут быть конъюгированы с растворимыми или нерастворимыми молекулами носителя для модификации свойств растворимости, при необходимости, и для увеличения локальных концентраций пептидов в тканях-мишенях. Примеры растворимых молекул носителей включают полимеры полиэтиленгликоля (PEG) и поливинилпирролидон; примеры нерастворимых полимеров включают, но не ограничиваются ими, силикаты, полистирол и целлюлозу. Пептиды могут быть микроинкапсулированы с использованием технологии липосом или посредством нанотехнологии для повышения их стабильности и для контролируемого высвобождения, чтобы повысить их стабильность во время и после применения.

[0021] Настоящее изобретение относится к способам применения описанных выше пептидов, как например, в составах или в качестве лекарственных средств. Эти способы могут вовлекать применение единичного пептида или нескольких пептидов в комбинации. В определенных случаях композиция по изобретению может находиться в устройствах, помещенных на, в или под кожу. Такие устройства включают трансдермальные пластыри, имплантаты и устройства для инъекций, которые высвобождают вещества так, чтобы они контактировали с кожей или волосяным фолликулом, посредством либо пассивного, либо активного механизма высвобождения. Композиции, используемые для доставки пептидов в способах, описанных в настоящем описании, могут быть в форме аэрозоля, эмульсии, жидкости, лосьона, раствора, геля, микрокапсул, крема, пасты, мази, порошка, пены или другого фармацевтически приемлемого состава. Более того, пептиды можно доставлять с использованием менее сложных составов, таких как деионизированная/дистиллированная вода, PBS или стандартные медицинские солевые растворы.

[0022] Состав необязательно может иметь косметическое применение, и/или может содержать другие средства, такие как ретиноиды, витамин C или другие пептиды, которые могут выступать в качестве адъювантов для терапевтического действия пептидов по изобретению. Также в состав можно добавлять антибиотики для предотвращения инфекции, тем самым, обеспечивая максимальное протекание процессов заживления.

[0023] Состав может содержать ингибиторы протеаз. Ингибитор протеаз может быть выбран для специфического нацеливания на протеазы, которые, как можно ожидать, будут разрушать определенный биоактивный пептид; такой выбор может определяться длиной и/или последовательностью биоактивного пептида. Однако ингибиторы протеаз не обязательно должны быть выбраны каким-либо конкретным образом; например, в рамках настоящего изобретения можно использовать коктейль ингибиторов протеаз, который содержит два или более ингибиторов. В рамках изобретения могут быть включены следующие типы ингибиторов протеаз: ингибиторы сериновых протеаз, ингибиторы цистеиновых протеаз, ингибиторы аспарагиновых протеаз, ингибиторы металлопротеиназ, ингибиторы тиоловых протеаз и ингибиторы треониновых протеаз. Ингибитор протеаз, используемый в рамках изобретения, может представлять собой пептид, или белок, или химические соединения. Неограничивающими примерами таких ингибиторов являются серпины, которые включают альфа-1-антитрипсин, ингибитор компонента 1 комплемента, антитромбин, альфа-1-антихимотрипсин, ингибитор активатора плазминогена 1 и нейросерпин, или химические соединения, включающие, но не ограничивающиеся ими, урсоловую кислоту и транексамовую кислоту, которая может действовать в качестве адъюванта для терапевтического действия пептидов по изобретению.

[0024] Пептиды по настоящему изобретению можно использовать для лечения ран кожи. Эпидермис кожи состоит из высокодинамичного стратифицированного эпителия, в основном состоящего из кератиноцитов. Также эпидермис населяют другие типы клеток, такие как фибробласты. Новые дифференцирующиеся кератиноциты постоянно возникают из пролиферативного базального слоя эпидермиса для восполнения верхних слоев, постепенно дифференцируясь во внешнюю ороговевшую и слущивающуюся погибшую оболочку. Кератиноциты также являются основным компонентом тканей слизистых оболочек, которые являются смежными с эпидермисом (Presland and Dale, 2000). Такие ткани лишены непроницаемого ороговевшего слоя эпидермиса, и они формируют внутренние выстилающие поверхности полости рта, носа, глотки, уха, ануса и гениталий. Аналогично коже, поверхности слизистых оболочек являются важными для предотвращения вхождения инфекционных агентов в различные ткани организма, таким образом, повреждение этих типов тканей может нарушить здоровье индивидуума. Повреждение тканей кожи и слизистых оболочек происходит, когда эпидермальный слой нарушается, например, в результате изъязвления, ожога или волдыря. Повреждение также может вовлекать размозжение или кровоподтек, что вовлекает повреждение ткани без сопутствующего разрыва эпидермиса. Инфекции кожи, а также определенные хронические заболевания, такие как злокачественная опухоль и аутоиммунные заболевания также могут вызывать проблемы на поверхности эпидермиса. Язвы, такие как язвы, поражающие диабетиков, или язвы, ассоциированные с пролежнями, являются другой формой повреждения кожи; эти раны часто являются довольно трудноизлечимыми, являясь воспаленными, склонными к инфицированию и требующими длительных процессов заживления. Персистирование язвы или другого типа хронических ран является следствием недостаточности клеточных процессов, вовлеченных в заживление. Неуспех заживления раны может быть результатом неспособности эпителизировать очаг повреждения, частично вследствие того факта, что кератиноциты на границе раны не мигрируют для закрытия или покрытия поражения (Enoch and Price, 2004). Заживление ран кожи и слизистых оболочек регулируется, частично, посредством активации базальных кератиноцитов. При активации кератиноциты, расположенные по периметру раны, пролиферируют и мигрируют с образованием единичного слоя над раной в процессе, называемом эпителизацией. Дальнейшая пролиферация и дифференцировка кератиноцитов формирует эпидермальный слой, содержащий нормальные стратифицированные слои (Enoch and Price, 2004). Таким образом, настоящее изобретение также можно использовать для лечения повреждений, ассоциированных с кератиноцитами в тканях слизистых оболочек. Термин «прилегающие ткани слизистых оболочек» относится к любой ткани, которая организована аналогично коже и которая содержит эпителиальные клетки/кератиноциты. Примерами таких тканей являются поверхности полости рта, носоглотки, уха и мочеполовой системы, а также палпебральная конъюнктива глаза. Примерами ран или очагов повреждения/поражений, которые могут поражать эти ткани и которые поддаются лечению пептидами по изобретению, являются царапины, волдыри, ожоги, изъязвления, проколы, язвы, кровоподтеки, сыпь и рубцы. Также с помощью пептидов можно лечить послеоперационные раны.

[0025] Другая форма повреждения эпидермиса является неявной и возникает в течение длительного периода времени, в конечном итоге нарушая функцию кожи - так называемая стареющая кожа. Стареющая кожа обуславливается генетической программой, а также совокупными внешними и эндогенными повреждениями, которые происходят на протяжении жизни индивидуума. Существует два основных процесса, которые индуцируют старение кожи; внутренние (хронологическое старение) в защищенной от действия солнца коже и внешние (старение под действием света) в подвергнутых воздействию солнца областях. Внутреннее старение отражает генетический фон и зависит от времени. В любом случае, стареющая кожа обладает одним или несколькими из следующих общих признаков: морщины, тонкие морщинки, гиперпигментация, потеря блеска, гладкость, жесткость, чистота и равномерность цвета кожи и изменения внешнего вида пор. В основе этих видимых признаков лежат различные гистологические и цитологические изменения, индуцируемые острым или хроническим воздействием стимулов окружающей среды, таких как ультрафиолет (UV) и загрязнение воздуха, в дополнение к генетической предрасположенности. Косметические проблемы, такие как появление морщин, сухость, истончение, обвисание, увеличенная чувствительность к кровоподтекам и солнечным ожогам, являются обычными внешними признаками повреждения эпидермиса, которые, в дополнение к старению, также могут возникать преждевременно вследствие длительного воздействия повреждающих агентов, таких как ультрафиолетовые лучи и загрязнение воздуха. Исследования указывают на то, что наиболее заметной морфологической модификацией при старении кожи является прогрессирующая утрата кожной ткани. Эта утрата ткани кожи может быть объяснена несколькими факторами, такими как утрата клеток и снижение пролиферации клеток. В самообновляющейся ткани, такой как эпидермис, число клеток строго регулируется тонким равновесием между пролиферацией, терминальной дифференцировкой и апоптозом (Robert L, Labat-Robert J and Robert AM. 2009). Таким образом, описанные пептиды можно использовать в случае проблем, ассоциированных со старением кожи, вызванным как внутренними, так и внешними стимулами, для предупреждения или обращения вспять эффектов старения. Аналогичным образом, пептиды можно наносить на ткань, которая повреждена вследствие воздействия различных внешних агентов, таких как солнечный свет. В связи с этим изобретение также можно использовать в качестве косметического средства, чтобы сообщить коже более молодой внешний вид и текстуру, и для обеспечения лучшего функционирования. Короткие пептиды сами по себе могут быть неизмененными, или посредством химической модификации и/или специализированной доставки может быть обеспечено их проникновение через эпидермис для обеспечения процессов, противодействующих процессам, которые вызывают истончение кожи, появление морщин, хрупкость и огрубение/уплотнение. Поскольку кератиноциты являются основным компонентом эпидермальных поверхностей и их количество уменьшено в постаревшей и поврежденной коже, ожидается, что их восполнение посредством стимуляции пептидом обратит вспять упомянутую выше проблему.

[0026] Кожа является относительно эластичной, однако существуют пределы ее способности к растяжению. Растяжки, или стрии, представляют собой форму рубцевания кожи несоответствующего цвета. Они возникают вследствие разрыва дермы, который может уменьшаться с течением времени, но не исчезает полностью. Сначала они выглядят как красноватые или фиолетовые линии, однако имеют тенденцию к постепенному выцветанию до более светлого диапазона. Растяжки часто являются результатом быстрого растяжения кожи, ассоциированного с быстрым увеличением или быстрым снижением веса. Растяжки могут появляться в любых областях организма, которые вообще не подвергаются заметному или избыточному растяжению или расширению. Наиболее частыми местами являются живот, молочные железы, плечевые части рук, подмышечные области, спина, голени, бедра и ягодицы. Растяжки часто вызываются гормональными изменениями некоторых значительных этапов жизни, таких как половое созревание и беременность, однако к растяжкам может приводить лечение кортикостероидами, ожирение, эстетическая хирургия и интенсивный культуризм. Под действием кортикостероидов рост как кератиноцитов, так и фибробластов может значительно снижаться и, следовательно, синтез коллагенов I и III, а также синтез фибронектина, также значительно снижается вплоть до 90% по сравнению с нормальной кожей (Rogalski et al., 2002). Репарация и восстановление функции кератиноцитов в сегменте дермы/эпидермиса может быть ключом к коррекции растяжек. Пептиды по настоящему изобретению ускоряют пролиферацию и миграцию кератиноцитов и, таким образом, являются идеальными для лечения растяжек.

[0027] Как правило, фармацевтически приемлемый состав включает любой носитель, пригодный для применения на коже человека. Такие фармацевтически и косметически приемлемые носители включают этанол, диметилсульфоксид, глицерин, диоксид кремния, оксид алюминия, крахмал и эквивалентные носители и разбавители. Состав необязательно может иметь косметическое применение и/или содержит другие средства, такие как ретиноиды или другие пептиды, которые могут выступать в качестве адъювантов для терапевтического действия пептидов по изобретению. Также в состав можно добавлять антибиотики для предотвращения инфекции, тем самым, обеспечивая максимальное протекание процессов заживления. Концентрация пептида в композиции может составлять от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 500 мкг/мл или от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 20 мг/мл; однако конечная используемая концентрация может выходить за пределы этих диапазонов, в зависимости от природы раны/состояния ткани, биологической активности пептида по изобретению и применения какого-либо адъюванта или способа для достижения усиленного всасывания композиции.

[0028] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, когда композиция предназначена для контакта с ороговевшей тканью человека, любые дополнительные компоненты, помимо пептидов по изобретению, должны быть пригодными для нанесения на ороговевшую ткань; т.е., когда они включены в композицию, такие другие компоненты не демонстрируют чрезмерной токсичности, несовместимости, нестабильности, аллергического ответа и т.п. по мнению медицинского специалиста. В CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992) описано широкое множество неограничивающих косметических и фармацевтических ингредиентов, часто используемых в промышленности средств по уходу за кожей, которые являются пригодными для применения в композициях по настоящему изобретению. Примеры этих классов ингредиентов включают: абразивные материалы, абсорбенты, эстетические компоненты, такие как отдушки, пигменты, красящие вещества/красители, эфирные масла, средства, обеспечивающие ощущение на коже, вяжущие средства и т.д. (например, гвоздичное масло, ментол, камфора, эвкалиптовое масло, эвгенол, ментил лактат, дистиллят гамамелиса), средства против угревой сыпи, средства против слеживания, противовспенивающие средства, противомикробные средства (например, йодпропилбутилкарбамат), антиоксиданты, связующие вещества, биологические добавки, буферные средства, наполнители, хелатирующие агенты, химические добавки, косметические биоциды, денатурирующие средства, лекарственные вяжущие средства, наружные обезболивающие средства, пленкообразующие средства или материалы, замутняющие средства, средства для коррекции pH, пропелленты, восстановители, секвестрантвы, средства для отбеливания и осветления кожи (например, гидрохинон, койевая кислота, аскорбиновая кислота, аскорбилфосфат магния, аскорбилглюкозамин), средства для кондиционирования кожи (например, увлажнители), успокаивающие средства для кожи и/или средства для заживления (например, пантенол и его производные, алоэ вера, пантотеновая кислота и ее производные, аллантоин, бисаболол и дикалий глицирризинат), средства для лечения кожи, загустители и витамины и их производные.

[0029] Введение пептидов по изобретению и ассоциированных с ними композиций можно проводить у человека и животных, включая всех млекопитающих. Также применение можно осуществлять в комбинации с типичными и/или экспериментальными материалами, такими как тканевые лоскуты, заменители кожи, продукты культуры тканей и повязки. Примеры включают, но не ограничиваются ими, марлю (тканная и нетканая, пропитанная, не прилипающая, упаковочная, очищающая рану); давящие повязки и систему; заполнители и очистители ран; контактные слои; коллагены; амниотические мембраны; бесклеточную дерму человека; бесклеточные матриксы и комбинированные продукты; и различные широко используемые повязки.

[0030] Перечень широко используемых повязок

Категории повязок на рану	Продукты
Пленки	BIOCLUSIVE™ (Johnson & Johnson Medical, Inc)
	OMIDERM1m (omicron Scientific Ltd.),
	OPSITE* (Smith & Nephew United, Inc)
	прозрачная повязка POLYSKIN®II (Kendall Healthcare)
	TEGADERM™ (3M Health Care)
Гидрогели	INTRASITE™ (Smith & Nephew United, Inc),
	NU-GEL™ (Johnson & Johnson Medical, Inc.)
	VIGILON® (Bard Medical Division)
Гидроколлоиды	COMFEEL® (Coloplast Sween Corp.)
	DUODERM® (ConvaTec®)
	RESTORE™ (Hollister Incorporated)
Полисахариды	BARD ABSORPTION DRESSING* (Bard Medical Division)
	DEBRISAN (Johnson & Johnson Medical, Inc.)
	Гранулы DUODERM® (ConvaTec®)
Альгинаты	KALTOSTAT® (ConvaTec®)
	SORBSAN1M (Dow Hicham Pharmaceuticals Inc)
Пенные повязки	ALLEVYN* (Smith & Nephew United, Inc)
	LYOFOAM® (Acme United Corporation)
Ламинаты	BIOBRANE® (Dow Hickam Pharmaceuticals Inc)
(*) Звездочкой обозначены индивидуальные торговые названия компаний

[0031] Как правило, композицию можно вводить местным, пероральным, трансдермальным, системным путем или любым другим способом, известным специалистам в данной области в качестве пригодного для доставки пептидов по изобретению в заданную ткань. Композиции также можно применять in vitro или ex vivo, например, либо к клеткам, либо к трансплантатам пациентов, растущим в культуре.

[0032] Композиции по настоящему изобретению могут содержать одно или несколько дополнительных средств, которые проявляют активность ухода за кожей. Помимо компонента-биоактивного пептида, настоящее изобретение может включать другие активные средства, такие как гиалуроновая кислота, ниацинамид, питантриол, фамезол, бисаболол, салициловая кислота, ретинол, ретиноевая кислота, альфагидроксикислоты, аскорбиновая кислота и алгуроновая кислота. Ожидается, что определенные дополнительные активные средства будут действовать синергично с компонентом в виде биоактивного пептида или будут повышать срок годности состава.

[0033] Далее следуют общепринятые сокращения для аминокислот:

Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагин	ASN	N
Аспарагиновая кислота	Asp	D
Цистеин	Cys	C
Глутамин	Gin	Q
Глутаминовая кислота	Glu	E
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	Ile	1
Лейцин	Leu	L
Лизин	Lys	K
Метионин	Met	M
Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	w
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Val	V

[0034] Детали в отношении способов составления и введения фармацевтических средств могут быть найдены в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Хотя местная доставка является желательной, существуют другие способы доставки, например: пероральное, парентеральное введение, введение с помощью аэрозоля, внутримышечное, подкожное, чрескожное, внутримозговое, интратекальное, внутрижелудочковое, внутривенное, внутрибрюшинное или интраназальное введение. Настоящее изобретение можно составлять в ряде носителей, например, в форме спрея; аэрозоля; эмульсии типа «вода в масле»; эмульсии типа «масло в воде»; крема для лица или крема для тела; лосьона от загара или лосьона после загара; или в другом носителе для местного введения. Кроме того, пептиды по настоящему изобретению и композиции, содержащие их, могут обеспечивать полезные признаки для включения в типичные составы по уходу за кожей и косметические составы, такие как различные косметические средства для кожи, кремы для кожи, лосьоны, кремы или лосьоны от загара, и терапевтические лосьоны или кремы, такие как составы против угревой сыпи.

[0035] Следующие примеры включены для демонстрации определенных предпочтительных вариантов осуществления изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Идентификация пептидов, которые стимулируют миграцию клеток и закрытие царапины

[0036] Кератиноциты кожи человека (ATCC CRL-2404) выращивали в бессывороточной среде для роста кератиноцитов, дополненной 5 нг/мл рекомбинантного эпителиального фактора роста (EOF) человека (Life Technologies Corporation, Grand Island, N.Y.). Клетки высевали в 12-ячеечные планшеты и позволяли им достигнуть 100% смыкания монослоя. Монослой клеток подвергали голоданию в течение 24 ч, а затем наносили на царапину с использованием наконечника пипетки P200 (200 мкл). Царапины промывали и фотографировали в 0 момент времени. Добавляли пептид в конечной концентрации 40 мкг/мл. Клетки держали в инкубаторе при 37°C, 5% CO2 с >90% влажностью, за исключением того, когда получали изображения в течение короткого периода времени при комнатной температуре. За закрытием царапины наблюдали в течение 7-8 ч после обработки и результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Закрытие царапины на культивируемых кератиноцитах. После обработки в течение 7 ч закрытие раны при обработке PBS принимали за 100%, закрытие раны при обработке пептидом вычисляли относительно обработки PBS
SEQ ID NO.	HB NO.	Последовательность	Закрытие раны после обработки в течение 7 ч (%)	Цитотоксичность в отношении кератиноцитов (мг/мл)
NA	NA	PBS	100	-
1	HB2265	EKMGRN	199*	>500
4	HB2234	EKMG	191*	>500
5	HB2235	MGRN	218*	>500
2	HB2262	KMGRN	182*	>500
3	HB2263	EKMGR	188*	>500
6	HB2268	KMG	107	>500
7	HB2269	GRN	102	>500
8	HB2232	KIEK	100	>500
9	HB1062	GRNIRN	99	>500
*: значимое

Пример 2. Цитотоксичность в отношении кератиноцитов нормальной кожи человека

[0037] Чтобы убедиться, что пептиды не являются цитотоксичными для клеток, нормальные кератиноциты эпидермиса человека высевали в 96-луночный планшет. Планшет инкубировали при 37°C в присутствии 5% CO2, чтобы позволить клеткам расти до >95% смыкания монослоя. Пептиды разбавляли до исходных растворов с концентрацией 50, 100, 200 и 500 мкг/мл. Среду для культивирования клеток заменяли свежей средой, содержащей пептиды в различных концентрациях, а затем инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 24 ч. В конце обработки измеряли жизнеспособность клеток с использованием набора для MTT-анализа, приобретенного от ATCC (Manassas VA). Результаты представлены в таблице 2. В концентрациях от 50 до 500 мкг/мл пептиды не изменяли жизнеспособность клеток при измерении с использованием MTT-анализа.

Пример 3: Идентификация пептидов, которые стимулируют пролиферацию клеток

[0038] Кератиноциты нормальной кожи человека (ATCC CRL-2404) выращивали в бессывороточной среде для роста кератиноцитов, дополненной 5 нг/мл рекомбинантного эпителиального фактора роста (EOF) человека (Life Technologies Corporation, Grand Island, N.Y.). Клетки микроскопически исследовали каждые сутки. Когда культура становилась смыкающейся на 50-75%, среду в планшете аспирировали и добавляли 0,25% трипсин/EDTA. Когда клетки становились округлыми и откреплялись, трипсин нейтрализовывали добавлением свежей культуральной среды. Затем клетки центрифугировали и осадок ресуспендировали в свежей культуральной среде. Для подсчета клеток в суспензии использовали гемоцитометр и общее количество клеток доводили до приблизительно 500-1000 клеток на лунку добавлением 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку. Как правило, использовали центральные 60 лунок и наружные лунки заполняли свежей средой для минимизации испарения. Когда клетки прикреплялись в каждой лунке после инкубации в течение 6-8 ч, добавляли 100 мкл свежей среды, содержавшей PBS или 2x желаемые концентрации пептида в трех экземплярах. Затем микропланшет инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 48-72 ч.

[0039] В конце инкубации клетки подвергали анализу цитотоксичности клеток CYTOSCAN™ SRB (GBiosciences Company, St. Louis, MO) в соответствии с инструкциями изготовителя. В кратком изложении, клетки фиксировали перед окрашиванием сульфородамином B (SRB). После тщательного промывания краситель солюбилизировали с использованием солюбилизирущего буфера. Поглощение измеряли при 565 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов. Результаты, представленные в таблице 2, представляют собой среднюю величину для обработки в трех экземплярах и величины более 120 считались значимыми.

Таблица 2 Модулирование пролиферации кератиноцитов нормального эпидермиса человека с использованием пептидов по изобретению
SEQ ID	HB #	Последова тельность	Концентрация пептида
			5 мкг/мл	2,5 мкг/мл	1,25 мкг/мл	0,625 мкг/мл
OD565	% относи-тельно PBS	OD565	% относи-тельно PBS	OD565	% относи-тельно PBS	OD565	% относи-тельно PBS
	PBS	PBS	0,1123	100	0,1123	100	0,1123	100	0,1123	100
1	HB2265	EKMGRN	0,142	126*	0,153	136*	0,127	113	0,125	111
4	HB2234	EKMG	0,103	92	0,143	127*	0,149	133*	0,151	134*
5	HB2235	MGRN	0,126	112	0,148	132*	0,145	129*	0,148	132*
2	HB2262	KMGRN	0,156	139*	0,169	150*	0,159	142*	0,159	142*
3	HB2263	EKMGR	0,129	115	0,154	137*	0,16	142*	0,137	122*
6	HB2268	KMG	0,108	96	0,134	119	0,113	101	0,103	92
7	HB2269	GRN	0,121	108	0,114	102	0,099	88	0,104	93
8	HB2232	KIEK	0,102	91	0,126	112	0,109	97	0,115	102
*: значимый

Пример 4. Анализ для определения профиля генов

[0040] 84 гена, кодирующих молекулы, участвующие в заживлении раны, молекулы внеклеточного матрикса и молекулы адгезии анализировали на ПЦР-чипах с использованием Sunny Biodiscovery, Inc (Santa Paula, CA). В кратком изложении, заменитель кожи EPIDERM™ приобретали от MatTek (Ashland, MA) и обрабатывали в соответствии с инструкциями изготовителя. После уравновешивания в течение ночи среду заменяли и наносили 10 проколов на всю толщину с использованием иглы 20G, и на ткань кожи наносили HB2235 (330 мкг/мл) или контроли в виде воды в двух экземплярах и осуществляли обработку в течение 24 часов. Также в качестве контроля использовали набор нормальных тканей без ран, чтобы определить профиль генов в тканях с ранами и нормальных тканях. В конце обработки ткани собирали и сохраняли в растворе RNAlater (Ambion, Austin, TX). РНК экстрагировали и очищали с использованием набора Illustra mini RNAspin kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Очищенную тотальную РНК оценивали при 260 нм и 280 нм с использованием спектрофотометра с диодной матрицей Agilent HP-8452A. Концентрацию РНК выравнивали среди образцов и экспрессию представляющих интерес генов определяли с использованием количественной ПЦР в реальном времени на системе BioRad iCycler iQ Detection System с использованием ПЦР-чипов PAHS-121A, с набором для синтеза 1 цепи, основной смесью SYBR Green и условиями ПЦР от Qiagen. Для количественного определения результатов использовали эффективность способа ΔΔCt после нормализации экспрессии генов к 5 генам домашнего хозяйства, проведенной с помощью программного обеспечения анализа данных чипов RT2 Profiler PCR Array Data analysis версии 3.5. Гены считали дифференциально экспрессирующимися, если уровень экспрессии был достаточно высоким (менее 30 циклов до обнаружения) и модулирование составляло 1,5 или более в каждой дублированной серии.

Таблица 3 Определение профиля экспрессии отдельных генов на ткани кожи с ранами по сравнению с контролем без ран и на ткани с ранами, обработанной HB2235, против ткани с ранами без обработки, представленное в качестве кратности изменений
Обозначение	Название гена	Кратность изменений Активация (+) или подавление (-)
Ткани с ранами против контроля без раны	Ткани с ранами, обработанные HB2235, против тканей с ранами
Белки матрикса
COL1A1	Коллаген I, альфа 1	1,3195	2,0279
COL3A1	Коллаген III, альфа 1	1,0353	1,5369
COL5A1	Коллаген V, альфа 1	-1,1487	1,1647
COL5A2	Коллаген V, альфа 2	-1,1096	1,8921
COL5A3	Коллаген V, альфа 3	1,8025	6,5887
COL14A1	Коллаген XIV, альфа 1	1,0353	1,5369
ITGB3	Интегрин бета 1	1,0353	1,5369
Воспалительный каскад
CXCL1	Хемокин (C-X-C), лиганд 1	1,3195	-1,057
CXCL2	Хемокин (C-X-C), лиганд 2	4,2871	-1,7171
CXCL5	Хемокин (C-X-C), лиганд 5	2,9282	-3,9449
CSF2	Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор 2	1,8661	-1,6021
IL6ST	Белок, передающий сигнал интерлейкина 6	1,9319	1,5369
IL-Ιβ	Интерлейкин 1, бета	1,4641	-1,3947
MAPK3	Митоген-активируемая протеинкиназа 3	2,2974	1,8921
Противовоспалительный каскад
IL-10	Интерлейкин 10	1,0353	1,5369
Факторы роста
EGF	Эпидермальный фактор роста	1,2746	1,434
PDGFA	Полипептид тромбоцитарного фактора роста альфа	-1,0353	1,434
VTN	Витронектин	1,0000	5,7358
VEGFA	Сосудисто-эндотелиальный фактор роста A	-1,366	1,1647
TGFB1	Трансформирующий фактор роста-β	1,2311	2,1735
Ингибиторы протеаз
MMP1	Матриксная металлопептидаза 1	1,8025	1,1647
CTSL2	Катепсин L2	1,1487	-1,7171
PLAT	Тканевой активатор плазминогена	3,3636	1,2483
PLAU	Урокиназный активатор плазминогена	2,0000	-1,1329
PTGS2	Простагландин G/H синтетаза и циклооксигеназа	2,4623	-1,7171
SERPINE1	Серпиновый ингибитор пептидаз, клад E, представитель 1	2,1435	-1,4948

[0041] Все композиции или способы, описанные и заявленные в настоящем описании, можно получать и выполнять без излишнего экспериментирования ввиду настоящего описания. Хотя композиции и способы по настоящему изобретению описаны с точки зрения предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области будет очевидно, что можно использовать изменения композиций и/или способов и стадий или последовательности стадий способов, описанных в настоящем описании, без отклонения от идеи, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что средства, описанные в настоящем описании, можно заменять определенными средствами, которые являются как химически, так и физиологически сходными, при достижении таких же или сходных результатов. Все такие сходные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области, считаются входящими в объем изобретения.

[0042] Все патенты и публикации, указанные в настоящей заявке, включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ССЫЛКИ

[0043] Bergers G, Coussens LM (2000). Extrinsic regulators of epithelial tumor progression: metalloproteinases. Curr Opin Genet Dev. 10:120-127.

[0044] Easton DM, Nijnik A, Mayer ML, Hancock RE (2009). Review Potential of immunomodulatory host defense peptides as novel anti-infectives. Trends Biotechnol. 27(10):582-90.

[0045] Enoch S, Price P (2004). Cellular, molecular and biochemical differences in the pathophysiology of healing between acute wounds, chronic wounds and wounds in the aged. World Wide Wounds. (worldwidewounds.com/2004/august/Enoch/Pathophysiology-Of-Healing.html)

[0046] Gallo RL, Ono M. et al., (1994). Syndecans, cell surface heparin sulfate proteoglycans, are induced by a prolin-rich antimicrobial peptide from wounds. Proc Natl Acad Sci USA. 91:11035-9.

[0047] Heilborn JD, Nilsson MF. et al., (2003). The cathelicidin antimicrobial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 120: 379-89.

[0048] Lee PH, Rudisill BA et al., (2004). HB-107, a nonbacteriostatic fragment of the antimicrobial peptide cecropin B, accelerate murine wound repair. Wound Rep Reg 12: 351-8.

[0049] Leitch VD, Strudwick XL, Matthaei KI, Dent LA, Cowin AJ. (2009). IL-5-overexpressing mice exhibit eosinophilia and altered wound healing through mechanisms involving prolonged inflammation. Immunol Cell Biol. 87(2): 131-40.

[0050] Mustoe TA, Cutler NR, Allman RM, Goode PS, et al., (1994) A phase II study to evaluate recombinant platelet-derived growth factor-BB in the treatment of stage 3 and 4 pressure ulcers. Ach Surg 129: 213-9.

[0051] Nijnik A, Madera L, Ma S, Waldbrook M, Elliott MR, Easton DM, Mayer ML, Mullaly SC, Kindrachuk J, Jenssen H, Hancock RE (2010). Synthetic cationic peptide IDR-1002 provides protection against bacterial infections through chemokine induction and enhanced leukocyte recruitment. J Immunol. 184(5):2539-50.

[0052] Oono T, Shirafuji Y. et al., (2002). Effects of human neutrophil peptide-1 on the expression of interstitial collagenase and type I collagen in human dermal fibroblasts. Arch Dermatol Res 294:185-9.

[0053] Presland RB, Dale BA (2000). Epithelial structural proteins of the skin and oral cavity: function in health and disease. Crit, Rev. Oral Bio. Med. 11:383-408.

[0054] Proksch E, Brandner JM, Jensen JM (2008). The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17:1063-72.

[0055] Robert L, Labat-Robert J and Robert AM (2009) Physiology of skin aging. Pathol Biol (Paris). 57(4):336-41.

[0056] Rogalski C et al., 2002. Extensive striae distensae as a result of topical corticosteroid therapy. Acta Derm Venereol, 83:54-55.

[0057] Samah A (2011). Topically applied KTTKS: a review. Int J Cosmet Sci. 33: 483-90. Shi J, Ross CR, Leto TL, and Blecha F (1996) PR-39, a prolin-rich antibacterial peptide that inhibits phagocyte NADPH oxidase activity by binding to Src homology 3 domains of p47 phox. Proc Natl Cad Sci USA. 93:6014-8.

[0058] Singer, A.I., Clark, R.A. (1999). Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746.

[0059] Steed DL (1995). Clinical evaluation of recombinant human platelet-derived growth factor for the treatment of lower extremity diabetic ulcers. Diabetic ulcer study group. J Vase Surg 21:71-8.

[0060] Steinstraesser L, Koehler T, Jacobsen F, Daigeler A, Goertz O, Langer S, Kesting M, Steinau H, Eriksson E, Hirsch T (2008). Host defense peptides in wound healing. Mol Med. 14(7-8):528-37.

[0061] Steinstraesser L, Kraneburg UM, Hirsch T, Kesting M, Steinau HU, Jacobsen F, Al-Benna S (2009). Host defense peptides as effector molecules of the innate immune response: a sledgehammer for drug resistance? Int J Mol Sci. 10(9):3951-70.

[0062] Upton Z, Cuttle L, Noble A, Kempf M, Topping G, Malda J, et al., (2008) Vitronectin: growth factor complexes hold potential as a wound therapy approach. J Invest Dermatol. 128:1538-1544.

[0063] Wang, XJ, Han G, Owens P, Siddiqui Y and Li AG (2006). Role of TGF beta-mediated inflammation in cutaneous wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 11 (1): 112-7.

[0064] Zhang L, Falla TJ (2006). Antimicrobial peptides: therapeutic potential. Expert Opin Pharmacother. 7(6):653-63.

1. Выделенный пептид, обладающий улучшенной активностью в стимуляции фибробластов кожи человека по сравнению с пептидом НВ107 - фрагментом цекропина В, где последовательность пептида состоит из SEQ ID NO: 4 (EKMG), SEQ ID NO: 5 (MGRN) или SEQ ID NO: 2 (KMGRN), где пептид необязательно является амидированным на С-конце или липидизированным на N-конце.

2. Пептид по п. 1, причем пептид является амидированным на С-конце или липидизированным на N-конце.

3. Пептид по п. 1, который содержит любой или оба из L- и D-энантиомеров аминокислот.

4. Композиция для применения для ухода за кожей, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного пептида по любому из пп. 1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Композиция по п. 4, где пептид присутствует в концентрации, находящейся в диапазоне от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 500 мкг/мл или от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 20 мг/мл.

6. Композиция по п. 4, где композиция имеет форму аэрозоля, эмульсии, жидкости, лосьона, раствора, геля, микрокапсул, крема, пасты, мази, порошка или пены.

7. Композиция для применения для заживления раны у млекопитающего при нанесении в терапевтически эффективном количестве в течение эффективного количества времени, где указанная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество по меньшей мере одного пептида по любому из пп. 1-3.

8. Композиция по п. 7, где рана поражает кожу или прилегающую к ней ткань слизистой оболочки у указанного млекопитающего.

9. Композиция по п. 8, где рана является следствием царапины, волдыря, ожога, изъязвления, язвы, кровоподтека, сыпи, рубца, растяжки или эффектов старения или воздействий окружающей среды.

10. Композиция по любому из пп. 4-9 для применения для обработки для ухода за кожей.

11. Композиция по любому из пп. 4-9 для применения в косметическом продукте.

12. Применение пептида по любому из пп. 1-3 для изготовления лекарственного средства для лечения раны кожи или ткани слизистой оболочки млекопитающего.

13. Применение пептида по п. 12, где рана является следствием царапины, волдыря, ожога, изъязвления, язвы, кровоподтека, сыпи, рубца, растяжки или эффектов старения или воздействий окружающей среды.

14. Способ лечения раны кожи или ткани слизистой оболочки млекопитающего, включающий нанесение на область раны композиции, содержащей пептид по п. 1.

15. Способ по п. 14, где пептид содержит любой или оба из L- и D-энантиомеров аминокислот или, дополнительно, является конъюгированным с молекулой носителя, амидированным на С-конце или липидизированным на N-конце.

16. Способ по п. 14, где рана является следствием царапины, волдыря, ожога, изъязвления, язвы, кровоподтека, сыпи, рубца, растяжки или эффектов старения или воздействий окружающей среды.