Способ получения ксенотрансплантата для офтальмохирургии

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для получения трансплантат-коллагенового материала для выполнения склеропластических хирургических вмешательств при лечении прогрессирующей миопии средней и высокой степени. Проводят механическую очистку, обработку 10% раствором аммиака в течение 4 часов, промывание водой очищенной, многократное замораживание и размораживание биоматериала, обработку 6% раствором перекиси водорода, фрагментацию биоматериала, дегидратацию в спиртах восходящей концентрации от 30 до 70 об.%, расфасовку во флаконы с 70% этиловым спиртом и стерилизацию ионизирующим излучением дозой 1,5 Мрад. Дополнительно проводят двухстадийную обработку раствором 15% муравьиной кислоты, сначала после первого замораживания и размораживания в течение 1,5 часов при перемешивании, затем после повторного замораживания и размораживания в течение 1 часа при перемешивании. Кроме этого перед дегидратацией дополнительно проводят ультрафиолетовое сшивание коллагена биоматериала путем обработки его 0,5% раствором рибофлавина в течение 20 минут и последующего ультрафиолетового облучения мощностью 5 мВт/см² при длине волны 370 нм в течение 20 мин. Использование изобретения повышает прочностно-механические характеристики и биосовместимость ксенотрансплантата. 1 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для получения трансплантат-коллагенового материала для выполнения склеропластических хирургических вмешательств при лечении прогрессирующей миопии средней и высокой степени.

Известен способ обработки склеропластического материала, получаемого из соединительной ткани животных и человека, который включает их очистку от механических примесей и крови, отмывку холодной водой, нарезку на полоски нужного размера с перфорациями, помещение в 6%-ный раствор перекиси водорода от 1 до 3-х часов, затем в 4М раствор мочевины не менее 15 часов, инкубацию в 2М растворе хлорида натрия, отмывку материала, помещение материала в смесь хлороформ: этанол в соотношении 1:1, отмывку водой, лиофилизацию и стерилизацию радиационным методом в дозе 1,7-2,5 Мрад [патент RU №2234289, 2004 г.]. Однако данный способ обработки не обеспечивает максимального удаления гликопротеинов и растворимых белков, определяющих антигенные свойства биологического материала.

Известен метод получения биоматериала для использования в офтальмологии посредством обработки перикарда сельскохозяйственных животных, который механически очищают, заливают 0,9% раствором хлорида натрия и дистиллированной водой, после чего помещают в раствор аммиака и этилового спирта, затем отмывают водой и заливают этиловым спиртом [патент RU №2054283, 1996 г.]. Следует отметить, что этот метод не всегда может обеспечивать полное освобождение материала от антигенов коллагена, липидов, фосфолипидов, липопротеидов и других жиросодержащих веществ, которые присутствуют в указанных тканях в больших количествах и снижают его биосовместимость, вследствие чего в послеоперационном периоде повышается риск возникновения аутоиммунных реакций.

Прототипом изобретения является способ получения материала для склеропластики [патент RU №2281061, 2006 г.], при котором перикард крупного рогатого скота после механической очистки обрабатывают 10% раствором аммиака в течение 4-5 часов, промывают дистиллированной водой, четырежды замораживают при температуре минус 10-12°С и размораживают при температуре +40+45°С, в течение 7,5 часов обрабатывают 6%-ным раствором перекиси водорода при +15°С, после разрезания материала обрабатывают его ультразвуком и повторяют всю процедуру обработки при перемешивании с использованием перемешивающего устройства. Затем материал дегидратируют в спиртах восходящей концентрации от 30 до 70 объемных процентов, раскладывают во флаконы с 70% этиловым спиртом и стерилизуют ионизирующим излучением в дозе 1,5 Мрад. Данный способ обработки позволяет освободиться от нежелательных антигенных свойств материала. Однако существенным недостатком последнего является его нестабильные прочностно-механические характеристики, значительно затрудняющие выполнение склеропластических хирургических вмешательств.

Задачей изобретения является создание трансплантат-коллагенового материала с улучшенными биомеханическими свойствами для склеропластических хирургических вмешательств при лечении прогрессирующей миопии средней и высокой степени.

Технический результат - повышение прочностно-механических характеристик и биосовместимости ксенотрансплантата.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения ксенотрансплантата для офтальмохирургии из перикарада крупного рогатого скота, включающем механическую очистку, фрагментацию биоматериала, двукратную обработку 10% раствором аммиака в течение 3-4 часов, промывание водой очищенной, многократное замораживание и размораживание биоматериала, двукратную обработку 6%-ным раствором перекиси водорода, дегидратацию в спиртах восходящей концентрации от 30 до 70 об. %, расфасовку во флаконы с 70%-ным этиловым спиртом и стерилизацию ионизирующим излучением дозой 1,5 Мрад, согласно изобретению после первого замораживания и размораживания дополнительно проводят обработку 15% раствором муравьиной кислоты в течение 1,5 часов при перемешивании с дальнейшим замораживанием и размораживанием; затем проводят обработку 6% раствором перекиси водорода в течение 6 часов, после этого проводят дополнительную фрагментацию биоматериала, повторно обрабатывают биоматериал 10% раствором аммиака в течение 3 часов с дальнейшим замораживанием и размораживанием, после чего повторно проводят обработку 15% раствором муравьиной кислоты в течение 1 часа при перемешивании с дальнейшим замораживанием и размораживанием, затем повторно проводят обработку 6% раствором перекиси водорода в течение 1,5 часов, а перед дегидратацией дополнительно проводят ультрафиолетовое сшивание коллагена биоматериала путем обработки его 0,5% раствором рибофлавина в течение 20 минут и последующим ультрафиолетовым облучением мощностью 5 мВт/см² при длине волны 370 нм в течение 20 мин. При этом для облучения используют диодный ультрафиолетовый источник ROITHNER LASER TECHNIK марки UVLED 370-10Е.

Предлагаемый способ получения трансплантат-коллагенового материала для офтальмохирургии осуществляется следующим образом.

1. Используют 1 кг перикарда крупного рогатого скота, полученного в течение 2 часов после забоя и доставленного в термоконтейнерах.

2. Проводят механическую очистку материала от жировых отложений, сгустков крови, сосудов и нарезают его на пластины 10×15 см.

3. Материал обрабатывают 10% раствором аммиака при перемешивании в течение 4-х часов с 5-кратной сменой раствора с использованием устройства перемешивающего ПЭ-6410М.

4. Промывают водой очищенной в течение 30 мин с 3-кратной сменой воды.

5. Замораживают материал при температуре минус 12-16°С в морозильной камере холодильника и размораживают в теплой воде при температуре +35+45°С.

6. Материал обрабатывают 15% раствором муравьиной кислоты однократно в течение 1,5 часов на перемешивающем устройстве ПЭ-6410М.

7. Промывают водой очищенной в течение 4-х часов с 6-кратной сменой воды.

8. Замораживают материал при температуре минус 12-16°С в морозильной камере холодильника и размораживают в теплой воде при температуре +35+45°С.

9. Обрабатывают материал 6% раствором перекиси водорода в течение 6-ти часов с 3-кратной сменой раствора.

10. Промывают материал водой очищенной в течение 4-х часов с 10-кратной сменой воды на перемешивающем устройстве ПЭ-6410М.

11. Обрабатывают материал ультразвуком в течение 30 мин на приборе Ретона УСУ-0707 при частоте колебаний излучателей 120 кГц.

12. Нарезают материал на полоски размером (7×25) мм и (10×100) мм.

13. Повторно обрабатывают материал 10% раствором аммиака в течение 3-х часов с 5-кратной сменой раствора на перемешивающем устройстве ПЭ-6410М.

14. Повторно промывают водой очищенной в течение 30 мин с 3-кратной сменой воды.

15. Повторно замораживают материал при температуре минус 12-16°С в морозильной камере холодильника и размораживают в теплой воде при температуре +35+45°С.

16. Повторно обрабатывают материал 15% раствором муравьиной кислоты однократно в течение 1 часа на перемешивающем устройстве ПЭ-6410М.

17. Повторно промывают водой очищенной в течение 3-х часов с 8-кратной сменой воды.

18. Повторно замораживают материал при температуре минус 12-16°С в морозильной камере холодильника и размораживают в теплой воде при температуре +35+45°С.

19. Повторно обрабатывают материал 6%-ным раствором перекиси водорода в течение 1,5 часов с 3-кратной сменой раствора на перемешивающем устройстве ПЭ-6410М.

20. Промывают водой очищенной в течение 4-х часов с 10-кратной сменой воды на перемешивающем устройстве ПЭ-6410М.

21. Проводят ультрафиолетовое сшивание (кросслинкинг) коллагена материала для повышения его биопластических и прочностно-механических свойств. Для этого пластинки материала обрабатывают 0,5% раствором рибофлавина в течение 20 минут, после чего избыток рибофлавина удаляют. Помещают материал в чашки Петри и облучают от диодного ультрафиолетового источника ROITHNER LASERTECHNIK марки UVLED370-10E при длине волны 370 нм мощностью 5 мВт/см в течение 20 мин.

22. Материал дегидратируют, используя спирт этиловый в восходящих концентрациях от 30 до 70 объемных процентов, в каждом растворе спирта выдерживают 24 часа на перемешивающем устройстве.

23. Расфасовывают материал во флаконы с 70%-ным этиловым спиртом, укупоривают.

24. Проводят стерилизацию ионизирующим излучением дозой 1,5 Мрад на установке Со⁶⁰.

25. Проводят бактериологическое исследование образцов материала.

Проведение кросслинкинга ксенотрансплантата приводит к образованию дополнительных химических связей между фибриллами коллагена, что значительно улучшает биомеханические свойства материала [Wollensak G., Spoerl Е., Seiler Т. Riboflavin / ultraviolet-a-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus // Am. J. Ophthalmol. 2003. Vol. 135. - N5. - P. 620-627; Wollensak G., Iomdina E., Dittert D.D., Salamatina O., Stoltenburg G. Cross-linking of sclera collagen in the rabbit using riboflavin and UVA // Acta. Ophthalmol. Scand. 2005. Vol.83. - N 4. - P. 477-482]. Кроме того, УФ-облучение обладает бактерицидным действием и элиминирует золотистый стафилококк, синегнойную палочку, стрептококк, пневмококк и др. [Richoz О., Kling S., Hoogewoud F., Hammer A., Tabibian D., Francois P., Schrenzel J., Hafezi F. Antibacterial efficacy of accelerated photoactivated chromophore for keratitis-corneal collagen crosslinking (PACK-CXL) // J. Refract. Surg. 2014. Vol.30. - N 12. - P. 850-854].

Изучение биомеханических свойств экспериментальных образцов предлагаемого трансплантат-коллагенового материала проводили на разрывной установке, совмещенной с персональным компьютером. В группу контроля включили ксенотрансплантаты, необработанные рибофлавин-УФ-облучением. После предварительного выдерживания в течение 2 минут образцов материала в физиологическом растворе, нагретом до 45°С, измеряли деформацию и растяжение на указанной разрывной установке с последующим расчетом модуля продольной упругости (модуля Юнга) по формуле

m - масса образца (кг),

g - ускорение свободного падения (м/с²),

l₀ - длина образца до растяжения (мм),

S - площадь поперечного сечения образца (мм²),

Δl₀ - приращение длины образца (мм).

Величина модуля Юнга для контрольных образцов составила 6,3±1,0 мПа, тогда как для опытных - 11,5±3,0 мПа, т.е. с помощью предлагаемого способа обработки ксенотрансплантатов повышаются прочностно-механические свойства материала в 1,8 раза.

Клинические свойства ксенотрансплантата исследованы при проведении экспериментальной склеропластической операции по Хатминскому на 8 кроликах породы Шиншилла весом от 2,8-3,2 кг. Животные были разделены на 2 группы (по 4 кролика в каждой). В контрольной группе для операции использовали ксенотрансплантат без рибофлавин-УФ обработки; в опытной - предлагаемый материал, дополнительно насыщенный 0,5% рибофлавиноми УФ-облученный в течение 20 мин при длине волны 370 нм и мощности 5 мВт/см.

Эксперименты проводились в условиях операционной вивария. В качестве анестезиологического пособия использовали препарат «Ксилазин» 2% внутримышечно в дозе 0,2 мл/кг в сочетании с местной анестезией 0,4% раствором оксибупрокаина («Инокаин»).

После двукратной обработки операционного поля раствором спирта и наложения блефаростата предварительно размечали участки предполагаемых разрезов конъюнктивы в 6-7 мм от лимба в нижневнутреннем и верхненаружном квадрантах. Производили разрезы конъюнктивы около 5 мм и обнажали склеру в 6-7 мм от лимба. Затем под мышцы в косом направлении заводили трансплантаты за экватор поперек мышц. Из одного разреза полоски трансплантат-коллагенового материала вставляли поочередно под две соседние мышцы. На конъюнктиву накладывали непрерывные швы.

В контрольной группе недостаточная механическая стабильность ксенотрансплантатов затрудняла проведение хирургических манипуляций, в частности, при «заведении» трансплантата к заднему полюсу глазного яблока. Использование предлагаемых трансплантатов, благодаря стабильным механическим свойствам (эластичность, сохранение придаваемой формы), облегчало выполнение склеропластики.

На 2-й день после операции при осмотре оперированных глаз кроликов отмечали отек и гиперемию конъюнктивы, которые были наиболее выраженными в контрольной группе.

На 3-4-е сутки после операции на фоне стандартной противовоспалительной и антибактериальной терапии у кроликов опытной группы сохранялась лишь легкая гиперемия конъюнктивы, тогда как у кроликов контрольной группы оставался умеренный отек конъюнктивы. У всех 8-ми животных положение трансплантатов оставалось стабильным, оптические среды глаза были прозрачными, рефлекс с глазного дна розовым. На 7 сутки у всех кроликов сняты швы с конъюнктивы. При биомикроскопии и офтальмоскопии на 15 и 30 сутки после операции в обеих группах глаза были спокойными, конъюнктива над трансплантатами бледно-розовой, трансплантаты сохраняли правильное положение.

Каких-либо осложнений, связанных с использованием предлагаемого трансплантат-коллагенового материала, не отмечалось.

Кролики были выведены из эксперимента с помощью передозировки препарата для наркоза («Ксилазин»).

Биомикроскопия глаз животных после энуклеации показала сохранение правильного положения трансплантатов на склере в обеих группах - спереди они находились в области мест прикрепления прямых мышц к склере, сзади - в 2-х мм от зрительного нерва. Сращение со склерой отмечалось по всей площади прилегания трансплантата.

При гистологическом исследовании глаз животных опытной группы, энуклеированных на 15 сутки, в толще склеры определялся трансплантат, окруженный умеренной и местами слабо выраженной воспалительной реакцией, новообразованными сосудами и выраженным отеком коллагеновых структур, на 30 сутки в срезе склеры определялся трансплантат, окруженный умеренным количеством лимфоцитов, моноцитов, плазматических клеток и единичных многоядерных клеток. Процессы приживления и структурной организации предлагаемых трансплантатов характеризовались образованием прочной волокнистой соединительной ткани, способствующей укреплению склеры.

В группе контроля через 2 недели после операции в толще склеры микроскопически определялись элементы имплантата (перикард), представленного гомогенной волокнистой тканью, между ксенотрансплантатом и склерой отмечалась выраженная воспалительная реакция, представленная массивным лимфо-макрофагальным инфильтратом, с наличием большого количества фибробластов. Через месяц в срезе склеры определялся имплантат (перикард) в виде грубоволокнистой структуры с признаками межуточного отека, окруженный массивным воспалительным инфильтратом, местами с формированием грануляционной ткани, клетки воспалительного инфильтрата проникали между волокнами трансплантата.

Таким образом, морфологическое изучение энуклеированных глаз животных показало приживление склеральных трансплантатов опытной и контрольной групп и подтвердило лучшую биологическую совместимость трансплантат-коллагенового материала, обработанного предлагаемым нами способом. Благодаря дополнительной УФ-обработке биоматериала при гистологическом исследовании между ксенотрансплантатом и склерой отмечалась умеренная, местами слабо выраженная воспалительная реакция, тогда как в контрольной группе присутствовал массивный лимфо-макрофагальный инфильтрат. Рибофлавин-УФ-обработанный ксенотрансплантат, обладая улучшенными биомеханическими характеристиками, облегчает проведение хирургических манипуляций, обеспечивает стабилизацию патологических процессов в склере и может использоваться для склеропластических операций при прогрессирующей миопии средней и высокой степени.

.

1. Способ получения ксенотрансплантата для офтальмохирургии из перикарада крупного рогатого скота, включающий механическую очистку, фрагментацию биоматериала, двукратную обработку 10% раствором аммиака в течение 3-4 часов, промывание водой очищенной, многократное замораживание и размораживание биоматериала, двукратную обработку 6% раствором перекиси водорода, дегидратацию в спиртах восходящей концентрации от 30 до 70 об.%, расфасовку во флаконы с 70% этиловым спиртом и стерилизацию ионизирующим излучением дозой 1,5 Мрад, отличающийся тем, что после первого замораживания и размораживания дополнительно проводят обработку 15% раствором муравьиной кислоты в течение 1,5 часов при перемешивании с дальнейшим замораживанием и размораживанием; затем проводят обработку 6% раствором перекиси водорода в течение 6 часов, после этого проводят дополнительную фрагментацию биоматериала, повторно обрабатывают биоматериал 10% раствором аммиака в течение 3 часов с дальнейшим замораживанием и размораживанием, после чего повторно проводят обработку 15% раствором муравьиной кислоты в течение 1 часа при перемешивании с дальнейшим замораживанием и размораживанием, затем повторно проводят обработку 6% раствором перекиси водорода в течение 1,5 часов, а перед дегидратацией дополнительно проводят ультрафиолетовое сшивание коллагена биоматериала путем обработки его 0,5% раствором рибофлавина в течение 20 минут и последующим ультрафиолетовым облучением мощностью 5 мВт/см при длине волны 370 нм в течение 20 мин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для облучения используют диодный ультрафиолетовый источник ROITHNER LASER TECHNIK марки UVLED 370-10Е.