Способ получения функционализированных визуализирующих агентов с антистоксовой фотолюминесценцией на основе полиакролеиновых дисперсий

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений и касается способа получения визуализирующих агентов с антистоксовой фотолюминесценцией в виде водной дисперсии полиакролеиновых частиц, содержащих наноразмерные антистоксовые фосфоры (НАФ), путем полимеризации акролеина в водно-щелочной среде, проводимой в две стадии, на первой из которых проводят осадительную полимеризацию, а на второй стадии полученный продукт подвергают дальнейшей радикальной полимеризации в присутствии водорастворимого инициатора K₂S₂O₈, отличающегося тем, что первую стадию полимеризации проводят в присутствии НАФ в количестве 0,1-1,5 мас.% в расчете на мономер, предварительно обработанных гидроксидом тетраметиламмония, которые используют в качестве инициатора полимеризации. Изобретение позволяет инкапсулировать наноразмерные антистоксовые фосфоры (НАФ) в объем полимерной матрицы, которая предохраняет оптические свойства нанофосфоров от воздействия биологических сред и обеспечивает коллоидно-химические свойства, необходимые для использования в качестве визуализирующих агентов в биоанализе и биоимиджинге. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области химии и технологии высокомолекулярных соединений.

Разработка новых методов диагностики злокачественных опухолей на сегодняшний день одна из наиболее актуальных и активно развивающихся областей медицины. Перспективной платформой для создания диагностических визуализирующих агентов являются, в частности, наноразмерные антистоксовые (апконвертирующие) фосфоры (НАФ), представляющие собой кристаллы NaYF₄, легированные редкоземельными элементами Yb³⁺/Er³⁺ или Yb³⁺/Tm³⁺ [А.В. Звягин и др. Антистоксовы нанолюминофоры: Перспективы применения в биологии и медицине // Сборник материалов V Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (г. Троицк, Московская область, 4-8 июня 2012 года), Троицкий научный центр, МОНИКИ, Том. 2, с. 8-9, 2012].

НАФ позволяют преобразовывать инфракрасное излучение лазера накачки в видимую область спектра, НАФ, характеризуются узким пиком эмиссии, большим стоксовым сдвигом, химической и физической стабильностью, а также низкой токсичностью. Ключевой особенностью НАФ являются их фотофизические свойства, обеспечивающие яркую визуализацию маркированных ими структур на фоне сильного рассеяния и автофлуоресценции биологической ткани. Кроме того, свет из ближней инфракрасной области проникает в биологические ткани глубже, чем УФ, не вызывая повреждений.

НАФ обычно получают в среде органических растворителей в присутствии стабилизатора (олеиновой кислоты). За счет формирования координационной связи с лантанидами, олеиновая кислота удерживается на поверхности нанокристаллов, что определяет гидрофобные свойства НАФ.

Поэтому необходимо разработать способы модификации НАФ, позволяющие получить коллоидно-устойчивые в условиях биологического окружения формы, содержащие на поверхности функциональные группы, необходимые для иммобилизации биоспецифических молекул.

Известны следующие основные способы решения данной задачи:

1) включение НАФ в частицы на основе SiO₂ [Li Z Q, Zhang Y. Monodisperse silica-coated polyvinylpyrrolidone/NaYF4 nanocrystals with multicolor upconversion fluorescence emission. Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 7732];

2) использование дифильных соединений, способных замещать молекулы олеиновой кислоты таким образом, что гидрофильные группы этих соединений после присоединения к НАФ оказываются экспонированными в водную фазу, что обеспечивает гидрофильность [WO/2012/091778 05.07.2012, Collins J.E., Bell H.Y., Ye X., Murray С.В. Morphologically and size uniform monodisperse particles and their shape-directed self-assembly];

Boyer J.C; Manseau M.P.; Murray J.I.; Veggel F.C.J.M. Surface Modification of Upconverting NaYF4 Nanoparticles with PEG-Phosphate Ligands for NIR (800 nm) Biolabeling within the Biological Window, Langmuir 2010, 26, 1157-64];

3) формирование полимерного слоя вокруг НАФ за счет проникновения гидрофобных фрагментов дифильных соединений в оболочку олеиновой кислоты без удаления ее с поверхности НАФ [G. Jiang, J. Pichaandi, N.J.J. Johnson, R.D. Burke, F.C. van Veggel An Effective Polymer Cross-Linking Strategy To Obtain Stable Dispersions of Upconverting NaYF₄ Nanoparticles in Buffers and Biological Growth Media for Biolabeling Applications, Langmuir 2012, 28, 3239-3247].

Общим недостатком известных способов является то, что формируется неплотная защитная полимерная оболочка, проницаемая для молекул растворителя, ионов буферных солей и т.д., что приводит к тушению флуоресценции и снижению коллоидной стабильности в течение сравнительно короткого срока (до 2-х месяцев).

Кроме того, в первом случае процедура создания оболочки из оксида кремния является сложной и длительной, наблюдается потеря материала и коллоидной стабильности при хранении.

Во втором случае динамический характер связи дифильных соединений с поверхностью НАФ приводит к недостаточной коллоидной стабильности.

В третьем случае при формировании полимерного слоя вокруг НАФ за счет гидрофобных взаимодействий наблюдается десорбция дифильного полимера с поверхности в буферных средах вследствие более сильного взаимодействия ионов солей буфера и редкоземельных металлов, чем полимера с поверхностью НАФ.

В то же время подход, основанный на включении НАФ в частицы полимерных дисперсий, имеет существенный потенциал для дальнейшего совершенствования.

Известно, например, что при полимеризации акролеина (альдегида акриловой кислоты) получают легкодиспергируемые полимерные частицы с реакционно-способными поверхностными альдегидными группами, которые могут образовывать ковалентную связь с первичными аминогруппами белков. При этом свойства получаемых частиц могут изменяться путем введения наполнителей [А.N Generalova, S.V. Sizova, Т.A. Zdobnova., М.М. Zarifullina, М.V. Artemyev, A.V. Baranov, V.A. Oleinikov, V.P. Zubov, S.М. Deyev, Submicron polymer particles containing fluorescent semiconductor nanocrystals CdSe/ZnS for bioassays, Nanomedicine, 2011, V. 6, №2, p. 195-209].

Известен наиболее близкий к заявленному способ [Лукин Ю.В., Сочилин В.А., Бахарев В.Н. и др. «Способ получения полиакролеиновых латексов», SU 1565845] получения водной дисперсии полиакролеиновых частиц путем полимеризации акролеина в водно-щелочной среде, проводимой в две стадии.

Первая стадия (анионная осадительная полимеризация) проводится при температуре 5-35°С, а вторая (радикальная полимеризация) проводится при температуре 40-90°С, в атмосфере инертного газа, с добавлением водорастворимого инициатора K₂S₂O₈, в количестве 3-6% от массы мономера.

Повышение температуры и добавление K₂S₂O₈ вызвано необходимостью увеличить коллоидно-химическую стабильность водной дисперсии полиакролеиновых частиц. В результате такой полимеризации получают полимерные частицы с диаметром около 500 нм, которые используют в качестве носителей биомолекул.

С целью изменения размеров и оптических свойств (цвета) полиакролеиновых частиц использовались различные водорастворимые органические красители.

При этом не предусматривалось введения НАФ в объем полиакролеиновых частиц.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения химически и коллоидно устойчивых в условиях биологического окружения полиакролеиновых дисперсий с антистоксовой фотолюминесценцией при введении НАФ на стадии синтеза, содержащих на поверхности альдегидные группы, способные формировать прочную связь с аминогруппами биомолекул и пригодные для модификации природными или синтетическими полимерами для получения амино- и/или карбоксильных групп на поверхности, необходимых для создания ковалентной связи с биомолекулами.

Водные дисперсии полимерно-капсулированных НАФ с указанными свойствами могут быть использованы в качестве химических и биосенсоров, для in vivo биоимиджинга, фотодинамической терапии и фотоактивации.

В предлагаемом изобретении, как и в патенте SU 1565845, полиакролеиновые частицы получают путем полимеризации акролеина в водно-щелочной среде, проводимой в две стадии.

Отличие состоит в том, что первую стадию полимеризации проводят в присутствии НАФ в количестве 0,1-1,5% масс. в расчете на мономер.

НАФ предварительно гидрофилизуют путем замены стабилизатора (олеиновой кислоты) на ионы гидроксида тетраметиламмония (ТМАГ), способного выступать в качестве катализатора фазового переноса при проведении реакции в двухфазных системах. Это дает возможность повысить сродство наночастиц к акролеину, который частично (20%) растворяется в водной среде. Кроме того, ТМАГ проявляет свойства сильной щелочи, что позволяет использовать его в качестве инициатора полимеризации вместо щелочи, используемой в патенте US 1565845.

Вторую стадию полимеризации проводят как описано в патенте SU 1565845.

В результате получают водные дисперсии полиакролеиновых частиц с инкапсулированными в них НАФ. Средний диаметр полиакролеиновых частиц может регулироваться в пределах от 200 до 520 нм путем изменения соотношения концентраций исходного мономера и инициатора реакции полимеризации (ТМАГ), причем уменьшение размера частиц происходит с уменьшением концентрации исходного мономера или с увеличением концентрации гидроксида тетраметиламмония в исходной смеси.

После окончания процессов, связанных с полимеризацией, проводят модификацию поверхности полиакролеиновых частиц путем добавления к полученной дисперсии водного раствора высокомолекулярного аминосодержащего компонента, легкоформирующего связь с поверхностными альдегидными группами, и перемешивания при 20°С в течение 2 ч, с целью получения на поверхности функциональных амино- и/или карбоксильных групп.

Эти функциональные группы в дальнейшем могут быть использованы для связи с направляющими биомолекулами, обеспечивающими адресную доставку к клеткам-мишеням, или биоспецифические реакции полиакролеиновых частиц, содержащих НАФ.

В качестве модифицирующих компонентов используют природные (белки, пептиды) или синтетические полимеры.

Технический результат выражается в достижении следующих существенных характеристик:

- повышение устойчивости функционализированных визуализирующих агентов с антистоксовой фотолюминесценцией к вредному воздействию биологического окружения на их фотофизические свойства за счет создания полимерной оболочки, недоступной для проникновения ионов буферных солей к НАФ;

- возможность регулирования размеров полиакролеиновых частиц путем изменения концентрации мономера или инициатора полимеризации, а также интенсивности люминесценции путем изменения концентрации НАФ, добавляемых на стадии синтеза;

- снижение количества компонентов в реакционной смеси, упрощение процедуры получения полимерных частиц, содержащих НАФ, и процедуры очистки полимерной дисперсии после синтеза;

- возможность получения полиакролеиновых частиц, содержащих на поверхности функциональные группы, необходимые для иммобилизации биоспецифических молекул;

- длительная сохранность коллоидных и фотофизических характеристик полиакролеиновых частиц, содержащих капсулированные НАФ (до 6 месяцев).

Пример 1. К 1 мл 1% водного раствора ТМАГ по каплям добавляют от 0 до 150 мкл дисперсии НАФ в хлороформе (20 мг/мл), две несмешивающиеся фазы тщательно перемешивают, затем помещают в ультразвуковую ванну на 15 мин. Происходит замена стабилизирующего лиганда (олеиновой кислоты) на ионы ТМАГ, и НАФ переходят в водную фазу, а хлороформ удаляют испарением. Затем в термостатированную колбу, снабженную механической мешалкой и вводом для инертного газа, помещают 0,2 мл свежеперегнанного акролеина, 3,8 мл дистиллированной воды и при перемешивании по каплям добавляют НАФ в водной фазе, в количестве 0,1-1,5% масс. в расчете на мономер. Смесь перемешивают при комнатной температуре, пока pH смеси не понизится до 8,0. Затем полученную дисперсию продувают слабым током азота в течение 30 мин, нагревают до 70°С и дополнительно перемешивают 2,5 ч при 70°С в атмосфере азота в присутствии водорастворимого инициатора K₂S₂O₈, взятого в количестве 2% масс. в расчете на мономер. Характеристики полученных частиц приведены в таблице 1.

Пример 2. Процесс проводят как в примере 1, но используют только 100 мкл НАФ (20 мг/мл), которые гидрофилизуют с помощью ТМАГ и добавляют в термостатированную колбу, содержащую 0,1 мл акролеина, 3,9 мл дистиллированной воды. Получают полимерную дисперсию со средним диаметром частиц 210 нм, выходом полимера 85%, концентрацией водорастворимых олигомеров 0,18 мг/мл и концентрацией альдегидных групп 52,4 мкМ/г полимера.

Пример 3. Процесс проводят как в примере 1, но используют только 100 мкл НАФ (20 мг/мл), которые по каплям добавляют к 1 мл 3% водного раствора ТМАГ, и две несмешивающиеся фазы тщательно перемешивают, затем помещают в ультразвуковую ванну на 15 мин. Получают полимерную дисперсию со средним диаметром частиц 194 нм, выходом полимера 88%, концентрацией водорастворимых олигомеров 0,2 мг/мл и концентрацией альдегидных групп 57,2 мкМ/г полимера.

Пример 4. Процесс проводят как в примере 1. Полученную полиакролеиновую дисперсию, содержащую апконвертирующие наночастицы, очищают от непрореагировавших компонентов центрифугированием при 10000 об/мин, заменяя надосадочную жидкость на дистиллированную воду, процедуру повторяют трижды, и затем заменяют надосадочную жидкость на фосфатно-солевой буфер pH 7,2.

К 200 мкл полученной дисперсии с концентрацией полимерных частиц 1% масс. добавляют 200 мкл 5% масс. водного раствора высокомолекулярного аминосодержащего компонента, такого как желатин, бычий сывороточный альбумин, овальбумин, полилизин, полиэтиленимин, полиаллиламин и др., и перемешивают при 20°С в течение 2 ч. Затем дисперсию очищают от непрореагировавших компонентов центрифугированием при 10000 об/мин, заменяя надосадочную жидкость на дистиллированную воду. Получают полимерные дисперсии с апконвертирующей флуоресценцией, содержащие поверхностные функциональные аминогруппы.

1. Способ получения функционализированных визуализирующих агентов с антистоксовой фотолюминесценцией в виде водной дисперсии полиакролеиновых частиц, содержащих наноразмерные антистоксовые фосфоры (НАФ), путем полимеризации акролеина в водно-щелочной среде, проводимой в две стадии, на первой из которых проводят осадительную полимеризацию, а на второй стадии полученный продукт подвергают дальнейшей радикальной полимеризации в присутствии водорастворимого инициатора К₂S₂O₈, отличающийся тем, что первую стадию полимеризации проводят в присутствии НАФ в количестве 0,1-1,5 мас.% в расчете на мономер, предварительно обработанных гидроксидом тетраметиламмония, которые используют в качестве инициатора полимеризации.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что поверхность полиакролеиновых частиц, содержащих НАФ, модифицируют путем добавления к полученной дисперсии водного раствора высокомолекулярного аминосодержащего компонента и перемешивания при 20°С в течение 2 ч, с образованием на поверхности функциональных амино- и карбоксильных групп.