Липосомный состав для купирования воспалительных заболеваний суставов

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и представляет собой липосомный состав для купирования воспалительных заболеваний суставов, содержащий дипальмитоилфосфатидилхолин, холестерин, гидрокортизон-ацетат, преднизолона гемисукцинат и физиологический раствор, причем компоненты состава находятся в определенном соотношении, в г. Изобретение обеспечивает высокое противовоспалительное действие и быстрое наступление положительного эффекта. 2 пр.

 

Изобретение относится к фармацевтическим средствам и может найти применение при лечении локальных воспалительных заболеваний, таких как обострение ревматоидного артрита, синовиит, тендовагинит, артроз.

В настоящее время для лечения локальных острых асептических воспалений наиболее широко используют нестероидные и стероидные противовоспалительные лекарственные препараты, препараты, модифицирующие антиревматоидные лекарственные средства, антибиотики, а также антагонисты цитокинов, такие как Фактор некроза опухолей, Итерлейкин-1, играющие существенную роль в патогенезе воспалительного процесса в суставе и разрушении хряща, покрывающего трущиеся внутрисуставные поверхности.

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) наиболее часто используют для лечения остеоартритов, ревматоидного артрита (РА) и мышечных болей. Они дают только симптоматический эффект, но не изменяют течение заболевания. Однако использование НПВП ограничивается высоким риском осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Эти осложнения вариабельны от желудочно-кишечного дискомфорта до жизни угрожающей пептидной язвы. Реже НПВП вызывают почечную и сердечно-сосудистую недостаточность, гипертензию, нарушения электролитного баланса, инфаркт миокарда и инсульт.

Глюкокортикоиды (ГК), такие как преднизолон, метилпреднизолон, гидрокортизон, триамцинолон и дексаметазон используют для купирования воспаления при РА и при других аутоиммунных заболеваниях. ГК характеризуются множественными механизмами действия: подавление накопления макрофагов, уменьшение проницаемости капилляров и др. Несмотря на то, что они являются наиболее мощными противовоспалительными соединениями, с быстрым началом действия, все они характеризуются тяжелыми побочными эффектами, включая атрофию кожи, остеопороз, мышечную атрофию, развитие катаракты и глаукомы, пептической язвы, манифестацию латентного диабета и даже преждевременную смерть. Для снижения этих серьезных осложнений используют внутрисуставное введение ГК, но и такой путь введения обладает системным эффектом, хотя и меньшим в сравнении с пероральным или парентеральным введением.

Препараты, модифицирующие антиревматоидные лекарственные средства (ПМАРЛ) - это синтетические препараты, первым среди них был метотрексат, который позволил улучшить результаты лечения РА. Он проявляет быстрый эффект, хорошо переносится больными, кроме того, характеризуется низкой стоимостью. Однако использование ПМАРЛ сопровождается многими побочными эффектами, в том числе дисбактериозом, дисфункцией печени, почек, ЖКТ и миелосупрессией.

В патогенезе обострений РА большую роль играет гиперпродукция цитокинов в суставной полости. Цитокины индуцируют деструкцию хряща на суставной поверхности. Поэтому в последнее время для лечения РА используют ингибиторы цитокинов, среди которых рассматривают этанерсепт (etanercept), инфликсмаб (infliximab), и другие. Используют и антагонист интерлейкина-6 - токилизумаб (tocilizumab). В целом можно утверждать, что использование перечисленных выше препаратов при пероральном и парентеральном применении требует больших доз, длительного применения и нередко сопровождается тяжелыми осложнениями, связанными с системными эффектами этих лекарственных соединений.

Одним из подходов, и на наш взгляд главным, к созданию лекарственных форм с новыми свойствами является инкапсулирование НПВП и ГК в микрокапсулы (липосомы, нанолипосомы, микросферы, наноэмульсии, наночастицы). Инкапсулирование предполагает две важные составляющие: существенное снижение системного эффекта этих препаратов за счет нахождения в месте введения (внутрисуставно) в виде депо и возможность снижения дозы за счет достижения высокой локальной концентрации вводимого в микрокапсулах вещества. Кроме того, эффект депонирования инкапсулированного соединения сочетается с медленным высвобождением действующего начала и соответствующей пролонгацией действия.

Липосомы представляют собой микрокапсулы из природных фосфолипидов, из которых формируются клеточные мембраны про- и эукариот, в том числе млекопитающих. В связи с этим одно из важнейших преимуществ липосом заключается в том, что их материал подвергается расщеплению или реутилизации по обычным циклам обмена и не накапливается в организме. Фосфолипиды используют в различных комбинациях с дополнением различных природных или синтетических соединений. В зависимости от технологии получения липосомы варьируют по величине (от 0,02 мкм до 2-3 мкм) и структуре. Они могут быть многослойными (мультиламеллярными), малыми униламеллярными величиной вплоть до 0,02 мкм и большими (0,2-3,0 мкм) - олигослойными. В мультиламеллярных липосомах, получаемых способом эмульгирования сухой липидной пленки водным раствором, содержащим инкапсулируемое водорастворимое соединение, захват вещества в водную фазу мал (до 2-3%), так как водное пространство между липидными слоями составляет от 24 до 140 ангстрем в зависимости от фосфолипидного состава. В больших олигослойных липосомах, получаемых, например, методом обращения фаз, водное пространство достаточно велико (0,2-2,8 мкм) и захват вещества в них может достигать 50-60%.

Имеется достаточно большое число экспериментальных исследований по оценке эффективности внутривенного и внутрисуставного введения липосомных форм НПВП, содержащих индометацин, кетанол, диклофенак и гидрокортизон (ГН).

Во всех случаях публикации касались исследований индуцированного у мышей или кроликов асептического артрита.

Наиболее перспективными для целей пролонгирования противовоспалительного эффекта и снижения дозы НПВП и ГК нам представляются температурно-чувствительные липосомы, так как они могут представлять собой депо, активирующееся многократно, циклически в зависимости от температуры в суставе или зоне воспаления (периартрально). Настоящее изобретение касается исследования эффективности именно температурно-чувствительных липосомных форм противовоспалительных средств с целью использования их для внутрисуставного введения.

В ряде случаев такие липосомы конструируют из смесей фосфолипидов, характеризующихся различной температурой фазовых переходов. Например, липосомы из дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ), характеризующегося температурой фазового перехода Тс=41,5°С, смеси ДПФХ и димиристоилфосфатидилхолина (Тс=12°С)-28°-34°С, а ДПФХ и дистеароилфосфатидилхолина (Тс=58°С)-44°С-56°С. Однако фосфолипиды (фосфоглицериды - ДМФХ и ДСФХ) достаточно дороги.

Известны экспериментальные исследования по изучению противовоспалительного эффекта НПВП и ГК в липосомах из различных смесей липидов, таких как дипальмитоилфосфатидилхолин (ДППС) и фосфатидная кислота (ФК), дистеароилфосфатидилхолин (ДСФХ) и ФК, димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ), ДСФХ и ФК.

При использовании температурно-чувствительных липосом, содержащих НПВП или ГК, реализуется циклически изменяющаяся структура липосом с жидкокристаллического на твердокристаллическое состояние при переходе через температуру фазового перехода (Тс). В зоне такого перехода мембрана липосом нестабильна, эффективно взаимодействует с клетками воспаления (моноцитами, нейтрофилами), а находящееся в мембране липосом противовоспалительное соединение подавляет активность этих клеток. При подавлении воспалительной реакции температура в суставе (или зоне воспаления) падает, например, до 36°С, и липосомы переходят в твердокристаллическое состояние, и в этом состоянии НПВП или ГК не активны. Новый подъем температуры переводит температурно-чувствительные липосомы в метастабильное состояние и действующее начало вновь оказывает противовоспалительный эффект. Несколько таких циклов приводят к полному купированию обострения ревматоидного артрита.

Ранее нами был изучен препарат термочувствительных липосом, состоящий из ДПФХ и холестерина в молярном отношении 1:0,2-1:0,25, содержащий в мембране липосом гидрокортизон-ацетат (ГН-ац) для лечения ревматоидного артрита [Розенберг О.А., Патент РФ №2078564, A51K /127], взятый нами в качестве прототипа.

Препарат на модели асептического артрита у кроликов показал возможность пролонгирования экспериментального артрита коленного сустава на 5 суток в сравнении со свободным ГН-ац, причем в дозе, в 10 раз меньшей, чем обычно применяющаяся форма гидрокортизон-ацетата, дающая кратковременный противовоспалительный эффект на этой же модели.

Этот препарат имеет следующий состав в г:

ДПФХ	1,6-2,0
Холестерин	0,2-0,25
Гидрокортизон-ацетат	1,8-2,2
Физиологический раствор	до 100 мл

В пилотных ограниченных клинических испытаниях у 20 больных было показано, что этот препарат позволяет путем однократной внутрисуставной инъекции купировать симптомы обострения ревматоидного артрита, причем доза ГН-ац составляла одну пятую от обычно применяемой дозы его в свободном виде.

Однако такой препарат, как оказалось, имел один серьезный недостаток: медленное начало его действия. Снижение температуры над суставом кролика с индуцированным асептическим артритом наступало только на вторые сутки после инъекции препарата в сустав (то же самое наблюдалось и у больных людей), что снижало его эффективность.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении эффективности липосомного препарата за счет дополнительного введения в водную фазу липосом преднизолона гемисукцината и увеличения содержания липидов в объеме эмульсии.

Этот результат достигается тем, что известный липосомный препарат для купирования асептического воспаления, содержащий ДПФХ, холестерин и гидрокортизон-ацетат, согласно изобретению дополнительно содержит преднизолона гемисукцинат при следующем соотношении ингредиентов, г:

ДПФХ	2,40-3,75
Холестерин	0,3-0,375
Гидрокортизон-ацетат	1,2-1,8
Преднизолона гемисукцинат	1,5-2,0
Физиологический раствор	до 100,0 мл

Занимаясь профессионально в течение многих лет изучением свойств липосомных препаратов и имея опыт создания липосом различного состава с получением при этом положительных свойств их, мы попробовали сконструировать липосомы с введением в их состав дополнительного противовоспалительного препарата, причем введением его в водную фазу.

В качестве такого препарата мы выбрали гидрофильное противовоспалительное соединение - преднизолона гемисукцинат, который, как показали наши экспериментальные наблюдения, проявлял противовоспалительный эффект уже через 6 часов после внутрисуставного введения. Такой ускоренный противовоспалительный эффект связан, на наш взгляд, с тем, что липосомы сразу при попадании в полость сустава взаимодействуют с клетками иммунологического ряда (лейкоцитами, моноцитами), что могло привести к увеличению проницаемости мембраны липосом и выходу преднизолона гемисукцината в полость сустава, с чем, по-видимому, и связан быстро наступающий противовоспалительный эффект. Этот феномен нам удалось зафиксировать с помощью тепловизора. Температура над суставом начала снижаться уже через 6-8 часов после введения препарата в сустав.

Поскольку соотношение ДПФХ и холестерина 1:0,2 молярное в готовом препарате обеспечивает циклическое изменение свойств мембраны липосом, при изменении температуры в суставе (или периартикулярно) с повышенной, 39-40°С, на нормальную - 37-38°С для кролика, в этот момент температурно-чувствительные липосомы переходят в твердокристаллическое состояние. Мембранная составляющая противовоспалительного препарата (гидрокортизон-ацетат) при этом, на наш взгляд, не взаимодействует с клетками и потому не влияет на изменение температуры. В то же время гидрофильное (водорастворимое) соединение - преднизолона гемисукцинат, по-видимому, продолжает вытекать из липосом по градиенту концентрации, подавляя активность нейтрофилов и замедляя активацию воспаления. Когда температура в суставе все же достигает температуры выше 37-38°С и мембрана липосом вновь перейдет в метастабильное состояние, гидрофобное противовоспалительное соединение (гидрокортизон-ацетат) тоже начинает подавлять активность нейтрофилов и температура вновь падает. А содержащийся в липосомах преднизолона гемисукцинат продолжает вытекать и дополнительно подавлять воспаление.

Используемое высокое содержание липидов в эмульсии, а именно ДПФХ (2,40-3,75 г) и холестерина (0,3-0,375 г), в предлагаемом нами липосомном составе обеспечивает максимально возможное количество липосом (везикул) в вводимом в сустав объеме эмульсии, что определяет высокий депонирующий эффект инкапсулированного преднизолона гемисукцината в нем, обеспечивая постепенное выделение его в полость сустава и придавая липосомному составу дополнительный пролонгированный противовоспалительный эффект.

Получение и противовоспалительный эффект предлагаемого липосомного состава поясняется примерами.

Пример 1.

Содержание ингредиентов следующее, г:

ДПФХ	2,40
Холестерин	0,3
Гидрокортизон-ацетат	1,2
Преднизолона гемисукцинат	1,0
Физиологический раствор	до 100,0 мл

В круглодонную колбу вносили 2,4 г ДППС, 0,3 г дважды перекристаллизованного холестерина и 1,2 г гидрокортизон-ацетата в хлороформе. Хлороформ удаляли на ротационном испарителе. Далее помещали колбу в эксикатор и выдерживали под вакуумом при остаточном давлении 0,5 мм рт.ст. в течение 2 ч для удаления следов органических растворителей. Затем растворяли липиды пленки, содержащие гидрофобный гидрокортизон-ацетат, в 150 мл свежеперегнанного диэтилового эфира, переносили в колбу на 0,5 литра (шлиф №14), вносили 1,0 г преднизолона гемисукцината в 100 мл физиологического раствора, обрабатывали систему ультразвуком на приборе УЗДН-1 с мощностью 22 кГц в течение 15 секунд при температуре +4°С под защитой нейтрального газа аргона (ХЧ). Процедуру повторяли 4 раза (суммарная обработка ультразвуком - 1 минута). Полученную обратную эмульсию (вода в масле) переводили в прямую путем удаления органического растворителя (диэтилового эфира) на ротационном испарителе. Расфасовывали полученную эмульсию по 2 мл во флаконе и укупоривали в атмосфере аргона резиновыми пробками и завальцовывали алюминиевыми колпачками. Срок хранения составил 1 год при 4°С.

Воспалительную реакцию в суставе регистрировали с помощью тепловизора ТВ-03 "Кольцо" с черно-белым изображением видеоконтрольного устройства, с температурной разрешающей способностью 0,2°С, с диапазоном возможного улавливания температуры от 20 до 200°С и выносным эталоном +32°С.

Препарат вводили кролику внутрисуставно в коленный сустав в объеме 0,4 мл на высоте асептического воспаления через трое суток после индукции артрита смесью поли-D-лизина и гиалуроновой кислоты. Температура над областью сустава на высоте воспаления составляла 39,5°С. Через 6 часов после введения препарата температура упала до 37,5°С и держалась на этом уровне в течение 10 суток (до 13 суток от начала введения препарата) с подъемами до 38°С на 6, 8 и 11 сутки.

Пример 2.

Состав липосом, г:

ДПФХ	3,75
Холестерин	0,375
Гидрокортизон-ацетат	1,8
Преднизолона гемисукцинат	2,0
Физиологический раствор	до 100,0 мл

Получение состава проводилось аналогично примеру 1. Полученные результаты испытания его на кроликах аналогичны.

Таким образом, созданный нами липосомный состав обладает высоким противовоспалительным действием и по сравнению с прототипом имеет ряд преимуществ, основным из которых является быстрое (через 6 часов от начала введения в сустав) наступление противовоспалительного эффекта и пролонгирование его до 10 суток, что дает нам уверенность на получение таких результатов и при проведении клинических испытаний. Липосомный препарат по прототипу (также на кроликах) начинал действовать лишь на вторые сутки и противовоспалительный эффект удерживался в течение 6 суток. Это свидетельствует о значительных преимуществах предлагаемого нами нового препарата.

Предлагаемый липосомный состав в настоящее время проходит широкие доклинические исследования эффективности и безопасности и готовится документация для подачи ее в Росздрав для получения разрешения на проведение клинических испытаний.

Препарат разработан в лаборатории медицинской биотехнологии РНЦ РХТ, к настоящему времени прошел экспериментальное изучение его свойств в сравнении с прототипом и выявил значительное повышение противовоспалительного действия с быстрым наступлением положительного эффекта.

Липосомный состав для купирования воспалительных заболеваний суставов, состоящий из дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ), холестерина, гидрокортизон-ацетата, преднизолона гемисукцината и физиологического раствора при следующем соотношении ингредиентов, г:

ДПФХ	2,40-3,75
Холестерин	0,3-0,375
Гидрокортизон-ацетат	1,2-1,8
Преднизолона гемисукцинат	1,5-2,0
Физиологический раствор	до 100,0 мл