Способ и микрофлюидный чип для культивирования клеток или клеточной модели

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен микрофлюидный чип и способ для культивирования клеток или клеточной модели в данном микрофлюидном чипе. Микрофлюидный чип включает микрофлюидные каналы с клапанами для перекрытия каналов, ячейку для культивирования, рабочую камеру с мембраной и средство создания постоянного давления в замкнутом контуре циркуляции. Причём мембрана выполнена с возможностью изменения объема рабочей камеры. Рабочая камера, клапаны и входная часть ячейки соединены микрофлюидными каналами с образованием замкнутого контура циркуляции питательной среды. Рабочая камера с клапанами и микрофлюидными каналами представляет собой насос-маршрутизатор. Способ включает заполнение микрофлюидных каналов и ячейки питательной средой, размещение вставки с клетками или клеточной моделью в ячейке культивирования. При этом в контуре циркуляции создают постоянное давление и пульсирующее течение питательной среды. Изобретения обеспечивают возможность моделирования в микрофлюидном чипе гидродинамическую составляющую микроциркуляции in vivo, а также моделирования системного ответа организма. 2 н. и 37 з.п. ф-лы, 15 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии, а именно, к устройствам для культивирования и/или исследования клеток человека, животных, растений и/или культур вирусов, и может быть использовано для воспроизведения in vitro гидродинамических аспектов микроциркуляции in vivo в исследовательских целях, в т.ч. необходимых для разработки и проведения испытаний лекарственных препаратов и способов их доставки, научно-исследовательских работах и т.п.

Заявляемый микрофлюидный чип предусматривает возможность сокультивирования различных клеточных моделей (клеток различных органов и тканей млекопитающих), а также использования первичного материала, например, полученного из резекций или биопсий, что позволяет использовать чип при разработке лекарственных препаратов (в т.ч. в качестве модели «человек-на-чипе» или «орган-на-чипе») и в персонализированной медицине.

Уровень техники

Транспорт веществ к клеткам организма, обмен растворенными веществами с клетками и отвод веществ от клеток осуществляется внеклеточными жидкостями, 90% объема которых приходится на плазму крови, интерстициальную (межклеточную) жидкость и лимфу. Интерстициальная жидкость и лимфа составляют около 80% этого объема, а плазма крови - всего 20%. Причем плазма и лимфа в основном выполняют транспортную функцию, а интерстициальная жидкость - участвует в обмене веществ.

Важным фактом, ставшим известным сравнительно недавно, является то, что обусловленная повышенным давлением в капиллярах фильтрация, т.е. поступление жидкости из плазмы крови в ткань, идет практически на всем протяжении капилляров, а не только на артериальных участках. Таким образом, наибольшая доля объема интерстициальной жидкости в норме отводится лимфатической системой [Adamson R.H. и др. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels // J. Physiol. 2004. T. 557. №3. C. 889-907.]

Среди известных пассивных механизмов, обеспечивающих транспорт веществ, можно выделить два основных: диффузию и адвекцию. Диффузия по большей части обеспечивает проникновение из капилляров в межклеточное пространство (интерстициальную область) ткани глюкозы, аминокислот, кислорода, а также вывод углекислого газа и других продуктов обмена веществ. Адвекция служит для переноса низкомолекулярных гидрофильных соединений и обусловлена разностью осмотических и гидростатических давлений в капилляре и межклеточном пространстве. Этими же механизмами обеспечивается доставка большинства лекарственных препаратов.

Процессы диффузии и адвекции зависят не только от осмотического и гидростатического давления, но и являются периодическими временными процессами, обусловленными гидродинамическими факторами, в частности артериальной сосудодвигательной функцией и насосной функцией сердца [Jain R.K. Transport of Molecules in the Tumor Interstitium: A Review // Cancer Res. 1987. T. 47. №17. C. 3039-3051.] Циклическое изменение гидростатического давления, обусловленное движением жидкости, и сопутствующие ему механические воздействия играют важную роль в регуляции молекулярно-биологических процессов клетки, в частности, влияют на экспрессионный профиль и выработку экстрацеллюлярного матрикса, способствуя формированию полноценной ткани. Самой важной разновидностью механических воздействий, обеспечивающей активацию соответствующих сигнальных путей, являются касательные напряжения, создаваемые движением жидкости вдоль поверхности клеток или через образованную ими пористую структуру - межклеточное пространство. При моделировании механических воздействий in vitro их характер и интенсивность зависят от моделируемого органа или ткани. Также существуют подтвержденные экспериментально сведения о том, что специфичные механические воздействия на клетки могут способствовать решению одной из наиболее значимых и сложных задач биологии - направленной дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток [Chen Н.С., Hu Y.C. Bioreactors for tissue engineering // Biotechnol. Lett. 2006. T. 28. №18. C. 1415-1423].

Наиболее простыми и распространенными системами для культивирования клеток являются статические in vitro системы, по сути представляющие собой чашки Петри различных размеров и форм. Основным недостатком статических систем является ограничение транспорта веществ диффузией, что в совокупности с высокой трудоемкостью обслуживания приводит к тому, что клеточные модели проводят часть времени в среде, избыточно насыщенной питательными веществами, а часть - в истощенной, но наполненной продуктами жизнедеятельности клеток. Динамические системы, то есть системы обеспечивающие транспорт веществ адвекцией (в процессе циркуляции или перемешивания среды каким-либо другим способом), лишены данного недостатка.

Очевидно, что чем лучше in vitro система воспроизводит условия in vivo, тем в большей степени полученные на ней результаты будут отражать свойства моделируемой in vivo системы. Из уровня техники известны in vitro системы (биореакторы) на основе микрофлюидных чипов (микрожидкостных систем) для культивирования клеток, моделирования тканей и органов человека, которые в отличие от промышленных биореакторов, предназначены для максимально полного и правдоподобного воспроизведения физиологических условий in vivo, например, рН культуральной среды, концентрацию кислорода, удаление продуктов метаболизма, поддержание состава культуральной среды, формирование физиологичных механических воздействий. В зависимости от решаемой задачи этот список может быть существенно расширен. Для указанных целей нередко используются микрофлюидные чипы с ячейками для культивирования клеток объемом менее 1 мл, объединенными сетью каналов диаметром менее 1 мм [Ashraf M.W., Tayyaba S., Afzulpurkar N. Micro Electromechanical Systems (MEMS) Based Microfluidic Devices for Biomedical Applications // Int. J. Mol. Sci. 2011. T. 12. №12. C. 3648-3704.].

Несмотря на то, что микрофлюидные чипы из-за малого объема культивируемых клеток повышают требования к чувствительности аналитических методов, во многих случаях их применение оправдано возможностью получения более точных и достоверных результатов исследований на клеточных моделях по сравнению с традиционными статическими in vitro системами. В большинстве случаев микрофлюидные чипы изготавливают из полидиметилсилоксана (ПДМС) или полистирола. Реже используются другие полимерные материалы или стекло. ПДМС обладает рядом полезных свойств, в частности, высокой эластичностью, оптической прозрачностью, низкой интенсивностью флуоресценции, высокой газопроницаемостью, биологической инертностью [Halldorsson S. и др. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices // Biosens. Bioelectron. 2015. T. 63. C. 218-231.]. Обычно питательная среда подается в микрофлюидный чип извне с помощью плунжерных насосов. Реже движение жидкости обусловлено центробежной силой, смачиванием, или встроенным в микрофлюидный чип насосом. Применение эластичных материалов, таких как ПДМС, позволяет изготавливать микрофлюидные чипы со встроенными микронасосами и клапанами для управления движением жидкости по системе каналов. Как правило, такие устройства управляются пневматически. Варианты конструктивного решения микрофлюидных чипов с активными компонентами хорошо описаны в материалах патентов US 7445926, US 6793753, US 7258774, US 7766033 и US 8763642.

Важным свойством, присущим только небольшому числу известных конструкций микрофлюидных биореакторов, является наличие замкнутого контура циркуляции питательной среды. Дело в том, что при упомянутых объемах ячеек концентрация метаболитов в системе с проточной ячейкой для культивирования может быть ниже на несколько порядков, чем в статической системе или системе с замкнутым контуром, что обусловлено однократной экспозицией культуральной среды в проточной системе и приводит к неприменимости данных систем для анализа широкого спектра метаболитов стандартными методами. Кроме того, применение в динамических микрофлюидных биореакторах замкнутого контура циркуляции позволяет проводить сокультивирование моделей различных органов и тканей, таким образом, моделируя транспорт веществ между различными органами и тканями организма.

В целом, моделирование микроциркуляции in vitro требует решения ряда сложных не связанных напрямую задач, принадлежащих к различным областям знания. Исходя из вышесказанного, можно выделить в качестве актуальной независимой задачи моделирование in vitro в микрофлюидном чипе с замкнутым контуром циркуляции гидродинамической составляющей микроциркуляции, а именно: постоянной составляющей разности давлений на участке ткани между кровеносным и лимфатическим сосудами и обусловленного деятельностью сердца пульсирующего движения крови в кровеносном сосуде, в частности пульсирующего изменения давления и адвективного массопереноса веществ в кровеносном сосуде и упомянутом участке ткани.

Несмотря на активное развитие техники в этой области, из уровня техники не известно систем, обеспечивающих воспроизведение в микрофлюидном чипе с замкнутой циркуляцией питательной среды сочетания постоянной составляющей разности гидродинамических давлений и пульсирующего характера течения питательной среды и разности давлений. При этом все известные системы обладают рядом недостатков, не позволяющих их широко применять на практике.

Из уровня техники известно устройство для механической стимуляции клеток (US 4851354), позволяющее изучать клетки в культуре в условиях, воспроизводящих механические воздействия, наблюдаемые in vivo. Устройство содержит герметичную ячейку, имеющую оптически прозрачное эластичное основание из биосовместимого материала, на котором упомянутые клетки могут выращиваться, и оптически прозрачную съемную крышку, а также находящийся под основанием встроенный герметичный прозрачный резервуар, заполненный жидкостью с возможностью циклического изменения гидростатического давления, деформирующего эластичное основание, и, следовательно, создающего равномерное напряжение на прикрепленным к этому основанию клеткам.

Существенный недостатком описанной конструкции является тот факт, что она не позволяет создавать разность давлений на клеточной модели, а, следовательно, не позволяет моделировать разность давлений и адвективный транспорт веществ в участке ткани.

Также известен аппарат для культивирования клеток, содержащий двумерную плашку, имеющую эластичные газопроницаемые мембраны на двух противоположных стенках, предназначенные для культивирования клеток под давлением, и два располагаемых на соответствующих противоположных сторонах плашки приспособления, имеющие зеркально-симметричную форму и включающие в себя рамки с жесткой структурой, поддерживающие мембраны плашки, предотвращая их избыточное деформирование (US 7422893). Плашка фиксируется между приспособлениями посредством соединений шип-паз. Аппарат содержит порт для подачи переменного или постоянного гидростатического давления. Возможен вариант выполнения, при котором аппарат содержит второй порт, например для организации течения питательной среды через плашку. Возможен вариант, при котором аппарат содержит компьютеризированное устройство для генерации переменного гидростатического давления в одной или нескольких плашках, включающее двунаправленный плунжерный насос с цифровым управлением и контроллер, запрограммированный на управление движением плунжера насоса. Недостатком описанного аппарата является отсутствие возможности моделирования разности давлений и адвективного транспорта веществ в участке ткани, поскольку применяемые мембраны непроницаемы для жидкости.

Известен аппарат, состоящий из плашки, содержащей несколько заполненных питательной средой лунок с мембранами, закрепленной под ней перфорированной пластины, а также крышки, создающей давление посредством пробок со скошенным основанием (US 7435587). Пробки могут иметь различную длину или завинчиваться в крышку для регулирования величины создаваемого давления, а также могут иметь уплотнительное кольцо и прорезь для удаления воздуха при установке в лунки плашки.

Основным недостатком данного аппарата является отсутствие возможности моделирования разности давлений и адвективного транспорта веществ также по причине того, что применяется непроницаемая для жидкости мембрана. Другим существенным недостатком является отсутствие движения питательной среды (адвекции) в лунках.

Наиболее близкой к предлагаемому техническому решению является система для тестирования лекарственных препаратов US 2013/0295601 (А1), моделирующая микроокружение трехмерных клеточных структур, например опухолей. Система состоит из нижней панели, включающей емкость для культивирования клеточной модели, имеющую отверстия для прокачивания через нее жидкости (питательной среды), и как минимум один боковой канал, моделирующий сосуд лимфатической системы, частично проходящий вдоль упомянутой емкости, и соединенный с ней отверстиями, позволяющими моделировать интерстициальный транспорт в/из лимфатического канала; мембраны с нанопорами, закрывающей упомянутую емкость сверху и позволяющей моделировать транспорт через эндотелий сосуда; верхней панели, расположенной над мембраной и содержащей канал, моделирующий сосуд кровеносной системы, по крайней мере, частично проходящий вдоль емкости для культивирования. Все перечисленные каналы и емкость для культивирования позволяют осуществлять подключение чего-либо к их противоположным концам, например, емкостей или насосов, тем самым позволяя организовать в них течение жидкости. Мембрана может быть покрыта слоем эндотелиальных клеток. Система позволяет проводить оценку количества живых и мертвых клеток с помощью наблюдения оптическими методами.

В одном из вариантов осуществления данного изобретения к входу каждого канала подключен насос или емкость, создающие давление, позволяя в зависимости от канала моделировать давление в ткани, кровеносной или лимфатической системе, соответственно, а выходы каналов подключены к емкости для отработанной жидкости. Возможен вариант, при котором к выходу одного или нескольких каналов вместо емкости для отработанной жидкости также подключен насос или емкость, создающие определенное давление. Система в первую очередь предназначена для моделирования транспорта (доставки) препаратов химиотерапии, основанного на применении наночастиц.

Существенным недостатком данной системы является ее проточный характер, т.е. отсутствие замкнутого контура циркуляции среды, вследствие чего, в отличие от статических систем или систем с замкнутым контуром циркуляции, из-за низких концентраций невозможно исследование стандартными методами молекулярной биологии множества продуцируемых клеточной моделью метаболитов. По этой же причине усложняется исследование в данной системе фармакокинетики и фармакодинамики лекарственных препаратов.

Другой недостаток данной системы обусловлен тем, что загрузка клеток в емкость и извлечение из нее может производиться только через соответствующий канал, поскольку конструкция не предусматривает возможности непосредственного доступа к модели, в т.ч. применения стандартных сменных вставок с мембранами (например, Transwell производства Corning, или подобных), что делает систему существенно менее удобной в работе. По этой же причине невозможно осуществить подготовку клеточной модели вне системы с последующим переносом ее в систему, что увеличивает стоимость проведения исследования, поскольку на практике значительный процент подготавливаемых клеточных моделей могут иметь дефекты.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является создание микрофлюидного чипа для культивирования клеточных моделей in vitro с замкнутой циркуляцией питательной среды, позволяющего более полно и точно моделировать in vitro условия существования (микроокружение) клеток in vivo, что позволяет при проведении экспериментов на культивируемых в чипе клеточных моделях получать результаты более точно и полно предсказывающие реакцию моделируемого организма.

Технический результат изобретения заключается в возможности моделировать в микрофлюидном чипе для культивирования клеточных моделей in vitro в замкнутом контуре циркуляции питательной среды гидродинамическую составляющую микроциркуляции in vivo, а именно: постоянную составляющую разности давлений на участке ткани между кровеносным и лимфатическим сосудами и обусловленное деятельностью сердца пульсирующее движение крови в кровеносном сосуде, и, как следствие, пульсирующее механическое воздействие на упомянутый участок ткани, а также пульсирующее изменение давления и адвективный перенос веществ в упомянутом участке ткани и кровеносном сосуде.

Кроме того, дополнительными техническими результатами заявляемого изобретения являются: моделирование системного ответа организма благодаря возможности сокультивирования нескольких клеточных моделей, удобство работы и возможность предварительного культивирования модели в планшете в статических условиях вследствие применения вставок, высокая надежность и технологичность за счет применения многослойной конструкции, включающей верхнюю пластину, обеспечивающую механическую прочность.

Поставленная задача решается тем, что микрофлюидный чип для культивирования клеток включает корпус, выполненный из соединенных, по крайней мере, двух, верхней и нижней, пластин, в котором расположены: микрофлюидные каналы, снабженные, по крайней мере, первым и вторым клапанами, выполненными с возможностью перекрытия каналов; по крайней мере, одна ячейка для культивирования, выполненная с возможностью герметичного размещения в ней вставки с клеточной моделью, делящей ячейку на входную и выходную части; рабочая камера, образованная частью микрофлюидного канала между первым и вторым клапанами по ходу движения питательной среды, и снабженного мембраной, выполненной с возможностью изменения объема рабочей камеры, при этом первый клапан, рабочая камера, второй клапан, входная часть ячейки для культивирования соединены микрофлюидными каналами с образованием замкнутого контура циркуляции питательной среды, а клапаны, рабочая камера и микрофлюидные каналы выполнены с возможностью создания пульсирующего течения питательной среды; средство создания постоянного давления в замкнутом контуре циркуляции, подключенное к контуру циркуляции на участке между вторым и первым клапанами по ходу движения питательной среды.

Микрофлюидный чип дополнительно может содержать размещенную в корпусе, по крайней мере, одну емкость сбора фильтрата, подключенную к выходной части ячейки для культивирования клеточной модели. Емкость сбора фильтрата может быть выполнена сообщающейся с атмосферой посредством выполненного в корпусе канала, в котором может быть размещен фильтрующий элемент. Емкость сбора фильтрата представляет собой полость в корпусе, которая может быть снабжена мембраной, выполненной с возможностью изменения объема расположенной под мембраной полости. Емкость сбора фильтрата может содержать датчик, выполненный с возможностью оценки объема фильтрата. Кроме того, емкость сбора фильтрата может быть соединена с рабочей камерой посредством отдельного микрофлюидного канала.

В предпочтительном варианте выполнения средство создания постоянного давления содержит мембрану, размещенную в выполненной в корпусе полости, соединенной с контуром циркуляции, при этом мембрана выполнена с возможностью изменения объема полости, расположенной под мембраной, которое может быть реализовано различными средствами, например, размещенным на мембране грузом соответствующей массы, или средством пневматического или гидравлического воздействия на мембрану, или с помощью соленоида, закрепленного на корпусе, с размещением его якоря на мембране, или с помощью магнита и ферромагнетика, или двух притягивающихся или отталкивающихся магнитов, размещенных на мембране и корпусе. В другом варианте исполнения средство создания постоянного давления выполнено в виде расположенной вертикально трубки с размещенной в ней жидкостью с требуемой высотой столба, нижняя часть которой выполнена сопряженной с микрофлюидным каналом контура циркуляции, а верхняя - сообщающейся с атмосферой.

Средство создания постоянного давления может быть подключено к контуру циркуляции до или после ячейки для культивирования по ходу движения питательной среды. При реализации первого варианта, микрофлюидные каналы имеют геометрию, обеспечивающую отношение гидродинамического сопротивления каналов на участке контура циркуляции между первым клапаном по ходу движения среды и ячейкой для культивирования к гидродинамическому сопротивлению каналов между ячейкой для культивирования и средством создания постоянного давления в диапазоне от 10:1 до 200:1. Для второго варианта подключения средства создания постоянного давления данное соотношение должно выполняться для участка контура циркуляции между вторым клапаном по ходу движения среды и ячейкой для культивирования, и участка контура между ячейкой для культивирования и средством создания постоянного давления, соответственно. Предпочтительно средство создания постоянного давления выполнено с возможностью создания постоянного давления в контуре циркуляции в диапазоне от 0 до 7 кПа.

Микрофлюидный чип может содержать дополнительное средство создания постоянного давления - постоянного давления в выходной части ячейки, размещаемое в емкости сбора фильтрата которое выполнено по аналогии основным, конструктивные особенности которого перечислены выше.

Микрофлюидный чип может дополнительно содержать емкость для «исходной» питательной среды и емкость для сбора «отработанной» среды, размещенные за пределами корпуса и подключенные к рабочей камере через отдельные микрофлюидные каналы, снабженные клапанами для подключения или отключения упомянутых емкостей.

Предпочтительно верхняя пластина корпуса выполнена из полистирола, полидиметилсилоксана или поликарбоната, а нижняя пластина выполнена из полистирола или стекла.

Корпус микрофлюидного чипа может содержать дополнительную эластичную пластину, расположенную между верхней и нижней пластинами, при этом клапаны, мембрана рабочей камеры, микрофлюидные каналы могут быть выполнены в эластичной пластине с обеспечением герметизации каналов посредством нижней пластины. В другом варианте осуществления изобретения микрофлюидные каналы выполнены в верхней и/или нижней пластине, а функцию клапанов и мембраны рабочей камеры выполняют фрагменты эластичной пластины. Возможен также вариант реализации изобретения, в котором микрофлюидные каналы выполнены в верхней и/или нижней пластине, а мембрана рабочей камеры и клапаны выполнены в виде отдельных эластичных элементов, установленных между пластинами, причем соединение упомянутых пластин и эластичных элементов выполнено с обеспечением герметичности микрофлюидных каналов. Предпочтительно мембрана рабочей камеры и клапаны выполнены из полидиметилсилоксана или других эластомеров и имеют толщину, выбранную из диапазона от 0.01 до 1 мм, с возможностью гидравлического или пневматического управления.

Ячейка для культивирования образована выполненным в корпусе отверстием и снабжена крышкой. Крышка может быть выполнена с возможностью введения через нее различных растворов и отбора проб циркулирующей питательной среды или фильтрата. Кроме того, микрофлюидный чип может содержать, по крайней мере, одну соединенную с контуром циркуляции дополнительную ячейку для культивирования.

Заявляемый микрофлюидный чип помимо первого и второго может содержать несколько дополнительных клапанов, например, один из которых может быть расположен в контуре циркуляции питательной среды между средством создания постоянного давления и ячейкой для культивирования для предотвращения вытекания питательной среды из ячейки при установке, либо извлечении вставки из ячейки. В другом варианте средство создания постоянного давления может быть подключено к контуру циркуляции через отдельный микрофлюидный канал, снабженный дополнительным клапаном для подключения или отключения упомянутого средства. Другой дополнительный клапан может быть расположен в микрофлюидном канале, соединяющем емкость сбора фильтрата с рабочей камерой. Кроме того, при отсутствии емкости сбора фильтрата, выходная часть ячейки для культивирования может быть соединена с рабочей камерой посредством отдельного микрофлюидного канала, также снабженного еще одним дополнительным клапаном.

Помимо перечисленных датчиков, предпочтительно, чтобы микрофлюидный чип содержал датчик давления в контуре циркуляции.

Микрофлюидный чип может дополнительно содержать порт для забора образцов питательной среды или внесения растворов препаратов, подключенный к контуру циркуляции или рабочей камере посредством микрофлюидного канала.

Микрофлюидные каналы, клапаны и рабочая камера в наилучшем варианте реализации изобретения выполнены с возможностью создания течения питательной среды в контуре циркуляции со значением среднего объемного расхода, выбранного из диапазона от 0 до 50 мкл/мин., а также создания пульсирующего течения питательной среды с пульсациями давления в ячейке для культивирования в диапазоне от 0 до 500 Па.

Поставленная задача решается также созданием способа культивирования клеточной модели в микрофлюидном чипе, согласно которому заполняют микрофлюидные каналы и ячейки для культивирования питательной средой, размещают вставку с клеточной моделью в ячейке для культивирования, после чего клеточную модель культивируют в условиях циркуляции питательной среды по замкнутому контуру, при этом в контуре циркуляции создают постоянное давление, моделирующее постоянную составляющую разности давлений на участке ткани между кровеносным и лимфатическим сосудами in vivo с помощью средства создания постоянного давления с обеспечением фильтрации питательной среды из входной части ячейки через клеточную модель в выходную часть ячейки, и пульсирующее течение питательной среды, моделирующее пульсирующее течение крови в кровеносном сосуде in vivo посредством открытия и закрытия первого и второго клапанов и изменения объема рабочей камеры.

Для моделирования в клеточной модели in vitro гидродинамической составляющей микроциркуляции солидной опухоли in vivo, дополнительно создают давление в выходной части ячейки от 0 до 2 кПа относительно атмосферного.

В одном из вариантов выполнения изобретения постоянное давление в контуре циркуляции создают с обеспечением превышения давления во входной части ячейки над давлением в выходной части на величину в интервале значений от 0 до 7 кПа в зависимости от моделируемого давления в капилляре in vivo. Пульсирующее течение питательной среды в замкнутом контуре обеспечивают с переменной составляющей давления во входной части ячейки для культивирования, с амплитудой импульсов из интервалов значений от 10 до 500 Па и длительностью от 50 до 1500 мс, которые выбирают в зависимости от моделируемой переменной составляющей давления в капилляре in vivo, посредством подачи соответствующих управляющих импульсов на первый и второй клапаны и мембрану рабочей камеры. Средняя скорость движения среды во входной части ячейки для культивирования лежит в интервале значений от 0.01 до 2.0 мм/с. Открытие и закрытие первого и второго клапанов, а также изменение объема рабочей камеры проводят циклически по алгоритму: ЗЗМ, ОЗМ, ОЗБ, ЗЗБ, ЗОБ, ЗОМ, соответственно, где З - клапан закрыт, О - клапан открыт, М - объем рабочей камеры снижен, Б - объем рабочей камеры увеличен.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 и 2 представлен вариант выполнения микрофлюидного чипа - общий вид и схема сборки, соответственно; на фиг. 3 представлен вид сверху на заявляемое устройство, где на местном разрезе представлен фрагмент, показывающий канал в верхней пластине, соединяющий емкость сбора фильтрата с ячейкой для культивирования клеточных моделей; на фиг. 4 представлено детализированное изображение фрагмента фиг. 3 в поперечном разрезе по линии В-В, где можно видеть устройство ячейки с установленной в ней мембранной вставкой с клеточной моделью; на фиг. 5 схематично представлен вариант конструктивного исполнения системы микрофлюидных каналов, выполненных в эластичной пластине (в планарном представлении), причем позиции 1, 3, 24, 26, 27, 48 показаны условно в местах проекций соответствующих элементов; на фиг. 6 изображен поперечный разрез одного из вариантов выполнения дополнительной ячейки (поз. 27 на фиг. 2); на фиг. 7 представлен поперечный разрез клапанов 25 и 10 и отверстия 26 для подключения емкости сбора среды; на фиг. 8 показан увеличено разрез клапана 25 с камерой управления и полостью микрофлюидного канала в закрытом (а) и открытом (б) состоянии; на фиг. 9 представлена временная диаграмма работы насоса (в каждой строке диаграммы схематично изображены сверху вниз: верхняя пластина, эластичная пластина с выполненными в ней клапанами/мембранами, микрофлюидный канал, в котором черной заливкой обозначено движение порции жидкости (питательной среды), нижняя герметизирующая пластина -предметное стекло), где T1-Т6 такты работы насоса; на фиг. 10 а) и б) показаны два варианта мембранной вставки: без фланца и с фланцем, соответственно; на фиг. 11 представлен в разрезе вариант конструкции средства создания постоянного давления на основе эластичной мембраны и груза; на фиг. 12 представлена гидравлическая принципиальная схема микрофлюидного чипа, где стрелками показано направление движения питательной среды, а пунктирным прямоугольником обозначены компоненты, в совокупности составляющие насос-маршрутизатор; на фиг. 13 показаны емкость с питательной средой и емкость сбора среды, на фиг. 14 представлен в разрезе вариант конструктивного решения средства создания постоянного давления на основе трубки; на фиг. 15 представлен вариант конструкции емкости сбора среды на основе деформируемой мембраны.

Позициями на чертежах обозначены:

1 - ячейка,

2 - модель, представленная, например, гидрогелем с клетками,

3 - емкость сбора фильтрата,

4 - трубка средства создания постоянного давления,

5 - входная часть ячейки,

6 - выходная часть ячейки,

7 - микрофлюидные каналы,

8 - первый клапан контура циркуляции,

9 - рабочая камера,

10 - второй клапан контура циркуляции,

11 - камеры управления клапанами и мембраной рабочей камеры,

12 - перегородка клапана,

13 - эластичная пластина корпуса (слой ПДМС),

14 - верхняя пластина корпуса,

15 - мембранная вставка,

16 - крышка ячейки,

17 - эластичный выступ ячейки,

18 - эластичное кольцо,

19 - канал, соединяющий ячейку и емкость сбора фильтрата,

20 - нижняя (герметизирующая) пластина корпуса,

21 - фильтр емкости сбора фильтрата,

22 - клапан емкости сбора фильтрата,

23 - клапан емкости с питательной средой,

24 - отверстие в корпусе для подключения емкости с питательной средой,

25 - клапан емкости сбора среды,

26 - отверстие в корпусе для подключения емкости сбора среды,

27 - дополнительная ячейка,

28 - трубки пневматического управления,

29 - мембрана средства создания постоянного давления,

30 - крышка дополнительной ячейки,

31 - манжета для герметизации трубки средства создания постоянного давления,

32 - быстросъемные фитинги для подключения трубок пневматического управления,

33 - миниатюрные штуцеры,

34 - трубка-капилляр к емкости с питательной средой,

35 - трубка-капилляр к емкости сбора среды,

36 - мембрана клапана,

37 - отверстие, соединяющее емкость сбора фильтрата с атмосферой,

38 - клапан средства создания постоянного давления,

39 - выступ на крышке,

40 - верхний эластичный выступ ячейки,

41 - мембрана мембранной вставки,

42 - емкость с питательной средой,

43 - емкость сбора среды,

44 - резиновая пробка стеклянного пузырька,

45 - полая игла с установленным в нее фильтром,

46 - груз средства создания постоянного давления,

47 - мембрана емкости сбора фильтрата,

48 - полость устройства поддержания давления.

Осуществление изобретения

В общем виде микрофлюидный чип для культивирования клеток включает корпус, выполненный из соединенных, по крайней мере, двух, верхней 14 и нижней (герметизирующей) 20, пластин с образованием многослойной структуры (фиг. 1, 2). В корпусе расположены микрофлюидные каналы 7, снабженные, по крайней мере, двумя клапанами 8, 10 выполненными с возможностью перекрытия каналов и, по крайней мере, одна рабочая камера 9 с мембраной, выполненной с возможностью изменения объема рабочей камеры (фиг. 5, 12). При выполнении корпуса из двух пластин каналы могут быть расположены в верхней и/или нижней пластине, при этом мембрана рабочей камеры 9 и клапаны 8, 10 и др. могут быть выполнены в виде отдельных эластичных элементов, закрепленных в корпусе между верхней 14 и нижней 20 пластинами, при выполнении корпуса из трех пластин - верхней 14, средней 13 из ПДМС (или другого эластомера) и нижней 20, каналы, клапаны и мембрана могут быть расположены в средней эластичной пластине 13 (фиг. 1, 2, 5, 7, 8).

Также чип содержит, по крайней мере, одну ячейку 1, выполненную с возможностью герметичного размещения в ней вставки 15, предназначенной для клеточной модели 2, делящей ячейку на входную 5 и выходную 6 части (фиг. 2, 4). К выходной части 6 ячейки подключена емкость сбора фильтрата 3 (фиг. 4).

Рабочая камера 9 соединена посредством микрофлюидных каналов 7 с клапанами 8 и 10 и с входной частью 5 ячейки 1 с образованием по крайней мере одного замкнутого контура циркуляции питательной среды (фиг. 5).

Чип также может содержать соединенные с контуром циркуляции дополнительные ячейки, например, ячейку 27 (фиг. 2, 6), не подключенные к емкости сбора фильтрата 3 (фиг. 4).

Также чип содержит средство создания постоянного давления (фиг. 11 или фиг. 14), соединенное полостью 48 с контуром циркуляции (фиг. 5). Соединение средства с контуром циркуляции может быть реализовано посредством отдельного микрофлюидного канала, причем для обеспечения удобства работы с клеточными моделями в упомянутом микрофлюидном канале или на участке между полостью 48 и ячейками 1, 27 может быть размещен клапан 38 средства создания постоянного давления.

Емкость сбора фильтрата 3 (фиг. 4) выполнена с возможностью подключения через клапан 22 к рабочей камере 9 (фиг. 5).

К рабочей камере 9 может быть подключена через клапан 23 емкость с питательной средой 42 (фиг. 5, 12, 13). К рабочей камере 9 также может быть подключена через клапан 25 емкость сбора среды 43 (фиг. 5, 12, 13).

Также к контуру циркуляции или рабочей камере 9 может быть подключен порт для забора образцов питательной среды или внесения растворов препаратов (на чертежах не показан). Подключение может производиться микрофлюидным каналом, в том числе через отдельный клапан.

Рабочая камера 9 в совокупности с подключенными к ней клапанами 8, 10, 22, 23 и 25 представляет собой насос-маршрутизатор, обеспечивающий перекачивание жидкостей в заданном направлении между любой парой упомянутых клапанов (фиг. 12).

В заявляемом устройстве микрофлюидный канал контура циркуляции, проходящий через входную часть ячейки 5, моделирует мелкий кровеносный сосуд. Формируемая средством создания постоянного давления постоянная составляющая давления и обусловленные работой насоса-маршрутизатора пульсирующее движение питательной среды и пульсации давления, соответственно, моделируют в чипе гидродинамические условия существования клеток в живом организме - постоянную составляющую давления в кровеносном сосуде, пульсирующее течение крови и пульсации давления, обусловленные деятельностью сердца. Выходная часть 6 ячейки 1, емкость сбора фильтрата 3 и соединяющий их канал 19 (см. фиг. 3, 4) в совокупности моделируют фрагмент лимфатической системы, обеспечивающий отвод интерстициальной жидкости из ткани под действием разности давлений.

Ниже представлены возможные варианты выполнения отдельных конструктивных элементов заявляемого микрофлюидного чипа.

Варианты решения корпуса микрофлюидного чипа и системы микрофлюидных каналов.

Для мелкосерийного производства предпочтителен вариант, в котором корпус представляет собой трехслойную структуру, включающую верхнюю пластину 14, например, выполненную фрезерованием из листа поликарбоната, нижнюю герметизирующую пластину 20, например, представляющую собой стандартное предметное стекло, и расположенную между ними эластичную пластину 13, выполненную, например, из ПДМС (фиг. 1, 2). Эластичная пластина 13 содержит систему микрофлюидных каналов 7, имеющую планарную структуру (фиг. 5) и герметизированную со стороны нижней поверхности эластичной пластины 13 нижней пластиной 20 (фиг. 6). При этом в эластичной пластине 13 выполнены мембраны рабочей камеры 9 и клапанов 8, 10, 22, 23, 25, 38 (фиг. 5). Верхняя пластина 14 может иметь отверстия 24 и 26 для подключения емкости с питательной средой 42 и емкости сбора среды 43, а также отверстия для ячеек 1 и 27, емкости сбора фильтрата 3, средства создания постоянного давления (трубки 4 на фиг. 14 или мембраны 29 на фиг. 11), а также камер управления 11 клапанами (или мембранами клапанов) и мембраной рабочей камеры 9 (фиг. 2). Эластичная пластина может иметь толщину, например, от 0.1 до 5 мм.

В предпочтительном для крупносерийного производства варианте исполнения с целью повышения технологичности микрофлюидные каналы могут быть изготовлены в верхней пластине и/или в нижней пластине, выполненных, например, из полистирола, поликарбоната или других термопластов литьем или горячей формовкой. Верхняя пластина и нижняя пластина могут быть выполнены из одного или различных материалов и соединены механически, термически и/или химически (например, посредством защелок, оплавляемых заклепок, ультразвуковой сварки, склеивания, адгезионного соединения («бондинга») и т.п.). Эластичные элементы микрофлюидного чипа, в частности, клапаны и рабочая камера при этом могут быть отлиты в упомянутых пластинах, например, методом двухкомпонентного литья с применением эластичных термопластов или реактопластов, например силоксанов, с обеспечением герметичного соединения с пластинами, или же закреплены в упомянутых пластинах или между ними механически также с обеспечением герметичного размещения в пластинах.

Также возможен вариант, при котором эластичная пластина (средний эластичный слой) изготовлена из пленки, обеспечивающей герметичное соединение верхней и нижней пластин, а также формирующей мембраны рабочей камеры и клапанов (см., например, US 8778282 В2). В этом случае микрофлюидные каналы также могут быть изготовлены в нижней и/или верхней пластине.

Возможны варианты, при которых корпус содержит более двух пластин с микрофлюидными каналами, в том числе с закрепленными между ними эластичными элементами, или при которых корпус содержит более одной выполненной из эластичного материала пластины.

Система микрофлюидных каналов может иметь более одного контура циркуляции.

Варианты выполнения клапанов и рабочей камеры, образующих в т.ч. насос-маршрутизатор.

Клапаны 22, 23, 25, 8, 10, 38 (фиг. 5, 7, 8) выполнены активными и предназначены для герметичного перекрытия микрофлюидных каналов. Клапаны могут быть выполнены как нормально закрытыми так и нормально открытыми. Мембрана рабочей камеры 9 (фиг. 5) выполнена с возможностью изменения объема рабочей камеры. Клапаны и рабочая камера могут управляться пневматически, однако возможны и другие способы управления, например, гидравлическое управление или управление посредством электромеханических приводов, например, соленоидов или пьезоэлементов.

Клапан, в отличие от рабочей камеры, может обеспечивать уменьшение просвета микрофлюидного канала вплоть до герметичного его перекрытия, например, с помощью выполненной на мембране 36 клапана перегородки 12 (на фиг. 8а клапан показан в закрытом состоянии, на фиг. 8б - в открытом). Более подробно варианты выполнения таких клапанов изложены, например, в материалах заявки US 2014/0197339A1. На фиг. 5 перегородки 12 схематично представлены в виде разрывов каналов в клапанах 8, 10, 22, 23, 25, 38. Толщина мембран клапанов или рабочей камеры может лежать в диапазоне от 0.1 до 1 мм.

В частности, если корпус содержит эластичную пластину 13 с выполненными в ней микрофлюидными каналами, загерметизированными нижней пластиной, функцию клапанов 22, 23, 25, 8, 10, 38 и мембраны рабочей камеры 9 выполняют фрагменты эластичной пластины, находящиеся в проекции камер управления. При этом камеры управления 11 клапанов и рабочей камеры могут частично располагаться в эластичной пластине (см. фиг. 7). Микрофлюидный канал при этом может иметь расширение в плоскости размещения каналов в области этих мембран (см. 22, 23, 25, 8, 9, 10, 38 на фиг. 5). В качестве седел клапанов может выступать плоская поверхность нижней герметизирующей пластины (фиг. 7, 8).

Мембраны клапанов 22, 23, 25, 8, 10, 38 и рабочей камеры 9 могут быть выполнены из эластичных материалов, в частности силоксанов, например, ПДМС.

Мембраны клапанов могут иметь гладкую поверхность в случае, если эластичная пластина изготовлена из пленки или мембраны выполнены как отдельные эластичные элементы, зажатые между пластинами корпуса. При этом в микрофлюидных каналах могут быть выполнены седла клапанов с возможностью полного перекрытия упомянутых каналов мембранами клапанов.

Возможен также вариант выполнения, при котором система микрофлюидных каналов содержит «проходные» клапаны. Так клапан 23 (фиг. 5), размещен непосредственно в месте ответвления микрофлюидного канала для соединения с емкостью для питательной среды, таким образом, что клапан 23 обеспечивает отключение ответвления, но никак не влияет на движение жидкости в замкнутом контуре.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения клапаны 8, 10, 22, 23, 25 в совокупности с рабочей камерой 9 имеют выполнение и расположение в системе микрофлюидных каналов (см. фиг. 5, 12), обеспечивающее реализацию функции насоса-маршрутизатора (или роутера, см. US 7445926). Насос-маршрутизатор совмещает в себе функции насоса и гидрораспределителя, т.е. в отличие от обычного насоса позволяет перемещать жидкость между произвольной парой упомянутых клапанов. В одном из вариантов реализации изобретения через клапан 22 к насосу-маршрутизатору может быть подключена емкость сбора фильтрата 3, через клапан 25 - емкость сбора среды, через клапаны 8 и 10 - замкнутый контур циркуляции с входящими в него ячейками 1, 27 и полостью 48 средства создания постоянного давления (трубки 4 на фиг. 14 или мембраны 29 на фиг. 11), через клапан 23 - емкость с питательной средой. При этом клапан 38 средства создания постоянного давления не входит в состав насоса-маршрутизатора.

В простейшем варианте осуществления изобретения насос-маршрутизатор может быть образован, по крайней мере, двумя - первым 8 и вторым 10 клапанами контура циркуляции, подключенными к рабочей камере 9 (фиг. 5).

Варианты выполнения ячейки для размещения клеточной модели или мембранной вставки.

Ячейка 1 (фиг. 4) может быть выполнена в виде отверстия в пластине (или пластинах) и иметь форму, например, близкую к цилиндрической, или представляющую собой усеченный расширяющийся в выходной части 6 конус, например, с одним и более эластичным выступом 17.

Входная или выходная часть ячейки 1 может закрываться крышкой (пробкой) 16.

Ячейка 1 может быть выполнена с возможностью герметичного размещения в ней вставки 15 (фиг. 4, 10) (например, мембранной вставки Transwell производства Corning или аналогичной), частично или полностью заполненной моделью 2, представляющей собой слой клеток, фрагмент ткани, скаффолд с клетками, или содержащей клетки в слое экстрацеллюлярного матрикса или его заменителя, например, гидрогеля, в частности, на основе агарозы или полиэтиленгликоля. При этом модель 2 должна быть размещена во вставке с учетом разделения ячейки 1 на входную 5 и выходную 6 части, например, полностью покрывать мембрану 41 вставки 15. Помимо мембранных вставок могут применяться вставки с различными трехмерными структурами, скаффолдами, предназначенными для культивирования клеток.

Вставка 15 может иметь конусность внешней поверхности с большим диаметром со стороны, закрываемой крышкой, что обеспечивает легкость установки вставки в ячейку 1. Также мембранная вставка 15 может иметь конусность внутренней поверхности с большим диаметром со стороны мембраны 41, что обеспечивает уменьшение пристеночного течения во вставке при применении гидрогелей в модели 2.

Возможен вариант, при котором, например, мембрана 41 вставки 15 (фиг. 10) позволяет разместить во входной части 5 ячейки дополнительную модель, например, слой эндотелиальных клеток, моделирующий стенку капилляра.

Герметичное размещение вставки 15 в ячейке 1 может обеспечиваться, например, с помощью эластичного кольцевого выступа 17 (на фиг. 4 показан недеформированным) на боковой стенке ячейки или при помощи прижатия крышкой 16 юбки (фланца) на верхней части мембранной вставки 15 (фиг. 10б) к верхнему эластичному торцу 40 ячейки 1 (фиг. 4).

Возможен вариант выполнения, при котором микрофлюидный чип содержит несколько ячеек, подключенных к одной или нескольким емкостям сбора фильтрата 3. При этом в различных ячейках могут располагаться различные модели, например, на основе различных линий клеток. Данный вариант позволяет сокультивировать несколько различных моделей, объединенных одним контуром циркуляции, с использованием процесса моделирования гидродинамической составляющей микроциркуляции в каждой ячейке, реализуемого посредством конструктивных элементов заявляемого чипа.

Возможен вариант выполнения, при котором микрофлюидный чип содержит, по крайней мере, одну дополнительную ячейку 27, не подключенную к какой-либо емкости сбора фильтрата (фиг. 1, 2, 6). Данный вариант реализации чипа позволяет проводить сокультивирование размещенной в ячейке 1 модели 2 (фиг. 4) с размещенными в дополнительных ячейках 27 (фиг. 6) дополнительными моделями, для которых не требуется моделирование гидродинамической составляющей микроциркуляции (например, сфероидами). Ячейка 27 также снабжена крышкой 30, как показано на (фиг. 1, 2, 6).

Крышки 16, 30 могут быть закреплены в верхней пластине 14 с помощью резьбового соединения (фиг. 2, 4, 6).

Крышки 16, 30 могут иметь выступ 39, например, в виде тела вращения, соосного с крышкой, на части, размещаемой внутри ячейки 1 (27), предназначенный для заполнения некоторого объема ячейки 1 (27), не занятого моделью, с целью уменьшения объема ячейки, предназначенного для размещения жидкости (фиг. 4, 6).

Крышка 16 (30) ячейки может уплотняться в ячейке 1 (27) посредством эластичной прокладки надетой на крышку, например, кольца 18 (фиг. 2, 4, 6). В другом варианте исполнения крышка может быть полностью или частично изготовлена из эластичного материала, обеспечивающего герметичное соединение с верхней пластиной 14. Возможен вариант, при котором крышка 16 (30) уплотняется в ячейке 1 (27), упираясь выступом 39 в эластичную пластину 13 (на фиг. 4, 6 не показано).

Крышки 16, 30 могут быть выполнены с возможностью введения через них различных растворов и отбора проб циркулирующей питательной среды или фильтрата.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения ячейка 1 герметично закрыта крышкой 16 и подсоединена в выходной части к каналу 19, ведущему в емкость сбора фильтрата 3.

Варианты выполнения средства создания постоянного давления.

В предпочтительном варианте исполнения средство создания постоянного давления представляет собой отверстие в корпусе и размещенную в нем деформируемую мембрану 29 (фиг. 11), выполненную с возможностью изменения объема жидкости полости 48; причем на мембране 29 размещен груз 46, например, стальной или свинцовый шарик или цилиндр, с возможностью создания повышенного давления в полости 48. Возможен вариант исполнения, в котором вместо груза 46 давление создает размещенный на мембране якорь соленоида или пара магнит-ферромагнетик или пара притягивающихся магнитов, один из которых размещен на мембране, а другой - закреплен в корпусе под ней. Также возможен вариант, в котором используется пара отталкивающихся магнитов, один из которых размещен на мембране, а второй - в корпусе над ней. Возможен вариант, в котором давление создает пружина, один конец которой закреплен на мембране, а второй - на корпусе. Возможен вариант, при котором давление создается гидравлическим или пневматическим воздействием на мембрану. Также возможен вариант, при котором давление создается непосредственно мембраной за счет ее упругих свойств и геометрии.

Мембрана 29 может иметь толщину от 0.01 до 1 мм и, например, форму близкую к полусфере, гофрированную или приведенную на фиг. 11. Мембрана 29 может быть выполнена из ПДМС как часть эластичной пластины 13 (фиг. 11).

Также мембрана 29 может быть выполнена в виде отдельного элемента, установленного в корпусе с обеспечением герметичности, например, может быть отлита или вырезана, например, из латекса или бутадиен-нитрильного каучука или сварена из фрагментов пленки из термопласта, например, полиэтилена и, например, вклеена в верхнюю пластину 14.

Возможен вариант исполнения средства создания постоянного давления, при котором оно включает в себя датчик, позволяющий оценивать объем питательной среды, содержащейся в полости 48 под мембраной 29, например, оптический, фиксирующий увеличение оптической плотности по мере деформации мембраны 29. Измерение может проводиться в проходящем свете через образованную мембраной 29 полость 48 с питательной средой при размещении датчика и излучателя над и под полостью 48, или в отраженном свете при размещении датчика и излучателя под нижней пластиной 20, в последнем случае на мембране 29 может быть размещен отражающий элемент. В качестве излучателя и приемника может применяться светодиод и фотодиод. Также могут применяться индуктивные датчики, датчики Холла и другие, позволяющие оценивать объем жидкости в упомянутой полости 48, например, по положению груза 46.

В простейшем варианте исполнения средство создания постоянного давления может быть выполнено в виде емкости, по крайней мере, частично расположенной выше ячейки 1, например, вертикальной трубки 4, в частности, пипетки Пастера, герметично размещенной в специально выполненном для нее отверстии в корпусе, например, в верхней пластине 14, при этом полость 48 трубки выполнена сообщающейся с микрофлюидным каналом, соединенным с контуром циркуляции. Герметичное размещение трубки 4 может быть реализовано посредством манжеты или выступа 31 или выступа, выполненного в эластичной пластине 13 или верхней пластине 14. Верхний конец трубки выполнен сообщающимся с атмосферой, например, через фильтр из капронового волокна (фиг. 1, 2, 5, 14). Трубка 4 в таком случае может быть частично заполнена жидкостью, например, питательной средой или питательной средой и минеральным маслом.

В данном варианте исполнения средства создания постоянного давления объем находящейся в трубке жидкости может оцениваться, посредством размещения на трубке 4 одного или нескольких датчиков, например, оптических или емкостных, определяющих достижение или превышение определенного уровня (уровней) жидкости в трубке, необходимого для создания заданной величины постоянного давления контуре циркуляции, воздействующего на размещенную в ячейке 1 клеточную модель. В частности, в качестве оптического датчика может применяться оптопара на основе светодиода и фотодиода, а в качестве емкостного - пара обкладок, размещенных на трубке с противоположных сторон.

Возможен также вариант, при котором чип включает в себя датчик давления, подключенный к контуру циркуляции, например, STM LPS25HB или Honeywell 40РС001В, позволяющий оценивать давление во входной части 5 ячейки 1.

Варианты выполнения емкости сбора фильтрата.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения емкость сбора фильтрата 3 имеет конструкцию на основе деформируемой мембраны 47 (фиг. 15), выполненной с возможностью поддержания в емкости сбора фильтрата 3 давления близкого к атмосферному. Конструкция мембраны 47 может быть аналогична мембране 29 устройства поддержания давления.

В простейшем варианте емкость сбора фильтрата 3 сформирована в верхней пластине 14 и эластичной пластине 13 в виде глухого отверстия. При этом емкость сбора фильтрата 3 может сообщаться с атмосферой через отверстие 37, выполненное со стороны торцевой поверхности верхней пластины 14 (фиг. 3, 4).

Емкость сбора фильтрата 3 также может сообщаться с атмосферой с помощью отверстия, выполненного в верхней пластине со стороны ее верхней поверхности.

Емкость сбора фильтрата 3 может быть закрыта крышкой или пробкой, аналогично ячейке 1, которая также может быть выполнена сообщающейся с атмосферой, например, через отверстие в крышке.

При этом в отверстии, выполненном в пробке, крышке или пластине, обеспечивающем сообщение емкости 3 с атмосферой, может быть установлен фильтр 21, выполненный, например, из пористого политетрафторэтилена или капрона.

Возможен вариант, при котором емкость сбора фильтрата может быть выполнена с дополнительной функцией создания постоянного давления, при этом емкость может быть выполнена по аналогии с средством создания постоянного давления, например, в виде трубки 4 (фиг. 14) или отверстия в пластине с мембраной 29 и грузом 46 не сообщаясь напрямую с атмосферой (фиг. 11). В этих двух вариантах емкость сбора фильтрата выполнена с возможностью поддержания в ней давления, превышающего атмосферное.

В одном из вариантов выполнения уровень фильтрата в емкости сбора фильтрата контролируется оптическим, акустическим, емкостным или датчиком на основе оценки электропроводности. Возможно использование и других видов датчиков.

Возможен вариант выполнения, при котором емкость сбора фильтрата 3 соединена с рабочей камерой 9 микрофлюидным каналом посредством клапана 22.

Возможен вариант, при котором микрофлюидный чип содержит более одной емкости сбора фильтрата. При этом насос-маршрутизатор дополнительно может содержать входные клапаны, к которым посредством микрофлюидных каналов могут быть по отдельности или группами подключены некоторые или все емкости сбора фильтрата. Емкости сбора фильтрата и соответствующие каналы в этом случае выполнены с возможностью моделирования лимфатической системы in vivo.

Возможен вариант выполнения чипа, в котором реализована возможность забора проб фильтрата из емкости 3, например, с помощью отверстия в пластине, закрытого крышкой, пробкой или эластичной мембраной (предназначенной для взятия или введения пробы посредством прокола шприцем с иглой).

Возможен вариант выполнения чипа, при котором емкость сбора фильтрата 3 совмещена с выходной частью ячейки 6, например, выполнена в виде полости в крышке 16 или корпусе чипа над вставкой 15.

Варианты выполнения емкости с питательной средой.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения к рабочей камере 9 через клапан 23 подключена емкость с питательной средой, представляющая собой, например, стеклянный пузырек 42 с резиновой пробкой 44 (фиг. 13).

Емкость может быть выполнена сообщающейся с атмосферой через трубку или отверстие с фильтром, например, через иглу 45 с установленным в ней фильтром. Подключение емкости к рабочей камере может быть реализовано с помощью трубки-капилляра 34. При этом один конец трубки соединен с содержащим клапан 23 микрофлюидным каналом через отверстие 24 в корпусе чипа (фиг. 1, 2, 3, 5, 13), а другой конец вставлен через пробку 44 в емкость 42 до упора с ее дном.

Также емкость может представлять собой блистерную упаковку, выполненную независимо от корпуса чипа или непосредственно в нем. Емкость может быть выполнена из пластмассы и снабжена крышкой. Емкость может устанавливаться непосредственно на корпус чипа.

Варианты выполнения емкости сбора среды.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения к рабочей камере 9 через клапан 25 подключена емкость сбора среды. Конструкция емкости может быть выполнена аналогично конструкции емкости с питательной средой. Подключение емкости сбора среды 43 может осуществляться также через трубку-капилляр 35 к выполненному в корпусе чипа отверстию 26 аналогично емкости с питательной средой, за исключением того, что конец упомянутой трубки-капилляра может находиться на значительном расстоянии от дна емкости сбора среды (фиг. 13).

Варианты выполнения порта для забора из контура циркуляции образцов питательной среды или внесения растворов препаратов.

Возможен вариант, при котором к рабочей камере или контуру циркуляции с помощью микрофлюидного канала, в том числе через отдельный клапан, подключен порт забора образцов питательной среды или внесения растворов препаратов, например, представляющий собой эластичную мембрану (предназначенную для взятия или введения пробы посредством прокола шприцем с иглой), резьбовое отверстие для установки фитинга или цилиндрическое отверстие в пластине с уплотнением, например, выполненным в эластичной пластине 13 в виде манжеты или выступа, в которое может вставляться трубка.

Ниже представлено подробное описание работы заявляемого устройства.

Описание устройства управления микрофлюидным чипом.

В зависимости от конструкций клапанов и камер для управления микрофлюидным чипом могут применяться различные устройства. В случае использования пневматического принципа управления клапанами и рабочей камерой микрофлюидного чипа в качестве рабочего тела может быть использован воздух или другой газ под повышенным (например, от +5 до +70 кПа) и пониженным (от -5 до -70 кПа) относительно атмосферного давлением.

Находящееся в камере управления 11 клапана рабочее тело деформирует мембрану 36 открывая или закрывая просвет микрофлюидного канала 7, и, таким образом, открывая или закрывая клапан (фиг. 7, 8). Аналогичным образом рабочее тело при деформации мембраны рабочей камеры 9 изменяет соответствующим образом объем жидкости в рабочей камере. Таким образом, мембрана рабочей камеры под действием управляющих сигналов создает пульсирующее течение жидкости в микрофлюидных каналах чипа.

Величины повышенного и пониженного давления выбираются в зависимости от геометрии микрофлюидных каналов, геометрии и эластичности мембран клапанов и рабочей камеры, требуемых гидродинамических параметров движения среды. Управление может осуществляться пневматическими сигналами, со сглаженными фронтами нарастания и спада давления, например с фронтами длительностью от 10 до 100 мс.

Обеспечивающее вышеуказанные сигналы управления устройство управления микрофлюидным чипом в простейшем варианте может представлять собой регулятор (повышенного) давления и регулятор вакуума (пониженного давления), подключенные входами к соответствующим источникам (например, компрессору и эжектору) а выходами - к магистралям блока пневмораспределителей 3/2 (т.е. коммутирующими три линии и имеющими два рабочих положения, в данном случае следующих: выход подключен к магистрали пониженного давления, выход подключен к магистрали повышенного давления), управляемых компьютером, микроконтроллером или программируемым логическим контроллером. Схема управления мембранами клапанов и рабочей камеры может быть выполнена аналогично тому, как описано в материалах заявки ЕР 2719459 А1. Выходы блока пневмораспределителей, например, через дроссели, могут подключаться трубками пневматического управления 28 к камерам управления 11 микрофлюидного чипа. Таким образом, на каждую камеру управления чипа в зависимости от положения соответствующего пневмораспределителя подается газ (например, воздух) с повышенным или пониженным относительного атмосферного давлением. Дроссели предназначены для ограничения скорости нарастания и спада давления (сглаживания фронтов пневматических сигналов) в камерах управления 11. Для описанной конструкции устройство управления должно обеспечивать повышенное относительное давление +30 кПа и пониженное относительное давление -30 кПа, с длительностью переднего и заднего фронтов не менее 50 мс. Возможны и другие конструкции устройства управления.

Устройство управления может обеспечивать режимы управления заявляемым микрофлюидным чипом, характеризующиеся различными последовательностями переключения управляющих сигналов на выходах. В частности, устройство управления должно обеспечивать режим замкнутой циркуляции питательной среды, режим заполнения каналов, режим паузы. В предпочтительном варианте устройство управления также может обеспечивать режимы: повышения объема среды, снижения объема среды, режим возврата фильтрата в контур циркуляции, режим паузы. Однако также возможно управление посредством других наборов режимов. Ниже представлено подробно описание перечисленных режимов.

Культивирование клеточных моделей.

Культивирование и сокультивирование клеточных моделей в микрофлюидном чипе с замкнутым контуром циркуляции при моделировании гидродинамической составляющей микроциркуляции в живой ткани реализуют следующим образом.

Подключают микрофлюидный чип к устройству управления, например, к вышеописанному устройству пневматического управления трубками 28.

Далее в простейшем варианте открывают крышку 16 ячейки 1, вводят в ячейку 1 и каналы контура циркуляции питательную среду шприцем, устанавливают вставку 15 с клеточной моделью 2 и закрывают крышку 16. Заполняют трубку 4 средства создания постоянного давления питательной средой и включают режим циркуляции, тем самым обеспечивая движение питательной среды в замкнутом контуре циркуляции, в т.ч. через входную часть 5 ячейки 1, причем это движение имеет пульсирующий характер, обусловленный действием насоса-маршрутизатора (фиг. 5, 12). Высоту столба жидкости в трубке 4 (например, минерального масла и питательной среды), обеспечивающего постоянную разность давлений на клеточной модели 2 (под и над клеточной моделью, соответственно) и параметры устройства пневматического управления (величина повышенного и пониженного давления, частота переключения, скорость нарастания и спада давления) выбирают в соответствии с задачами исследования. Проводят культивирование клеточных моделей.

В результате созданной разности давлений на клеточной модели 2 (под и над клеточной моделью, соответственно) питательная среда из полости 48 средства создания постоянного давления, поступая по микрофлюидным каналам контура циркуляции во входную часть 5 ячейки 1 фильтруется через клеточную модель 2 в выходную часть 6 ячейки 1 и затем через канал 19 поступает в емкость сбора фильтрата 3 (фиг. 4).

В предпочтительном варианте трубками 34 и 35 к чипу подключают емкость с питательной средой 42 и емкость сбора среды 43. Включают режим заполнения каналов и заполняют питательной средой ячейки 1, 27, микрофлюидные каналы контура циркуляции и полость 48 средства создания постоянного давления. Открывают крышки 16 и 30, размещают в ячейке 1 вставку 15 с клеточной моделью 2, размещают в дополнительной ячейке 27 дополнительные клеточные модели, закрывают крышки 16, 30 (фиг. 1, 2, 4, 6). Подготавливают к работе средство создания постоянного давления в соответствии с задачами исследования. В частности, если средство создания постоянного давления представляет собой деформируемую мембрану 29 с грузом 46 (фиг. 11), размещают на мембране 29 груз 46, обеспечивающий требуемую постоянную разность давлений на клеточной модели 2 (см. ниже). С помощью устройства управления в режиме повышения объема среды полость 48 под мембраной 29 заполняют питательной средой, таким образом, чтобы в полости 48 содержался максимально возможный объем питательной среды чтобы груз 46 находился в верхней точке (см. ниже). Проводят культивирование клеточных моделей.

Объем среды в полости 48 средства создания постоянного давления в режиме повышения объема среды может контролироваться визуально или с помощью датчиков: например, по уровню жидкости в трубке 4, в том числе оптическими или емкостными датчиками; по положению груза 46, в том числе оптическими, индуктивными или датчиками Холла; по давлению в контуре циркуляции - датчиком давления (фиг. 11, 14, датчики не показаны).

Периодически по мере заполнения емкости сбора фильтрата 3 с помощью устройства управления включают режим возврата фильтрата в контур циркуляции, при котором фильтрат через клапан емкости сбора фильтрата 22 перекачивается насосом-маршрутизатором в полость 48 средства создания постоянного давления (фиг. 4, 5, 12), причем степень заполнения емкости сбора фильтрата 3 контролируется либо визуально, либо соответствующим датчиком, например оптическим.

После каждого включения режима возврата фильтрата при необходимости (например, по мере испарения питательной среды, а, следовательно, снижения объема среды в средстве создания постоянного давления) с помощью устройства управления включают режим повышения объема среды, причем контроль за объемом среды в устройстве поддержания давления может производиться перечисленными выше средствами.

Таким образом, в данном способе культивирования на клеточной модели создается разность давлений, формирующая физиологичный градиент давления межклеточной жидкости в клеточной модели и, следовательно, благодаря пористости клеточной модели, обеспечивается перенос веществ не только за счет диффузии, но и за счет адвекции, что существенно увеличивает массоперенос низкомолекулярных соединений в клеточной модели. Кроме того, за счет пульсирующего движения питательной среды, а следовательно, и пульсирующего изменения упомянутой разности давлений, обеспечивается физиологичное циклическое механическое воздействие на клетки. Наконец, как и при прочих способах динамического культивирования, за счет адвекции обеспечивается постоянство состава питательной среды, контактирующей с клеточной моделью. Воспроизведение вышеперечисленных аспектов микроциркуляции делает условия культивирования клеточных моделей с применением заявляемого микрофлюидного чипа более приближенными к условиям in vivo, по сравнению с клеточными моделями в приспособлениях для культивирования клеток, не воспроизводящих эти аспекты.

Принцип работы насоса-маршрутизатора.

Насос-маршрутизатор (фиг. 5, 12), в зависимости от пары задействованных клапанов, может обеспечивать движение питательной среды по различным «маршрутам» системы микрофлюидных каналов.

Насос-маршрутизатор может приводиться в действие по алгоритму, представленному на фиг. 9, содержащему 6 тактов, со следующими сигналами, подаваемыми на входной клапан (например, 8), рабочую камеру 9 и выходной клапан (например, 10), соответственно: Д Д Д; В Д Д; В В Д; Д В Д; Д В В; Д Д В, где «Д» - повышенное относительно атмосферного давление, а «В» - пониженное относительно атмосферного давление. Применение данного алгоритма исключает нежелательное обратное течение жидкости через насос при условии применения герметично закрывающихся клапанов. Однако, возможно применение и других алгоритмов. Очевидно, что насос-маршрутизатор позволяет менять направление движения жидкости между клапанами, при выполнении алгоритма в обратной последовательности. В предпочтительном варианте применения в качестве входного клапана насоса-маршрутизатора могут быть задействованы клапаны 8, 23, качестве выходного - клапаны 10, 25 и, как в качестве входного, так и выходного - клапан 22.

Микрофлюидный чип должен обеспечивать следующие режимы работы (фиг. 5, 12):

1. Режим замкнутой циркуляции, при котором насос-маршрутизатор использует первый 8 (в качестве входного) и второй 10 (в качестве выходного) клапаны контура циркуляции, а питательная среда под действием разности давлений между входной 5 и выходной 6 частями ячейки 1 фильтруется через модель 2, размещенную в ячейке 1 и одновременно циркулирует по замкнутому контуру через входную часть 5 ячейки 1. В зависимости от варианта исполнения также закрыты клапан 23 емкости с питательной средой и клапан 22 емкости сбора фильтрата, клапан емкости сбора среды 25, и открыт клапан средства создания постоянного давления 38, а циркуляция по замкнутому контуру включает в себя дополнительную ячейку 27.

2. Режим заполнения каналов, при котором все клапаны открыты, а насос-маршрутизатор бездействует.

3. Режим паузы, при котором все клапаны закрыты. Также, в зависимости от варианта исполнения, микрофлюидный чип может обеспечивать следующие режимы:

4. Режим возврата фильтрата, при котором закрыты: первый клапан контура циркуляции 8, клапан 23 емкости с питательной средой, клапан 25 емкости сбора среды и открыт клапан 38 средства создания постоянного давления. Насос-маршрутизатор при этом использует клапан 22 емкости сбора фильтрата (в качестве входного) и второй клапан контура циркуляции 10 (в качестве выходного). Фильтрат в данном случае, смешиваясь с питательной средой в контуре циркуляции, нагнетается из емкости сбора фильтрата 3 через контур циркуляции в полость 48 средства создания постоянного давления.

5. Режим повышения объема среды, при котором закрыты: первый клапан контура циркуляции 8, клапан 22 емкости сбора фильтрата, клапан 25 емкости сбора среды и открыт клапан 38 средства создания постоянного давления. Насос-маршрутизатор при этом использует клапан 23 емкости с питательной средой (в качестве входного) и второй клапан контура циркуляции 10 (в качестве выходного). Питательная среда в данном режиме нагнетается из емкости с питательной средой 42 через контур циркуляции в средство создания постоянного давления, вследствие чего увеличивается объем питательной среды в полости 48 средства создания постоянного давления.

6. Режим снижения объема среды, при котором закрыты: второй клапан контура циркуляции 10, клапан 22 емкости сбора фильтрата, клапан емкости с питательной средой 23, и открыт клапан 38 средства создания постоянного давления. Насос-маршрутизатор при этом использует первый клапан контура циркуляции 8 (в качестве входного) и клапан 25 емкости сбора среды (в качестве выходного). Питательная среда в данном случае нагнетается из средства создания постоянного давления в емкость сбора среды 43, вследствие чего снижается объем питательной среды в полости 48 средства создания постоянного давления.

Возможны и другие режимы работы микрофлюидного чипа, полученные с помощью других последовательностей переключения клапанов. В режимах 1, 4, 5, 6 насос-маршрутизатор по приведенному выше алгоритму обеспечивает движение жидкости от указанного входного к указанному выходному клапану.

При чередовании режимов повышения объема среды и снижения объема среды обеспечивается замена питательной среды в микрофлюидном чипе, при которой чип заполняется средой из емкости с питательной средой 42, а отработанная среда помещается в емкость сбора среды 43.

Принцип действия средства создания постоянного давления.

В случае, если средство создания постоянного давления включает в себя емкость, по крайней мере, частично расположенную выше ячейки 1, например, трубку 4, повышенное давление во входной части 5 ячейки обеспечивается гидростатическим давлением столба жидкости определенной высоты (фиг. 14, столб жидкости не показан). В предпочтительном варианте трубка 4 заполнена в нижней части питательной средой, а в верхней - минеральным маслом (минеральное масло и питательная среда не смешиваются). В таком варианте обеспечивается адекватный объему культивируемых клеток объем питательной среды. Поскольку питательная среда постепенно покидает средство создания постоянного давления, фильтруясь через модель 2, высота столба жидкости в трубке 4 может поддерживаться путем периодического закачивания или добавления питательной среды или фильтрата в трубку до заданного уровня. Поскольку величина давления определяется высотой столба жидкости и не зависит от диаметра трубки, использование трубок большего диаметра позволяет обеспечить меньшее падение давления при фильтрации некоторого количества жидкости через модель, по сравнению с трубкой меньшего диаметра. По этой причине целесообразно использовать трубку с расширением в верхней части на уровне верхней границы жидкости, например, трубка может иметь нижнюю часть длиной 110 мм с диаметром отверстия 2 мм и верхнюю - длиной 50 мм с диаметром отверстия 10 мм.

Расчет необходимой высоты столба питательной среды и масла, а также геометрии трубки несложно произвести исходя из требуемой величины постоянной составляющей давления и плотностей жидкостей. Например, для трубки с диаметром отверстия 4 мм, требуемого объема питательной среды в трубке 300 мкл и давления 1200 Па, высота столба питательной среды будет составлять 24 мм, минерального масла - 111 мм.

В случае, если средство создания постоянного давления основано на деформируемой мембране 29, повышенное давление в контуре циркуляции может обеспечиваться давлением груза 46 на мембрану 29 (фиг. 11). Мембрана при этом должна обладать определенной геометрией и упругостью, позволяющими деформироваться под действием тяжести груза, не оказывая существенного ему сопротивления, таким образом, позволяя ему создавать близкое (например, ±10%) к заданному давление в достаточно широком рабочем диапазоне объема питательной среды в устройстве (например, 100 мкл: от 50 в нижнем положении груза до 150 мкл - в верхнем).

Вес груза 46 подбирается в зависимости от задач исследования и геометрии мембраны. Например, несложно рассчитать, что при диаметре мембраны 6 мм и грузе в виде стального шарика диаметром 5 мм, создаваемое постоянное давление будет составлять приблизительно 250 Па.

Объем питательной среды в полости 48 средства создания постоянного давления может восполняться автоматически путем периодического включения режима повышения объема среды. В зависимости от варианта выполнения для контроля объема питательной среды в полости 48 могут использоваться показания датчика, определяющего давление в контуре циркуляции или высоту столба жидкости в трубке 4 или деформацию мембраны 29.

Постоянная составляющая давления в контуре циркуляции, обусловленная средством создания постоянного давления в зависимости от задач исследования может лежать в диапазоне от 0 до 7 кПа.

Способ поддержания давления в емкости сбора фильтрата.

Давление в емкости сбора фильтрата 3 может поддерживаться на уровне атмосферного с помощью выполненного в упомянутой емкости отверстия, открытого в атмосферу. Фильтр 21 в отверстии препятствует попаданию пыли и инфекционных агентов в емкость сбора фильтрата 3, а, следовательно, загрязнению и заражению находящихся в микрофлюидном чипе жидкостей и клеток (фиг. 4).

В случае, если емкость сбора фильтрата включает в себя деформируемую мембрану 47, атмосферное давление обеспечивается изготовлением этой мембраны из эластичного материала малой толщины, с возможностью обеспечения деформации мембраны при давлении порядка десятков Паскалей (фиг. 15).

В случае выполнения емкости сбора фильтрата 3 по типу средства создания постоянного давления, в ней может поддерживаться давление выше атмосферного в соответствии с задачами исследования.

Вариант реализации забора образцов питательной среды и фильтрата или внесения растворов препаратов в контур циркуляции.

Для последующего анализа питательная среда или фильтрат могут отбираться, помимо емкости сбора среды 43, из выходной части 1 ячейки, дополнительной 27 ячейки, емкости сбора фильтрата 3 (см. фиг. 2, 4, 5), а также из контура циркуляции через порт (на фигурах не показан). Порт также может использоваться для внесения растворов исследуемых препаратов.

Выбор величин давлений и скорости движения жидкости.

В зависимости от задач исследования культивирование в микрофлюидном чипе может проводиться в физиологичных или не физиологичных условиях. В первом случае параметры культивирования выбираются по литературным или экспериментальным данным таким образом, чтобы максимально соответствовать норме в той или иной ткани или органе организма. Во втором случае параметры могут выбираться с определенным отклонением от нормы, в том числе, основываясь на известных данных о заболевании.

Если понятие нормы не применимо для культивируемой модели в рамках исследования, как, например, в случае некоторых линий раковых клеток, параметры культивирования могут подбираться экспериментально, например, с целью максимизации жизнеспособности модели.

В целом в норме постоянная составляющая давления в капиллярах лежит в диапазоне от 1 до 4 кПа. В частности, в капиллярах кожи постоянное давление составляет приблизительно 2 кПа [Shore А.С. Capillaroscopy and the measurement of capillary pressure // Br. J. Clin. Pharmacol. 2000. T. 50. №6. C. 501-513]. Величина интерстициального давления в норме близка к нулю [Shieh А.С, Swartz М. a. Regulation of tumor invasion by interstitial fluid flow. // Phys. Biol. 2011. T. 8. №1. С 015012]. Величина обусловленных деятельностью сердца пульсаций давления в капиллярах составляет приблизительно 0.1 кПа. Средняя скорость течения крови в капиллярах варьируется от 0 до 0.7 мм/с [Hahn М., Klyscz Т., Junger М. Synchronous measurements of blood pressure and red blood cell velocity in capillaries of human skin // J Invest Dermatol. 1996. T. 106. №6. С. 1256-1259].

Таким образом, для культивирования в условиях физиологической нормы давление в средстве создания постоянного давления следует устанавливать в диапазоне от 1 до 4 кПа, а в емкости сбора фильтрата - на уровне атмосферного давления. Исходя из скорости 0.7 мм/с, высоты микрофлюидного канала во входной части 5 ячейки равной 0.1 мм и диаметра вставки 15 равного 5.6 мм, несложно рассчитать, что средний объемный расход, обеспечиваемый насосом-маршрутизатором должен составлять 23.5 мкл/мин. Данный объемный расход в заявляемом устройстве обеспечивается выбором геометрии (например, диаметра и толщины) мембраны рабочей камеры 10, выбором геометрии микрофлюидных каналов контура циркуляции (и, следовательно, гидродинамического сопротивления), выбором амплитуды управляющих сигналов и частоты смены тактов насоса-маршрутизатора. При выборе данных параметров следует исходить из того, что средний объемный расход за период времени равен количеству циклов насоса-маршрутизатора за этот период, умноженному на объем жидкости, вытесняемой рабочей камерой при смене на ней управляющего сигнала. Например, рабочая камера может иметь диаметр от 1 до 10 мм и толщину мембраны от 0.1 до 1 мм. Пульсации давления величиной порядка 0.1 кПа обеспечиваются подбором гидродинамических сопротивлений микрофлюидньгх каналов (т.е. их геометрии), исходя из амплитуды пульсаций на входе и выходе насоса-маршрутизатора (при выбранном среднем объемном расходе и, соответственно, форме, амплитуде и частоте управляющих сигналов). Так, при размещении полости устройства поддержания давления 48 после входной части 5 ячейки 1 по ходу движения питательной среды и амплитуде пульсаций 6 кПа, отношение сопротивления участка микрофлюидного канала между вторым клапаном контура циркуляции и входной частью 5 ячейки 1 к сопротивлению участка между входной частью 5 ячейки 1 и полостью 48 устройства поддержания давления должно составлять 59:1.

Выбор емкостей с необходимым объемом.

Выбор емкости сбора фильтрата 3, с одной стороны, диктуется скоростью фильтрации жидкости через модель 2, а с другой - максимальной частотой включения режима возврата фильтрата. Причем скорость фильтрации зависит от физико-химических параметров модели, в частности, пористости, и от заданной разности давлений на модели, и может лежать в диапазоне от сотых долей до десятков микролитров в час. Таким образом, в зависимости от планируемых к применению моделей целесообразно выбирать объем емкости сбора фильтрата 3, например, из ряда: 10, 20, 50, 100, 200, 400 мкл, учитывая «мертвый» объем, т.е. объем фильтрата, который нельзя откачать из емкости сбора фильтрата из-за конструктивных особенностей или риска поступления воздуха в микрофлюидную систему.

Рабочий диапазон средства создания постоянного давления при этом должен приблизительно составлять суммарный объем соединенных с рабочей камерой 9 емкостей сбора фильтрата 3, за вычетом мертвого объема.

Выбор объема емкости с питательной средой и емкости сбора среды зависит от длительности эксперимента, объема заменяемой среды и частоты ее замены с помощью чередовании режимов повышения объема среды и снижения объема среды. Например, несложно рассчитать, что при замене 30 мкл среды каждые 30 мин. для 48-часового эксперимента целесообразно использовать емкости объемом 5 мл.

Объем входной части 5 ячейки 1 может составлять 15 мкл при применении вставок от 96-луночного планшета. Объем выходной части 6 ячейки 1-50 - 150 мкл. Объем дополнительных ячеек 27 может составлять 150-200 мкл.

Пример конкретного выполнения

Конструкция микрофлюидного чипа и его изготовление.

Заявляемое изобретение было апробировано на серии из 4 микрофлюидных чипов. Чипы были изготовлены по вышеописанной технологии. В качестве механической основы конструкции микрофлюидньгх чипов выступала верхняя пластина 14 из поликарбоната толщиной 10 мм, обработанная фрезерованием (фиг. 2). В верхней пластине 14 были изготовлены резьбовые отверстия для ячейки 1, дополнительной ячейки 27, камер управления клапанов 8, 10, 22, 23, 25, 38 и рабочей камеры 9, а также для подключения емкости с питательной средой 42 и емкости сбора среды 43. Также были изготовлены отверстия для емкости сбора фильтрата 3 и трубки 4, служившей средством создания постоянного давления. Отверстие, формирующее емкость сбора фильтрата 3, было выполнено цилиндрическим и глухим со стороны верхней поверхности пластины. Перпендикулярно отверстиям для емкости сбора фильтрата 3 и ячейки 1 было изготовлено отверстие, образующее одновременно канал 19 между ними и отверстие 37 со стороны боковой стенки верхней пластины 14, связывающее емкость сбора фильтрата 3 с атмосферой (фиг. 4). Это отверстие было закрыто фильтром 21 из пористого фторполимера, применяемого в наконечниках автоматических пипеток. Отверстия емкостей для культивирования имели в верхней части резьбу М10, отверстия камер управления и отверстия для подключения емкости с питательной средой и емкости сбора среды - М3.

Чип имел эластичную пластину 13, которая была отлита из ПДМС в литьевой форме, частью которой являлась верхняя пластина 14, нижняя сторона которой и другие части, предназначенные для контакта с ПДМС, были для обеспечения хорошей адгезии обработаны праймером. Использовался двухкомпонентный состав ПДМС Dow Corning Sylgard 184. В качестве праймера использовался Dow Corning PR-1200 RTV. Форма для литья включала в себя мастер-шаблон с рисунком микрофлюидных каналов, представленным на фиг. 5, и цилиндрическим выступом, формирующим при литье полость емкости сбора фильтрата 3. Помимо этого, форма содержала рамку, формирующую периметр эластичной пластины 13 и задающую ее толщину, пуансоны, а также крышку, фиксирующую пуансоны и верхнюю пластину 14 относительно рамки и мастер-шаблона. Мастер-шаблон и рамка выполнялись фрезерованием. Пуансоны представляли собой токарные изделия. Детали формы скреплялись винтами. Состав ПДМС дегазировался, под давлением вводился шприцем в форму и отверждался при температуре 80°С в течение 40 минут.

Высота эластичной пластины составляла 2 мм, размеры соответствовали размерам предметного стекла - 25×75 мм. Микрофлюидные каналы были выполнены высотой 100 мкм.

Готовая отливка эластичной пластины 13 извлекалась из формы вместе с верхней пластиной 14. Затем сформированные в эластичной пластине 13 микрофлюидные каналы герметизировались снизу предметным стеклом 20. Прочное герметичное соединение стекла и ПДМС обеспечивалось обработкой обоих частей в плазменной камере.

Пуансоны формировали канал 19, отверстия в эластичной пластине 13, включая отверстие 37, а также мембраны 36 рабочей камеры 9 и различных клапанов (8, 10, 22, 23, 25, 38). Мембраны 36 имели диаметр 2,4 мм и толщину 250 мкм. Мембраны 36 клапанов 8, 10, 22, 23, 25 и 38, в отличие от рабочей камеры 9, имели перегородки 12 в плоскости каналов, обеспечивающие герметичное закрытие клапанов при подаче управляющих пневматических сигналов повышенного давления (фиг. 7, 8).

Система микрофлюидных каналов была выполнена в соответствии с фиг. 5. К рабочей камере 9 через клапаны 8 и 10 был подключен контур циркуляции, через клапан 22 - емкость сбора фильтрата 3, через клапаны 23 и 25 подключалась емкость с питательной средой 42 и емкость сбора среды 43 соответственно.

Контур циркуляции по ходу движения среды включал в себя первый клапан 8, камеру 9, второй клапан 10, дополнительную ячейку 27, ячейку 1, клапан 38 и полость 48 средства создания постоянного давления. Клапан 23 емкости с питательной средой был расположен между первым клапаном 8 контура циркуляции и рабочей камерой 9. Клапан 25 емкости сбора среды был расположен между рабочей камерой 9 и вторым клапаном 10 контура циркуляции. Клапан 22 емкости сбора фильтрата был подключен к рабочей камере 10.

Эластичная пластина 13 имела сформированные пуансонами манжеты (нижние эластичные выступы) 17 в ячейках 1 и 27, позволявшие герметично устанавливать в них отдельные мембранные вставки 15 планшета Corning Transwell 3391 или аналогичные. Также манжета 31, выполненная в эластичной пластине 13, обеспечивала герметичность установки трубки 4 средства создания постоянного давления в соответствующее отверстие пластины.

Крышки 16 и 30 ячейки 1 и дополнительной ячейки 27 были изготовлены из прута поликарбоната токарно-фрезерной обработкой. Крышки имели резьбу М10 для установки в верхнюю пластину 14 и шестигранную головку. В проточку резьбы устанавливалась прокладка в виде эластичного кольца 18 из резины, обеспечивающая ее герметичность.

В отверстиях камер управления устанавливались быстросъемные фитинги 32 Festo QSM-M3-2-I, в отверстия для подключения емкости с питательной средой и емкости сбора среды - миниатюрные штуцеры 33 SMC M-3AU-2 из нержавеющей стали.

В быстросъемные фитинги вставлялись полиуретановые трубки 28 диаметром 2 мм, подключенные к устройству управления. Устройство управления было выполнено по вышеописанной схеме с возможностью формирования управляющих пневматических сигналов повышенного давления в диапазоне 10-70 кПа и пониженного - в диапазоне минус 10-70 кПа с длительностью фронтов нарастания и спада давления 100 мс. Устройство управления позволяло реализовать вышеописанные режимы работы микрофлюидного чипа.

На миниатюрные штуцеры 33 надевали трубки-капилляры 34 и 35, другие концы которых были надеты на полые иглы, которые, в свою очередь, вставлялись в укупоренные стеклянные пузырьки 42 и 43 объемом 2 мл с резиновыми пробками 44, представляющие собой емкость с питательной средой и емкость сбора среды соответственно. Пузырек емкости с питательной средой 42 содержал стерильную среду DMEM. Оба пузырька сообщались с атмосферой через вставленные в пробки пузырьков иглы от шприцев 45 с установленными в них фильтрами из пористого флюорополимера, применяемыми в наконечниках автоматических пипеток.

Применение заявляемого устройства.

Заявляемый микрофлюидный чип был апробирован на модели на основе линии НЕК293 (получена из клеток почки человека). Модель представляла собой слой агарозного геля высотой 4 мм с концентрацией 0.5%, в котором равномерным образом были распределены клетки НЕК-293. Для этого клетки НЕК-293 выращивались во флаконах 25 см² до 90-100% уровня конфлюэнтности, после чего диспергировались согласно протоколу АТСС с добавлением 10 мл среды DMEM, 10% бычьей фетальной сыворотки, 4 мМ глютамина, 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (далее - питательной средой). Суспензия клеток центрифугировалась в течение 5 мин. при 200 g, ресуспендировалась в DPBS до требуемой концентрации и инкубировалась 2 мин. при 30°С. Далее клеточная суспензия смешивалась в объемном соотношении 1:1 с охлажденным до 30°С расплаве агарозы (1% в DPBS) и заливалась в мембранную вставку 15 (фиг. 10б), предварительно отделенную от планшета, таким образом, что высота модели составляла около 4 мм, где суспензия застывала [Gordeev, Chetverina, Chetverin, 2012]. Всего было подготовлено 8 моделей, которые затем в течение 12 часов культивировались в планшете с питательной средой (230 мкл в ячейках, 70 мкл во вставках) в инкубаторе (37°С, 5% CO₂).

Для оценки создаваемого адвективного транспорта в модели применялись моноклональные антитела ЕрСАМ, меченные флуоресцентной меткой (PerCP-Су5.5). Проводилось сравнение распределения антител в моделях, культивированных в чипе, и в моделях, культивированных в стандартном планшете в статическом режиме. В эксперименте использовались четыре чипа, в которые из планшета были перенесены четыре модели из вышеуказанных восьми.

Каждый чип перед применением подключался к устройству пневматического управления и в режиме заполнения промывался спиртом и затем буферным раствором. К чипу подключались емкость 42 с питательной средой, содержащей антитела ЕрСАМ в концентрации 25 нг/мл, и пустая емкость сбора среды 43. Далее в режиме заполнения чип заполнялся питательной средой, содержащей антитела ЕрСАМ в концентрации 25 нг/мл. В режиме паузы устанавливалась мембранная вставка с моделью в ячейку 1 и ячейка герметично закрывалась крышкой 16. Устанавливалась предварительно частично заполненная минеральным маслом и питательной средой трубка 4 (пипетка Пастера). Культуральная среда при этом находилась в нижней части трубки благодаря более высокой плотности. Высота столба минерального масла составляла 111 мм. С помощью режимов повышения и понижения давления устанавливалась высота столба жидкости в трубке 4 равной 135 мм относительно плоскости каналов контура циркуляции. Указанная высота столба жидкости в трубке создавала постоянное давление величиной 1.2 кПа в контуре циркуляции.

Далее включался режим замкнутой циркуляции и в инкубаторе (37°С, 5% СО₂) проводилось культивирование моделей в чипах в режиме замкнутой циркуляции среды. При культивировании использовались управляющие пневматические сигналы с давлением ±20 кПа и частотой смены тактов насоса-маршрутизатора 5 Гц. Насос-маршрутизатор при этом создавал пульсации давления в ячейке 1 периодичностью 1.2 с и амплитудой 0.1 кПа. Периодически с помощью устройства управления задействовался режим возврата фильтрата в контур циркуляции. При этом откачивался фильтрат, скопившаяся в емкости сбора фильтрата 3. После чего, при необходимости уровень питательной среды в трубке 4 восполнялся с помощью режима повышения объема среды. Уровень жидкости в емкости сбора фильтрата контролировался визуально.

Величина указанных значений постоянной составляющей давления (1.2 кПа) и пульсаций (0.1 кПа) контролировалась датчиком давления Honeywell 40РС001В, установленным в верхней пластине в дополнительно изготовленном отверстии, соединенном с микрофлюидным каналом контура циркуляции между клапаном 38 устройства поддержания давления и ячейкой 1.

Таким образом, заявляемый микрофлюидный чип воссоздавал физиологичную картину давления в капилляре кровеносной системы человека и разность давлений в интерстициальной области участка ткани между капилляром и лимфатическим сосудом с величиной постоянной составляющей давления 1.2 кПа и пульсаций давления 0.1 кПа.

Одновременно с переносом четырех моделей в чипы, питательная среда в ячейках планшета с оставшимися четырьмя моделями заменялась 230 мкл питательной среды с антителами ЕрСАМ в концентрации 25 нг/мл, а во внутреннюю часть вставок вносилось 70 мкл свежей питательной среды без антител.

Далее через два часа модели извлекались из вставок и разрезались по оси симметрии. После чего проводился анализ интенсивности флуоресценции в камере ChemiDoc MP. Модели, культивированные в чипах имели практически равномерную окраску, в то время как модели, культивированные в плашке имели окрашенную полоску в нижней части шириной менее 1 мм.

Таким образом, применение заявляемого чипа существенно усиливает адвективный транспорт в моделях ткани, что в большей степени соответствует наблюдениям in vivo.

1. Микрофлюидный чип для культивирования клеток или клеточных моделей, включающий корпус, выполненный из соединенных, по крайней мере, двух, верхней и нижней, пластин, причем в корпусе расположены: микрофлюидные каналы, снабженные, по крайней мере, первым и вторым клапанами, выполненными с возможностью перекрытия каналов; по крайней мере, одна ячейка для культивирования, выполненная с возможностью герметичного размещения в ней вставки с клеточной моделью, делящей ячейку на входную и выходную части; рабочая камера, образованная частью микрофлюидного канала между первым и вторым клапанами по ходу движения питательной среды и снабженная мембраной, где мембрана выполнена с возможностью изменения объема рабочей камеры, при этом первый клапан, рабочая камера, второй клапан, входная часть ячейки для культивирования соединены микрофлюидными каналами с образованием замкнутого контура циркуляции питательной среды, при этом рабочая камера в совокупности с подключенными к ней клапанами и микрофлюидными каналами представляет собой насос-маршрутизатор, обеспечивающий создание пульсирующего течения питательной среды; средство создания постоянного давления в замкнутом контуре циркуляции, подключенное к контуру циркуляции на участке между вторым и первым клапанами по ходу движения питательной среды.

2. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит размещенную в корпусе, по крайней мере, одну емкость сбора фильтрата, подключенную к выходной части ячейки для культивирования клеточной модели.

3. Микрофлюидный чип по п. 2, характеризующийся тем, что емкость сбора фильтрата выполнена сообщающейся с атмосферой посредством выполненного в корпусе канала.

4. Микрофлюидный чип по п. 3, характеризующийся тем, что в канале размещен фильтрующий элемент.

5. Микрофлюидный чип по п. 2, характеризующийся тем, что емкость сбора фильтрата представляет собой полость в корпусе, снабженную мембраной, выполненной с возможностью изменения объема расположенной под мембраной полостью.

6. Микрофлюидный чип по п. 2, характеризующийся тем, что емкость сбора фильтрата содержит датчик, выполненный с возможностью оценки объема фильтрата.

7. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что средство создания постоянного давления содержит мембрану, размещенную в выполненной в корпусе полости, соединенной с контуром циркуляции, при этом мембрана выполнена с возможностью изменения объема полости, расположенной под мембраной.

8. Микрофлюидный чип по п. 7, характеризующийся тем, что средство создания постоянного давления содержит размещенный на мембране груз соответствующей массы, или средство пневматического или гидравлического воздействия на мембрану, или соленоид, закрепленный на корпусе, с размещением его якоря на мембране, или магнит и ферромагнетик, или два притягивающихся или отталкивающихся магнита, размещенные на мембране и корпусе.

9. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что средство создания постоянного давления выполнено в виде расположенной вертикально трубки с размещенной в ней жидкостью с требуемой высотой столба, нижняя часть которой выполнена сопряженной с микрофлюидным каналом контура циркуляции, а верхняя - сообщающейся с атмосферой.

10. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что при подключении средства создания постоянного давления к контуру циркуляции до ячейки для культивирования по ходу движения питательной среды микрофлюидные каналы имеют геометрию, обеспечивающую отношение гидродинамического сопротивления каналов на участке контура циркуляции между первым клапаном по ходу движения среды и ячейкой для культивирования к гидродинамическому сопротивлению каналов между ячейкой для культивирования и средством создания постоянного давления в диапазоне от 10:1 до 200:1.

11. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что при подключении средства создания постоянного давления к контуру циркуляции после ячейки для культивирования по ходу движения питательной среды микрофлюидные каналы имеют геометрию, обеспечивающую отношение гидродинамического сопротивления каналов на участке контура циркуляции между вторым клапаном по ходу движения среды и ячейкой для культивирования к гидродинамическому сопротивлению каналов между ячейкой для культивирования и средством создания постоянного давления в диапазоне от 10:1 до 200:1.

12. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что средство создания постоянного давления выполнено с возможностью создания постоянного давления в контуре циркуляции в диапазоне от 0 до 7 кПа.

13. Микрофлюидный чип по п. 5, характеризующийся тем, что емкость сбора фильтрата снабжена дополнительным средством создания постоянного давления в выходной части ячейки, которое представляет собой размещенный на мембране груз соответствующей массы, или средство пневматического или гидравлического воздействия, или соленоид, закрепленный на корпусе, с размещением его якоря на мембране, или магнит и ферромагнетик, или два притягивающихся или отталкивающихся магнита, размещенных на мембране и корпусе.

14. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит емкость для исходной питательной среды, размещенную за пределами корпуса и подключенную к рабочей камере через отдельный микрофлюидный канал, снабженный клапаном для подключения или отключения упомянутой емкости.

15. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит емкость для сбора отработанной среды, размещенную за пределами корпуса и подключенную к рабочей камере через отдельный микрофлюидный канал, снабженный клапаном для подключения или отключения упомянутой емкости.

16. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что верхняя пластина выполнена из полистирола, полидиметилсилоксана или поликарбоната, а нижняя пластина выполнена из полистирола или стекла.

17. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что корпус содержит дополнительную эластичную пластину, расположенную между верхней и нижней пластинами.

18. Микрофлюидный чип по п. 17, характеризующийся тем, что клапаны, мембрана рабочей камеры, микрофлюидные каналы выполнены в эластичной пластине с обеспечением герметизации каналов посредством нижней пластины.

19. Микрофлюидный чип по п. 17, характеризующийся тем, что микрофлюидные каналы выполнены в верхней и/или нижней пластине, а функцию клапанов и мембраны рабочей камеры выполняют фрагменты эластичной пластины.

20. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что микрофлюидные каналы выполнены в верхней и/или нижней пластине, а мембрана рабочей камеры и клапаны выполнены в виде отдельных эластичных элементов, установленных между пластинами, причем соединение упомянутых пластин и эластичных элементов выполнено с обеспечением герметичности микрофлюидных каналов.

21. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что клапаны и мембрана рабочей камеры выполнены из полидиметилсилоксана или других эластомеров и имеют толщину, выбранную из диапазона от 0.01 до 1 мм.

22. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что мембрана рабочей камеры и клапаны выполнены с возможностью гидравлического или пневматического управления.

23. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что ячейка образована выполненным в корпусе отверстием и снабжена крышкой.

24. Микрофлюидный чип по п. 23, характеризующийся тем, что крышка выполнена с возможностью введения через нее различных растворов и отбора проб циркулирующей питательной среды или фильтрата.

25. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что он содержит, по крайней мере, одну соединенную с контуром циркуляции дополнительную ячейку для культивирования.

26. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что выходная часть ячейки для культивирования соединена с рабочей камерой посредством отдельного микрофлюидного канала, снабженного дополнительным клапаном.

27. Микрофлюидный чип по п. 2, характеризующийся тем, что емкость сбора фильтрата соединена с рабочей камерой посредством отдельного микрофлюидного канала, снабженного дополнительным клапаном.

28. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что он содержит дополнительный клапан, расположенный в контуре циркуляции питательной среды между средством создания постоянного давления и ячейкой для культивирования, для предотвращения вытекания питательной среды из ячейки при установке либо извлечении вставки из ячейки.

29. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что средство создания постоянного давления подключено к контуру циркуляции через отдельный микрофлюидный канал, снабженный дополнительным клапаном для подключения или отключения упомянутого средства.

30. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что он содержит датчик давления в контуре циркуляции.

31. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит порт для забора образцов питательной среды или внесения растворов препаратов, подключенный к контуру циркуляции или рабочей камере посредством микрофлюидного канала.

32. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что микрофлюидные каналы, клапаны и рабочая камера выполнены с возможностью создания течения питательной среды в контуре циркуляции со значением среднего объемного расхода, выбранного из диапазона от 0 до 50 мкл/мин.

33. Микрофлюидный чип по п. 1, характеризующийся тем, что геометрия микрофлюидных каналов, клапаны и рабочая камера выполнены с возможностью создания пульсирующего течения питательной среды с пульсациями давления в ячейке для культивирования в диапазоне от 0 до 500 Па.

34. Способ культивирования клеток или клеточной модели в микрофлюидном чипе по п. 1, согласно которому заполняют микрофлюидные каналы и ячейки для культивирования питательной средой, размещают вставку с клетками или клеточной моделью в ячейке для культивирования, после чего осуществляют их культивирование в условиях циркуляции питательной среды по замкнутому контуру, при этом в контуре циркуляции создают постоянное давление, моделирующее постоянную составляющую разности давлений на участке ткани между кровеносным и лимфатическим сосудами in vivo с помощью средства создания постоянного давления с обеспечением фильтрации питательной среды из входной части ячейки через клетки или клеточную модель в выходную часть ячейки, и пульсирующее течение питательной среды, моделирующее пульсирующее течение крови в кровеносном сосуде in vivo посредством открытия и закрытия первого и второго клапанов и изменения объема рабочей камеры.

35. Способ по п. 34, характеризующийся тем, что для моделирования в клетках или клеточной модели in vitro гидродинамической составляющей микроциркуляции солидной опухоли in vivo дополнительно создают давление в выходной части ячейки от 0 до 2 кПа относительно атмосферного.

36. Способ по п. 34, характеризующийся тем, что постоянное давление в контуре циркуляции создают с обеспечением превышения давления во входной части ячейки над давлением в выходной части на величину в интервале значений от 0 до 7 кПа в зависимости от моделируемого давления в капилляре in vivo.

37. Способ по п. 34, характеризующийся тем, что пульсирующее течение питательной среды в замкнутом контуре обеспечивают с переменной составляющей давления во входной части ячейки для культивирования с амплитудой импульсов из интервалов значений от 10 до 500 Па и длительностью от 50 до 1500 мс, которые выбирают в зависимости от моделируемой переменной составляющей давления в капилляре in vivo, посредством подачи соответствующих управляющих импульсов на первый и второй клапаны и мембрану рабочей камеры.

38. Способ по п. 34, характеризующийся тем, что средняя скорость движения среды во входной части ячейки для культивирования лежит в интервале значений от 0.01 до 2.0 мм/с.

39. Способ по п. 34, характеризующийся тем, что открытие и закрытие первого и второго клапанов, а также изменение объема рабочей камеры проводят циклически по алгоритму: ЗЗМ, ОЗМ, ОЗБ, ЗЗБ, ЗОБ, ЗОМ соответственно, где З - клапан закрыт, О - клапан открыт, М - объем рабочей камеры снижен, Б - объем рабочей камеры увеличен.