Способ определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале

Изобретение относится к токсикологии, а именно к способу определения 3-метоксигидроксибензола в биологических материалах. Для этого образцы, содержащие 3-метоксигидроксибензол, трижды экстрагируют метилацетатом в течение 45 мин. Объединенные экстракты обрабатывают раствором KOH в этаноле, а затем удаляют растворитель испарением при 18-22°С. Остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим НСl в избытке по отношению к щелочи в остатке. Подкисленные ацетоновые экстракты объединяют, обрабатывают водным раствором NaOH для создания избытка щелочной среды и удаляют ацетон в токе воздуха при температуре 18-22°С. Водно-щелочной раствор разбавляют водой, подкисляют до рН 2-3 24% НСl, экстрагируют диэтиловым эфиром и насыщают Na₂SO₄ для удаления остатков воды. Экстракт упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С и хроматографируют на макроколонке с силикагелем КСС 3 80/120 мкм. Смесь элюируют смесью гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему. Фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют и концентрируют до 10 мл. Полученный остаток защелачивают раствором NaOH с рН 12-13, а затем подкисляют 24% НСl до рН 2-3, а затем экстрагируют дихлорметаном и насыщают Na₂SO₄ для удаления остатков воды. Дихлорметановый экстракт обрабатывают N-метил-N-триметилсилил-трифторацетамидом, 20 минут, 60°С для получения триметилсилильного производного 3-метоксигидроксибензола. Определение проводят методом хромато-масс-спектрометрии. Для разделения используют капиллярную колонку (L=25 м d= 0,2 мм), неподвижной фазой 5%-фенил-метилполисилоксан в токе гелия 0,6 мл/мин. Начальная температура термостата колонки составляет 70°С и выдерживается в течение 3 мин, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью изменения 20°С в мин, конечная температура колонки выдерживается 10 мин. Температура инжектора составляет 250°С, температура интерфейса детектора - 300°С. Для регистрации сигнала используют масс-селективный детектор в режиме электронного удара ионизирующим пучком электронов 70 эВ. Количество триметилсилильного производного 3-метоксигидроксибензола вычисляют, используя предварительно построенный калибровочный график при сравнении площадей пиков. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности метода и может быть использовано на санэпидстанциях, в химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораториях. 3 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале (тканях печени и почек), который заключается в том, что биологический объект двукратно по 45 минут обрабатывают этилацетатом при массовом соотношении этилацетата и биоматериала при каждом настаивании 2:1, этилацетатные извлечения объединяют, растворитель из объединенного этилацетатного извлечения испаряют, остаток растворяют в ацетоне, полученный раствор наносят на хроматографическую пластину типа «Сорбфил» с люминесцентным индикатором, хроматографируют в присутствии вещества-свидетеля, используя подвижную фазу бензол-дихлорэтан в соотношении 8:2 по объему, хроматограммы проявляют в УФ-свете, анализируемое вещество элюируют из сорбента этанолом и измеряют оптическую плотность этанольного элюата при длине волны 277,7 нм на фоне раствора, полученного в контрольном опыте [Асташкина А.П., Шорманов В.К., Гришечко О.И. Определение 3-метоксигидроксибензола в биологических объектах методом электронной спектрофотометрии // Биомедицинская инженерия и биотехнология: Сборник материалов V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Курск, 2012. - С. 61-63].

Способ характеризуется относительно низкой чувствительностью.

Известен способ определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект неоднократно (дважды) по 45 минут обрабатывают алкилацетатом, в качестве которого используется этилацетат, отдельные извлечения объединяют, растворитель из объединенного алкилацетатного извлечения испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, хроматографируют в макроколонке силикагеля L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, температура инжектора составляет 250°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 3-метоксигидроксибензола исходя из площади хроматографического пика, полученного регистрацией сигнала по характеристическому молекулярному иону 124 m/Z (Асташкина А.П., Шорманов В.К., Останин М.А., Гришечко О.И., Елизарова М.К. Распределение метоксипроизводных гидроксибензола в организме теплокровных животных. // Фармация. - 2013. - Т. 62, №5. - С. 5-8).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Наиболее близким является способ определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект неоднократно (трижды) по 45 минут обрабатывают метилацетатом, отдельные метилацетатные извлечения объединяют, растворитель из объединенного метилацетатного извлечения испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления ацетона, остаток растворяют в эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°С, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в соотношении 20:5:1 по объему, хроматографируют в макроколонке силикагеля L 40/100 мкм с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в дихлорметане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, температура инжектора составляет 250°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 3-метоксигидроксибензола, исходя из площади хроматографического пика, полученного регистрацией сигнала по характеристическому молекулярному иону 124 m/Z (Патент 2546292 Российская Федерация, МПК G01N 33/50; G01N 30/02. / Способ определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале. / Шорманов В.К., Асташкина А.П., Останин М.А., Елизарова М.К.; заявители и патентообладатели: Шорманов В.К., Асташкина А.П., Останин М.А., Елизарова М.К. - №2013157166; Заяв. 23.12.2013; опуб. 10.04.2015 // Изобретения (Заявки и патенты). - 2015. - №10. - 11 с.).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический объект неоднократно (трижды) по 45 минут обрабатывают метилацетатом, отдельные метилацетатные извлечения объединяют, обрабатывают этанольным раствором гидроксида калия, растворитель из объединенного метилацетатного извлечения испаряют при 18-22°С, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим хлороводородную кислоту в избытке по отношению к гидроксиду калия, находящемуся в остатке, подкисленные ацетоновые извлечения объединяют, обрабатывают водным раствором гидроксида натрия для нейтрализации остатков хлороводородной кислоты в ацетоне и создания избытка щелочной среды, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до удаления ацетона, водно-щелочной остаток разбавляют водой, образующийся раствор подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстракт обезвоживают, упаривают, хроматографируют в макроколонке с силикагелем КСС 3 80/120 мкм с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочной экстракт подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют дихлорметаном, дихлорметановый экстракт обезвоживают, анализируемое вещество, содержащееся в дихлорметановом экстракте, переводят в соответствующее триметилсилильное производное, для чего дихлорметановый экстракт обрабатывают в течение 20 минут - метил-N-триметилсилил-трифторацетамидом в условиях нагревания при температуре 60°С, и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 3-метоксигидроксибензола, исходя из площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий 3-метоксигидроксибензол, неоднократно (трижды) по 45 минут обрабатывают метилацетатом, отдельные извлечения объединяют, обрабатывают этанольным раствором гидроксида калия, растворитель из объединенного метилацетатного извлечения испаряют при 18-22°С, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим хлороводородную кислоту в избытке по отношению к гидроксиду калия, находящемуся в остатке, подкисленные ацетоновые извлечения объединяют, обрабатывают водным раствором гидроксида натрия для нейтрализации остатков хлороводородной кислоты в ацетоне и создания избытка щелочной среды, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до удаления ацетона, водно-щелочной остаток разбавляют водой, образующийся раствор подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстракт обезвоживают, упаривают, хроматографируют в макроколонке с силикагелем КСС 3 80/120 мкм с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочной экстракт подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют дихлорметаном, дихлорметановый экстракт обезвоживают, анализируемое вещество, содержащееся в дихлорметановом экстракте, переводят в соответствующее триметилсилильное производное, для чего дихлорметановый экстракт обрабатывают в течение 20 минут N-метил-N-триметилсилил-трифторацетамидом в условиях нагревания при температуре 60°С, и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 3-метоксигидроксибензола исходя из площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение 3-метоксигидроксибензола в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 см) ткани печени прибавляют 10 мг 3-метоксигидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С.

По истечении указанного времени биологический объект неоднократно (трижды) по 45 минут при перемешивании обрабатывают метилацетатом, порциями по 20 мл каждая.

Отдельные метилацетатные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, обрабатывают 1 мл 8% этанольного раствора гидроксида калия, растворитель из объединенного метилацетатного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°С, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают при энергичном перемешивании порциями (по 15 г каждая) ацетона, содержащего концентрированную (10 М) хлороводородную кислоту в количестве 1%, что обеспечивает избыток хлороводородной кислоты по отношению к гидроксиду калия, находящемуся в остатке, подкисленные ацетоновые извлечения объединяют, обрабатывают 2 мл 10% водного раствора гидроксида натрия для нейтрализации остатков хлороводородной кислоты в ацетоне и создания избытка щелочной среды, ацетон удаляют из объединенного извлечения путем его упаривания в токе воздуха при температуре 18-22°С, водно-щелочной остаток разбавляют водой, доводя объем раствора до 10 мл, образующийся раствор подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 10 мл, эфирные экстракты объединяют, объединенный экстракт обезвоживают, пропуская через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл диэтилового эфира. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°С до объема 4-5 мл, полученный объем смешивают с 1,5 г силикагеля КСС 3 80/120 мкм и испаряют остатки эфира из сорбента в токе воздуха при 18-22°С.

В хроматографическую макроколонку размером 490×11 мм вносят вначале 8,5 г силикагеля КСС 3 80/120 мкм, а затем, поверх образующегося слоя, - 1,5 г силикагеля КСС 3 80/120 мкм, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде эфирного раствора.

Хроматографируют в колонке с силикагелем, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 соотношении 20:5:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 8 по 15 включительно, содержащие анализируемое вещество (3-метоксигидроксибензол), объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до объема 6-8 мл, доводят до 10 мл смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 соотношении 20:5:1 по объему, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с рН 12-13, отдельные экстракты отделяют, объединяют, объединенный водно-щелочной экстракт подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают полученный раствор сульфатом натрия и экстрагируют порциями дихлорметана трижды по 8 мл каждая. Отдельные органические экстракты отделяют, объединяют, объединенный дихлорметановый экстракт обезвоживают, пропуская через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 10 мл дихлорметана. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до объема 2-3 мл и доводят дихлорметаном до 5 мл (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл и переводят анализируемое вещество, содержащееся в растворе, в соответствующее триметилсилильное производное, для чего раствор обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл дериватизирующего реагента, которым является N-метил-N-триметилсилил-трифторацетамид, в условиях нагревания при 60°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки (раствор Б).

4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят хромато-масс-спектрометрическим методом, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя - 150°С, температура источника ионов - 230°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 3-метоксигидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,05 мин соответствует триметилсилильному производному 3-метоксигидроксибензола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 40, 45, 59, 73, 89, 106, 121, 133, 151, 165, 181, 196. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 181, интенсивность которой принимается за 100%. Молекулярный ион - частица с массовым числом 196.

Качественное определение 3-метоксигидроксибензола осуществляют по времени удерживания соответствующего триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки, а также специфическому набору и интенсивности сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 3-метоксигидроксибензола, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,2, 0,5, 1,0, 5,0 мл 0,125% раствора и 1,0, 5,0, 10,0, 20,0 мл 1,25% раствора 3-метоксигидроксибензола и доводят объем содержания каждой колбы до метки дихлорметаном.

0,1 мл каждого из растворов вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл Nтрет-бутил-диметилсилил-N-метилтрифторацетамида в условиях нагревания при 60°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят хромато-масс-спектрометрическим методом, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя - 150°С, температура источника ионов - 230°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 3-метоксигидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 2⋅10^-10 - 2⋅10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид

S=194201⋅С-9256,

где S - площадь хроматографического пика; С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения 3-метоксигидроксибензола в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 3-метоксигидроксибензола в ткани легких

К 10 г мелкоизмельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 см) ткани легких прибавляют 10 мг 3-метоксигидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°С.

По истечении указанного времени биологический объект неоднократно (трижды) по 45 минут при перемешивании обрабатывают метилацетатом, порциями по 20 мл каждая.

Отдельные метилацетатные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, обрабатывают 1 мл 8% этанольного раствора гидроксида калия, растворитель из объединенного метилацетатного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°С, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают при энергичном перемешивании порциями (по 15 г каждая) ацетона, содержащего концентрированную (10 М) хлороводородную кислоту в количестве 1%, что обеспечивает избыток хлороводородной кислоты по отношению к гидроксиду калия, находящемуся в остатке, подкисленные ацетоновые извлечения объединяют, обрабатывают 2 мл 10% водного раствора гидроксида натрия для нейтрализации остатков хлороводородной кислоты в ацетоне и создания избытка щелочной среды, ацетон удаляют из объединенного извлечения путем его упаривания в токе воздуха при температуре 18-22°С, водно-щелочной остаток разбавляют водой, доводя объем раствора до 10 мл, образующийся раствор подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром дважды порциями по 10 мл, эфирные экстракты объединяют, объединенный экстракт обезвоживают, пропуская через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл диэтилового эфира. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°С до объема 4-5 мл, полученный объем смешивают с 1,5 г силикагеля КСС 3 80/120 мкм и испаряют остатки эфира из сорбента в токе воздуха при 18-22°С.

В хроматографическую макроколонку размером 490×11 мм вносят вначале 8,5 г силикагеля КСС 3 80/120 мкм, а затем, поверх образующегося слоя, - 1,5 г силикагеля КСС 3 80/120 мкм, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде эфирного раствора.

Хроматографируют в колонке с силикагелем, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 соотношении 20:5:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 8 по 15 включительно, содержащие анализируемое вещество (3-метоксигидроксибензол), объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С до объема 6-8 мл, доводят до 10 мл смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 соотношении 20:5:1 по объему, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с рН 12-13, отдельные экстракты отделяют, объединяют, объединенный водно-щелочной экстракт подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают полученный раствор сульфатом натрия и экстрагируют порциями дихлорметана трижды по 8 мл каждая. Отдельные органические экстракты отделяют, объединяют, объединенный дихлорметановый экстракт обезвоживают, пропуская через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 10 мл дихлорметана. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до объема 2-3 мл и доводят дихлорметаном до 5 мл (раствор А).

0,1 мл раствора А вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл и переводят анализируемое вещество, содержащееся в растворе, в соответствующее триметилсилильное производное, для чего раствор обрабатывают в течение 20 минут 0,016 мл дериватизирующего реагента, которым является N-метил-N-триметилсилил-трифторацетамид, в условиях нагревания при 60°С, продукт реакции вместе с содержимым пробирки количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят дихлорметаном до метки (раствор Б).

4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят хромато-масс-спектрометрическим методом, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 10 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя - 150°С, температура источника ионов - 230°С, температура интерфейса детектора - 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 3-метоксигидроксибензола по площади хроматографического пика его триметилсилильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,6 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 3,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,05 мин соответствует триметилсилильному производному 3-метоксигидроксибензола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 40, 45, 59, 73, 89, 106, 121, 133, 151, 165, 181, 196. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 181, интенсивность которой принимается за 100%. Молекулярный ион - частица с массовым числом 196.

Качественное определение 3-метоксигидроксибензола осуществляют по времени удерживания соответствующего триметилсилильного производного в неподвижной фазе колонки, а также специфическому набору и интенсивности сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание 3-метоксигидроксибензола, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся в примере 1.

Результаты количественного определения 3-метоксигидроксибензола в ткани легких представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 100 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 3,2 раза - в биологическом материале.

Сравнительные характеристики предлагаемого и известного способов представлены в таблице 3.

Способ определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале, заключаюшийся в том, что биологический объект неоднократно (трижды) по 45 минут обрабатывают метилацетатом, отдельные метилацетатные извлечения объединяют, растворитель из объединенного метилацетатного извлечения испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°C до удаления ацетона, хроматографируют в макроколонке силикагеля с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 20:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°C, данная температура выдерживается в течение 3 минут, в дальнейшем температура программируется от 70°C до 290°C со скоростью 20°C в минуту, температура инжектора составляет 250°C, температура интерфейса детектора - 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 3-метоксигидроксибензола, исходя из площади хроматографического пика, отличающийся тем, что после объединения отдельных метилацетатных извлечений их обрабатывают этанольным раствором гидроксида калия, после испарения растворителя из объединенного метилацетатного извлечения остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим хлороводородную кислоту в избытке по отношению к гидроксиду калия, находящемуся в остатке, подкисленные ацетоновые извлечения объединяют, обрабатывают водным раствором гидроксида натрия для нейтрализации остатков хлороводородной кислоты в ацетоне и создания избытка щелочной среды, после упаривания в токе воздуха при 18-22°C до удаления ацетона водно-щелочной остаток разбавляют водой, образующийся раствор подкисляют до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстракт обезвоживают, упаривают, при хроматографировании в макроколонке используют силикагель КСС-3 80/120 мкм, после объединения фракций элюата, содержащих анализируемое вещество, экстрагируют буферным раствором с pH 12-13, водно-щелочной экстракт подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют дихлорметаном, дихлорметановый экстракт обезвоживают, анализируемое вещество, содержащееся в дихлорметановом экстракте, переводят в соответствующее триметилсилильное производное, для чего дихлорметановый экстракт обрабатывают в течение 20 минут N-метил-N-триметилсилил-трифторацетамидом в условиях нагревания при температуре 60°C, а количество 3-метоксигидроксибензола вычисляют исходя из площади пика его триметилсилильного производного.