Способ получения пробиотической композиции

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в получении пробиотиков, предназначенных для непосредственного потребления или в качестве биологически активной добавки к продуктам питания, при производстве кисломолочных продуктов профилактического назначения, предназначенных в частности для нормализации уровня холестерина и полезной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и повышения общей резистентности организма. Изобретение включает способ получения пробиотической композиции для снижения уровня холестерина, содержащей сухую биомассу пробиотических штаммов бактерий В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884, L. fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556, L. acidophilus АСТ-44. Указанный способ включает раздельное культивирование штаммов В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884 на среде Блаурокка, штаммов L. fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556 и L. acidophilus АСТ-44 В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884, L. fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556, L. acidophilus АСТ-44 ВКПМ - В-9647 на MRS-бульоне при 37°C±1°C до стационарной фазы развития, концентрирование, смешивание с защитной средой, высушивание и смешивание сухой биомассы пробиотических штаммов в равных количествах. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 6 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в получении пробиотиков, предназначенных для непосредственного потребления или в качестве биологически активной добавки к продуктам питания, при производстве кисломолочных продуктов профилактического назначения, предназначенных, в частности, для нормализации уровня холестерина и полезной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и повышения общей резистентности организма.

Пробиотические микроорганизмы хорошо известны из уровня техники.

Обычно в качестве пробиотиков используются молочнокислые бактерии, включая лактобактерии (Lactobacillus) и бифидобактерии (Bifidobacterium), но также могут использоваться и другие, включая рода Lactococcus, Propionibacterium, Bacillus, Saccharomyces, Streptococcus, а также штаммы рода Escherichia.

Наиболее доступны и распространены пробиотики в составе пищевых продуктов. Однако также известны порошки, таблетки и капсулы, содержащие пробиотики. Таким образом, пробиотики могут использоваться в различных видах продукции профилактического назначения.

Пробиотические микроорганизмы могут быть введены субъекту для обеспечения благоприятного эффекта, например такого, как улучшение микрофлоры кишечника. Пробиотики могут подавлять численность жизнеспособных нежелательных микроорганизмов продуцированием антибактериальных соединений путем конкуренции за питательные вещества или за участки адгезии. Кроме того, они могут изменять микробный метаболизм путем увеличения или уменьшения ферментативной активности или они могут стимулировать иммунную систему путем увеличения уровня антител или увеличения активности макрофагов. Так, известно, что пробиотические микроорганизмы могут участвовать в выполнении жизненно важных функций в организме человека (см. Синбиотики в технологии продуктов питания: Рогов И.А. и др., М: МГУПБ, 2006, Амерханова A.M. Роль пробиотических микроорганизмов в современных технологиях профилактической и восстановительной медицины и возможности повышения эффективности препаратов на их основе. Новые лекарственные средства, 2007, №4, с. 4-7).

Известно, что применение пробиотиков положительно сказывается на поддержании и/или восстановлении здоровья кишечника и предотвращает возникновение дисбиозов любой этиологии (см., например, RU 2536939 C2, 27.12.2014). Также известна возможность использования пробиотиков для профилактики рака ободочной и прямой кишки, или для профилактики и лечения воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), или для профилактики и лечения вагинальных инфекций и воспалительных состояний во влагалище, или для восполнения и восстановления баланса непатогенной кишечной бактериальной флоры (см. RU 2364623 C2, 20.08.2009).

Широко распространено использование пробиотиков в составе кисломолочных продуктов (RU 97108832 A, 27.04.1999, KZ 24649 17.10.2011 A4, WO 2010/055499, 20.05.2010). Преимущества пробиотиков по сравнению с кисломолочными продуктами, обладающими пробиотическими свойствами, заключаются в том, что они могут употребляться с различными продуктами питания.

Так, из уровня техники известен способ получения пробиотика «Симбитер-2» и способ производства с его использованием кисломолочного продукта (RU 97108832 A 27.04.1999). Способ получения пробиотика предусматривает совместное культивирование в молочной среде бифидобактерий разных видов, уксуснокислых бактерий и пропионовокислых бактерий, которые смешивают с предварительно полученным консорциумом молочнокислых бактерий в соотношении 4:1. С использованием такого пробиотика получают кисломолочный продукт на основе молока, или пахты, или смеси молока с пахтой, или смеси молока с молочной сывороткой, или смеси пахты с сывороткой. Недостатком указанного способа получения пробиотика является то, что при совместном культивировании разных видов бифидобактерий, отличающихся динамикой развития, не всегда можно гарантировать получение пробиотика стабильного качества, где будут представлены в нужном количестве все используемые виды бифидобактерий. Применение данного пробиотика ограничивается только его использованием для получения кисломолочных продуктов определенного состава и имеющих короткий срок годности.

Из уровня техники известен также способ получения сухого бактериального препарата «Бифацид» (RU 2083666 C1, 10.07.1997), предусматривающий приготовление питательной среды, термическую обработку ее, охлаждение до температуры инкубирования, раздельное культивирование конкретных штаммов ацидофильных бактерий и бифидобактерий, смешивание их в равных соотношениях, сублимационное высушивание. Недостатком данного способа получения сухого бактериального препарата является использование питательных сред, наиболее благоприятных для накопления клеток конкретных штаммов ацидофильных бактерий и бифидобактерий и не содержащих ингредиентов, способствующих усилению пробиотического действия препарата в организме человека.

По мере изучения пробиотических бактерий ученые сообщают о выявлении у них функциональных свойств, таких как способность к участию в регулировании уровня холестерина в крови (Getz G.S. Animal models of atherosclerosis, Arterioscler Tromb Vase Biol, Vol 32, №5, 2012, p. 1104-1115, Хамагаева И.С. и др. Исследование холестеринметаболизирующих свойств пробиотических микроорганизмов. - Молочная промышленность, 2011, №10, с. 56, Kumar et. al. Cholesterol-lowering probiotics as potential biotherapeutics for metabolic diseases, Experimental diabetes research, 2012, T. 2012, p. 14). Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из главных причин смертности среди средней и старшей возрастных групп людей в разных странах мира. Повышенный уровень липидов в крови признан основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, в частности коронарной болезни сердца и других нарушений здоровья в развивающихся странах. Прежде всего, клинические испытания показывают связь между уровнем холестерина и риском возникновения коронарной болезни сердца (Getz G.S. Animal models of atherosclerosis, Arterioscler Tromb Vasc Biol, Vol 32, №5, 2012, p. 1104-1115, Бондаренко B.M. Роль условно-патогенных бактерий при хронических воспалительных процессах различной локализации. –Тверь : ООО «Издательство «Триада»», 2001, 88 с.).

Известна композиция, включающая эффективное количество по меньшей мере одного из штаммов, выбранных из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528 и Lactobacillus plantarum CECT 7529 или их мутантных штаммов, где мутантные штаммы получают с использованием депонированных штаммов в качестве исходного материала и где мутантные штаммы сохраняют или дополнительно улучшают снижающую холестерин активность исходных штаммов, используемая для снижения уровня холестерина (RU 2012118639, 20.11.2013).

Авторами настоящего изобретения в статье «Холестеринредуцирующие пробиотические бактерии в молочной продукции». Молочная промышленность, №5, 2014, были предложены два консорциума бактерий, которые снижают концентрацию холестерина в питательной среде.

Однако на настоящий момент существует потребность в поиске более эффективных пробиотических штаммов или композиций пробиотических штаммов для снижения уровня холестерина, поскольку известные пробиотические штаммы и композиции не обеспечивают желаемого уровня снижения холестерина.

Задачей настоящего изобретения является получение высокоэффективной пробиотической композиции, снижающей уровень холестерина.

Таким образом, технический результат заключается в увеличении способности пробиотических штаммов, входящих в состав композиции, снижать уровень холестерина.

Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что состав питательной среды влияет на способность клеток пробиотиков к снижению концентрации холестерина. Кроме того, была исследована интенсивность снижения концентрации холестерина пробиотическими штаммами на разных этапах их развития на выбранных средах. При этом неожиданно обнаружено, что этап развития оказывает влияние на способность к снижению концентрации холестерина пробиотическими штаммами.

Сущность предлагаемого технического решения состоит в способе получения пробиотической композиции для снижения уровня холестерина, содержащей сухую биомассу пробиотических штаммов бактерий В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884, L. Fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. Rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. Plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556, L. Acidophilus АСТ-44 ВКПМ В-9647, включающем раздельное культивирование штаммов В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884 на среде Блаурокка, штаммов L. Fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. Rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. Plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556 и L. Acidophilus АСТ-44 ВКПМ В-9647 на MRS-бульоне при 37°C±1°C до стационарной фазы развития, концентрирование, высушивание и смешивание сухой биомассы пробиотических штаммов в равных количествах.

Поставленная задача решалась следующим образом.

Для начала были проведены эксперименты по изучению способности штаммов пробиотиков снижать концентрацию холестерина. В качестве штаммов пробиотиков были выбраны следующие штаммы: В. adolescentis BGV-11, В. bifidum GG-72, L. Acidophilus АСТ-44, L. Fermentum LFM-2, L. Plantarum ГВИ-1, L. Rhamnosus LC-52GV; L. Acidophilus ACT-41, L. Acidophilus 887.

Был проверен характер их роста в среде культивирования, содержащей холестерин с эмульгирующим агентом (рисунок 1). Оказалось, что холестерин в сочетании с Твин-80 у всех штаммов увеличивает концентрацию клеток от 1,2 раза (В. adolescentis BGV-11) до 11,2 раза (L. Rhamnosus LC-52GV). В среднем увеличение роста у всех изученных штаммов составило 3,8 раза. Штамм В. bifidum GG-72 увеличил рост в 2,2 раза в присутствии холестерина и Твин-80.

Результаты исследований показали наличие разной способности к снижению концентрации холестерина у изученных штаммов (рисунок 2). Выявлено, что наибольшей способностью к снижению концентрации холестерина в данных условиях обладали штаммы: В. adolescentis BGV-11 - на 33,6±0,9%, В. bifidum GG-72 - на 37,6±0,38%; L. Acidophilus АСТ-44 - на 16,0±0,41%, L. Fermentum LFM-2 - на 29,6±0,73%; L. Plantarum ГВИ-1 - на 30,6±1,4%, L. Rhamnosus LC-52GV - на 27,4±2,1%; наименьшей L. Acidophilus АСТ-41 - на 10,6±2%, L. Acidophilus 887 - на 13,4±0,6%.

Кроме того, были проведены исследования пробиотических культур на клетках CaCo-2 для выяснения способности к адгезии. Были получены данные о количестве клеток изучаемых штаммов пробиотиков, способных к адгезии к модельным клеткам эпителия кишечника CaCo-2. Уровень адгезии оценивали на основании количества бактериальных клеток, прикрепившихся к 1000 клеток CaCo-2 (см. табл. 1).

Таким образом, оказалось, что три штамма являются самыми перспективными сразу по двум показателям (адгезия к клеткам CaCo-2 и снижение концентрации холестерина in vitro) - это штаммы В. bifidum GG-72, В. adolescentis BGV-11, L. Rhamnosus LC-52GV. На втором месте по перспективности оказались пробиотические штаммы: L. Plantarum ГВИ-1, L. Fermentum LFM-2. И наименее перспективными оказались три штамма: L. Acidophilus АСТ-41, L. Acidophilus АСТ-44; L. Acidophilus 887. Хотя последние три штамма занимают последнее место по результатам построения математической поверхности, они относятся к «средней» группе адгезивности, а штамм L. Acidophilus АСТ-44 проявил не самую низкую способность к снижению концентрации холестерина 16±0,41%. Данный штамм ацидофильных молочнокислых бактерий является ценным с точки зрения выработки молочной кислоты, антагонизма по отношению к условно патогенным и патогенным тест-культурам, поэтому целесообразно штамм L. Acidophilus АСТ-44 использовать в пробиотической композиции.

На основании обработки и анализа полученных данных по изучению адгезионных свойств и способности к снижению концентрации холестерина, были отобраны штаммы для создания пробиотической композиции: В. bifidum GG-72; L. Fermentum LFM-2; L. Plantarum ГВИ-1, L. Rhamnosus LC-52GV, L. Acidophilus ACT-44.

Далее была изучена возможность усиления целевой активности - снижения концентрации холестерина у штаммов пробиотиков. Известно, что состав питательной среды и условия культивирования, фаза развития микроорганизмов влияют на их метаболизм. Однако информации в уровне техники о влиянии перечисленных факторов на способность клеток пробиотиков к снижению концентрации холестерина не обнаружено.

На первом этапе сравнивали влияние различных питательных сред.

В отношении варьирования условиями культивирования в русле исследования возможности усиления свойств пробиотических бактерий самым первым подходом представлялся выбор питательных сред различного состава (таблица 2, таблица 3).

Для лактобактерий распространенными средами культивирования служат среда MRS и среда для лактобактерий, сравнительный состав которых приведен в таблице 2.

Оказалось, что рассматриваемые штаммы проявили наибольшую способность к снижению концентрации холестерина на MRS-бульоне. Штамм L. Fermentum LFM-2 проявлял практически одинаковую способность к снижению концентрации холестерина как на MRS-бульоне, так и на среде для лактобактерий (таблица 3).

При изучении влияния состава питательных сред на снижение концентрации холестерина штаммом В. bifidum GG-72 использовали питательные среды: MRS-бульон с добавлением 0,05% L-цистеина, ГМК-2, Блаурокка, которые наиболее широко используются в микробиологической практике. Сравнительный состав этих питательных сред рассмотрен ниже (таблица 4).

Анализ результатов показал, что способность к снижению концентрации холестерина у изучаемых штаммов бифидобактерий в большей степени проявлялась при их развитии на среде Блаурокка (таблица 5).

Далее была изучена интенсивность снижения концентрации холестерина пробиотическими штаммами на разных этапах их развития на выбранных средах. Полученные результаты исследования зависимости способности отобранных штаммов к снижению концентрации холестерина от стадии роста приведены на рисунках 3-7.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что в течение развития культур пробиотических микроорганизмов наблюдается изменение их способности к снижению концентрации холестерина в среде культивирования. Выявлено, что наибольшая способность у изученных штаммов пробиотических бактерий к снижению концентрации холестерина в среде культивирования проявляется в конце фазы логарифмического роста - в самом начале стационарной фазы роста.

Количество клеток в момент наибольшей способности к снижению концентрации холестерина у разных исследованных пробиотических штаммов отличалось (таблица 6).

Таким образом, была установлена зависимость способности к снижению концентрации холестерина от стадии роста пробиотических штаммов: наибольшая способность отмечалась в конце фазы логарифмического роста - начале стационарной фазы, что составляло 12-14 ч после начала развития в зависимости от штамма. Разная способность к снижению концентрации холестерина, в зависимости от возраста культуры, может быть связана с различиями интенсивности метаболизма и разной адсорбирующей способностью клеточных стенок.

Таким образом на основании проведенных исследований можно сделать вывод, что рациональными условиями биотехнологии изученных штаммов пробиотических бактерий, проявляющих способность к снижению концентрации холестерина, являются: питательная среда для бифидобактерий - Блаурокка; для лактобактерий - MRS-бульон; культивирование при 37±1°C до стационарной фазы развития.

Была исследована сочетаемость выбранных штаммов пробиотических бактерий, полученные данные приведены на рисунке 8. Колонии пробиотических штаммов в виде штрихов в зоне их пересечения оказались равномерными без явных зон ингибирования роста. Установлено, что штаммы не проявляют антагонизма по отношению друг к другу и, таким образом, доказана возможность их совместного присутствия в пробиотической композиции.

Предлагаемый способ получения пробиотической композиции, снижающей холестерин, заключается в следующем:

1. Каждый штамм культивируют отдельно при установленных оптимальных условиях, обеспечивающих максимальное снижение концентрации холестерина: штамм В. bifidum GG-72 культивируют на среде Блаурокка при температуре 37°C в течение 14 часов до наступления стационарной фазы; штамм L. rhamnosus LC-52GV культивируют на среде MRS-бульон при температуре 37°C в течении 13 часов до наступления стационарной фазы; штамм L. plantarum ГВИ-1 культивируют на среде MRS-бульон при температуре 37°C в течение 12,5 часов до наступления стационарной фазы; штамм L. fermentum LFM-2 культивируют на среде MRS-бульон при температуре 37°C в течение 13,5 часов до наступления стационарной фазы; штамм L. acidophilus АСТ-44 культивируют на среде MRS-бульон при температуре 37°C в течение 12 часов до наступления стационарной фазы.

2. После культивирования полученную культуральную жидкость каждого отдельного штамма концентрируют, смешивают с защитной средой в соотношении 1:2 и тщательно перемешивают.

3. Биомассу, смешанную с защитной средой, в асептических условиях разливают на стерильные поддоны, помещают в сублимационную установку, в которой происходит высушивание до получения сухой биомассы с массовой долей влаги не более 4,0%.

4. Для получения пробиотической композиции в стерильную емкость вносят равное количество сухой биомассы каждого штамма и тщательно перемешивают. После чего сухую пробиотическую композицию фасуют.

Выявлено, что в составе композиции штаммы пробиотиков проявляли усиление способности к снижению концентрации холестерина. Композиция проявила способность снижать концентрацию холестерина в условиях in vitro на 47,6%, что больше способности снижать концентрацию холестерина у любого отдельного штамма в фазе логарифмического роста:

1. Способ получения пробиотической композиции для снижения уровня холестерина, содержащей сухую биомассу пробиотических штаммов бактерий В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884, L. fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556, L. acidophilus АСТ-44 ВКПМ - В-9647, включающий раздельное культивирование штаммов В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884 на среде Блаурокка, штаммов L. fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556 и L. acidophilus АСТ-44 ВКПМ В-9647 на MRS- бульоне при 37°С±1°С до стационарной фазы развития, концентрирование, смешивание с защитной средой, высушивание и смешивание сухой биомассы пробиотических штаммов в равных количествах.

2. Пробиотическая композиция, полученная способом по п. 1, содержащая сухую биомассу пробиотических штаммов бактерий В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884, L. fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556, L. acidophilus АСТ-44 ВКПМ В-9647 в равных количествах.