Терапевтическая вакцина против рака

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения вакцины лечения рака у млекопитающего. Раковая вакцина включает экспрессирующие один или более антигенов раковые клетки и эксципиенты, где указанный антиген экспрессируется раковыми клетками с повышенным уровнем p38 и где указанные раковые клетки получены приведением в контакт указанных раковых клеток и Mycobacterium w. Группа изобретений относится также к способу лечения рака у млекопитающего, включающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества вышеуказанной раковой вакцины. Использование данной группы изобретений позволяет индуцировать как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ против гомологичных, а также гетерологичных опухолевых клеток. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 пр., 1 табл., 10 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Область настоящего изобретения относится к терапевтическим вакцинам, предназначенным для применения в лечении злокачественных опухолей, обладающим иммуногенностью по отношению к гетерогенным раковым антигенам, специфичным для ткани/органа. Изобретение также предоставляет способ для приготовления указанного.

Уровень техники

Известно, что злокачественные опухоли содержат в своем составе много различных типов клеток. Эти клетки имеют гены и белки, которые сильно отличаются друг от друга. И растут они с различными скоростями. Это известно как гетерогенность. Гетерогенность приводит также к необходимости для эффективного лечения злокачественных опухолей соединять химиотерапию с радиотерапией и/или другим типом химиотерапии в комбинации.

У специфичного для ткани/органа рака число хорошо охарактеризованных антигенов недостаточно. Для преодоления этой проблемы в качестве антигена используют раковые клетки. Использование раковых клеток обеспечивает преимущество ассортимента антигенов, присутствующих на раковых клетках.

Раковые клетки могут быть отобраны у тех же самых пациентов (аутологичные) или у другого пациента (аллогенные).

Использование в вакцинах аутологичных раковых клеток представляет собой персонализованную терапию и сопряжено с практическими трудностями. Аутологичные клетки могут не быть доступными у всех пациентов. Если же они доступны, они могут быть не в нужном количестве и/или не нужного качества. Этот подход также отнимает много времени. Этот подход связан также с трудностями урегулирования.

Заманчиво использовать аллогенные клетки в качестве антигена в терапевтической вакцине. Однако такой подход чреват отсутствием общего антигена (общих антигенов), поскольку раковые клетки из ткани/органа по своей природе гетерогенны. Аллогенные раковые клетки не способны обеспечить иммунную реакцию на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа. К примеру линии аллогенных клеток рака поджелудочной железы Mia-paca-2 и Panc-1 создают иммунный ответ на самих себя. Однако линия клеток Mia-paca-2 не может обеспечить иммунный ответ на Panc-1, а Panc-1 не может обеспечить иммунный ответ на Mia-paca-2.

Это можно преодолеть использованием в вакцине множественно гетерогенных аллогенных раковых клеток или идентификацией антигена, присутствующего в раковой ткани, и использованием специфической вакцины к нему.

Гетерогенность опухоли затрудняет получение терапевтической вакцины с одиночным антигеном для обеспечения иммунной реакции на все клетки/большинство клеток, содержащихся в опухоли. По этой причине необходимо в терапевтической вакцине объединять аллогенные клетки/антигены, чтобы она была эффективной против опухоли в целом.

Было продемонстрировано, что проблема гетерогенности рака/опухолей разрешается использованием в качестве антигена более одной клетки. Emens et al. продемонстрировали использование более чем одной линии аллогенных клеток для перекрывания антигенного ассортимента гетерогенной опухоли/рака (Emens L.A. et al; J. Clin. Oncol. 2009 Dec 10; 27(35): 5911-8). В то же время Laheru D. et al. продемонстрировали использование GM CSF с целью повышения иммуногенности вакцины с аллогенными раковыми клетками для лечения рака. (Clin. Cancer Res. 2008 Mar 1; 14(5): 1455-63).

To, что фиксированные формалином опухолевые клетки эффективно индуцируют противоопухолевый иммунитет как в профилактических, так и в терапевтических условиях, было объяснено Chikage Obata в Journal of dermatological science, Volume 34, issue 2, Pages 209-219 (May 2004). Результаты клинического исследования противоопухолевой вакцины с фиксированными формалином аутологичными клетками у пациентов с множественными формами глиобластомы опубликованы Ishikawa Е. в Cancer Sci. 2007. Aug; 98(8): 1226-33. Epub 2007 May 22. В обоих исследованиях была установлена эффективность по отношению к гомологичным раковым клеткам/опухолям, Но никто не продемонстрировал убиение вакциной гетерогенных раковых клеток, специфичных для ткани/органа.

Поэтому существует необходимость получения терапевтической вакцины с использованием в качестве антигена аллогенных клеток для применения в лечении рака, которая вызывает иммунную реакцию на гетерогенный раковый антиген (антигены), специфичный (специфичные) для ткани/органа. Например, терапевтическая вакцина для рака поджелудочной железы, использующая линию клеток Mia-paca-2, вызывает иммунную реакцию на Panc-1 и другие клетки рака поджелудочной железы.

Гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, - это раковые клетки, которые присутствуют в тех же самых ткани/органе или происходят из тех же самых ткани/органа, но не способны создавать иммунный ответ и/или реагировать с иммунным ответом, создаваемым раковыми клетками, которые присутствуют в тех же самых ткани/органе или происходят из тех же самых ткани/органа.

Методы отбора раковых клеток и их сохранения или их поддержания хорошо известны. Эти методы можно использовать как для аутологичных, так и для аллогенных клеток. Список некоторых имеющихся линий аллогенных раковых клеток для разных типов опухолей приведен далее. Линии клеток могут быть получены из различных хранилищ, таких как American Type Culture Collection (USA); Cell bank Australia (Australia); Coriell Cell Repositories (New Jersey USA); European Collection of Cell Cultures (ECACC) (UK); German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Germany); Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) (Japan); German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Germany); Korean Cell bank (Korea); RIKEN Biresource Centre (Japan); Human Genetics Resource Center (USA); National Centre for Cell Science (India); MMRRC: Mutant Mouse Regional Resource Centers (USA); National Human Neural Stem Cell Resource (USA); UK Stem Cell Bank (UK) и NCCS (India).

Эти или новые линии клеток или специфические раковые клетки могут быть также выделены, как описано в работе Eton О. et al. Active immunotherapy with В irradiated autologous whole melanoma cells plus DETOX in patients with metastatic melanoma. // Clinical cancer research, March 1998, Vol.4, 619-627. Свежую опухоль получали во время хирургической операции в отделе замороженных препаратов и измельчали нарезанием. Для получения максимального выхода жизнеспособных опухолевых клеток для приготовления вакцины опухолевую массу фрагментировали с помощью коллагеназы 1 типа (2 мг/мл) и ДНКазы IV типа (0,4 мг/мл) по прописи Sigma chemical Co., St Loius, MO, ссылка 25. Эти ферменты могут изменять иммуногенность полученного препарата клеток. Диссоциированные клетки промывали HBSS с гентамицином и ресуспендировали в равных объемах HBSS и охлажденного раствора 10% ДМСО +4% человеческого сывороточного альбумина. Аликвоты, содержавшие 1,5-2×10⁷ жизнеспособных опухолевых клеток, хранили в жидком азоте.

Robert О et al. (Induction of Delayed-Type Hypersensitivity to Autologous Tumor is Associated with Improved Survival // Cancer biotherapy and Radiopharmaceuticals. Volume 17, Number 1, 2002) описали применение облученных клеток из линий аутологичных опухолевых клеток как специфичную для пациента вакцинотерапию у 125 пациентов с метастазирующим раком. Они создали краткосрочные культуры чистых опухолевых клеток для использования в качестве вакцин из аутологичных опухолевых клеток в попытке исследовать эффекты специфичной для пациента иммунотерапии. От пациентов с метастазирующим раком получали хирургически удаленные свежие опухоли. Жизнеспособные линии опухолевых клеток (5×10⁷) доращивали до 10⁸ клеток, облучали и криоконсервировали для клинического использования. После исходного теста на гиперчувствительность замедленного типа (delayed-type hypersensitivity, DTH) к внутрикожному введению 10⁶ облученных аутологичных опухолевых клеток пациенты получали 3 еженедельных подкожных инъекции 10⁷ клеток. Затем на 4-й неделе проводили повторный DTH тест, после чего пациенты получали ежемесячные вакцинации в течение 5 месяцев. Позитивный DTH тест определяли как уплотнение размером ≥10 мм; выживание отсчитывали от первого DTH теста.

Опубликована работа Dillman R.O. et al. Establishing in vitro cultures of autologous tumor cells for use in active specific immunotherapy in emphasis // Tumor Immunol. 1993 Jul; 14(1): 65-69. Авторы отбирали свежие опухоли и пытались создать краткосрочные культуры опухолевых клеток для получения 108 клеток, которые потом могли быть использованы в программах получения вакцин с аутологичными опухолевыми клетками. Свежие опухоли механически обрабатывали, чтобы положить начало первичным культурам в среде RPMI-1640, содержащей 1 мМ пируват натрия, 2 мМ глутамин, 10 мМ N-(2-оксиэтил)-пиперазин-N'-(2-этансульфоновую) кислоту, 15% сыворотку коровьего эмбриона (FBS) и антибиотики, и инкубировали при 37°C в 5% CO₂. Авторам удалось вырастить 87 культур всего из 142 опухолей [61%, (95% доверительный интервал 55-68%)], в том числе 39 из 58 меланом (67%), 10 из 10 карцином клеток почки (100%), 14 из 14 сарком (100%) и 23 из 54 различных аденокарцином (43%).

Опубликована работа Jaffee Е.М. Development and characterization of a cytokine secreting pancreatic adenocarcinoma vaccine from primary tumors for use in clinical trials // Cancer journal from scientific American, Vol.4, Issue 3, PP: 194. Клетки свежеразрушенной опухоли высевали в 2-х повторах в количестве по 2×10⁶ клеток во флаконы 25 см². Для каждого варианта порознь определяли условия роста, а также комбинации других ростовых добавок. Исходными компонентами проверяемых ростовых сред были различные среды, включая RPMI, DMEM, Ham's и Aim V, и различные количества FBS. После установления оптимальной среды и сыворотки систематически проверяли добавки. Количество каждой добавки доводили до такого уровня, когда в культурах начинали преобладать либо клетки эпителия, либо клетки типа фибробластов.

Методы выращивания первичных клеток и опухолевых клеток и превращения их в клеточные линии описаны также в книге «Culture of animal cells - A manual of Basic technique», Fifth edition, Protocol-24.3, pp: 429-430.

Список раковых клеток, доступных для получения из различных хранилищ

Рак шеи: HeLa S3, HeLa 229, H1HeLa, Hs 588.T, GH329, GH354, HeLa NR1, C-4 I, C-4 II, DoTc2 4510, C-33 A, SW756 SiHa

Рак толстой кишки: NCI-H548, Hs 255.T, HCT-8 (HRT-18), Hs 675.T

Рак мочевого пузыря: Hs 195.Т, Hs 228.T, Hs 172.T5637, HT-1376, HT-1197, UM-UC-3, SW 780, J82 SCaBER, T24, TCCSUP, Hs 789.T, Hs 769.T, RT4

Рак почки: A704, A-704, NCI-H1373, NCI-H1395, Hs 618.T, SK-LU-1, HCC2935, HCC4006, HCC827, ACHN 786-0769-P, Caki-2, HTB-47, A-498, A-549, A-427, SW156, G-402, Hs 926.T, G-401

Рак молочной железы: Hs 274.T, Hs 280.T, Hs 281.T, Hs 343.T, Hs 362.T, Hs 739.T, Hs 741.T, Hs 742.T, Hs 190.T, Hs 319.T, Hs 329.T, Hs 344.T, Hs 350.T, Hs 371.T, Hs 748.T, Hs 841.T, Hs 849.T, Hs 851.T, Hs 861.T, Hs 905.T, Hs 479.T, Hs 540.T, Hs 566(B).T, Hs 605.T, Hs 606, BT-20, HT 762.T, UACC-812, HCC1954, Hs 574.T, BT-483, BT-549, DU4475, Hs 578T, BT-474, HCC1806, UACC-893, HCC38, HCC70, HCC202, HCC1143, HCC1187, HCC1395, HCC1419, HCC1500, HCC1599, HCC1937, HCC2157, HCC2218, HCC1569

Рак яичников: Caov-3, TOV-21G, Hs 38.T, Hs 571.T, ES-2, ТЕ 84.T

Рак поджелудочной железы: BxPC-3, HPAF-II, HPAC, Panc 03.27, Panc 08.13, Panc 02.03, Panc 02.13, Panc 04.03, Panc 05.04, Capan-2, CFPAC-1, PL45, Panc 10.05, MIA PaCa-2, PANC-1

Рак легких: Hs 229.Т, NCI-H2135, NCI-H2172, NCI-H2444, NCI-H835, UMC-11, NCI-Н727, NCI-H720, Hs 573.Т, NCI-H596, NCI-H1688, NCI-H1417, NCI-H1836, NCI-Н1672, HLF-a, NCI-H292, NCI-H2126, Calu-6, NCI-H2170, NCI-H520, SW 900, Hs 57.T

Колоректальный рак: NCI-H716, NCI-H747, NCI-H508, NCI-H498, SNU-C2B, SNU-С2А, LS513, LS1034, LS411N, WiDr, COLO 320DM, COLO 320HSR, DLD-1, HCT-15, SW480, SW403, SW48, SW1116, SW948, SW1417, LS 123, LS 180, LS 174T, C2BBe1, Hs 257.T, Hs 587.lnt, Caco-2, HT-29, HCT 116, ATRFLOX, SW1463, Hs 200.T, Hs 219.T, Hs 722.T

Немелкоклеточный рак легких: NCI-H1581, NCI-H23, NCI-H522, NCI-H1435, NCI-H1563, NCI-H1651, NCI-H1734, NCI-H1793, NCI-H1838, NCI-H1975, NCI-H2073, NCI-H2085, NCI-H2228, NCI-H2342, NCI-H2347, NCI-H2066, NCI-H2286, NCI-H1703, SW 1573, NCI-H358, NCI-H810, DMS 79, DMS 53, DMS 114, SW 1271, NCI-H2227, NCI-HI 963, SHP-77, H69AR

Рак кожи: 182-PF, SK 166-ME, SK, ТЕ 354.T, A-431, A431NS, A253*, Hs 357.T, Hs 941.T, Hs 295.T, Hs 63.T, Hs 892.T, Hs 898.T, Hs 416.T, Hs 925.T, Hs 156.T, WM-115, Hs 600.T, Hs 688(A).T, Hs 839.T, Hs 852.T, Hs 906(A).T, Hs 906(B).T, Hs 908.Sk, Hs 936.T, Hs 936.T (C1), Hs 939.T, A101D, CHL-1, HMCB (Human Melanoma Cell Bowles), C32TG, C32, G-361, A-375, A375.S2, COLO 829, Hs 940.T, HT-144, Malme-3M, RPMI-7951, SK-MEL-5, SK-MEL-24, SK-MEL-28, SK-MEL-31, WM278, 451 Lu, WM1552C, WM35, WM793B, 1205Lu, WM39, A7

Рак печени: C3A, SNU-398, SNU-449, SNU-182, SNU-475, Hep 3B2.1-7, Hep G2, SNU-387, SNU-423, PLC/PRF/5

Рак мозга: A172, U-138 MG, DBTRG-05MG, LN-18, LN-229, U-87 MG, U-118 MG, M059K, M059J, LNZTA3WT4, LNZTA3WT11, Hs 683, PFSK-1, CHP-212, IMR-32, H4

Рак костей/костного мозга: Hs 819.T, SW 1353, TF-1,TF-1a, TF-1.CN5a.1, HEL 92.1.7, KG-1, Hs 709.T, Hs 454.T, NCI-H929, 143.98.2, G-292, clone A141B1, MG-63, HOS, KHOS/NP (R-970-5), KHOS-240S, KHOS-321H, MNNG/HOS (CI #5), Hs 3.T, Hs 39.T, Hs 184.T, Hs 188.T, Hs 387.T, Hs 704.T, Hs 707(A).T, Hs 735.T, Hs 755(B).T, Hs 781,T, Hs 792(B).T, Hs 805.T, Hs 811.T, Hs 866.T, Hs 870.T, Hs 871.T, Hs 889.T, Hs 890.T, R-970-5, ТЕ 417.T, ТЕ 418.T, TO 203.T, HT 728.T, Hs 14.T, T1-73, 143 В, 143B PML BK TK, Saos-2, U-2 OS, Hs 88.T, Hs 864.T, SJSA-1, Hs 900.T, Hs 903.T, Hs 919.T, SK-ES-1, Hs 706.T, Hs 737.T, Hs 821.T, Hs 846.T, Hs 883.T, Hs 822.T, Hs 863.T, RD-ES, ТЕ 76.T, ТЕ 130.T, Hs 814.T, Hs 324.T, SW 982, MEG-01

Рак крови: SUP-B15, CCRF-SB, 8E5, TALL-104, MOLT-4, CCRF-CEM, CCRF-HSB-2, MOLT-3, CEM/C2, CEM/C1, THP-1, TIB-202, AML-193, Kasumi-1, Kasumi-3, BDCM, AML14.3D10/CCCKR3 Clone 16, Kasumi-6, HL-60, Clone 15 HL-60, HL-60/MX2, HL-60/MX1, J.CaM1.6, Jurkat, Clone E6-1, J.RT3-T3.5, D1.1, J45.01, MV-4-11, Kasumi-4, KU812, KU812E, KU812F, RPMI 6666, U266B1, RPMI 8226, Mo, Mo-B, SUP-T1, JM1, GDM-1, CESS, ARH-77, 1A2, H9/HTLV-IIIB, HuT 78, JSC-1, BCP-1, 2B8, Daudi, EB-3, Raji, Jiyoye, NAMALWA, HS-Sultan, CA46, GA-10, GA-10 (Clone 4), GA-10 (Clone 20), NC-37, 20B8, HKB-11.1G2, HH, H9, MJ, BC-1, BC-2, Toledo, U-937, TUR, DB, BC-3

Саркома: ТЕ 441.T, ТЕ 617.Т, Hs 729.Т, ТЕ 381.Т, RD, А-673, Hs 729, А-204, Hs 94.Т, Hs 132.Т, Hs 127.Т, Hs 701.T, HT-1080, Hs 778(A).Т, Hs 778(В).Т, Hs 15.Т SW 684, ТЕ 115.T, Hs 93.T, Hs 934.T, Hs 935.T

Рак лимфатических узлов: Hs 604.Т, Hs 751.Т, Hs 445, Hs 611.T, Hs 616, Hs 505.T, Hs 491.T

Сущность изобретения

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы изменить профиль иммуногенности раковых клеток таким образом, чтобы они стали лучшим иммуногеном.

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы изменить профиль иммуногенности раковых клеток таким образом, чтобы они стали иммуногенными для гетерогенного ракового антигена (гетерогенных раковых антигенов), специфичного (специфичных) для ткани/органа.

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить терапевтическую вакцину, предназначенную для применения в лечении злокачественной опухоли (злокачественных опухолей), обладающую иммуногенностью для гетерогенного ракового антигена (гетерогенных раковых антигенов), специфичного (специфичных) для ткани/органа.

Еще одна цель изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ приготовления терапевтической вакцины, предназначенной для применения в лечении злокачественной опухоли (злокачественных опухолей), обладающей иммуногенностью для гетерогенного ракового антигена (гетерогенных раковых антигенов), специфичного (специфичных) для ткани/органа.

Еще одна цель изобретения состоит в том, чтобы предоставить антиген для терапевтической вакцины, предназначенной для применения в лечении злокачественной опухоли (злокачественных опухолей), которая обеспечивает иммунный ответ на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа.

Еще одна цель изобретения состоит в том, чтобы предоставить аллогенную раковую вакцину, не индуцирующую канцерогенез.

Еще одна цель изобретения состоит в том, чтобы предоставить терапевтические вакцины против злокачественной опухоли (злокачественных опухолей), которые стимулируют клеточный иммунный ответ, специфичный как для гомологичных, так и для гетерологичных раковых клеток, специфичных для ткани/органа.

Еще одна цель изобретения состоит в том, чтобы предоставить терапевтические вакцины против злокачественной опухоли (злокачественных опухолей), которые стимулируют гуморальный иммунный ответ, специфичный как для гомологичных, так и для гетерологичных раковых клеток, специфичных для ткани/органа.

Описание рисунков

Фиг.1: Иммунореактивность препарата раковой вакцины по отношению к гомологичным раковым клеткам из поджелудочной железы, определенная путем выявления антител с помощью вестерн-блотирования в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.2: Иммунореактивность препарата раковой вакцины в соответствии с настоящим изобретением к гомологичным и гетерологичным раковым клеткам из поджелудочной железы, определенная по числу клеток, секретирующих ИФН-γ.

Фиг.3: Иммунореактивность препарата раковой вакцины в соответствии с настоящим изобретением к гомологичным и гетерологичным раковым клеткам из поджелудочной железы, определенная по убиению гомологичных и гетерологичных раковых клеток.

Фиг.4: Иммунореактивность препарата раковой вакцины в соответствии с настоящим изобретением к гомологичным и гетерологичным раковым клеткам из поджелудочной железы, определенная по числу клеток, секретирующих ИФН-γ.

Фиг.5: Иммунореактивность препарата раковой вакцины в соответствии с настоящим изобретением к гомологичным и гетерогенным раковым клеткам из поджелудочной железы, определенная путем выявления антител с помощью вестерн-блотирования гомологичных и гетерогенных раковых клеток в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.6: Добавление «Mycobacterium W» усиливает эффекторную функцию убитых нагреванием раковых клеток как терапевтической раковой вакцины.

Фиг.7: Добавление «Mycobacterium W» усиливает эффекторную функцию обработанных формальдегидом раковых клеток как терапевтической раковой вакцины.

Фиг.8: Добавление различных адъювантов повышает эффективность использующей убитые раковые клетки терапевтической раковой вакцины, предназначенной для применения в лечении злокачественных опухолей.

Фиг.9: Регрессия in vivo опухоли меланомы: лечение рака у млекопитающего в соответствии с настоящим изобретением без ограничения пределов охвата изобретения.

Фиг.10: Регрессия in vivo опухоли поджелудочной железы: лечение рака у млекопитающего в соответствии с настоящим изобретением без ограничения пределов охвата изобретения.

Детальное описание изобретения

Непредсказуемо наблюдается, что раковые клетки изменяют свои иммунологические характеристики в присутствии Mycobacterium w. После изменения иммунологических характеристик раковые клетки удерживают иммуноген, которым владеют совместно с гетерогенными раковыми клетками, специфичными для ткани/органа. Однако приобретенный таким образом иммуноген не реагирует с нормальными клетками, а также с опухолями, появляющимися в другом органе/ткани.

Поэтому согласно настоящему изобретению иммуногенный профиль раковых клеток, происходящих из органа, в присутствии Mycobacterium w (Mw) становится измененным. Благодаря измененному иммуногенному профилю раковые клетки осуществляют иммунную реакцию в ответ на гомогенные клетки и на гетерогенные клетки, присутствующие в том же самом органе/ткани (появляющиеся из того же самого органа/ткани). Обычно создание иммунной реакции на гетерогенную клетку не наблюдается в раковых клетках.

Раковые клетки в соответствии с настоящим изобретением изменяют иммунологический профиль, когда выравнивается уровень внутриклеточного p38. Раковые клетки по настоящему изобретению могут быть живыми, убитыми или в состоянии старения.

Раковые клетки по настоящему изобретению могут быть убитыми, но не ограничены их физической обработкой и/или химической обработкой.

Раковые клетки по настоящему изобретению убиваются нагреванием, кипячением или обработкой паром.

Раковые клетки по настоящему изобретению убиваются обработкой химическими соединениями/веществами, такими как альдегид, кетон, кислота, щелочь, соль, простой эфир, сложный эфир и т.д.

Отношение числа раковых клеток к числу клеток Mycobacterium w в соответствии с настоящим изобретением находится в диапазоне от 10:1 до 1:10000, что приводит к изменению иммунологических характеристик раковых клеток.

Отношение числа раковых клеток к числу клеток Mycobacterium w в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно находится в диапазоне от 1:10 до 1:1000.

Наиболее предпочтительное отношение числа раковых клеток к числу клеток Mycobacterium w в соответствии с настоящим изобретением находится в диапазоне от 1:10 до 1:100.

В соответствии с настоящим изобретением раковые клетки для приобретения этого нового иммунологического профиля не обязательно должны находиться внутри тела.

Время, в течение которого присутствие Mycobacterium w необходимо для изменения иммунологического профиля раковых клеток, составляет 1 минуту или более. Этот промежуток времени может ограничиваться моментом введения раковых клеток в тело.

Температура, при которой имеет место изменение иммунного профиля раковых клеток, находится в диапазоне от 1° до 60°C.

Окружающая среда, необходимая для изменения иммунного профиля раковых клеток, выбрана из солевого раствора, буфера, питательной среды или их комбинации. Питательной средой является среда, в которой раковые клетки размножаются и/или поддерживаются живыми.

В соответствии с настоящим изобретением раковые клетки погибают в присутствии Mycobacterium w.

В соответствии с настоящим изобретением степень гибели, индуцированной Mycobacterium w, составляет более 10% от общего количества клеток, предпочтительно более 30% и наиболее предпочтительно от 60% до 80% от общего количества раковых клеток.

Раковые клетки для целей настоящего изобретения могут быть живыми раковыми клетками или убитыми раковыми клетками.

В соответствии с настоящим изобретением раковые клетки, приобретшие иммунологический профиль, сохраняют его, даже будучи убитыми. Раковые клетки, приготовленные в соответствии с настоящим изобретением, индуцируют иммунную реакцию.

Раковые клетки, используемые в настоящем изобретении, могут быть аллогенными раковыми клетками или аутологичными раковыми клетками. Аллогенные раковые клетки выделяют, очищают, получают и/или модифицируют из другого организма/млекопитающего/человека/пациента того же биологического вида. Аллогенные раковые клетки могут быть также созданной и/или иммортализованной линией клеток, произведенной или поставленной из хранилища.

Аутологичные раковые клетки выделяют, очищают, получают и/или модифицируют из того же самого организма/млекопитающего/человека/пациента

Mycobacterium w - это непатогенный штамм Mycobacterium spps, выделенный из почвы. Широкие сопоставления геномов вместе с такими методами молекулярного филогенетического анализа, как флуоресцентный анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (fluorescent amplified fragment length polymorphism, FAFLP), генотипирование на основе консенсуса энтеробактериальных межгенных повторов (enterobacterial repetitive intergenic consensus, ERIC) и секвенирование предполагаемых ортологов (candidate orthologues sequencing), показали, что штамм Mw был предком высоко патогенного комплекса Mycobacterium avium- intracellulare complex (MAIC), который не претерпел паразитической адаптации вследствие редукционной генной эволюции и поэтому предпочитал жизненный стиль свободного существования. Дополнительный анализ позволил предположить, что бациллы MAIC существовали в водной фазе совместно с ранними патогенными формами Mycobacterium, задолго до того, как последняя разделилась на «специалистов» (Ahmed N, et al. (2007) Molecular Analysis of a Leprosy Immunotherapeutic Bacillus Provides Insights into Mycobacterium Evolution. // PLoS ONE 2(10): e968). При тестировании уреазой, гидролизом твином 80 и ниацином организм дает отрицательные результаты, но дает положительный результат в тесте восстановления нитрата.

Измененный иммунологический профиль клеток проявляется в измененной иммунной реакции иммунной системы организма, которому введена вакцина. Измененную иммунную реакцию можно определить по клеточной иммунной реакции или/и гуморальной иммунной реакции. Применяемые для этой цели общепринятые методы - это ELISPOT, определение эффекторной функции (метод «effector function»), вестерн-блотирование и т.п.

Эффективность терапевтической раковой вакцины определяется по ее способности индуцировать иммунную реакцию на специфический антиген и также ее способности реагировать на антиген. Для настоящего изобретения антигенами являются раковые клетки с иммунологическими свойствами, измененными путем совместной инкубации раковых клеток с Mycobacterium w.

Эффективность этих раковых клеток определяли по способности иммунной системы соответствующего хозяина как индуцировать иммунную реакцию, так и реагировать с антигеном. Эффективность терапевтической вакцины в индукции иммунной реакции изучали, определяя методом ELISPOT увеличение числа клеток, продуцирующих интерферон-гамма (ИФН-γ) в ответ на антиген. Эта техника обеспечивает указание на индукцию клеточного иммунного ответа. Гуморальную иммунную реакцию исследовали, определяя появление в сыворотках мышей специфических антител в ответ на введение вакцины.

Подобным же образом способность индуцировать гетерогенную иммунную реакцию, при этом специфичную для ткани/органа, определяли также по специфической иммунной реакции в ответ на стимул в виде линий негомологичных (гетерогенных) раковых клеток, специфичных для ткани/органа. Гетерогенную реакцию оценивали также как по клеточному ответу с помощью теста ELISPOT на интерферон-гамма, так и гуморальному иммунному ответу с использованием вестерн-блотирования.

Способность реагировать с клетками-мишенями определяли методом эффекторной функции. Это метод, с помощью которого определяют, убиваются ли клетки-мишени (раковые клетки) клетками иммунной системы, стимулированной/активированной введением вакцины. Терапевтическая раковая вакцина проявляла способность убивать раковые клетки-мишени обоих типов, то есть гомологичные и гетерогенные раковые клетки одной и той же ткани (одного и того же органа).

Пример 1: Способ изменения иммуногенного профиля раковых клеток таким образом, что они становятся иммуногенными по отношению к гетерогенному раковому антигену (гетерогенным раковым антигенам), специфичному (специфичным) для ткани/органа

A) Аллогенные раковые клетки Mia-paca-2 собирают и промывают забуференным фосфатом солевым раствором Dulbelco (Dulbelco's Phosphate buffer saline, DPBS) для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:100. Суспензию клеток инкубируют при 37°С в течение 6 ч. Суспензию клеток центрифугируют при 350 g в течение 10 мин для отделения и удаления «Mycobacterium w». Измеряют уровни внутриклеточного р38. Клетки с повышенным уровнем р38 используют как вакцину, или они могут быть затем включены в рецептуру (formulated). При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

B) Аллогенные клетки меланомы B16 собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:100. Суспензию клеток инкубируют при температуре 10°C до введения - предпочтительно в течение 4-6 ч. Измеряют уровни внутриклеточного р38. Клетки с повышенным уровнем p38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

C) Аллогенные раковые клетки NFS60 (клетки лейкемии) собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:10. Суспензию клеток инкубируют при 60°С в течение 10 мин. Клетки центрифугируют при 350 g в течение 10 мин для удаления «Mycobacterium w». Измеряют уровни внутриклеточного р38. Клетки с повышенным уровнем р38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

D) Аллогенные раковые клетки (Panc-1) собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:10. Суспензию клеток инкубируют при 37° в течение 4-6 ч. Измеряют уровни внутриклеточного р38. Клетки с повышенным уровнем р38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

E) Аллогенные раковые клетки А549 (рак легких) собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:1000. Эту суспензию клеток инкубируют при температуре 37°C в течение 4-6 ч. Клетки центрифугируют при 350 g в течение 10 мин для удаления «Mycobacterium w». Измеряют уровни внутриклеточного p38. Клетки с повышенным уровнем р38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

F) Аллогенные раковые клетки РС-3 (рак простаты) собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:1000. Эту суспензию клеток инкубируют при температуре 25°C в течение 24 ч. Измеряют уровни внутриклеточного p38. Клетки с повышенным уровнем p38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

G) Аллогенные раковые клетки AsPC собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:10000. Эту суспензию клеток инкубируют при температуре 30°C в течение 6 ч. Клетки центрифугируют при 350 g в течение 10 мин для удаления «Mycobacterium w». Измеряют уровни внутриклеточного p38. Клетки с повышенным уровнем p38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

H) Аллогенные раковые клетки Mia-paca-2 собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:10000. Эту суспензию клеток инкубируют при температуре 37°C в течение 120 мин. Измеряют уровни внутриклеточного р38. Клетки с повышенным уровнем р38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

I) Аллогенные раковые клетки MCF 1 (рак молочной железы) собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:1. Эту суспензию клеток инкубируют при температуре 40°C в течение 5 ч. Клетки центрифугируют при 350 g в течение 10 мин для удаления «Mycobacterium w». Измеряют уровни внутриклеточного р38. Клетки с повышенным уровнем р38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

J) Аллогенные раковые клетки, отобранные у пациента с меланомой, культивируют в лаборатории, собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:1. Эту суспензию клеток инкубируют при температуре 50°C в течение 4-6 ч. Измеряют уровни внутриклеточного р38. Клетки с повышенным уровнем р38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

K) Аллогенные раковые клетки (Panc-1) собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:10. Эту суспензию клеток инкубируют при температуре 37°C в течение 4-6 ч. Добавленные клетки Mw отделяют центрифугированием при 350 g в течение 10 мин. Измеряют уровни внутриклеточного p38. Клетки с повышенным уровнем р38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

L) Аллогенные раковые клетки, отобранные у пациента с меланомой, культивируют в лаборатории, собирают и промывают DPBS для удаления следов сыворотки. Подсчитывают число жизнеспособных клеток и к клеткам добавляют «Mycobacterium w» при отношении числа клеток к «Mycobacterium w» 1:1. Эту суспензию клеток инкубируют при температуре 50°C в течение 4-6 ч. Добавленные клетки Mw отделяют центрифугированием при 350 g в течение 10 мин. Измеряют уровни внутриклеточного р38. Клетки с повышенным уровнем р38 используют как вакцину или они могут быть затем включены в рецептуру. При необходимости к вакцине можно добавлять адъювант (адъюванты).

Пример 2: Следующий пример иллюстрирует улучшенную иммунную реакцию в соответствии с настоящим изобретением без ограничения области охвата изобретения

А. Терапевтическая вакцина вызывает клеточную иммунную реакцию на гомологичные раковые клетки, демонстрируемую с помощью анализа ELISPOT на интерферон-гамма

Терапевтические раковые вакцины, приготовленные способом, описанным в примере 1, иммуногенны и вызывают иммунную реакцию Th1 типа, как демонстрирует исследование иммуногенности на мышиной модели. Вкратце, мышей иммунизировали внутрикожным введением в дни 0 и 21 контроля плацебо или вакцинной рецептуры, содержащей 2×10⁶ клеток. Животных на 28-й день подвергали эвтаназии повышенным содержанием CO₂ и определяли иммунный статус по числу секретирующих ИФН-γ клеток среди спленоцитов. Как показано в таблице 1, было обнаружено существенное увеличение (в 8,4 раза) числа секретирующих ИФН-γ клеток в группе, иммунизированной вакцинной рецептурой, по сравнению с контролем плацебо.

Таблица 1
Иммуногенность раковой вакцины, определенная по числу клеток, секретирующих ИФН-γ
Группа	Число продуцирующих интерферон-гамма клеток на 0,1 млн спленоцитов
Контроль плацебо	15 клеток
Раковая вакцина	126 клеток

В. Терапевтическая вакцина вызывает гуморальную иммунную реакцию на гомологичные раковые клетки, демонстрируемую с помощью вестерн-блотирования

Мышей распределяли случайным образом по двум группам. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 21 внутрикожным введением терапевтической раковой вакцины, приготовленной в соответствии с примерами 1-6, а вторую группу, то есть контрольную группу, иммунизировали забуференным фосфатом солевым раствором (PBS). На 28-й день исследования у всех мышей отбирали пробы сыворотки для выявления образования антител к вакцине.

Вестерн-блотирование лизатов гомологичных раковых клеток (Mia-paca-2) проводили с пробами сыворотки мышей из каждой группы. Для обнаружения антител, связанных с белком в лизате, использовали конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) козьи антитела к мышиному IgG с DAB (диаминобензидин) в качестве окрашивающего агента и H₂O₂ как субстрата.

По данным анализа вестерн-блотированием установлено, как показано на фиг.1, что иммунизация терапевтической раковой вакциной вызывает образование антител к лизату гомологичных клеток.

Пример 3: Следующий пример иллюстрирует иммунную реакцию на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, в соответствии с настоящим изобретением без ограничения области охвата изобретения

А. Терапевтическая вакцина вызывает клеточную иммунную реакцию на гетерогенные раковые клетки, демонстрируемую по повышению числа клеток, продуцирующих интерферон-гамма, методом ELISPOT

Мышей иммунизировали в дни 0 и 21 внутрикожным введением контроля или рецептуры раковой вакцины, содержащей 2×10⁶ клеток Mia-paca-2, приготовленной, как описано в примере 1. Животных на 28-й день подвергали эвтаназии повышенным содержанием CO₂. У каждой мыши извлекали селезенку и выделяли спленоциты. 5×10⁵ спленоцитов от каждой мыши высевали на планшеты ELISPOT фирмы R&D Systems, покрытые фиксирующими антителами к ИФН-γ. Клетки стимулировали in-vitro 10 мкг/мл лизатов клеток Mia-PaCa-2, Panc-1 и AsPC-1 и инкубировали при 37°C и 6% CO₂ в течение около 36 ч. В конце периода инкубации планшеты проявляли в соответствии с инструкциями поставщика. Вкратце, ячейки отмывали от клеток и добавляли детектирующие антитела. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляли фермент, конъюгированный с стрептавидином-ALP, после чего добавляли осаждающий субстрат BCIP-NBT. Интенсивность пятен определяли автоматическим сканирующим устройством для иммуноферментного анализа. Иммунореактивность вакцинного препарата по отношению к гомологичным клеткам (Mia-paca-2) и гетерогенным раковым клеткам (Panc-1 и AsPC-1) из поджелудочной железы выражали числом секретирующих ИФН-γ клеток, как представлено на фиг.2. Полученные данные позволяют предположить, что приготовленная в соответствии с настоящим изобретением раковая вакцина с использованием клеток Mia-paca-2 способна вызывать иммунную реакцию не только на клетки Mia-paca-2 (гомологичные), но и на клетки Panc-1 и AsPC-1 (гетерологичные). Нет существенного различия в иммунной реакции на различные типы клеток.

B. Терапевтическая вакцина вызывает клеточную иммунную реакцию на гетерогенные раковые клетки, демонстрируемую по эффекторной функции - убиению раковых клеток-мишеней

Мышей линии Balb/c иммунизировали в дни 0 и 21 либо раковыми клетками (Mia-Paca-2), либо терапевтической раковой вакциной, приготовленной, как описано в примерах 1-6. Мышей забивали, и выделенные спленоциты использовали как эффекторные клетки против линий клеток Mia-paca-2 и Panc-1. Представленные на фиг.3 результаты показывают, что терапевтическая раковая вакцина способна осуществлять перекрестную иммунизацию раковых клеток. Терапевтическая раковая вакцина проявляет эффекторную функцию против обеих линий клеток, то есть против гомологичных (Mia-paca-2) и против гетерогенных раковых клеток (Panc-1 и AsPC-1) из поджелудочной железы.

C. Обработка «Mycobacterium w» усиливает перекрестное предъявление раковых клеток для создания гетерогенного иммунитета

Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 21 внутрикожным введением клеток Mia-paca-2 cells, а вторую - введением терапевтической раковой вакцины, приготовленной в соответствии с примерами 1-6. На 28-й день исследования от всех мышей получали суспензию спленоцитов (10⁷ клеток/мл) для определения числа секретирующих ИФН-γ клеток методом ELISPOT.

Клетки спленоцитов контрольной и тестовой групп вносили в различные ячейки планшета для ELISPOT в количестве 1×10⁶ клеток на ячейку. Планшеты инкубировали при 37°C и 6% CO₂ в течение 36-48 ч. После завершения периода инкубации клетки декантировали с планшета и промывали DPBS. В каждую ячейку добавляли 100 мкл разведенных 1:100 детектирующих антител. Планшет инкубировали при 4°C в течение ночи, затем его промывали и осушали. Конъюгат стрептавидин-ALP разбавляли 1:1000 в PBS с 0,5% FBS. В каждую ячейку добавляли 100 мкл разбавленного 1:1000 конъюгата стрептавидин-ALP и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте. Планшет промывали и осушали. В каждую ячейку добавляли 100 мкл субстрата BCIP-NBT. Планшет вновь инкубировали при комнатной температуре в темноте до появления пятен. Реакцию останавливали промыванием планшета водой. Планшет сушили в течение ночи при 37°C. На основании представленных на фиг.4 результатов очевидно, что терапевтическая раковая вакцина, приготовленная в соответствии с настоящим изобретением, повышает иммунореактивность мышей к гетерогенным раковым клеткам.

D. Терапевтическая вакцина вызывает гуморальную иммунную реакцию на гетерологичные раковые клетки той же самой ткани (того же самого органа), как продемонстрировано реакционной способностью антител по отношению к лизатам гетерологичных раковых клеток с помощью вестерн-блотирования

Мышей иммунизировали в дни 0 и 21 внутрикожным введением терапевтической раковой вакцины. На 28-й день исследования у мышей отбирали пробы сывороток для определения появления антител к вакцине и гетерогенной реактивности мышиных антител к раковой вакцине по отношению к другим клеткам (гетерогенным) из поджелудочной железы, а именно SW1990 и AsPC.

Осуществляли вестерн-блотирование лизатов клеток Mia-paca-2, AsPC-1, SW-1990 и раковых клеток различного происхождения, как НЕK-293 (почки), РС-3 (простата), MCF-7 (молочная железа), А549 (легкие), РА-1 (яичники), с первичными антителами, образующимися у мышей в ответ на терапевтическую раковую вакцину. Для выявления первичных антител, связавшихся в антигеном (антигенами) лизата, использовали конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела к мышиному IgG с DAB (диамино-бензидин) в качестве окрашивающего/детектирующего агента.

Анализ с помощью вестерн-блотирования показывает (фиг.5), что мышиные антитела к раковой вакцине обладают гетерогенной реактивностью по отношению к лизатам других раковых клеток из различных тканей/органов.

E. Убитые теплом раковые клетки, усиленные «Mycobacterium w», вызывают иммунную реакцию на гомологичные и гетерологичные раковые клетки той же самой ткани (того же самого органа), что установлено по эффекторной функции.

Мышей линии Balb/c в дни 0 и 21 иммунизировали введением убитых нагреванием раковых клеток (клетки Mia-paca-2 рака поджелудочной железы), смешанных в соотношении 1:100 с «Mycobacterium w». На 28-й день мышей забивали, выделяли спленоциты и использовали их как эффекторные клетки против линии гомологичных раковых клеток.

Представленные на фиг.6 результаты показывают, что добавление «Mycobacterium w» улучшает эффективность терапевтической вакцины, использующей убитые нагреванием клетки, в воздействии на злокачественную опухоль (злокачественные опухоли), что вызывает иммунную реакцию на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, что продемонстрировано по эффекторной функции - убиению раковых клеток-мишеней.

F. Обработанные формальдегидом убитые раковые клетки, усиленные «Mycobacterium w», вызывают иммунную реакцию на гомологичные и гетерологичные раковые клетки той же самой ткани (того же самого органа), что установлено по эффекторной функции

Мышей линии Balb/c в дни 0 и 21 иммунизировали введением обработанных формальдегидом раковых клеток (клетки Mia-paca-2 рака поджелудочной железы), смешанных в различных соотношениях с «Mycobacterium w». Мышей забивали, выделяли спленоциты и использовали их как эффекторные клетки против линии гомологичных раковых клеток.

Представленные на фиг.7 результаты показывают, что добавление «Mycobacterium w» улучшает эффективность терапевтической вакцины, использующей обработанные формальдегидом клетки, в воздействии на злокачественную опухоль (злокачественные опухоли), что вызывает иммунную реакцию на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, что продемонстрировано по эффекторной функции - убиению раковых клеток-мишеней.

G. Убитые раковые клетки, усиленные другими адъювантами, вызывают иммунную реакцию на гомологичные раковые клетки той же самой ткани (того же самого органа), что определено методом анализа ELISPOT

Мышей линии Balb/c в дни 0 и 21 иммунизировали введением убитых раковых клеток (клетки Mia-paca-2 рака поджелудочной железы), смешанных с различными адъювантами, а именно: «Mycobacterium w», ВВ2, G1, Cadi OFF 10 и их комбинациями. Мышей забивали, и выделенные спленоциты использовали для анализа лизата гомологичных раковых клеток на секрецию ИФН-γ методом ELISPOT (фиг.8).

Представленные на фиг.8 результаты показывают, что добавление адъюванта улучшает эффективность терапевтической раковой вакцины, использующей убитые раковые клетки, при использовании для воздействия на злокачественную опухоль (злокачественные опухоли).

Пример 4: Следующие примеры иллюстрируют лечение рака у млекопитающих в соответствии с настоящим изобретением без ограничения области охвата изобретения

A. Регрессия опухоли in vivo: лечение рака у млекопитающих в соответствии с настоящим изобретением без ограничения области охвата изобретения

Для исследования использовали 30 мышей-самцов линии Balb/C в возрасте 6-8 недель. Животных случайным образом распределяли по группам с учетом веса тела. Индукцию опухолей осуществляли подкожной инъекцией 1×10⁵ клеток B16-F1 в заднюю лапу. Мышам давали время для развития опухолей до среднего размера около 100-150 мм³ и распределяли случайным образом (рандимизировали) на 2 группы по 15 мышей в каждой с учетом размера опухоли. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 10 после рандомизации внутрикожным введением меланомной вакцины (приготовленной, как описано в примере 1), а вторую, т.е. контрольную, группу мышей оставляли без иммунизации (без воздействия). Дважды в неделю регистрировали размер опухолей вплоть до того момента, когда размер опухоли достигал 10% от веса тела животного.

Объем опухолей в группе воздействия не увеличивался по сравнению с контрольной группой (фиг.9). В действительности в группе с воздействием наблюдалось уменьшение размера опухолей, что указывает на ослабление условий болезни. В общем в группе с воздействием увеличилась выживаемость и уменьшился размер опухолей.

В группе с воздействием обнаружено замедленное развитие опухолей и регрессия массы опухолей по сравнению с животными, не подвергавшимися воздействию.

B. Регрессия опухоли in vivo: лечение рака у млекопитающих в соответствии с настоящим изобретением без ограничения области охвата изобретения

Для исследования использовали 20 мышей-самцов линии С57 в возрасте 6-8 недель. Животных случайным образом распределяли по группам с учетом веса тела. Индукцию опухолей осуществляли подкожной инъекцией мышам 1×10⁵ клеток Pan 02 в заднюю лапу. Мышам давали время для развития опухолей до среднего размера около 200 мм³ и распределяли случайным образом (рандимизировали) на 2 группы по 10 мышей в каждой с учетом размера опухоли. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 10 после рандомизации внутрикожным введением раковой панкреатической вакцины (приготовленной в соответствии с примером 1), а вторую, т.е. контрольную, группу мышей оставляли без иммунизации (без воздействия). Дважды в неделю регистрировали размер опухолей вплоть до того момента, когда размер опухоли достигал 10% от веса тела животного.

Объем опухолей в группе воздействия не увеличивался по сравнению с контрольной группой (фиг.10). В действительности в группе с воздействием наблюдалось уменьшение размера опухолей, что указывает на ослабление условий болезни. В общем в группе с воздействием увеличилась выживаемость и уменьшился размер опухолей.

В группе с воздействием обнаружено замедленное развитие опухолей и регрессия массы опухолей по сравнению с животными, не подвергавшимися воздействию.

Эти примеры с очевидностью демонстрируют, что вакцина из раковых клеток с использованием в рецептуре «Mycobacterium w» обладает усиленной иммуногенностью и иммунореактивностью по отношению к гетерогенному раковому антигену (гетерогенным раковым антигенам), специфичному (специфичным) для ткани/органа.

Другие эксперименты с мышами и иммуноанализ ex vivo показывают, что вакцина из раковых клеток способна генерировать эффекторную функцию, означающую, что иммунная система и ее часть способны эффективно убивать раковые клетки-мишени гетерогенной природы, специфичные для ткани/органа. Вакцина обладает также эффективностью in vivo в лечении рака.

Таким образом, раковая вакцина использована для того, чтобы справляться с раком, с точки зрения задерживания, подъема или лечения рака. Вакцина может также использоваться для регрессии существующих опухолей и подавления раковых клеток.

1. Раковая вакцина, включающая экспрессирующие один или более антигенов раковые клетки и эксципиенты, где указанный антиген экспрессируется раковыми клетками с повышенным уровнем p38 и где указанные раковые клетки получены приведением в контакт указанных раковых клеток и Mycobacterium w.

2. Раковая вакцина по п. 1, где количество экспрессирующих антиген раковых клеток в рецептуре раковой вакцины находится в диапазоне от 10⁴ до 10⁹.

3. Раковая вакцина по п. 1, которая при введении млекопитающему вызывает клеточную иммунную реакцию, специфичную для ткани/органа, к которым принадлежат раковые клетки.

4. Раковая вакцина по п. 1, которая при введении млекопитающему вызывает гуморальную иммунную реакцию, специфичную для ткани/органа, к которым принадлежат раковые клетки.

5. Раковая вакцина по п. 1, дополнительно содержащая адъювант.

6. Раковая вакцина по п. 5, где адъювантом является Mycobacterium w.

7. Раковая вакцина по п. 1, где раковые клетки получают от пациента и/или из хранилища клеток.

8. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества раковой вакцины по п. 1.

9. Способ по п. 8, где рак представлен гомологичными или гетерологичными клетками.

10. Способ по п. 8, где раковая вакцина включает раковые клетки, полученные от того же или другого млекопитающего.

11. Способ по п. 8, где путь введения является парентеральным.

12. Способ по п. 8, где путь введения является внутрикожным.