Сочетанная терапия афукозилированным антителом к cd20 с антителом к vegf

Авторы патента:

КЛЯЙН Кристиан (CH)

ГЕРТИНГ Франк (DE)

C07K16/28 - против рецепторов, клеточных поверхностных антигенов или клеточных поверхностных детерминантов

C07K16/22 - против факторов роста

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

Владельцы патента RU 2615459:

РОШ ГЛИКАРТ АГ (CH)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к комбинированной терапии афукозилированным антителом к CD20 и антителом к VEGF для лечения рака, что может быть использовано в медицине. Применяют афукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1 в комбинации с антителом к VEGF, а также композицию, содержащую указанные антитела для терапии CD20-экспрессирующего рака и лечения пациента, страдающего от CD20-экспрессирующего рака. Изобретение позволяет эффективно ингибировать рост CD20-экспрессирующих опухолей. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Данное изобретение относится к комбинированной терапии афукозилированным антителом к CD20 с анти-VEGF-антителом для лечения рака.

Уровень техники

Афукозилированные антитела

Опосредованные клетками эффекторные функции моноклональных антител могут быть усилены путем инженерии их олигосахаридного компонента, как описано в Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; и US 6602684. Антитела типа IgG1, наиболее часто используемые антитела в иммунотерапии рака, представляют собой гликопротеины, которые имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования на Asn297 в каждом домене СН2. Два сложных двухантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, скрыты между СН2-доменами, образуя обширные контакты с полипептидным остовом, и их присутствие имеет важное значение для антитела, чтобы опосредовать эффекторные функции, такие как антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) (Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S.L, Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). В Umana, P., et al. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 и WO 99/54342 показано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III («GnTIII»), гликозилтрансферазы, катализирующей формирование олигосахаридов с симметричным разветвлением, значительно увеличивает in vitro ADCC-активность антител. Изменения в составе N297-углевода или его ликвидация также влияет на связывание с FcγR и C1q (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L, et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147).

Сообщалось об исследованиях, обсуждающих активности афукозилированных и фукозилированных антител, в том числе анти-CD20-антител (например, Iida, S., et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887; Natsume, A., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 93-103; Satoh, M., et al., Expert Opin. Biol. Ther. 6 (2006) 1161-1173; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294).

CD20 и антитела к CD20

Молекула CD20 (также называемая человеческим В-лимфоцитарным антигеном дифференцировки или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок, находящийся на пре-В и зрелых В-лимфоцитах (Valentine, М.А., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287; и Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568). CD20 экспрессируется на более чем 90% В-клеток неходжкинских лимфом (non-Hodgkin’s lymphomas, NHL) (Anderson, K.C., et al., Blood 63 (1984) 1424-1433), но он не найден на гемопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или других нормальных тканях (Tedder, T.F., et al., J, Immunol. 135 (1985) 973-979).

Существует два различных типа анти-CD20-антител, значительно различающихся по характеру их связывания CD20 и биологическим активностям (Cragg, M.S., et al., Blood, 103 (2004) 2738-2743; и Cragg, M.S., et al., Blood, 101 (2003) 1045-1051). Антитела I типа, такие как ритуксимаб (нефукозилированное антитело с содержанием фукозы 85% или выше), являются мощными в отношении опосредованной комплементом цитотоксичности.

Антитела II типа, такие как антитела тозитумомаб (В1), 11В8, АТ80 или гуманизированное B-Ly1, эффективно инициируют смерть клетки-мишени путем каспаза-независимого апоптоза с сопутствующим высвобождением фосфатидилсерина.

Общие особенности анти-CD20-антител I и II типа приведены в таблице 1.

Таблица 1
Свойства анти-CD20-антител I и II типа
анти-CD20-антитела I типа	анти-CD20-антитела II типа
эпитоп CD20 I типа	эпитоп CD20 II типа
Локализация CD20 на липидных рафтах	Нет локализации CD20 на липидных рафтах
Увеличена CDC (при изотипе IgG1)	Уменьшена CDC (при изотипе IgG1)
Антителозависимая клеточная	Антителозависимая клеточная

цитотоксическая активность (при изотипе IgG1)	цитотоксическая активность (при изотипе IgG1)
Полная связывающая способность	Уменьшенная связывающая способность
Гомотипическая агрегация	Более сильная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза при перекрестном сшивании	Сильная индукция клеточной гибели без перекрестного сшивания

VEGF и антитела к VEGF

Человеческий фактор роста эндотелия сосудов (VEGF/VEGF-A) описан, например, в Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-1309; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-1312, и Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-20024. VEGF участвует в регуляции нормального и патологического ангиогенеза и неоваскуляризации, которые связаны с опухолями и внутриглазными нарушениями (Ferrara, N., and Davis-Smyth, Т., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; и Dvorak, H., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF представляет собой гомодимерный гликопротеин, который был выделен из нескольких источников. VEGF демонстрирует весьма специфическую митогенную активность по отношению к эндотелиальным клеткам. VEGF имеет важные регуляторные функции в формировании новых кровеносных сосудов во время эмбрионального васкулогенеза и ангиогенеза во взрослой жизни (Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439; Ferrara, N., et al., Nature, 380 (1996) 439-442; обзор в Ferrara, N. and Davis-Smyth, Т., Endocrine Rev., 18 (1997) 4-25). Значение роли, которую играет VEGF, было продемонстрировано в исследованиях, показывающих, что инактивация отдельной аллели VEGF приводит к эмбриональной летальности из-за неудачного развития сосудистой сети (Carmeliet, Р., et al., Nature 380 (1996) 435-439; Ferrara, N., et al., Nature 380 (1996) 439-442). Кроме того, VEGF имеет сильную активность хемоаттрактанта по отношению к моноцитам, может индуцировать активатор плазминогена и ингибитор активатора плазминогена в эндотелиальных клетках, а также может индуцировать проницаемость капилляров. Из-за последней активности его иногда называют фактором сосудистой проницаемости (VPF, vascular permeability factor). Выделение и свойства VEGF были рассмотрены; см. Ferrara, N., et al., J. Cellular Biochem. 47 (1991) 211-218, и Connolly, J. Cellular Biochem. 47 (1991) 219-223. Альтернативный сплайсинг мРНК одного гена VEGF дает до пяти изоформ VEGF.

Нейтрализующие анти-VEGF-антитела подавляют рост различных человеческих опухолевых клеточных линий у мышей (Kim, K.J., et al., Nature 362 (1993) 841-844; Warren, R.S., et al., J. Clin. Invest. 95 (1995) 1789-1797; Borgstrom, P., et al., Cancer Res. 56 (1996) 4032-4039; и Melnyk, O., et al., Cancer Res. 56 (1996) 921-924).

В одном воплощении анти-VEGF-антитела включают моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное анти-VEGF-антитело А4.6.1, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 10709; рекомбинантное гуманизированное моноклональное анти-VEGF-антитело, полученное в соответствии с Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599, в том числе, но не ограничиваясь им, антитело, известное как «бевацизумаб (BV)», также известное как «rhuMAb VEGF» или «AVASTIN». Бевацизумаб содержит мутированные человеческие каркасные области из IgG1 и антигенсвязывающие области, определяющие комплементарность, из мышиного моноклонального анти-hVEGF-антитела А.4.6.1, которое блокирует связывание человеческого VEGF с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, в том числе большая часть каркасных областей, получено из человеческого IgG1, и примерно 7% последовательности получено из мышиного антитела А4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу примерно 149000 дальтон и является гликозилированным. Бевацизумаб и другие гуманизированные анти-VEGF-антитела более подробно описаны в патенте США №6884879 от 26 февраля 2005 года. Дополнительные предпочтительные антитела включают антитела серии G6 или В20 (например, G6-23, G6-31, В20-4.1), описанные в публикации заявки РСТ № WO 2005/1012359. Дополнительные предпочтительные антитела см. в патентах США №№ US 7060269, US 6582959, US 6703020; US 6054297, WO 98/145332, WO 96/130046, WO 94/110202, EP 0666868 B1; публикациях патентных заявок США №№ US 2006009360, US 20050186208, US 20030206899, US 20030190317, US 20030203409, US 20050112126 и в Popkov., M. et al., Journal of Immunological Methods 288 (2004) 149-164. Они характеризуются связыванием с человеческим и мышиным VEGF; это является необходимым условием для изучения их эффективности на стимулированном мышиным muVEGF ангиогенезе на мышиных моделях. «Антитело серии G6» в соответствии с данным изобретением представляет собой анти-VEGF-антитело, которое получено из последовательности антитела G6 или G6-производного антитела, полученного в соответствии с одной из фиг.7, 24-26 и 34-35 из публикации заявки РСТ № WO 2005/1012359. «Антитело серии В20» в соответствии с данным изобретением представляет собой анти-VEGF-антитело, которое получено из последовательности антитела В20 или В20-производного антитела, полученного в соответствии с одной из фиг.27-29 из публикации заявки РСТ № WO 2005/1012359.

WO 94/10202, WO 98/45332, WO 2005/00900 и WO 00/35956 ссылаются на антитела против VEGF. Гуманизированное моноклональное антитело бевацизумаб (продается под торговой маркой Avastin®) представляет собой анти-VEGF-антитело, используемое в терапии опухолей (WO 98/45331).

Ранибизумаб (торговое название Lucentis®) представляет собой фрагмент моноклонального антитела, полученный из того же родительского мышиного антитела, что и бевацизумаб (Avastin). Он гораздо меньше родительской молекулы и обладает аффинностью, созревшей для обеспечения более сильного связывания с VEGF-A (WO 98/45331). Он является антиангиогенным средством, которое было одобрено для лечения «влажного» типа возрастной макулярной дегенерации (ARMD, age-related macular degeneration), распространенной формы возрастной потери зрения.

Другое анти-VEGF-антитело, например, В20-4.1 описано в WO 2005/012359 A3 в US 2007/0141065.

Другое анти-VEGF-антитело, например, HuMab G6-31, описано в WO 2005/012359 A3.

Имеются сообщения о доклинических и/или клинических исследованиях с использованием комбинации бевацизумаба с ритуксимабом и другими лекарственными препаратами (например, Ganjoo, K.N. et al., Leuk Lymphoma. 47 (2006) 998-1005; Ruan, J. et al., Annals of Oncology 20 (2009) 413-424).

Сущность изобретения

Мы уже выяснили, что комбинация афукозилированного анти-CD20-антитела с анти-VEGF-антителом показало синергетические антипролиферативные эффекты.

Изобретение включает применение афукозилированного анти-CD20-антитела с содержанием фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 для изготовления лекарственного средства для лечения рака в комбинации с анти-VEGF-антителом.

Одним из аспектов изобретения является способ лечения пациента, страдающего от рака, путем введения афукозилированного анти-CD20-антитела с содержанием фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 в комбинации с анти-VEGF-антителом пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Другим аспектом изобретения является афукозилированное анти-CD20-антитело с содержанием фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 для лечения рака в комбинации с анти-VEGF-антителом.

В одном воплощении содержание фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297.

В другом воплощении содержание фукозы составляет 0% от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297.

В одном воплощении афукозилированное анти-CD20-антитело представляет собой IgG1-антитело.

В другом воплощении указанный рак представляет собой CD20-экспрессирующий рак, предпочтительно B-клеточную неходжкинскую лимфому (NHL), где в одном воплощении указанное анти-CD20-антитело является гуманизированным B-Ly1-антителом.

В одном воплощении указанное анти-VEGF-антитело представляет собой бевацизумаб, антитело серии В20 или антитело серии G6, в одном воплощении антитело серии В20, и в одном воплощении бевацизумаб.

В одном воплощении указанное афукозилированное анти-CD20-антитело является гуманизированным B-Ly1-антителом, а указанное анти-VEGF-антитело является бевацизумабом, антителом серии В20 или антителом серии G6, и указанный рак является CD20-экспрессирующим раком, в одном воплощении B-клеточной неходжкинской лимфомом (NHL).

В одном воплощении афукозилированное анти-CD20-антитело связывается с CD20 с KD от 10^-8 М до 10^-13 М.

Одно воплощение изобретения представляет собой композицию, содержащую афукозилированное анти-CD20-антитело с содержанием фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 (в одном воплощении афукозилированное гуманизированное B-Ly1-антитело) и анти-VEGF-антитело (в одном воплощении бевацизумаб или антитело серии В20) для лечения рака.

Описание графических материалов

Фиг.1: Ингибирование роста опухоли in vivo у мышей с ксенотрансплантатом (клетками человеческой лимфомы SU-DHL-4); Сравнение анти-CD20-антитела (гликоинженерного гуманизированного B-Ly1 (B-HH6-B-KV1 GE=GA101)) и анти-VEGF-антитела В20-4.1, самостоятельно и в комбинации. Комбинация показывает синергетическое влияние на ингибирование роста опухоли.

Подробное описание изобретения

Изобретение включает применение афукозилированного анти-CD20-антитела изотипа IgG1 или IgG3 с содержанием фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 для изготовления лекарственного средства для лечения рака в комбинации с анти-VEGF-антителом.

Термин «антитело» охватывает различные формы антител, в том числе, но не ограничиваясь ими, целые антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела и антитела, полученные путем генной инженерии, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител до тех пор, пока сохраняются их характерные свойства в соответствии с изобретением. Используемые в данном документе термины «моноклональное антитело» или «композиция с моноклональным антителом» относятся к изготовлению молекул антитела единого аминокислотного состава. Соответственно, термин «человеческое моноклональное антитело» относится к антителам, демонстрирующим одинаковую специфичность связывания, которые имеют вариабельные и константные области, полученные из человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулина. В одном воплощении человеческие моноклональные антитела производят с помощью гибридомы, которая включает В-клетки, полученные из трансгенного, отличного от человека, животного, например из трансгенной мыши, с геномом, содержащим трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитым с иммортализованной клеткой.

Термин «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, из одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области, полученной из другого источника или вида, как правило полученному с помощью методик рекомбинантной ДНК. Особенно предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Такие мышиные/человеческие химерные антитела являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные участки мышиного иммуноглобулина, и сегменты ДНК, кодирующие константные участки человеческого иммуноглобулина. Другими формами «химерных антител», охватываемыми данным изобретением, являются те, в которых класс или подкласс был модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела также называют «антителами с переключением класса». Способы получения химерных антител включают обычные методики рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, в настоящее время хорошо известные в данной области. См., например, Morrison, S.L, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5202238 и US 5204244.

Термин «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых были изменены каркасные участки или «участки, определяющие комплементарность» (CDR, complementarity determining regions) так, чтобы они содержали CDR иммуноглобулина другой специфичности, отличной от родительского иммуноглобулина. В предпочтительном воплощении мышиный CDR прививают каркасному участку человеческого антитела для получения «гуманизированного антитела». См., например, Riechmann, L, et al., Nature 332 (1988) 323-327; и Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Особенно предпочтительные CDR соответствуют тем из представленных последовательностей, которые распознают отмеченные выше антигены для химерных и бифункциональных антител.

Термин «человеческое антитело», используемый в данном документе, включает антитела с вариабельными и константными участками, полученными из человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулина. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). На основе такой технологии можно получить человеческие антитела против самых разнообразных мишеней. Примерами человеческих антител являются, например, описанные в Kellermann, S. A., et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597.

Термин «рекомбинантное человеческое антитело», используемый в данном документе, охватывает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных средств, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой как клетка NS0 или СНО, или животного (например, мыши), которое является трансгенным для человеческих генов иммуноглобулинов, или антитела, экспрессируемые с помощью рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельный и константный области, полученные из человеческих зародышевых иммуноглобулиновых последовательностей, в перегруппированной форме. Рекомбинантные человеческие антитела в соответствии с изобретением подвергали соматическому гипермутированию in vivo. Таким образом, аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, будучи полученными из и связанными с человеческими зародышевыми последовательностями VH и VL, не могут естественным образом существовать в наборе человеческих зародышевых антител in vivo.

Используемые в данном документе термины «связывание» или «специфическое связывание» относятся к связыванию антитела с эпитопом опухолевого антитела в анализе in vitro, предпочтительно в анализе плазменного резонанса (Biacore, GE-Healthcare, Упсала, Швеция) с очищенным антигеном дикого типа. Аффинность связывания определяется терминами ka (константа скорости ассоциации антитела из комплекса антитело/антиген), k_D (константа диссоциации) и K_D (k_D/ka). Связывание или специфическое связывание означает аффинность связывания (K_D) 10^-8 М или ниже, предпочтительно от 10^-8 М до 10^-13 М (в одном воплощении от 10^-9 М до 10^-13 М). Таким образом, афукозилированное антитело в соответствии с изобретением специфически связывается с опухолевым антигеном с аффинностью связывания (K_D) 10^-8 моль/л или ниже, предпочтительно от 10^-8 М до 10^-13 М (в одном воплощении от 10^-9 М до 10^-13 М).

Термин «нуклеиновокислотная молекула», используемый в данном документе, включает молекулы ДНК и РНК. Нуклеиновокислотная молекула может быть одноцепочечной или двуцепочечной, но предпочтительно является двуцепочечной ДНК.

«Константные домены» не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но участвуют в эффекторных функциях (ADCC, реакция связывания комплемента и CDC).

Термин «вариабельный участок» (вариабельный участок легкой цепи (VL), вариабельный участок тяжелой цепи (VH)), используемый в данном документе, означает пару из легкой и тяжелой цепей, которая непосредственно участвует в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельной человеческой легкой и тяжелой цепей имеют одинаковые общие структуры, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (framework region, FR), последовательности которых в значительной степени консервативны, соединенные тремя «гипервариабельными участками» (или участками, определяющими комплементарность, CDR). Каркасные участки принимают конформацию b-листа, и CDR могут образовывать петли, связывающие структуру b-листа. CDR в каждой цепи удерживаются в их трехмерной структуре с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий участок.

Термины «гипервариабельный участок» или «антигенсвязывающая часть антитела», используемые в данном документе, относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «участков, определяющих комплементарность», или «CDR». «Каркасными участками», или «FR», являются те участки вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельных участков, определенных здесь. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела содержат от N-конца к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В частности, CDR3 тяжелой цепи является участком, который вносит наибольший вклад в связывание антигена. Участки CDR и FR определены в соответствии со стандартной системой определения Кабата, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или этими остатками из «гипервариабельной петли».

Термин «афукозилированное антитело» относится к антителу изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1) с измененной структурой гликозилирования в Fc-области на Asn297 с пониженным уровнем фукозных остатков. Гликозилирование человеческого IgG1 или IgG3 происходит на Asn297 как гликозилирование сердцевинного фукозилированного двухантенного сложного олигосахарида, заканчивающегося двумя остатками Gal. Эти структуры обозначаются как G0-, G1- (α1,6 или α1,3), или G2-гликанановые остатки в зависимости от количества концевых Gal-остатков (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). Тип гликозилирования Fc-частей антитела в СНО описан, например, Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207. Антитела, которые рекомбинантно экспрессируются в негликомодифицированных клетках-хозяевах СНО, обычно фукозилированы на Asn297 в количестве по меньшей мере 85%. Следует понимать, что термин «афукозилированное антитело», используемый в данном документе, включает антитело, не имеющее фукозу в паттерне гликозилирования. Общеизвестно, что типичной позицией гликозилированного остатка в антителе является аспарагин в позиции 297 в соответствии с системой нумерации ЕС («Asn297»).

«Система нумерации ЕС» или «индекс ЕС» обычно используется, когда речь идет об остатке в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс ЕС, о котором сообщается в сообщении Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), специально включенном в данный документ посредством ссылки).

Таким образом, афукозилированное антитело в соответствии с изобретением означает антитело изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1), в котором количество фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 (что означает, что по меньшей мере 40% или более олигосахаридов Fc-области на Asn297 являются афукозилированными). В одном воплощении содержание фукозы составляет от 40% до 60% олигосахаридов Fc-области на Asn297. В другом воплощении содержание фукозы составляет 50% или менее, и в еще одном воплощении содержание фукозы составляет 30% или менее от олигосахаридов Fc-области на Asn297. В соответствии с изобретением «количество фукозы» означает количество указанного олигосахарида (фукозы) в олигосахаридной (сахарной) цепочке на Asn297, связанное с суммой всех олигосахаридов (сахаров), присоединенных к Asn297 (например, сложных, гибридных и высокоманнозных структур), которое измеряется масс-спектрометрией MALDI-TOF и рассчитывается как среднее значение (подробный порядок определения количества фукозы, см., например, в WO 2008/077546). Кроме того, в одном воплощении олигосахариды в Fc-области имеют симметричное разветвление. Афукозилированное антитело в соответствии с изобретением может быть экспрессировано в гликомодифицированной клетке-хозяине, созданной для экспрессии по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью GnTIII, в количестве, достаточном для частично фукозилированных олигосахаридов в Fc-области. В одном воплощении полипептид с активностью GnTIII является гибридным полипептидом. Альтернативно α1,6-фукозилтрансферазная активность клетки-хозяина может быть уменьшена или устранена в соответствии с US 6946292 для создания гликомодифицированных клеток-хозяев. Степень фукозилирования антитела может быть предопределена, например, в ферментативных условиях (например, по времени ферментирования) или при комбинации по меньшей мере двух антител с различной степенью фукозилирования. Такие афукозилированные антитела и соответствующие гликоинженерные способы описаны в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO2007/031875, Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739. Эти гликоинженерные антитела обладают повышенной ADCC. Другие гликоинженерные способы, дающие афукозилированные антитела в соответствии с изобретением, описаны, например, в Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, Т., et al., J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 или US 2005/0249722.

Таким образом, одним из аспектов изобретения является применение афукозилированного анти-CD20-антитела изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1), специфически связывающегося с CD20 с содержанием фукозы 60% или менее от общего числа олигосахаридов (сахаров) на Asn297, для изготовления лекарственного средства для лечения рака в комбинации с анти-VEGF-антителом. Предпочтительно содержание фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297.

CD20 (также известный как B-лимфоцитарный антиген CD20, B-лимфоцитарный поверхностный антиген В1, Leu-16, BP35, ВМ5 и LF5; последовательность характеризуется записью в базе данных SwissProt P11836) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой примерно 35 кДа, расположенный на пре-В и зрелых В-лимфоцитах (Valentine, M.A. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989):11282-11287; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568). Соответствующий человеческий ген относится к гену, который имеет 4 домена, пронизывающих мембрану, подсемейству А, члену 1, также известному как MS4A1. Этот ген кодирует члена семейства генов, пронизывающих мембрану, 4А. Члены этого возникающего семейства белков характеризуются общими структурными особенностями и похожими границами сплайсинга интронов/экзонов и демонстрируют уникальный характер экспрессии среди гемопоэтических клеток и нелимфоидных тканей. Этот ген кодирует В-лимфоцитарную поверхностную молекулу, которая играет важную роль в развитии и дифференциации В-клеток в плазматические клетки. Этот член семейства локализуется в 11q12, среди кластера членов семейства. Альтернативный сплайсинг этого гена приводит к двум вариантам транскрипции, которые кодируют один и тот же белок.

Термины «CD20» и «CD20-антиген» используются в данном документе как взаимозаменяемые и включают в себя любые варианты, изоформы и виды гомологов человеческого CD20, которые естественным образом экспрессируются клетками или экспрессируются на клетках, трансфицированных геном CD20. Связывание антитела изобретения с антигеном CD20 опосредует уничтожение клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевой клетки) путем инактивации CD20. Уничтожение клеток, экспрессирующих CD20, может осуществляться по одному или более чем одному из следующих механизмов: клеточная гибель/индукция апоптоза, ADCC и CDC.

Синонимы CD20, принятые в данной области, включают B-лимфоцитарный антиген CD20, B-лимфоцитарный поверхностный антиген В1, Leu-16, Bp35, BM5 и LF5.

Термин «анти-CD20 антитело» в соответствии с изобретением обозначает антитело, которое специфически связывает CD20-антиген. В зависимости от связывающих свойств и биологической активности анти-CD20-антител с CD20-антигеном можно различать два типа анти-CD20-антител (тип I и тип II анти-CD20-антител) в соответствии с Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; и Cragg, M.S., et al Blood 101 (2003) 1045-1051, см. таблицу 2.

Таблица 2
Свойства анти-CD20-антител I и II типа
анти-CD20-антитела I типа	анти-CD20-антитела II типа
эпитоп CD20 I типа	эпитоп CD20 II типа
Локализация CD20 на липидных рафтах	Нет локализации CD20 на липидных рафтах
Увеличена CDC (при изотипе IgG1)	Уменьшена CDC (при изотипе IgG1)
Антителозависимая клеточная цитотоксическая активность (при изотипе IgG1)	Антителозависимая клеточная цитотоксическая активность (при изотипе IgG1)

Полная связывающая способность	Уменьшенная связывающая способность
Гомотипическая агрегация	Более сильная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза при перекрестном сшивании	Сильная индукция клеточной гибели без перекрестного сшивания

Примеры анти-CD20 антител II типа включают, например, гуманизированное антитело B-Ly1 IgG1 (химерное гуманизированное антитело IgG1, описанное в WO 2005/044859), 11В8 IgG1 (описанное в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Обычно анти-CD20-антитела II типа изотипа IgG1 демонстрируют характерные CDC-свойства. Анти-CD20-антитела II типа имеют пониженную CDC (при изотипе IgG1) по сравнению с антителами I типа изотипа IgG1.

Примеры анти-CD20-антител I типа включают, например, ритуксимаб, HI47 IgG3 (ЕСАСС, гибридома), 2С6 IgG1 (описанное в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описанное в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описанное в WO 2004/056312).

Афукозилированные анти-CD20-антитела в соответствии с изобретением представляют собой в одном воплощении анти-CD20-антитело типа II, в другом воплощении афукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1.

Афукозилированные анти-CD20-антитела в соответствии с изобретением проявляют повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в отличие от анти-CD20-антител, не имеющих пониженного содержания фукозы.

Под используемым в данном документе термином «афукозилированное анти-CD20-антитело, имеющее повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC)» понимается афукозилированное антитело с повышенной ADCC, что определяется любым подходящим способом, известным специалистам в данной области. Одним из принятых анализов ADCC in vitro является следующий:

1) анализ использует клетки-мишени, о которых известно, что они экспрессируют целевой антиген, распознаваемый антигенсвязывающим участком антитела;

2) в качестве эффекторных клеток анализ использует мононуклеарные клетки периферической крови человека (peripheral blood mononuclear cells, PBMC), выделенные из крови случайно выбранных здоровых доноров;

3) анализ проводится в соответствии со следующим протоколом:

I) PBMC выделяют с использованием стандартных процедур центрифугирования по плотности и суспендируют в количестве 5×10⁶ клеток/мл в культуральной клеточной среде RPMI;

II) клетки-мишени выращивают с использованием стандартных способов культивирования тканей, собирают в экспоненциальной фазе роста с жизнеспособностью более 90%, промывают культуральной клеточной средой RPMI, метят 100 мкКюри ⁵¹Cr, дважды промывают культуральной клеточной средой и ресуспендируют в клеточной культуральной среде с плотностью 10⁵ клеток/мл;

III) 100 мкл конечной клеточной суспензии переносят в каждую лунку 96-луночного микротитровального планшета;

IV) антитело серийно разводят от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл в клеточной культуральной среде, и 50 мкл полученных растворов антитела добавляют к клеткам-мишеням в 96-луночном микротитровальном планшете, тестируя в трех повторах различные концентрации антитела, охватывающие весь спектр концентраций;

V) для контроля максимального высвобождения (maximum release, MR) в три дополнительные лунки в планшете с мечеными клетками-мишенями вносят по 50 мкл 2% (VN) водного раствора неионогенного поверхностно-активного вещества (Nonidet, Sigma, St. Louis) вместо раствора антитела (п. IV выше);

VI) для контроля спонтанного высвобождения (spontaneous release, SR) в три дополнительные лунки в планшете с мечеными клетками-мишенями вносят по 50 мкл клеточной культуральной среды RPMI вместо раствора антитела (п. IV выше);

VII) затем 96-луночный микротитровальный планшет центрифугируют при 50g в течение 1 минуты и инкубируют в течение 1 часа при 4°С;

VIII) 50 мкл суспензии PBMC (п. V выше) добавляют в каждую лунку для получения отношения эффекторные клетки: клетки-мишени, равного 25: 1, и помещают планшеты в инкубатор в атмосферу с 5% CO₂ при 37°С на 4 часа;

IX) из каждой лунки собирают бесклеточный супернатант и с помощью гамма-счетчика оценивают экспериментальный выброс радиоактивных веществ (experimentally released radioactivity, ER);

x) процент специфического лизиса рассчитывают для каждой концентрации антитела по формуле (ER-MR)/(MR-SR)×100, где ER представляет собой среднюю радиоактивность, подсчитанную (см. п. IX выше) для данной концентрации антитела, MR представляет собой среднюю радиоактивность, подсчитанную (см. п. IX выше) для контроля MR (см. п. V выше), a SR представляет собой среднюю радиоактивность, подсчитанную (см. п. IX выше) для контроля SR (см. п. VI выше);

4) «повышенная ADCC» определяется или как увеличение максимального процента специфического лизиса, наблюдаемого в диапазоне концентраций антитела, описанном выше, и/или как снижение концентрации антитела, необходимой для достижения половины максимального процента специфического лизиса, наблюдаемого в диапазоне концентраций антитела, описанном выше. Повышение ADCC соотносится с ADCC, измеренной в описанном выше анализе при посредничестве того же антитела, которое было получено с помощью того же типа клеток-хозяев с использованием тех же стандартных способов получения, очистки, составления и хранения, которые хорошо известны специалистам в данной области, но которое не было получено с помощью клеток-хозяев, созданных для сверхэкспрессии GnTIII.

Указанная «повышенная ADCC» может быть получена с применением гликотехнологии к указанным антителам, это означает повышение указанных естественных клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител путем разработки их олигосахаридного компонента, как описано в Umana, Р. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) и US 6602684.

Термин «комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC)» относится к лизису человеческих опухолевых клеток-мишеней с помощью антитела в соответствии с изобретением в присутствии комплемента. CDC измеряют предпочтительно путем обработки препарата клеток, экспрессирующих CD20, антителом анти-CD20 в соответствии с изобретением в присутствии комплемента. CDC считается найденной, если антитело в концентрации 100 нМ в течение 4 часов индуцирует лизис (клеточную гибель) 20% или более опухолевых клеток. Анализ проводят предпочтительно с опухолевыми клетками, мечеными ⁵¹Cr или Eu, и измеряют высвобождение ⁵¹Cr или Eu. Для контроля проводят инкубацию опухолевых целевых клеток с комплементом, но без антитела.

Антитело «ритуксимаб» (референсное антитело; пример анти-CD20-антитела I типа) является генно-инженерным химерным моноклональным антителом, содержащим человеческий гамма 1 и мышиный константный домен, направленным против человеческого антигена CD20. Это химерное антитело содержит человеческие гамма-1 константные домены и называется «С2В8» в US 5736137 (Andersen et. al.), изданном 17 апреля 1998 года при IDEC Pharmaceuticals Corporation. Ритуксимаб одобрен для лечения пациентов с рецидивирующей или рефракторной, низкой степени злокачественности или фолликулярной, CD20-положительной B-клеточной неходжкинской лимфомой. Исследования механизма действия in vitro показали, что ритуксимаб демонстрирует человеческую комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) (Reff, M.E., et. al., Blood 83 (1994) 435-445). Кроме того, он проявляет значительную активность в анализах, которые измеряют антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Ритуксимаб не является афукозилированным.

Антитело	Содержание фукозы
Ритуксимаб (не афукозилированное)	>85%
Афукозилированное гликоинженерное гуманизированное В-Ly1 дикого типа (В-НН6-B-KV1) (не афукозилированное)	>85%
афукозилированное гликоинженерное гуманизированное В-Ly1 (B-HH6-B-KV1 GE)	45-50%

Термин «гуманизированное B-Ly1-антитело» относится к гуманизированному антителу B-Ly1, раскрытому в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которое было получено из мышиного моноклонального анти-CD20-антитела B-Ly1 (вариабельный участок мышиной тяжелой цепи (VH): SEQ ID №1; вариабельный участок мышиной легкой цепи (VL): SEQ ID №2 - см. Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139) путем химеризации с человеческим константным доменом из IgG1 и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Эти «гуманизированные антитела B-Ly1» раскрыты подробно в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

В одном воплощении «гуманизированное антитело B-Ly1» имеет вариабельный участок тяжелой цепи (VH), выбранный из группы с SEQ ID №3 по SEQ ID №20 (с В-НН2 по В-НН9 и с B-HL8 по B-HL17 из WO2005/044859 и WO 2007/031875). В одном конкретном воплощении такой вариабельный домен выбран из группы, состоящей из SEQ ID №№3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (В-НН2, ВНН-3, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и B-HL13 из WO2005/044859 и WO 2007/031875). В одном конкретном воплощении «гуманизированное антитело B-Ly1» имеет вариабельный участок легкой цепи (VL) SEQ ID №20 (B-KV1 из WO2005/044859 и WO 2007/031875). В одном конкретном воплощении «гуманизированное антитело В-Ly1» имеет вариабельный участок тяжелой цепи (VH) SEQ ID №7 (В-НН6 из WO2005/044859 и WO 2007/031875) и вариабельный участок легкой цепи (VL) SEQ ID №20 (B-KV1 из WO2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, в одном воплощении гуманизированное антитело B-Ly1 является IgG1-антителом. В соответствии с изобретением такие афукозилированные гуманизированные антитела B-Ly1 являются гликоинженерными (т.е. получены путем модификации углевода, ассоциированного с молекулой белка (glycoengineered, GE)) в Fc-области в соответствии с процедурами, описанными в WO2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) и WO 99/154342. В одном воплощении афукозилированное гликоинженерное гуманизированное B-Ly1 представляет собой B-HH6-B-KV1 GE. Такие гликоинженерные гуманизированные антитела B-Ly1 имеют измененную структуру гликозилирования в Fc-области, предпочтительно имея сниженный уровень фукозных остатков. В одном воплощении содержание фукозы составляет 60% или менее от общего числа олигосахаридов на Asn297 (в одном воплощении содержание фукозы составляет от 40% до 60%, в другом воплощении содержание фукозы составляет 50% или менее, а в еще одном воплощении по меньшей мере 30% или менее). В другом воплощении олигосахариды Fc-области предпочтительно имеют симметричное разветвление. Эти гликоинженерные гуманизированные антитела B-Ly1 демонстрируют повышенную ADCC.

Термин «VEGF», используемый в данном документе, относится к человеческому эндотелиальному фактору роста (VEGF/VEGF-A), который описан, например, в Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-1309; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-1312, и Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-20024. VEGF участвует в регуляции нормального и патологического ангиогенеза и неоваскуляризации, которые связаны с опухолями и внутриглазными нарушениями (Ferrara, N., and Davis-Smyth, Т., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; и Dvorak, H., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF представляет собой гомодимерный гликопротеин, который был выделен из нескольких источников. VEGF демонстрирует весьма специфическую митогенную активность по отношению к эндотелиальным клеткам. VEGF имеет важные регуляторные функции в формировании новых кровеносных сосудов во время эмбрионального васкулогенеза и ангиогенеза во взрослой жизни (Carmeliet, P., et al., Nature 380 (1996) 435-439; Ferrara, N., et al., Nature 380 (1996) 439-442; обзор в Ferrara, N. and Davis-Smyth, Т., Endocrine Rev. 18 (1997) 4-25). Значение роли, которую играет VEGF, было продемонстрировано в исследованиях, показывающих, что инактивация отдельной аллели VEGF приводит к эмбриональной летальности из-за неудачного развития сосудистой сети (Carmeliet, Р., et al., Nature 380 (1996) 435-439; Ferrara, N., et al., Nature 380 (1996) 439-442). Кроме того, VEGF имеет сильную активность хемоаттрактанта по отношению к моноцитам, может индуцировать активатор плазминогена и ингибитор активатора плазминогена в эндотелиальных клетках, а также может индуцировать проницаемость капилляров. Из-за последней активности его иногда называют фактором сосудистой проницаемости (VPF, vascular permeability factor). Выделение и свойства VEGF были рассмотрены; см. Ferrara, N., et al., J. Cellular Biochem. 47 (1991) 211-218, и Connolly, J. Cellular Biochem. 47 (1991) 219-223. Альтернативный сплайсинг мРНК одного гена VEGF дает до пяти изоформ VEGF.

Термин «анти-VEGF-антитело» в соответствии с данным изобретением представляет собой антитело, которое специфически связывается с антигеном VEGF. В одном воплощении анти-VEGF-антитела включают моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное анти-VEGF-антитело А4.6.1, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 10709; рекомбинантное гуманизированное моноклональное анти-VEGF-антитело, полученное в соответствии с Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599, в том числе, но не ограничиваясь им, антитело, известное как «бевацизумаб (BV)», также известное как «rhuMAo VEGF» или «AVASTIN». Бевацизумаб содержит мутированные человеческие каркасные области из IgG1 и антигенсвязывающие области, определяющие комплементарность, из мышиного моноклонального анти-hVEGF-антитела А.4.6.1, которое блокирует связывание человеческого VEGF с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, в том числе большая часть каркасных областей, получено из человеческого IgG1, и примерно 7% последовательности получено из мышиного антитела А4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу примерно 149000 дальтон и является гликозилированным. Бевацизумаб и другие гуманизированные анти-VEGF-антитела более подробно описаны в патенте США №6884879 от 26 февраля 2005 года. Дополнительные предпочтительные антитела включают антитела серии G6 или В20 (например, G6-23, G6-31, В20-4.1), описанные в публикации заявки РСТ № WO 2005/1012359. Дополнительные предпочтительные антитела см. в патентах США №№ US 7060269, US 6582959, US 6703020; US 6054297, WO 98/145332, WO 96/130046, WO 94/110202, EP 0666868 B1; в публикациях патентных заявок США №№ US 2006009360, US 20050186208, US 20030206899, US 20030190317, US 20030203409, US 20050112126; и в Popkov., M. et al., Journal of Immunological Methods 288 (2004) 149-164. Они характеризуются связыванием с человеческим и мышиным VEGF; это является необходимым условием для изучения их эффективности на стимулированном мышиным muVEGF ангиогенезе на мышиных моделях. «Антитело серии G6» в соответствии с данным изобретением представляет собой анти-VEGF-антитело, которое получено из последовательности антитела G6 или G6-производного антитела, полученного в соответствии с одной из фиг.7, 24-26 и 34-35 из публикации заявки РСТ № WO 2005/1012359. «Антитело серии В20» в соответствии с данным изобретением представляет собой анти-VEGF-антитело, которое получено из последовательности антитела В20 или В20-производного антитела, полученного в соответствии с одной из фиг.27-29 из публикации заявки РСТ № WO 2005/1012359.

Олигосахаридный компонент может существенно влиять на свойства, имеющие отношение к эффективности терапевтического гликопротеина, включая физическую стабильность, устойчивость к разрушению протеазой, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетику и специфическую биологическую активность. Такие свойства могут зависеть не только от наличия или отсутствия олигосахаридов, но также от их специфических структур. Можно сделать некоторые обобщения между олигосахаридной структурой и функцией гликопротеина. Например, некоторые олигосахаридные структуры опосредуют быстрое выведение гликопротеина из кровотока через взаимодействие со специфическими углеводосвязывающими белками, тогда как другие могут связываться с антителами и вызывать нежелательные иммунные реакции (Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).

Клетки млекопитающих являются превосходными хозяевами для продукции терапевтических гликопротеинов из-за их способности гликозилировать белки в наиболее подходящей для применения у человека форме (Cumming, D.A., et al., Glycobiology 1 (1991) 115-130; Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981). Бактерии очень редко гликозилируют белки, и как другие типы общепринятых хозяев, таких как дрожжи, мицелиальные грибы, клетки насекомых и растений, вырабатывают структуры гликозилирования, связанные с быстрым выведением из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями, а также в некоторых конкретных случаях сокращением биологической активности. Среди клеток млекопитающих в течение последних двух десятилетий наиболее часто используются клетки яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary, CHO). В дополнение к данной подходящей структуре гликозилирования эти клетки позволяют получить постоянное потомство генетически стабильных высокопроизводительных клональных клеточных линий. Они могут культивироваться с высокой плотностью в простых биореакторах с использованием бессывороточных сред, и позволяют разработать безопасные и воспроизводимые биологические процессы. Другие часто используемые клетки животных включают клетки почек детенышей хомяка (baby hamster kidney, BHK), мышиные миеломные клетки NSO и SP2/0. Совсем недавно также была испытана продукция с помощью трансгенных животных (Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных позициях в константных участках тяжелых цепей, с каждым изотипом, обладающим различной сетью N-связанных углеводных структур, которые с различной силой влияют на сборку, секрецию или функциональную активность белка (Wright, A., and Morrison, S.L, Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). Структура присоединенных N-связанных углеводов значительно варьирует в зависимости от степени процессинга, а также может включать высокоманнозные сложные олигосахариды, широко разветвленные и с двумя ветвями (Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). Как правило, существует гетерогенный процессинг центральных олигосахаридных структур, присоединенных к конкретному сайту гликозилирования, так что даже моноклональные антитела существуют в нескольких гликоформах. Кроме того, было показано, что между клеточными линиями происходят значительные различия в гликозилировании антител, и незначительные различия наблюдаются даже при культивировании данной линии клеток в различных условиях (Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822).

Один из способов достижения значительного увеличения активности, сохраняя при этом простой процесс продукции и, возможно, избегая значительных нежелательных побочных эффектов, заключается в усилении природных клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител путем проектирования их олигосахаридного компонента, как описано в Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) и US 6602684. Антитела типа IgG1, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования Asn297 в каждом СН2-домене. Два сложных олигосахарида с двумя ветвями, присоединенные к Asn297, скрыты между СН2-доменами, образуя обширные контакты с полипептидным остовом, и их присутствие имеет важное значение для опосредования эффекторных функций антитела, таких как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) (Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32).

Ранее было показано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы 111 («GnTII17»), гликозилтрансферазы, катализирующей образование олигосахаридов с двумя ветвями, значительно увеличивает in vitro ADCC-активность антинейробластомного химерного моноклонального антитела (chCE7), полученного путем проектирования клеток СНО (см. Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; и WO 99/154342, содержание которых полностью включено данной ссылкой). Антитело chCE7 относится к широкому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые имеют высокую опухолевую аффинность и специфичность, но слишком низкую активность, чтобы быть клинически полезными, когда производятся в стандартных промышленных клеточных линиях, в которых отсутствует фермент GnTIII (см. Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180). Это исследование впервые показало, что значительное увеличение ADCC-активности может быть достигнуто путем создания клеток, продуцирующих антитела, чтобы они экспрессировали GnTIII, что также ведет к увеличению доли константного участка (Fc)-ассоциированных олигосахаридов с двумя ветвями, включая нефукозилированные олигосахариды с двумя ветвями, выше уровней, обнаруженных в природных антителах.

Термин «рак», используемый в данном документе, включает лимфомы, лимфоцитарные лейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), бронхиолоальвеолярный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почек или мочеточников, почечно-клеточную карциному, карциному почечной лоханки, мезотелиому, гепатоцеллюлярный рак, рак желчного пузыря, опухоли центральной нервной системы (ЦНС), опухоли спинного мозга, глиому головного мозга, мультиформную глиобластому, астроцитомы, шванномы, эпендимомы, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденому гипофиза и саркому Юинга, включая рефракторные версии любого из вышеперечисленных видов рака, или комбинацию одного или более чем одного из вышеперечисленных видов рака.

Термин «экспрессия CD20-антигена» призван подчеркнуть значительный уровень экспрессии антигена CD20 в клетке, предпочтительно на клеточной поверхности Т- или В-клетки, более предпочтительно В-клетки, из опухоли или рака соответственно, предпочтительно несолидной опухоли. Пациентов с «CD20-экспрессирующим раком» можно выявить с помощью стандартных анализов, известных в данной области. Например, экспрессию антигена CD20 измеряют с помощью иммуногистохимического исследования (IHC, immunohistochemical detection), FACS-анализа (проточного цитометрического анализа) или путем основанного на ПЦР выявления соответствующей мРНК.

Термин «CD20-экспрессирующий рак», используемый в данном документе, относится ко всем ракам, при которых раковые клетки демонстрируют экспрессию антигена CD20. Предпочтительно термин «CD20-экспрессирующий рак», используемый в данном документе, относится к лимфомам (предпочтительно B-клеточным неходжкинским лимфомам (NHL)) и лимфоцитарным лейкемиям. Такие лимфомы и лимфоцитарные лейкемии включают, например, а) фолликулярные лимфомы, b) лимфомы из мелких клеток с нерасщепленными ядрами/лимфому Беркитта (включая эндемическую лимфому Беркитта, спорадическую лимфому Беркитта и неходжкинскую лимфому Беркитта); с) лимфомы маргинальной зоны (включая экстранодальную B-клеточную лимфому маргинальной зоны (лимфомы, связанные с лимфатической тканью слизистой оболочки, MALT), узловую B-клеточную лимфому маргинальной зоны и лимфому маргинальной зоны селезенки), d) лимфому из клеток зоны мантии (MCL), е) крупноклеточную лимфому (включая диффузную B-крупноклеточную лимфому (DLCL), диффузную лимфому смешанного клеточного типа, иммунобластную лимфому, первичную B-клеточную лимфому средостения, ангиоцентричную лимфому-легочную b-клеточную лимфому), f) волосатоклеточную лейкемию, g) лимфоцитарную лимфому, макроглобулинемию Вальденстрема, h) острый лимфолейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL)/лимфому из малых лимфоцитов (SLL), B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, i) новообразования из плазматических клеток, миелому из плазматических клеток, множественную миелому, плазмоцитому, j) болезнь Ходжкина.

В одном воплощении CD20-экспрессирующим раком является B-клеточная неходжкинская лимфома (NHL). В другом воплощении CD20-экспрессирующим раком является лимфома клеток мантии (MCL), острый лимфолейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), B-клеточная диффузная крупноклеточная лимфома (DLCL), лимфома Беркитта, волосатокпеточная лейкемия, фолликулярная лимфома, множественная миелома, лимфома маргинальной зоны, посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство (PTLD), ВИЧ-ассоциированная лимфома, макроглобулинемия Вальденстрема или первичная лимфома ЦНС.

Термин «способ лечения» или его эквивалент, применяемый, например, к раку, относится к процедуре или курсу действий, которые предназначены для устранения или уменьшения количества раковых клеток у пациента или для облегчения симптомов рака. «Способ лечения» рака или другого пролиферативного расстройства не обязательно означает, что раковые клетки или другое расстройство в действительности могут быть устранены, что число клеток или расстройство в действительности могут быть сокращены, или что симптомы рака или другого расстройства в действительности могут быть ослаблены. Часто способ лечения рака будет выполняться даже при низкой вероятности успеха, но когда, тем не менее, считается, с учетом истории болезни и предполагаемой продолжительности выживания пациента, что это будет иметь улучшающее действие.

Термин «совместное введение» относится к введению указанного афукозилированного анти-CD20-антитела и указанного анти-VEGF-антитела в виде одного состава или в виде двух отдельных составов. Совместное введение может быть одновременным или последовательным в любом порядке, где предпочтительно есть период времени, в течение которого оба (или все) активных вещества одновременно проявляют свои биологические активности. Указанное афукозилированное анти-CD20-антитело и указанное анти-VEGF-антитело совместно вводят одновременно или последовательно (например, внутривенно (IV) путем непрерывной инфузии (одной для анти-CD20-антитела и в конце одной для указанного анти-VEGF-антитела)). Когда оба терапевтических агента вводят совместно последовательно, то дозу вводят либо в один и тот же день путем двух отдельных введений, либо один из агентов вводят в 1-й день, а второй вводят совместно в дни со 2 по 7, предпочтительно в дни со 2 по 4. Таким образом, термин «последовательно» означает в течение 7 дней после дозирования первого компонента (анти-CD20 антитела или анти-VEGF-антитела), предпочтительно в течение 4 дней после дозирования первого компонента; а термин «одновременно» означает «в то же время». Термин «совместное введение» по отношению к поддерживающим дозам указанного афукозилированного анти-CD20-антитела и указанного анти-VEGF-антитела означает, что поддерживающие дозы могут быть совместно введены либо одновременно, если цикл лечения подходит для обоих препаратов, например, раз в неделю, либо указанное анти-VEGF-антитело вводят например, каждые первый-третий дни, а указанное афукозилированное антитело вводят каждую неделю. Либо поддерживающие дозы вводят совместно последовательно в течение одного или нескольких дней.

Очевидно, что антитела вводят пациенту в «терапевтически эффективном количестве» (или просто «эффективном количестве»), которое представляет собой количество соответствующего соединения или комбинации, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ ткани, системы, животного или человека, который пытается получить исследователь, ветеринар, врач или другой специалист.

Количество совместно введенных указанного афукозилированного анти-CD20-антитела и указанного анти-VEGF-антитела и сроки совместного введения будут зависеть от типа (вида, пола, возраста, веса и т.д.) и состояния пациента, который подвергается лечению, и тяжести заболевания или состояния, которое лечат. Указанное афукозилированное анти-CD20-антитело и указанное анти-VEGF-антитело являются подходящими для совместного введения пациенту в одно время или в течение серий лечения, например, в тот же день или на следующий день.

Если введение является внутривенным, то инфузия указанного афукозилированного анти-CD20-антитела или указанного анти-VEGF-антитела в начальный момент времени может быть больше, чем последующая инфузия, например, приблизительно 90 минут для начальной инфузии и приблизительно 30 минут для последующей инфузии (если начальная инфузия переносится хорошо).

В зависимости от типа и тяжести заболевания примерно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) указанного афукозилированного анти-CD20-антитела и от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) указанного анти-VEGF-антитела составляют начальную кандидатную дозировку для совместного введения пациенту обоих препаратов. В одном воплощении предпочтительная доза указанного афукозилированного анти-CD20-антитела (предпочтительно афукозилированного гуманизированного антитела B-Ly1) будет находиться в диапазоне примерно от 0,05 мг/кг до 30 мг/кг. Таким образом, одна или более чем одна доза среди примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг (или любая их комбинация) может быть совместно введена пациенту. В одном воплощении предпочтительная доза указанного анти-VEGF-антитела (предпочтительно бевацизумаба) будет находиться в диапазоне от примерно 0,05 мг/кг до 30 мг/кг. Таким образом, одна или более чем одна доза среди примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг (или любая их комбинация) может быть совместно введена пациенту.

В зависимости от типа (вида, пола, возраста, веса и т.д.), состояния пациента и типа афукозилированного анти-CD20-антитела, дозировка и режим введения указанного афукозилированного антитела могут отличаться для указанного анти-VEGF-антитела. Например, указанное афукозилированное анти-CD20-антитело можно вводить, например, каждые одну-три недели, а указанное анти-VEGF-антитело можно вводить ежедневно или в каждый из 2-10 дней. Может быть также введена начальная более высокая нагрузочная доза, после которой следует одна или более чем одна меньшая доза.

В одном воплощении предпочтительная дозировка указанного афукозилированного анти-CD20-антитела (предпочтительно афукозилированного гуманизированного антитела B-Ly1) будет составлять от 800 до 1200 мг в день 1, 8, 15 3-6-недельного дозового цикла, а затем от 800 до 1200 мг в дни с 1 по 8 3-4-недельного дозового цикла. В одном воплощении предпочтительная доза для бевацизумаба составляет от 5 мг/кг до 15 мг/кг, предпочтительно от 5 мг/кг до 10 мг/кг, и более предпочтительно 5 мг/кг, каждые 14 дней в форме внутривенной инфузии. Рекомендуемая доза бевацизумаба при лечении рака молочной железы, мозга (глиобластомы) или почки (почечно-клеточного) составляет 10 мг на кг и вводится в форме инфузии каждые 4 дня. Рекомендуемая доза будет меняться (на 5 или 10 мг на кг) в зависимости от того, будет ли дальнейшее совместное введение химиотерапевтического агента, и в зависимости от типа химиотерапевтического агента (например, 5 мг/кг бевацизумаба в неделю, с R-СНОР или 15 мг/кг бевацизумаба в 1-й день с последующим R-CHOP во 2-й день цикла 1; и R-CHOP в 1-й день циклов 2-8 в качестве возможного режима введения).

Альтернативно предпочтительная доза указанного афукозилированного анти-CD20-антитела может составлять от 800 до 1200 мг (предпочтительно 1000 мг) в дни с 1-го по 8-й 3-недельного дозового цикла. Предпочтительная доза для бевацизумаба составляет от 5 мг/кг до 15 мг/кг, предпочтительно от 5 мг/кг до 10 мг/кг, и более предпочтительно 5 мг/кг, каждые 14 дней в форме инфузии.

В одном воплощении лекарственное средство применяют для предотвращения или уменьшения метастазирования или дальнейшей диссеминации у такого пациента, страдающего от рака, предпочтительно CD20-экспрессирующего рака. Лекарственное средство применяют для увеличения продолжительности жизни такого пациента, увеличения выживаемости такого пациента без прогрессии, увеличения продолжительности ответа, что приводит к статистически значимому и клинически заметному улучшению состояния леченых пациентов, определяемому по продолжительности жизни, выживаемости без прогрессии, доли ответивших на лечение или продолжительности ответа. В предпочтительном воплощении лекарственное средство применяют для увеличения доли ответов на лечение в группе пациентов.

В контексте этого изобретения в комбинированном лечении рака афукозилированным анти-CD20 антителом и указанным анти-VEGF-антителом могут быть использованы дополнительные Другие цитотоксические, химиотерапевтические или противораковые агенты или соединения, которые усиливают эффект таких агентов.

Такие агенты включают, например: алкилирующие агенты или агенты с алкилирующим действием, например циклофосфамид (СТХ, например цитоксан®), хлорамбуцил (CHL, например лейкеран®), цисплатин (CisP, например platinol®), бусульфан (например милеран®), мелфалан, кармустин (BCNU), стрептозотоцин, триэтиленмеламин (TEA), митомицин С и т.п.; антиметаболиты, такие как метотрексат (МТХ), этопозид (VP16, например вепезид®), 6-меркаптопурин (6МР), 6-тиогуанин (6TG), цитарабин (Ara-С), 5-фторурацил (5-FU), капецитабин (например кселода®), дакарбазин (DTIC) и т.п.; антибиотики, такие как актиномицин D, доксорубицин (DXR, например адриамицин®), даунорубицин (дауномицин), блеомицин, митрамицин и т.п.; алкалоиды, такие как алкалоиды Винка, например винкристин (VCR), винбластин и т.п.; и другие противоопухолевые препараты, такие как паклитаксел (например таксол®) и производные паклитаксела, цитостатические агенты, глюкокортикоиды, такие как дексаметазон (DEX, например декадрон®) и кортикостероиды, такие как преднизон, нуклеозидные ингибиторы ферментов, такие как гидроксимочевину, ферменты, разрушающие аминокислоты, такие как аспарагиназу, лейковорин и другие производные фолиевой кислоты, и подобные различные противоопухолевые агенты. В качестве дополнительного средства также могут быть использованы следующие агенты: амифостин (например этиол®), дактиномицин, мехлоретамин (азотистый аналог иприта), стрептозоцин, циклофосфамид, ломустин (CCNU), липосомальный доксорубицин (например доксил®), гемцитабин (например гемзар®), липосомальный даунорубицин (например дауноксом®), прокарбазин, митомицин, доцетаксел (например таксотер®), алдеслейкин, карбоплатин, оксалиплатин, кладрибин, камптотецин, СРТ 11 (иринотекан), 10-гидрокси-этил-7-камптотецин (SN38), флоксуридин, флударабин, ифосфамид, идарубицин, месна, бета-интерферон, альфа-интерферон, митоксантрон, топотекан, лейпролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пегаспаргаза, пентостатин, пипоброман, пликамицин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, горчичный урацил, винорельбин, хлорамбуцил. В одном воплощении комбинация для лечения с афукозилированным анти-CD20 антителом и анти-VEGF-антителом используется без таких дополнительных агентов.

Применение цитотоксических и противораковых агентов, описанных выше, также как и антипролиферативных специфических к мишеням противораковых препаратов, таких как ингибиторы протеинкиназы в химиотерапевтических схемах, как правило, хорошо охарактеризовано в области терапии рака, и их применение здесь основано на тех же соображениях мониторинга толерантности и эффективности и контроля путей введения и доз с некоторыми изменениями. Например, фактические дозы цитотоксических агентов могут варьировать в зависимости от ответа культивируемых клеток пациента, определенного с помощью способов культивирования тканей. Как правило, доза будет снижена по сравнению с количеством, используемым в отсутствие дополнительных других агентов.

Типичные дозы эффективного цитотоксического агента могут находиться в диапазоне, рекомендованном изготовителем, и, будучи обозначенными как ответы in vitro или ответы на животных моделях, они могут быть сокращены до примерно одного порядка величины концентрации или количества. Таким образом, фактическая доза будет зависеть от решения врача, состояния пациента, а также эффективности терапевтического способа, основанного на реакции in vitro первично культивированных злокачественных клеток или культивированного образца ткани, или на реакции, наблюдаемой на соответствующих животных моделях.

В контексте данного изобретения можно проводить ионизирующее облучение в эффективном количестве, и/или в дополнение к комбинированному лечению CD20-экспрессирующего рака афукозилированным анти-CD20-антителом и указанным анти-VEGF-антителом можно использовать радиоактивный препарат. Источник излучения может быть внешним или внутренним для пациента, получающего лечение. Если источник является внешним по отношению к пациенту, то терапия называется наружной лучевой терапией (EBRT, external beam radiation therapy). Если источник является внутренним по отношению к пациенту, то терапия называется брахитерапией (ВТ, brachytherapy). Радиоактивные атомы для применения в контексте данного изобретения могут быть выбраны из группы, включающей радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод-123, йод-131 и индий-111, но не ограничиваясь ими. Также можно пометить антитела такими радиоактивными изотопами. В одном воплощении комбинированное лечение афукозилированным анти-CD20 антителом и указанным анти-VEGF-антителом в соответствии с изобретением применяется без такого ионизирующего облучения.

Лучевая терапия является стандартным способом контроля нерезектабельной или неоперабельной опухоли и/или метастазов опухоли. Улучшенные результаты были замечены при объединении лучевой терапии с химиотерапией. Лучевая терапия основана на том принципе, что высокие дозы излучения, поступаемые в целевую область, приводят к гибели репродуктивных клеток как в опухолевых, так и в нормальных тканях. Режим дозы облучения, как правило, задается в форме поглощенной дозы излучения (Гр), времени и фракционирования, и должен быть тщательно определен онкологом. Количество радиации, которое получает пациент, будет зависеть от различных факторов, но двумя наиболее важными являются локализация опухоли по отношению к другим критическим структурам или органам тела и степень распространения опухоли. Типичный курс лечения пациента, который проходит лучевую терапию, течет по графику от 1 до 6 недель с суммарной дозой от 10 до 80 Гр, вводимой пациенту 5 дней в неделю частями примерно от 1,8 до 2,0 Гр в день. В предпочтительном воплощении данного изобретения проведение людям с опухолью комбинированного лечения в соответствии с изобретением и радиация действуют синергично. Другими словами, ингибирование опухолевого роста с помощью агентов, содержащих комбинацию изобретения, усиливается в комбинации с излучением, возможно с дополнительными химиотерапевтическими или противораковыми агентами. Параметры адъювантной лучевой терапии содержатся, например, в WO 99/60023.

Афукозилированные анти-CD20-антитела вводят пациенту в соответствии с известными способами путем внутривенного введения в виде болюса или непрерывной инфузии в течение периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутриспинномозговым, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным или интратекальным путем. В одном воплощении введение антитела является внутривенным или подкожным.

Анти-VEGF-антитело вводят пациенту в соответствии с известными способами путем внутривенного введения в виде болюса или непрерывной инфузии в течение периода времени внутримышечным, внутрибрюшинным, внутриспинномозговым, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным или интратекальным путем. В одном воплощении введение антитела является внутривенным или подкожным.

Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые или все материалы, совместимые с введением фармацевтических препаратов, включая растворители, дисперсные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, а также другие материалы и соединения, совместимые с введением фармацевтических препаратов. За исключением случаев, когда любая обычная среда или агент несовместимы с активным соединением, ее применение в композиции изобретения может рассматриваться. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции.

Фармацевтические композиции:

Фармацевтические композиции могут быть получены путем обработки анти-CD20-антитела и/или анти-VEGF-антитела в соответствии с данным изобретением фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими носителями. Лактоза, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновая кислота или ее соли и т.п. могут быть использованы, например, в качестве таких носителей для таблеток, покрытых оболочкой таблеток, драже и твердых желатиновых капсул. Подходящими носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Тем не менее, в случае мягких желатиновых капсул в зависимости от природы активного вещества никакие носители, как правило, не требуются. Подходящими носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, глицерин, растительные масла и т.п. Подходящими носителями для суппозиториев являются, например, природные или отвержденные масла, воски, жиры, полужидкие или жидкие полиолы и т.п.

Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать консерванты, растворители, стабилизаторы, увлажняющие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, ароматизаторы, соли для изменения осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты. Они могут также содержать другие терапевтически полезные вещества.

В одном воплощении изобретения композиция включает как указанное афукозилированное анти-CD20-антитело с содержанием фукозы 60% или менее (предпочтительно указанное афукозилированное гуманизированное антитело В-Ly1), так и указанное анти-УЕСР-антитело для применения в лечении рака, в частности, CD20-экспрессирующего рака (например, B-клеточной неходжкинской лимфомы (NHL).

Указанные фармацевтические композиции могут содержать один или более чем один фармацевтически приемлемый носитель.

Данное изобретение также предусматривает фармацевтическую композицию, например, для применения при раке, включающую (I) эффективное первое количество афукозилированного анти-CD20-антитела с содержанием фукозы 60% или менее (предпочтительно афукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1) и (II) эффективное второе количество анти-VEGF-антитела. Такая композиция, возможно, включает фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты.

Фармацевтические композиции только с афукозилированным анти-CD20-антителом, используемые в соответствии с данным изобретением, готовят для хранения путем смешивания антитела, имеющего требуемую степень чистоты, с возможно фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, хлорид октадецилдиметилбензил-аммония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метиловый или пропиловый парабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие контр-ионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, или PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

Фармацевтические композиции анти-VEGF-антитела могут быть подобны тем, которые были описаны выше для афукозилированного анти-CD20-антитела.

В одном дополнительном воплощении изобретения афукозилированное анти-CD20-антитело и анти-VEGF-антитело собраны в две отдельных фармацевтических композиции.

Также активные ингредиенты могут быть введены в изготовленные микрокапсулы, например путем методик коацервации или путем полимеризации на границе раздела фаз, например в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметацилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980).

Могут быть изготовлены препараты замедленного высвобождения. Подходящими примерами препаратов замедленного высвобождения являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, которые формируют в виде округлых частиц, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц для замедленного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, неразлагающийся этиленвинилацетат, разлагающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), а также поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

Составы, которые будут применяться для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществляется путем фильтрации через мембраны для стерилизующей фильтрации.

Одно воплощение представляет собой композицию, содержащую гуманизированное B-Ly1-антитело, которое афукозилировано с содержанием фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, и бевацизумаб или антитело серии В20 для лечения рака.

Данное изобретение также предусматривает способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, (i) эффективного первого количества афукозилированного анти-CD20-антитела с содержанием фукозы 60% или менее (предпочтительно афукозилированного гуманизированного B-Ly1-антитела) и (ii) эффективного второго количества анти-VEGF-антитела.

В одном воплощении содержание фукозы составляет от 40% до 60%.

Предпочтительно указанный рак представляет собой CD20-экспрессирующий рак.

Предпочтительно указанный CD20-экспрессирующий рак представляет собой В-клеточную неходжкинскую лимфому (NHL).

Предпочтительно указанное афукозилированное анти-CD20-антитело представляет собой анти-CD20-антитело II типа.

Предпочтительно указанное антитело является гуманизированным B-Ly1-антителом.

Предпочтительно указанное анти-VEGF-антитело представляет собой бевацизумаб, антитело серии В20 или антитело серии G6, более предпочтительно серии антитело В20, более предпочтительно бевацизумаб.

Предпочтительно афукозилированное анти-CD20-антитело является гуманизированным B-Ly1-антителом, и указанное анти-VEGF-антитело является бевацизумабом, антителом серии В20 или антителом серии G6, а указанный рак является CD20-экспрессирующим раком, предпочтительно B-клеточной неходжкинской лимфомой (NHL).

Используемый в данном документе термин «пациент» предпочтительно относится к человеку, нуждающемуся в лечении афукозилированным анти-CD20-антителом (например, пациент, страдающий от CD20-экспрессирующего рака) с любой целью, и более предпочтительно к человеку, нуждающемуся в таком лечении для лечения рака или предракового состояния или поражения. Тем не менее, термин «пациент» может также относиться к животным, отличным от человека, предпочтительно к млекопитающим, таким как собаки, кошки, лошади, коровы, свиньи, овцы и приматы, среди прочих.

Изобретение также включает афукозилированное анти-CD20-антитело с содержанием фукозы 60% или менее для лечения рака в комбинации с анти-VEGF-антителом.

Изобретение также включает афукозилированное анти-CD20-антитело с содержанием фукозы 60% или менее и анти-VEGF-антитело для применения в лечении рака.

Предпочтительно афукозилированное анти-CD20-антитело является гуманизированным B-Ly1-антителом.

Предпочтительно указанное анти-VEGF-антитело является бевацизумабом, антителом серии В20 или антителом серии G6, более предпочтительно антителом серии В20, более предпочтительно бевацизумабом.

Предпочтительно указанное афукозилированное анти-CD20-антитело является гуманизированным B-Ly1-антителом, и указанное анти-VEGF-антитело является бевацизумабом, антителом серии В20 или антителом серии G6, а указанный рак является CD20-экспрессирующим раком, предпочтительно B-клеточной неходжкинской лимфомой (NHL).

Следующие примеры и графические материалы приведены с целью облегчить понимание данного изобретения, истинные пределы которого изложены в прилагаемой формуле изобретения. Необходимо понимать, что в изложенных процедурах могут быть сделаны изменения без отступления от сущности изобретения.

Список последовательностей

SEQ ID №:1 аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) мышиного моноклонального анти-CD20-антитела B-Ly1.

SEQ ID №:2 аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) мышиного моноклонального анти-CD20-антитела B-Ly1.

SEQ ID №:3-19 аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) гуманизированных антител B-Ly1 (с В-НН2 по В-НН9, В-HL8 и с B-HL10 по B-HL17)

SEQ ID №:20 аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) гуманизированного B-Ly1-антитела B-KV1

Экспериментальные процедуры

Противоопухолевая активность комбинированного лечения афукозилированным анти-CD20-антителом и анти-VEGF-антителом В20-4.1 на мышиной модели с ксенотрансплантатом

Анализируемые агенты:

Афукозилированное анти-CD20-антитело B-HH6-B-KV1 GE (= гуманизированное B-Ly1, гликоинженерное B-HH6-B-KV1, = GA101, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875) и В20-4.1 были предоставлены GlycArt, Шлиерен, Швейцария. Буфер для антител включал гистидин, трегалозу и полисорбат 20. Раствор антител разводили соответствующим образом в PBS из стокового раствора для предварительных инъекций.

Так как бевацизумаб не является перекрестно реактивным для мышей (Fun, G., et al., J. Biol. Chem. 281 (2006) 6625-631), то антитело В20-4.1 использовали вместо анти-VEGF-антитела (в качестве установленного суррогатного антитела для бевацизумаба) для демонстрации синергетического эффекта на ингибирование роста опухоли афукозилированным анти-CD20-антителом (с содержанием фукозы ниже 60%) B-HH6-B-KV1 GE (= гуманизированное B-Ly1, гликоинженерное B-HH6-B-KV1=GA101) с анти-VEGF-антителом.

Клеточные линии и условия культивирования

Клеточная линия человеческой лимфомы SU-DHL-4 и культуральные среды были закуплены и предоставлены компанией Oncodesign.

Клеточная линия	Тип	Происхождение	Источник
SU-DHL-4	лимфома	человек	DSMZ*
* Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Германия

Опухолевые клетки выращивали в виде суспензии при 37°С во влажной атмосфере (5% С02, 95% воздуха). Культуральной средой являлась RPMI 1640, содержащая 2 мМ L-глутамина (см. BE12-702F, серия №8МВ0056, Lonza, Вервье, Бельгия) и 10% эмбриональную телячью сыворотку (см. 3302, серия № Р282005, Lonza). Клетки подсчитывали в гемоцитометре и оценивали их жизнеспособность методом исключения 0,25% трипанового синего.

Животные

Самок мышей SCID beige CB17 в возрасте 5-6 недели и с весом 16-20 г получали от Charles River (L’Arbresle, Франция). Животных наблюдали в течение 7 дней в наших условиях ухода за животными, свободными от патогенов (SPF), до начала лечения.

Блок ухода за животными имел разрешение Министерства сельского хозяйства и научных исследований Франции (соглашение № А21231011). Эксперименты на животных проводили в соответствии с этическими принципами экспериментов на животных (1) и английскими рекомендациями по благосостоянию животных при экспериментальной неоплазии (2).

Индукция опухолей SC SU-DHL-4 у мышей SCID beige

Десять миллионов (10⁷) опухолевых клеток SU-DHL-4 в 100 мкл PBS с матригелем (50:50, BD Biosciences, Франция) подкожно (SC) вводили в правый бок 52 самкам мышей SCID beige.

Мониторинг

Всеми данными исследования, в том числе измерениями массы тела животного, объема опухоли, клинических проявлений и смертности, а также проведением медикаментозного лечения управляли с помощью программного обеспечения Vivo Manager® (Biosystemes, Дижон, Франция).

Isoflurane Forene (Minerve, Бондуфль, Франция) использовали для анестезирования животных перед подкожным введением опухолевых клеток, внутривенным введением соединений и умерщвлением. Смертность, клинические признаки и поведение записывали каждый день. Массу тела животных и объемы опухолей контролировали и записывали дважды в неделю.

Лечение животных

Когда опухоль достигала среднего объема 172±95 мм³, 40 из 52 голых мышей с опухолями распределяли в 4 группы по 10 мышей в каждой. Схема лечения была выбрана следующим образом.

Мышам из группы 1 один раз в неделю проводили внутривенное болюсное введение носителя в течение 4 недель подряд (Q7Dx4).

Мышам из группы 2 один раз в неделю проводили внутривенное болюсное введение анти-CD20-антитела B-HH6-B-KV1 GE в дозе 3 мг/кг/инъекцию в течение 4 недель подряд (Q7Dx4).

Мышам из группы 3 один раз в неделю проводили внутривенное болюсное введение В20-4.1 в дозе 10 мг/кг/инъекцию в течение 4 недель подряд (Q7Dx4).

Мышам из группы 4 один раз в неделю проводили внутривенное болюсное введение анти-CD20-антитела B-HH6-B-KV1 GE в дозе 3 мг/кг/инъекцию (Q7Dx4) в комбинации с внутривенным болюсным введением один раз в неделю В20-4.1 в дозе 10 мг/кг/инъекцию (Q7Dx4).

Исследование ингибирования роста опухоли in vivo

Противоопухолевая эффективность анти-CD20-антитела B-HH6-B-KV1 GE (= гуманизированное B-Ly1, гликоинженерное B-HH6-B-KV1, = GA101) была рассмотрена отдельно и в комбинации с В20-4.1. В20-4.1, введенное в качестве единственного агента, использовали в качестве референсного соединения. В качестве агента для монотерапии анти-CD20-антитело B-HH6-B-KV1 GE в субоптимальной дозе 3 мг/кг или В20-4.1 в дозе 10 мг/кг приводило к умеренному ингибированию роста опухоли. Комбинированное лечение анти-CD20-антителом В-HH6-B-KV1 GE и В20-4.1 повышало противоопухолевую активность in vivo по сравнению с каждым препаратом в отдельности. Девять субъектов в группе, получавшей 3 мг/кг анти-CD20-антитела B-HH6-B-KV1 GE плюс 10 мг/кг В20-4.1, были определены как не имеющие опухоли. Рост опухоли был соответственно медленнее в группе с комбинированной терапией, чем в группе с монотерапией. Из-за выраженной противоопухолевой активности в группе с комбинированным лечением было невозможно рассчитать задержку роста опухоли и значение времени удвоения опухоли. На 46 день после введения опухолевых клеток значения Т/С (%) в группах с лечением по сравнению с группой с носителем составляли 51, 33 и 4 с анти-CD20-антителами B-HH6-B-KV1 GE, В20-4.1 и их комбинацией, соответственно.

1. Применение гуманизированного В-Ly1 антитела (B-HH6-B-KV1), содержащего вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью SEQ ID №7 (В-НН6) и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью SEQ ID №20 (B-KV1), которое представляет собой афукозилированное анти-CD20-антитело с содержанием фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 для изготовления лекарственного средства для лечения CD20-экспрессирующего рака в комбинации с анти-VEGF-антителом.

2. Применение по п. 1, характеризующееся тем, что CD20-экспрессирующий рак является В-клеточной неходжкинской лимфомой (NHL).

3. Применение по п. 1, характеризующееся тем, что анти-VEGF-антитело является бевацизумабом, антителом серии В20 или антителом серии G6.

4. Применение по п. 1, характеризующееся тем, что указанное анти-VEGF-антитело является бевацизумабом или антителом серии В20.

5. Композиция, содержащая гуманизированное В-Ly1-антитело (В-НН6-В-KV1), содержащее вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью SEQ ID №7 (В-НН6) и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью SEQ ID №20 (B-KV1), которое представляет собой афукозилированное анти-CD20-антитело с содержанием фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 в эффективном количестве, и бевацизумаб или антитело серии В20 для лечения CD20-экспрессирующего рака в эффективном количестве.

6. Способ лечения пациента, страдающего от CD20-экспрессирующего рака, путем введения эффективного количества гуманизированного В-Ly1 антитела (В-HH6-B-KV1), содержащего вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью SEQ ID №7 (В-НН6) и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью SEQ ID №20 (B-KV1), которое представляет собой афукозилированное анти-CD20-антитело с содержанием фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 в комбинации с эффективным количеством анти-VEGF-антитела пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что указанный CD20-экспрессирующий рак является В-клеточной неходжкинской лимфомой (NHL).

8. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что указанное анти-VEGF-антитело является бевацизумабом, антителом серии В20 или антителом серии G6.

9. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что указанное анти-VEGF-антитело является бевацизумабом или антителом серии В20.

10. Способ по любому из предыдущих пп. 6-9, характеризующийся тем, что вводится один или более чем один дополнительный другой цитотоксический, химиотерапевтический или противораковый агент, или соединение, или ионизирующее излучение, которое усиливает эффекты таких агентов.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлено моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1, использующееся в качестве самостоятельного действующего вещества для терапии опухолевых заболеваний.

Антигенсвязывающие молекулы, которые связывают egfr, кодирующие их векторы и их применение // 2610688

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложены выделенные полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепи антитела против человеческого EGFR; анти-EGFR антитело и фрагмент антитела; а также вектор, клетка-хозяин и способ получения анти-EGFR антитела или его фрагмента.

Антитела против рецептора фолиевой кислоты 1, их иммуноконъюгаты и использование // 2610663

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложено гуманизированное антитело и его антиген-связывающий фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором фолиевой кислоты 1 (FOLR1) человека и охарактеризованные аминокислотными последовательностями участков, определяющих комплементарность с антигеном (CDR).

Cd37-связывающие молекулы cd37 и иммуноконъюгаты // 2610662

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описаны антитела, специфично связывающиеся с CD37 человека и CD37 макаки.

Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли // 2610428

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его фрагменту, которые обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1. Также раскрыты конъюгат антитела, который специфически связывается с CAPRIN-1, фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело или его фрагмент или конъюгат, для лечения или профилактики злокачественной опухоли, ассоциированной с CAPRIN-1, ДНК, кодирующая указанное антитело.

Новые конъюгаты связывающее соединение - активное соединение (adc) и их применение // 2610336

Настоящее изобретение относится к новым конъюгатам связывающее соединение - активное соединение (ADC) N,N-диалкилауристатинов, которые направлены против мишени С4.4а, к активным метаболитам указанных конъюгатов ADC, к способу получения этих конъюгатов ADC, к применению этих конъюгатов ADC для лечения и/или предотвращения заболеваний, а также к применению этих конъюгатов ADC для получения лекарственных средств для лечения и/или предотвращения заболеваний, более конкретно гиперпролиферативных и/или ангиогенных заболеваний, таких как, например, онкологические заболевания.

Анти-cd40-антитела и способы применения // 2609647

Изобретение относится к биохимии. Описано выделенное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые связываются с CD40 человека и являются агонистами CD40.

Гуманизированные антитела к liv-1 и их применение для лечения рака // 2608646

Изобретение относится к области биохимии, в частности к гуманизированному антителу, которое специфично связывается с LIV-1, а также к нуклеиновой кислоте, кодирующей зрелый вариабельный участок тяжелой цепи и к нуклеиновой кислоте, кодирующей зрелый вариабельный участок легкой цепи вышеуказанного антитела.

Антитела против белка рецептора с-мет // 2608644

Изобретение относится к биохимии. Описано антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с белком c-Met человека.

Fcγriib-специфичное fc-антитело // 2608504

Изобретение относится к биохимии. Описан полипептид, содержащий Fc-область антитела по меньшей мере с одним аминокислотным изменением, который имеет повышенную активность связывания с FcγRIIb по сравнению с исходным полипептидом, где величина [величина KD полипептида, содержащего Fc-область антитела, в отношении FcγRIIa (тип R)]/[величина KD полипептида, содержащего Fc-область антитела, в отношении FcγRIIb] равна 1,2 или более, где величина [величина KD для более сильной из активностей связывания полипептида, содержащего Fc-область антитела, в отношении FcγRIIa (тип R) и FcγRIIa (тип Н)]/[величина KD для более сильной из активностей связывания исходного полипептида в отношении FcγRIIa (тип R) и FcγRIIa (тип Н)] составляет 0,7 или более, и где аминокислотное изменение представляет собой замену Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp или замену Leu в положении 328 (нумерация EU) на Glu.

Антитела, которые связывают интегрин альфа-v бета-8 // 2614252

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предлагаются антитела с высокой аффинностью к β8-субъединице αvβ8.

Состав, содержащий антитело // 2609658

Изобретение относится к биохимии. Описан фармацевтический состав для лечения ангиогенных заболеваний, содержащий антитело, которое связывается с VEGF, в аргинин ацетатном буфере, рН 4,5-6,0, и поверхностно-активное вещество, где антитело представляет собой бевацизумаб.

Биспецифические двухвалентные антитела анти-vegf/анти-ang-2 // 2597973

Изобретение относится к области биохимии, в частности к биспецифическому двухвалентному антителу, которое специфично связывается с фактором роста эндотелия сосудов человека (VEGF) и с ангиопоэтина-2 человека (ANG-2).

Новые модуляторы и способы их применения // 2592672

Изобретение относится к биохимии. Представлено химерное, CDR-привитое, гуманизированное или рекомбинантное человеческое антитело или его фрагмент, который специфически связывается с человеческим EFNA4.

Стабильные и растворимые антитела, ингибирующие vegf // 2588467

Изобретение относится к биохимии. Описано рекомбинантное антитело, его фрагмент, нейтрализующие VEGF человека, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), где VH содержит CDRH1, CDRH2 и CDRH3 последовательности SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 32 соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), где VL содержит CDRL1, CDRL2 и CDRL3 последовательности SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 66 соответственно и где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87.

Способы лечения диабета антагонистами dll4 // 2587624

Изобретение относится к биохимии. Описано применение антител или их фрагментов, которые специфично связывают hDH4 и блокируют взаимодействие между Dll4 и Notch-рецептором для предупреждения, лечения или ослабления сахарного диабета 1-го типа у субъекта.

Нацеленные средства связывания, направленные на dll4, и их применение // 2581962

Изобретение относится к биохимии. Раскрыто антитело или его связывающий фрагмент, которое(ый) специфически связывается с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и включает: VH CDR 1, которая содержит аминокислотную последовательность NYGIT (аминокислотные остатки 31-35 SEQ ID NO: 30), и VH CDR 2, которая содержит аминокислотную последовательность WISAYNGNTNYAQKLQD (аминокислотные остатки 50-66 SEQ ID NO: 30), VH CDR 3, которая содержит аминокислотную последовательность DRVPRIPVTTEAFDI (аминокислотные остатки 99-113 SEQ ID NO: 30), и VL CDR 1, которая содержит аминокислотную последовательность SGSSSNIGSYFVY (аминокислотные остатки 23-35 SEQ ID NO: 32), VL CDR 2, которая содержит аминокислотную последовательность RNNQRPS (аминокислотные остатки 51-57 SEQ ID NO: 32), VL CDR 3, которая содержит аминокислотную последовательность AAWDDSLSGHWV (аминокислотные остатки 90-101 SEQ ID NO: 32).

Антитела человека против ангиопоэтин-подобного белка 4 человека // 2580045

Изобретение относится к биохимии. Раскрыты антитело человека или антиген-связывающий фрагмент антитела человека, которые специфически связывают и ингибируют ангиопоэтин-подобный белок 4 человека (hANGPTL4).

Способ получения биспецифических антител против cd3*cd19 формата флексибоди в клетках млекопитающих // 2577226

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения рекомбинантного моноклонального антитела против CD3*CD19 формата флексибоди.

Биспецифические антигенсвязывающие белки // 2573914

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения биспецифического антигенсвязывающего белка, содержащего: две легкие цепи и две тяжелые цепи полноразмерного антитела, включающего два Fab-фрагмента и специфически связывающегося с первым антигеном; и два дополнительных Fab-фрагмента антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, где указанные дополнительные Fab-фрагменты оба слиты посредством пептида-коннектора с С- или N-концами тяжелых цепей, указанных в подпункте а); где пептидом-коннектором является (Gly-x-Ser)n, или (Gly-x-Ser)nGlym(х=3, n=3, 4, 5 или 6 и m=0,1, 2 или 3), или (х=4, n=2,3, или 5 и m=0, 1, 2 или 3) и где в Fab-фрагментах осуществлены следующие модификации: I) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), или в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и/или константные домены CL и СН1 замены друг на друга; II) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга или константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; III) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга или константные домены CL и СН1 заменены друг на друга, и в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; IV) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга и в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), константные домены CL и СН1 заменены друг на друга; или V) в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте а), константные домены CL и СН1 заменены друг на друга и в обоих Fab-фрагментах, указанных в подпункте б), вариабельные домены VL и VH заменены друг на друга; а способ включает этапы: а) трансформацию клетки-хозяина экспрессионными векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие указанный биспецифический антигенсвязывающий белок; б) культивирования клетки-хозяина в условиях, которые позволяют синтезировать молекулу этого биспецифического антигенсвязывающего белка; и в) выделение молекулы указанного биспецифического антигенсвязывающего белка из указанной культуры.

Фармацевтические композиции на основе соли микофеноловой кислоты с энтеросолюбильным покрытием // 2615397

Группа изобретений раскрывает фармацевтическую композицию, включающую микофенолят с нанесенным на него энтеросолюбильным покрытием, обеспечивающую высвобождение микофенолята в верхней части кишечного тракта, и способ подавления иммунитета у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества указанной композиции пациенту, нуждающемуся в такой терапии.