Способ моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования мышиной меланомы в16 у белых нелинейных крыс

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано для моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования меланомы B₁₆. Для этого используют белых нелинейных крыс. Через 2 недели после выведения у животного селезенки под кожу передней брюшной стенки в нее имплантируют суспензию опухолевых клеток мышиной меланомы В₁₆ в физиологическом растворе в объеме 0,1 мл и в разведении 1:10. Через полгода от момента перевивки регистрируют лимфогенный и гематогенный путь распространения меланомы с морфологически подтвержденным метастатическим поражением внутренних органов. Способ обеспечивает достоверность моделирования, при этом экономичен и прост в исполнении. 6 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано при воспроизведении мышиной меланомы В₁₆ у белых нелинейных крыс и в дальнейшем для разработки новых способов ее экспериментальной терапии.

Известно, что меланома - одна из трудно поддающихся лечению онкологических нозологий, заболеваемость которой в России, как и во всем мире, постоянно растет (см. Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность). Под ред. Каприна А.Д., Старинского В.В., Петровой Г.В., Москва, 2014, с. 250). Среди всех типов злокачественных опухолей кожи 65% летальных исходов обусловлены меланомой, поскольку даже полное локальное удаление опухоли не исключает развитие отдаленных метастазов (см. Лопатин В.Ф., Мардынский Ю.С., Горбушин Н.Г. Интегративная оценка сопротивляемости организма при термолучевой терапии онкологических больных / Росс. онколог. журнал. - 2007. - №4. - С. 26-32).

Для изучения патогенеза меланомы и для разработки способов ее профилактики и терапии используют различные экспериментальные модели: 1) перевиваемые опухоли животных; 2) гетеротрансплантаты опухолей человека; 3) культуры тканей или клеток опухоли; 4) органные культуры.

Использование перевиваемых опухолей делает возможным постановку эксперимента с большим числом сравниваемых групп животных. Среди перевиваемых меланом наиболее часто применяют меланомы мышей: Хардинга-Пасси, В-16 и S-91 Клаудмана. Меланома В₁₆ возникла спонтанно в коже мыши линии C57BL/6 у основания уха в 1954 году. Штамм поддерживается на мышах линии C57BL/6 перевивкой опухолевой взвеси на 12-16 сутки роста.

В зависимости от способа перевивки у мышей меланома B₁₆ «ведет» себя по-разному. Так, при подкожной перевивке (0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса или среде 199 (1:10), перевиваемость опухоли составляет 100%) - меланома метастазирует преимущественно гематогенно в легкие (60-90%), реже - в печень и селезенку (см. Софьина З.П. и др. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. - М.: Медицина, 1980. - 296 с.; Dingemane K.Р. et al. В-16 Melanoma Metastasis in Mouse Liver and Lung // Inv. Metast. - 1985. - №5. - P. 50-60).

При введении опухолевых клеток в хвостовую вену развиваются метастазы в легких.

При внутрибрюшной имплантации меланома В₁₆ растет в виде множественных мелких узелков, выстилающих брюшную полость. Клеточная популяция опухоли гетерогенна и включает как сильно пигментированные участки, так и фрагменты с незначительным содержанием или полным отсутствием меланина. Модальный класс опухоли насчитывает 40 хромосом. Пролиферативный пул в момент перевивки опухоли составляет 71,6% (см. Фадеева Е.В. Экспериментальная модель меланомы В16 и методы иммунотерапии / Межд. журн. экспер. образ. - 2010. - №8. - С. 49-50).

Известно, что меланома у людей метастазирует не только гематогенным, но и лимфогенным путем, поражая кроме легких и печени лимфатические образования, например лимфатические узлы. Поэтому меланому B₁₆, перевиваемую стандартно подкожно мышам, нельзя считать «идеальной» моделью меланомы людей.

В настоящее время белые лабораторные крысы не используются для изучения меланомы, поскольку, как и у любых альбиносов, спонтанные меланомы у них не возникают, а меланомы животных других видов, например мышиные, при стандартных способах перевивки не воспроизводятся. В то же время, в некоторых случаях, крысы могут иметь преимущества перед мышами. Прежде всего, это большие размеры животного и, следовательно, больший объем материала для исследований и меньшее количество умерщвленных животных для решения тех или иных научных задач. Во-вторых, это более продолжительное по времени развитие опухоли, что позволит более детально изучить патогенез заболевания, а значит и точки воздействия на него.

Известно, что один и тот же штамм опухоли при разных способах его перевивки может не метастазировать совсем или метастазировать по-разному. Так, подкожное введение крысам клеток гепатокарциномы не дает метастазов, внутривенное введение приводит к образованию метастазов в легком и печени, а введение опухолевого материала под капсулу почки вызывает метастазирование опухоли в грудные паратимические лимфатические узлы (см. Trencsenyi G., Marian Т., Bako F., Emri M., Nagy G., Kertai P., Banfalvi G. Metastatic hepatocarcinoma he/de tumor model in rat. J Cancer. 2014 Jun 21; 5(7): 548-58).

Для того чтобы воспроизвести активное лимфогенное метастазирование для штамма опухоли, слабо метастазирующей таким образом при стандартной перевивке, надо каким-то образом попытаться ослабить иммунную систему животного. Одним из таких приемов является введение опухолевых клеток в селезенку крыс.

Известен способ перевивки карциномы Герена в селезенку крыс. Карцинома Герена при подкожной перевивке иногда метастазирует в лимфатические узлы. Введение опухолевых клеток в селезенку приводит к активации пролиферации в самой опухоли, так и к бласттрансформации в селезенке, в результате развиваются лимфомы и лейкемии, происходят изменения в тимусе и мезентериальных лимфатических узлах (см. Бобро Л.И., Фильчаков Ф.В., Гриневич Ю.А., Шумилина Е.С. Морфологические изменения в органах иммуногенеза при трансплантации карциномы Герена в селезенку / Арх. пат. - 2004. - N 4. - С. 30-35).

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа получения экспериментальной модели меланомы у крыс, метастазирующей лимфогенным и гематогенным путем.

Поставленный технический результат достигается тем, что через 2 недели после предварительного выведения селезенки под кожу передней брюшной стенки в нее имплантируют суспензию опухолевых клеток мышиной меланомы В₁₆ в физиологическом растворе в объеме 0,1 мл и в разведении 1:10, и через полгода от момента перевивки регистрируют лимфогенный и гематогенный путь распространения меланомы с морфологически подтвержденным метастатическим поражением внутренних органов.

Для пояснения предлагаемого изобретения предложены рисунки.

На фиг. 1 изображена диффузная инфильтрация опухолевыми клетками меланомы В₁₆ с крупной эозинофильной цитоплазмой, неравномерным скоплением гранул меланина в трабекулах селезенки.

На фиг. 2 изображено нарушение дольковой структуры в тимусе, нет четкой градации коркового и мозгового вещества, отмечается выраженная диффузная инфильтрация лимфоцитами и опухолевыми клетками меланомы В₁₆ с крупными гиперхромными ядрами, патологическими митозами.

На фиг. 3 изображен метастаз в лимфоузле эпителиоидноклеточной меланомы с апоптозом отдельных клеток.

На фиг. 4 изображено скопление крупных атипичных опухолевых клеток с микровезикулярной цитоплазмой, содержащих мелкие гранулы меланина вокруг центральных вен в центральных отделах печени.

На фиг. 5 изображена диффузная инфильтрация опухолевыми клетками в парапанкреатической жировой клетчатке, представленными эпителиодными клеточными элементами, содержащими меланин.

На фиг. 6 изображена диффузная инфильтрация опухолевыми клетками, в стенке кишки с вовлечением мышечной оболочки, представленными эпителиодными клеточными элементами, содержащими меланин.

Изобретение «Способ моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования мышиной меланомы В₁₆ у белых нелинейных крыс» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии о воспроизведении мышиной меланомы В₁₆ у крыс.

Новизна изобретения заключается в ксеногенной трансплантации опухолевого штамма меланомы В₁₆ в селезенку нелинейных белых крыс, в результате чего мышиная опухоль начинает расти в селезенке крысы, постепенно нарушая ее работу и метастазируя лимфогенным и гематогенным путем в тимус, регионарные лимфоузлы, кишечник, печень, поджелудочную железу, легкие.

Изобретение «Способ моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования мышиной меланомы В₁₆ у белых нелинейных крыс» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной модели меланомы у крыс, метастазирующей лимфогенным и гематогенным путем с целью изучения патогенеза этого заболевания и дальнейшей разработки методов его экспериментальной терапии.

«Способ моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования мышиной меланомы В₁₆ у белых нелинейных крыс» выполняется следующим образом.

Все манипуляции с животными производятся в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицируют общепринятым способом. Ассистент фиксирует крысу в положении на спине, удаляет шерсть с передней поверхности тела, смазывает кожу живота 70% спиртом и дает эфирный наркоз.

Затем экспериментатор в стерильных условиях проводит верхнюю срединную лапаротомию, аккуратно отсепарорывает кожу от мышц, формируя «карман», и делает небольшой вертикальный разрез в мышечном слое передней брюшной стенки под левой реберной дугой, достаточный, чтобы через него «прошла» селезенка без повреждений.

После того как экспериментатор извлек селезенку из отверстия в мышцах, он ушивает этот разрез, чтобы селезенка фиксировалась под кожей в кармане. Далее ассистент ушивает операционную рану и обрабатывает шов 5% спиртовым раствором йода.

Через 2 недели после заживления операционной раны и восстановления животного интралиенально вводят 0,1 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В₁₆ в физиологическом растворе в разведении 1:10. Для этого, соблюдая все условия асептики, описанные выше, ассистент фиксирует крысу на спине. Селезенка визуализируется в виде бугорка на животе крысы. Над местом возвышения ассистент сбривает шерсть, обрабатывает кожу 5% спиртовым раствором йода. Экспериментатор рукой в стерильной перчатке захватывает кожную складку с выступающей селезенкой и в месте максимального ее возвышения, что приблизительно соответствует центру органа, иглой 5 см³ шприца прокалывает кожу и селезенку не глубоко, примерно до середины органа, и вводит опухолевую взвесь. Затем извлекает иглу, и место введения плотно, сильно не надавливая, прижимает ватным тампоном, смоченным в 70% спирте с небольшим добавлением йода, на 1 минуту, чтобы исключить вытекание вводимой взвеси.

Через 1,5 месяца после интралиенального введения опухолевой взвеси в селезенку она становится плотной. Через полгода - крысы вялые, аппетит снижен, из носа кровянистые выделения, видимые кожные покровы и слизистые - бледные, одышка, живот умеренно увеличен в размерах, при пальпации - флюктуирует.

При вскрытии:

I. Макроскопически

В плевральной и брюшной полостях - прозрачная жидкость, желтоватого оттенка, объемом 1,5-2 мл (гидроторакс, асцит). Селезенка находится под кожей в фиброзной капсуле, плотная, темного цвета, незначительно увеличена. Тимус увеличен до 1 см³, шаровидной формы, черно-серого цвета. Легкие и сердце визуально не изменены. Печень неоднородной окраски: по бледному фону с желтоватым оттенком - красная зернистость. В толще хвостатой доли объемное опухолевое образование, размером 1-1,5 см³. Петли тонкого кишечника раздуты, окрашены в желтый цвет. В брюшной полости - опухолевый конгломерат, исходящий из брыжейки или кишечника, размером 11,25 см³, бугристый, неоднородной окраски (темные и светлые участки). Опухоль проросла желудок, 12-перстную кишку, поджелудочную железу. Увеличены пейеровы бляшки, мезентеральные лимфатические узлы выглядят как «бусы» или «гроздья». Надпочечники увеличены в размерах, черного цвета. Кровоизлияние в верхний полюс правого семенника.

II. Микроскопически

В трабекулах селезенки - диффузная инфильтрация опухолевыми клетками меланомы В₁₆ с крупной эозинофильной цитоплазмой, неравномерным скоплением гранул меланина (фиг. 1).

В тимусе - нарушение дольковой структуры, нет четкой градации коркового и мозгового вещества, отмечается выраженная диффузная инфильтрация лимфоцитами и опухолевыми клетками меланомы В₁₆ с крупными гиперхромными ядрами, патологическими митозами (фиг. 2).

В лимфоузле - метастаз эпителиоидноклеточной меланомы с апоптозом отдельных клеток (фиг. 3).

В центральных отделах печени, вокруг центральных вен - скопление крупных атипичных опухолевых клеток с микровезикулярной цитоплазмой, содержащих мелкие гранулы меланина (фиг. 4).

В парапанкреатической жировой клетчатке - диффузная инфильтрация опухолевыми клетками, представленными эпителиодными клеточными элементами, содержащими меланин (фиг. 5).

В стенке кишки с вовлечением мышечной оболочки диффузная инфильтрация опухолевыми клетками, представленными эпителиодными клеточными элементами, содержащими меланин (фиг. 6).

Технико-экономическая эффективность «Способ моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования мышиной меланомы B₁₆ у белых нелинейных крыс» заключается в том, что полученные метастазы в легкие, печень, кишечник и другие органы являются морфологически подтвержденными метастазами меланомы, растут и приводят к гибели животных. Способ осуществляется на белых беспородных крысах с применением опухолевого штамма мышиной меланомы В₁₆ и предполагает распространение метастазов двумя путями: лимфогенным и гематогенным, что приближает данную экспериментальную модель меланомы к меланоме, развивающейся в организме человека. Способ экономичен, доступен.

Способ моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования мышиной меланомы В₁₆ у белых нелинейных крыс, заключающийся в том, что через 2 недели после предварительного выведения селезенки под кожу передней брюшной стенки в нее имплантируют суспензию опухолевых клеток мышиной меланомы В₁₆ в физиологическом растворе в объеме 0,1 мл и в разведении 1:10, и через полгода от момента перевивки регистрируют лимфогенный и гематогенный путь распространения меланомы с морфологически подтвержденным метастатическим поражением внутренних органов.