Композиции и способы испытаний на токсикогенность

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ анализа нейротоксина Clostridium botulinum (BoNT) на активность, включающий: контактирование нервной клетки, происходящей от индуцированной полипотентной стволовой клетки (hiPS) человека, с композицией, включающей BoNT и анализ указанного BoNT на биологическую активность путем определения присутствия или отсутствия расщепления субстрата BoNT в подвергшейся контакту нервной клетке, и/или присутствия или отсутствия высвобождения нейромедиатора из подвергшейся контакту нервной клетки. Также описан способ анализа нейротоксина BoNT на активность, включающий: контактирование нервной клетки, происходящей от hiPS человека, с композицией, включающей BoNT и нейтрализующее антитело, и анализ указанного BoNT на биологическую активность путем определения присутствия или отсутствия расщепления субстрата BoNT в подвергшейся контакту нервной клетке, и/или присутствия или отсутствия высвобождения нейромедиатора из подвергшейся контакту нервной клетки. Также представлен способ определения количества биологически активного BoNT в препарате путем контактирования нервной клетки, происходящей hiPS, с образцом препарата и определения количества биологически активного BoNT, присутствующего в препарате, путем определения количества расщепления субстрата BoNT в подвергшейся контакту нервной клетке, происходящей от hiPS, и/или определения количества высвобождения нейромедиатора из подвергшейся контакту нервной клетки, происходящей от hiPS. Также раскрыто применение нервной клетки, происходящей от индуцированной полипотентной стволовой клетки (hiPS) человека, для анализа BoNT на активность. Изобретение представляет высокочувствительный анализ для обнаружения и/или анализа нейротоксина BoNT в образце с использованием нервных клеток, полученных из IP человека в качестве высокочувствительной и воспроизводимой платформы для обнаружения ботулинического нейротоксина. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 пр.

 

По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 61/540693, поданной 29 сентября 2011 г., которая является включенной в настоящее описание во всей своей полноте путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для испытания отравляющих веществ (например, детектированию и анализу нейротоксина Clostridium botulinum (BoNT)). В частности, настоящее изобретение относится к применению клеток, происходящих от индуцированных полипотентных стволовых клеток (hiPS) человека для детектирования и анализа отравляющих веществ.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Нейротоксины ботулизма (BoNT), синтезируемые грамположительной, обитающей в почве бактерией Clostridium botulinum, являются наиболее токсичными веществами, известными человечеству, и являются причинными факторами нейропаралитического заболевания ботулизма (Johnson E., (2005) в Topley and Wilson's microbiology and microbial infections, ред. S.P. Borriello, P.R. Murray, and G.Funke (Hodder Arnold, London, United Kingdom), p. 1035-1088). Описано семь иммунологически различных серотипов BoNT, обозначаемых А-G (Gimenez DF & Gimenez JA (1995) Int J Food Microbiol 27: 1-9). BoNT исходно синтезируются в виде одноцепочечного полипептида в ~150 кДа, но посттрансляционное протеолитическое расщепление дает различные тяжелые и легкие цепи (НС и LC) в ~100 кДа и ~50 кДа, связанные дисульфидной связью. НС далее функционально разделяется на субдомены НС_С и HC_N. Домен НС_С отвечает за распознавание и связывание со специфическими рецепторами на поверхности нервной клетки, приводя к эндоцитозу, в то время как домен HC_N отвечает за формирование канала в мембране эндоцитовой везикулы и транслокацию, и интернализацию LC по эндосомальной мембране (Montecucco et al., (2004) Trends Microbiol 12: 442-446; Fischer A. & Montal M. (2007) J Biol Chem 282: 29604-29611; Fischer A. et al., (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106: 1330-1335). Во время транслокации дисульфидная связь расщепляется и LC высвобождается в цитозоль клетки, и заново сворачивается в активный ферментный компонент в качестве цинк-зависимой эндопептидазы (Fischer et al., выше; Fischer A. & Montal M. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104: 10447-10452). LC затем специфически нацеливается и расщепляет внутриклеточный белок SNARE у пресинаптических везикул, что приводит к ингибированию высвобождения нейромедиатора. Каждый серотип BoNT имеет отдельную мишень для расщепления; при этом BoNT/A и Е расщепляют SNAP-25 на отдельных участках, BoNT/B, D, F и G расщепляют VAMP/синаптобревин на отдельных участках, и BoNT/C расщепляет и SNAP-25, и синтаксин (обзор у Montecucco C. & Schiavo G. (1994) Mol Microbiol 13: 1-8).

Встречающийся в природе ботулизм представляет собой редкую, но опасную болезнь; при этом ~110 случаев в год происходят в Соединенных Штатах, со смертностью ~5-10% (Johnson E.A. & Montecucco C. (2008) в Handbook of Clinical Neurology, ed Andrew G. Engel (Elsevier, pp 333-368). Из-за их исключительной силы (оцениваемая смертельная доза для человека в 1 нг/кг массы тела для BoNT/A, Bossi P. et al., (2006) Cell Mol Life Sci 63: 2196-2212) опасности болезни ботулизма и высоких затрат, связанных со случаями лечения, особенно в крупном масштабе, BoNT классифицировали как особо опасный патоген категории А, и они представляют собой серьезную угрозу в качестве биотеррористического оружия (Arnon S.S. et al., (2001) JAMA 285: 1059-1070).

BoNT/A и, в гораздо меньшей степени, BoNT/B также используют в качестве уникальных и важных лекарственных препаратов для лечения ряда нервно-мышечных расстройств и в косметике. Условия, в которых управление по контролю продуктов питания и лекарственных средств разрешило использование BoNT, включат в себя косметические обработки и для временного снятия различных расстройств мышечной спастичности (Chaddock J.A. & Acharya K. (2011) FEBS J 278: 899-904). Косметические и клинические применения BoNT расширяются, и разрабатываются новые составы BoNT для фармацевтических целей, делая необходимыми клинические испытания, точное определение силы и скрининга нейтрализующих антител. Например, BoNT фармацевтически применяют для лечения болевых расстройств, гипергидроза, косметической коррекции морщин, блефароспазма, оромандибулярной дистонии, синдрома открытия челюстей, синдрома закрытия челюстей, бруксизма, синдрома Мейжа, язычной дистонии, апраксии век, открывающейся цервикальной дистонии, антеколлиса, ретроколлиса, латероколлиса, тортиколлиса, фарингальной дистонии, ларингальной дистонии, спастической дисфонии/аддукторного типа, спастической дисфонии/абдукторного типа, спастической одышки, дистонии конечностей, дистонии рук, направленной дистонии, писчего спазма, музыкального спазма, спазма гольфиста, дистонии ног, аддукции ляжки, аддукции ляжки со сгибанием колена, флексии лодыжки, разгибания стопы, экиноваруса, деформирующей дистонии ноги, стриарного пальца ноги, разгибания пальца ноги, аксиальной дистонии, синдрома “Пизанской башни”, синдрома “танца живота”, сегментальной дистонии, гемидистонии, общей дистонии, дистонии в лубаге, дистонии в кортико-базальной дегенерации, дистонии в лубаге, тардивной дистонии, дистонии в спино-церебральной атаксии, дистонии в синдроме Паркинсона, дистонии в болезни Хантингтона, дистонии в болезни Галлервордена-Шпатца, ДОФА-индуцированных дискинезий/ДОФА-индуцированной дистонии, тардивных дискинезий/тардивной дистонии, пароксизмальных дискинезий/дистоний, индуцированного кинезиогенным, некинезиогенным действием нистагма мягкого неба, миоклонической миокимии, окоченения, слабых мышечных колик, наследственного дрожания подбородка, парадоксальной активности челюстной мышцы, гемимастикаторных спазмов, гипертрофической бранхиальной миопатии, мазетеральной гипертрофии, гипертрофии передней большеберцовой мышцы, нистагма, надъядерного паралича взора при осциллопсии, парциальной непрерывной эпилепсии, планирования операции спастической кривошеи, паралича абдукторных голосовых связок, рекальцинатной мутационной дисфонии, дисфункции верхнего пищеводного сфинктера, гранулемы голосовой складки, синдрома Жиль де ла Туретта с заиканием, миоклонии среднего уха, защитного закрытия гортани, постларингэктомии, нарушения речи, защитного опущения верхнего века, заворота век, дисфункции сфинктера Одди, псевдоахалазии, неахалазии, нарушений пищеводной моторики, вагинизма, постоперационного иммобилизационного дрожания, дисфункции мочевого пузыря, детрузорно-сфинктерной диссинергии, спазма сфинктера мочевого пузыря, одностороннего спазма лица, реиннервационных дискинезий, косметического эффекта “гусиных лапок”, сморщивающих лицевых асимметрий, впадин подбородочной мышцы, синдрома скованного человека, тетанического увеличения предстательной железы, ожирения, лечения детского церебрального паралича, косоглазия, смешанного паралитического сопутствующего синдрома, после операции по отделению ретины, после операции катаракты, в миотическом косоглазии при афакии, миопатического косоглазия, раздвоенного вертикального отклонения, в качестве дополнения при операции косоглазия, эзотропии, экзотропии, ахалазии, анальных трещин, гиперактивности экзокринной железы, синдрома Фрея, синдрома “крокодиловых слез”, гипергидроза, аксиальной ладонной подошвенной ринореи, относительного повышенного слюнотечения при сердечном приступе, в амиотрофическом латеральном склерозе, спастических условиях, при аутоиммунных процессах энцефалита и миелита, множественном склерозе, поперечном миелите, синдроме Девика, вирусных инфекциях, бактериальных инфекциях, паразитных инфекциях, грибковых инфекциях, в наследственном постапоплектическом синдроме спастического парапареза, полушарном инфаркте, инфаркте столба головного мозга, инфаркте спинного мозга, при травме центральной нервной системы, полушарных повреждениях, повреждениях столба головного мозга, повреждении спинного мозга, при внутримозговом кровотечении, в субарахноидальном кровотечении, субдуральном кровотечении, интраспинальном кровотечении, в неоплазиях, полушарных опухолях, опухолях столба головного мозга и опухолях спинного мозга. Таким образом, количественное и надежное детектирование активности BoNT в окружающей среде, пищевых продуктах, в фармацевтических препаратах, для детектирования антител и в исследовательских применениях является важным как в предотвращении ботулизма, для борьбы с терроризмом, также как и для разработки новых лекарств и безопасности пациентов, и контроля качества, и для контроля подлинности продуктов.

Опубликовано много способов детектирования BoNT, и их можно разделить на четыре общие категории (обзор у Cai et al., (2007) Crit Rev Microbiol 33: 109-125): 1. анализы in vitro, которые иммунологически детектируют присутствие голотоксина, но не могут различить активные или неактивные состояния (ELISA); 2. эндопептидазные анализы, которые детектируют ферментативную активность токсина LC, но не делают различий между биологически активным голотоксином и только LC; 3. анализы in vivo (мышиный биоанализ); и, наконец, 4. симуляционные анализы in vivo, такие как анализы правого купола диафрагмы, анализы локальной инъекции и анализы на клеточной основе с использованием материнских или иммортализированных клеток. Для детектирования полностью активных BoNT в анализе на обнаружение следует измерять все стадии процесса интоксикации (например: связывание НС с рецепторами на поверхности клетки, эндоцитоз, формирование канала в везикуле, расщепление дисульфидной связи, трансдукция LC в цитозоль клетки, и, наконец, протеолитическое расщепление белков SNARE). Лишь в мышином биоанализе и в симуляционных анализах in vivo измеряют все эти стадии. Мышиный биоанализ включает в себя инъекцию мышам либо внутривенно, либо интраперитонально различных разбавлений BoNT, и затем наблюдение за мышами на предмет симптомов отравления ботулизмом (паралич конечностей, затрудненное дыхание, встопорщенная шерсть и т.д.) (Hatheway C.L. (1988) в Laboratory diagnosis of infectious diseases: principles and practice, ред. Balows A., Hausler W.H., Ohashi M. & Turano M.A. (Springer-Verlag, New York), pp. 111-133; Schantz EJaK, D.A. (1978) Journal of Association of Official Analytical Chemists 61: 96-99) и, наконец, смерть. Хотя МВА является количественным и может отслеживать все стадии интоксикации, он обладает большой частотой ошибок, не является стандартизированным между или внутри лабораторий, требует большого числа животных, и соответствующего оборудования и квалифицированного персонала. Анализы правого купола диафрагмы и локальной инъекции снижают страдание животных и некоторые являются достаточно чувствительными, но все еще требуют большого числа животных и квалифицированного персонала.

Эти ясно выявленные недостатки этих анализов вызвали рекомендацию регулирующих органов, включая FDA и USDA, разработать модель на клеточной основе, которая бы обеспечила специфичную, чувствительную и количественную альтернативу МВА (National Institute of Environmental Health Sciences, 2008). Для испытания на токсичность использовали различные непрерывные клеточные линии, включая neuro-2a и РС-12, но они не являются достаточно чувствительными для конкуренции с МВА. Материнские нейроны, происходящие от крысы, мыши или цыпленка, и нейроны, происходящие от эмбриональных стволовых клеток мыши, являются значительно более чувствительными (Hall Y.H. et al. (2004) J Immunol Methods 288: 55-60; Keller J.E., Cai F. & Neale E.A. (2004) Biochemistry 43: 526-532; Lalli G. et al. (1999) J Cell Sci 112 (Pt 16): 2715-2724; Neale et al., (1999) J Cell Biol 147: 1249-1260; Stahl A.M. et al. (2007) J Biomol Screen 12: 370-377). Наиболее чувствительным типом клеток для испытания на токсичность и детектирование антител из описанных являются анализ материнскими клетками спинного мозга крысы (RSC) (Pellett et al., (2007) FEBS Lett 581: 4803-4808), который является более чувствительным, чем МВА, воспроизводимым, и хорошо коррелирует с мышиным биоанализом (Pellett et al., (2010) J Pharmacol Toxicol Methods). В дополнение, было также показано, что нейроны, происходящие от эмбриональных стволовых клеток, являются высокочувствительными (McNutt et al., (2011) Biochem Biophys Res Commun 405: 85-90; Pellett S. et al. (2011) Biochem Biophys Res Commun 404: 388-392; Kiris E. et al. (2011) Stem Cell Res). Однако анализ RSC все еще требует использования какого-то количества животных и квалифицированного персонала для подготовки клеток, и не является легко адаптируемым для стандартизации испытания из-за потребности непрерывно получать новые партии клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам испытаний отравляющих веществ (например, детектирование и анализ нейротоксина Clostridium botulinum (BoNT)). В частности, настоящее изобретение относится к применению клеток, происходящих от индуцированных полипотентных стволовых клеток (hiPS) человека для детектирования и анализа отравляющих веществ.

В вариантах осуществления настоящего изобретения созданы нервные клетки (например, человеческие (например, происходящие от iPS)) для использования в исследованиях, скрининге, клинических и терапевтических применений. В некоторых вариантах осуществления способы используют для детектирования и анализа BoNT и нейтрализации антител к BoNT. Примерные варианты осуществления описаны в настоящем описании и ниже. В настоящем описании описаны дополнительные варианты осуществления, и они находятся в пределах знаний специалиста в данной области техники.

Например, в некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении создан способ анализа вида клостридий (например, нейротоксина Clostridium botulinum (BoNT)) на активность, включающий: а) контактирование нервной клетки, происходящей от индуцированной полипотентной стволовой клетки (hiPS) человека, с композицией, включающей в себя NT; и b) анализ NT на биологическую активность. В некоторых вариантах осуществления виды клостридий представляют собой Clostridium botulinum, Clostridium butyricum или Clostridium baratii. В некоторых вариантах осуществления BoNT охватывает все семь известных серотипов, включая серотипы А, В, С, D, E, F и G, и известные подтипы внутри каждого серотипа. В некоторых вариантах осуществления NT представляет собой рекомбинантный, мутантный или химерный NT. В некоторых вариантах осуществления биологическая активность представляет собой расщепление SNAP-25, VAMP или синтаксина. В некоторых вариантах осуществления анализ является качественным, в то время как в других он является количественным. В некоторых вариантах осуществления NT является очищенным, в то время как в других он находится в комплексе, растворе или матрице. В некоторых вариантах осуществления NT является рекомбинантным. В некоторых вариантах осуществления NT является конъюгированным с другой молекулой, выбранной из терапевтических воздействий, маркеров, радиофармацевтических средств, ферментов, рецепторов, антител или биологически активных соединений. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию контактирования NT с пробным веществом перед контактированием с нервными клетками, происходящими от hiPS. В некоторых вариантах осуществления пробное вещество представляет собой антитело (например, нейтрализующее антитело) или малый молекулярный ингибитор NT. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело является очищенным или находится в сыворотке или в образце антитоксина.

В настоящем изобретении дополнительно создан способ анализа нейротоксина вида клостридий (например, BoNT) на активность, включающий: а) контактирование нервной клетки, происходящей от индуцированной полипотентной стволовой клетки (hiPS) человека, с композицией, включающей в себя: а) NT; и b) нейтрализующее антитело, и b) анализ NT на биологическую активность.

Настоящее изобретение также относится к способу определения количества биологически активного BoNT в препарате, включающем биологически активный BoNT и, предпочтительно, фармацевтический препарат, включающий в себя биологически активный BoNT. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадии (а) контактирования нервной клетки, происходящей от клетки hiPS, с образцом препарата, включающим в себя биологически активный BoNT; и (b) определения количества биологически активного BoNT, присутствующего в препарате, путем анализа образца на биологическую активность BoNT.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение нервной клетки, происходящей от индуцированной полипотентной стволовой клетки (hiPS) человека, для анализа BoNT на активность.

Дополнительные варианты осуществления описаны в настоящем описании.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показана экспрессия рецептора BoNT в нейронах iPS. А. Клетки iPS выдерживали в течение 4, 7, 10, 14 и 21 дня и анализировали вестерн-блоттингом на уровни экспрессии рецепторов BoNT. В. Клетки iPS выдерживали в течение 5, 10, 15 и 20 дней, и для осуществления количественных анализов ПЦР использовали зрелые клетки мозга человека.

На фиг. 2 показано сравнение чувствительности нейронов iPS, посеянных на 7 различных субстратов (указано справа), на BoNT/A1.

На фиг. 3 показана чувствительность нейронов iPS и клеток RSC на BoNT/A1.

На фиг. 4 показана зависимость детектирования активности BoNT/A1 в нейронах iPS.

На фиг. 5 показана интенсивность поглощения BoNT/A1 нейронами iPS по сравнению с клетками RSC.

На фиг. 6 показана интенсивность поглощения BoNT/A1 нейронами в зависимости от активности. А. Нейроны iPS и клетки RSC подвергали воздействию 55 U или 275 U BoNT/A1 в клеточно-стимулирующей среде в течение 1, 5, 10 и 15 мин, с последующим удалением токсина и 24 ч инкубации. В. Нейроны iPS подвергали воздействию 55 U BoNT/A1 и в нейронной, и в клеточно-стимулирующей средах в течение 1, 5 и 10 мин. С. Нейроны подвергали воздействию 1,7-55 U BoNT/A1 в течение 5 мин в клеточно-стимулирующей среде, дважды промывали нейронной средой и инкубировали в течение 24 ч.

На фиг. 7 показаны данные вестерн-блоттинга и денситометрии в анализе защиты антителами в нейронах iPS. А. Нейроны iPS подвергали воздействию 1,5 U токсина и антитела в течение 24 ч. В. Нейроны iPS подвергали воздействию 55 U смеси токсин-антитело в клеточно-стимулирующей среде в течение 5 мин, затем смесь удаляли, клетки промывали дважды и инкубировали в течение 24 ч.

На фиг. 8 показана чувствительность нейронов iPS к комплексу BoNT/A и очищенного BoNT/A. А. Сравнение очищенного BoNT/A1 и комплекса BoNT/A1 в геле SDS-PAGE (лэддер от Invitrogen: SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard). В. Чувствительность нейронов iPS к очищенному токсину BoNT/A1 и комплексу BoNT/A1 после 48 ч воздействия токсина.

На фиг. 9 показано детектирование активности BoNT/B, C и Е в нейронах iPS. Нейроны iPS выдерживали в течение 7 дней, и клетки RSC подвергали воздействию последовательных разбавлений BoNT/B(A)/C(B) и/E(C) в течение 48 ч параллельно.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Для облегчения понимания настоящего изобретения ряд терминов и фраз пояснен ниже:

В том виде, как он используется в настоящем описании, термин “клетка-хозяин” относится к любой эукариотической или прокариотической клетке (например, клетки млекопитающих, клетки птиц, клетки амфибий, клетки растений, клетки рыб и клетки насекомых), расположенной либо in vitro, либо in vivo.

В том виде, как он используется в настоящем описании, термин “клеточная культура” относится к любой клеточной культуре in vitro. В этот термин включены непрерывные клеточные линии (например, с бессмертным фенотипом), первичные клеточные культуры, перевиваемые клеточные линии (например, нетрансформированные клетки) и любая другая популяция клеток, поддерживаемая in vitro, включая ооциты и эмбрионы.

В том виде, как он используется в настоящем описании, термин “токсичный” относится к любому неблагоприятному или вредоносному воздействию на клетку или ткань по сравнению с той же самой клеткой или тканью до ввода токсиканта.

В том виде, как он используется в настоящем описании, термин “фармацевтическая композиция” относится к комбинации активного ингредиента с носителем, инертным наполнителем или активным компонентом, делающим композицию особенно пригодной для диагностического или терапевтического применения in vitro, in vivo или ex vivo.

В том виде, как он используется в настоящем описании, термин “фармацевтически приемлемый носитель” относится к любому стандартному фармацевтическому носителю, такому как физиологический раствор с фосфатным буфером, вода, эмульсии (например, такие эмульсии как “масло в воде” или “вода в масле”) и различные типы смачивающих средств. Композиции могут также включать в себя стабилизаторы или консерванты. Для примеров носителей, стабилизаторов и вспомогательных средств см., например (Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]).

В том виде, как он используется в настоящем описании, термин “детектировать”, “детектирующий” или “детектирование” может описывать либо общее действие по открытию или распознаванию, или конкретному наблюдению поддающейся обнаружению маркированной композиции.

В том виде, как он используется в настоящем описании, термин “очищенный” или “очищать” относится к удалению компонентов (например, загрязнений) из образца. Например, антитела очищают путем удаления загрязняющих неиммуноглобулиновых белков; их также очищают путем удаления иммуноглобулина, который не связывается с молекулой-мишенью. Удаление неиммуноглобулиновых белков и/или удаление иммуноглобулинов, которые не связываются с молекулой-мишенью, приводит к увеличению доли активных к мишени иммуноглобулинов в образце. В другом примере рекомбинантные полипептиды экспрессируются в бактериальных клетках-хозяевах, и полипептиды очищают путем удаления белков клетки-хозяина; таким образом, доля рекомбинантных полипептидов в образце увеличивается.

В том виде, как он используется в настоящем описании, термин “образец” используется в наиболее широком смысле. В одном смысле он имеет целью включать в себя образец или культуру, полученные из любого источника, также как и образцы окружающей среды и биологические. Биологические образцы можно получить от животных (включая людей), и они охватывают жидкости, твердые вещества, ткани и газы. Биологические образцы включают в себя клетки, ткани, продукты крови, такие как плазма, сыворотка и им подобные. Однако такие примеры не должны толковаться как ограничивающие типы образцов, применимые в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления образец также может представлять собой образец препарата, включающий в себя биологически активный BoNT, такой как препарат BoNT для применения в фармацевтических или косметических целях. Более того, в аспекте раскрытия образец может представлять собой образец окружающей среды или пищевой образец, подозреваемые в содержании BoNT.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для испытания отравляющих веществ (например, детектирование и анализ нейротоксина Clostridium botulinum (BoNT)). В частности, настоящее изобретение относится к применению клеток, происходящих от индуцированных полипотентных стволовых клеток (hiPS) человека, для детектирования и анализа отравляющих веществ.

В вариантах осуществления изобретения созданы системы и способы детектирования и анализа BoNT. В некоторых вариантах осуществления в системах и анализах используют нейроны, происходящие от человеческих iPS в качестве высокочувствительной и воспроизводимой платформы для детектирования ботулинического нейротоксина (BoNT). В некоторых вариантах осуществления нейроны составляют популяцию пан-нейронной GABA-эргических, допаминэргических и глутаматэргических нейронов с чистотой 98%, и продуцируются и криосохраняются в виде дифференцированных клеток. В другом аспекте нейроны представляют собой по существу чистую пан-нейронную популяцию GABA-эргических, допаминэргических и глутаматэргических нейронов, и продуцируются и криосохраняются в виде дифференцированных клеток, где клетки являются, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95% или, по меньшей мере, на 96% чистыми относительно нервных клеток. Эксперименты, проведенные во время разработки вариантов осуществления настоящего изобретения, показали, что клетки эспрессируют все необходимые рецепторы и субстраты для интоксикации BoNT всеми серотипами BoNT. Анализы детектирования BoNT показывают, что происходящие от iPS нейроны являются высокочувствительными к количественному детектированию BoNT/A, B, C и Е, и нейтрализующих антител.

В ноябре 2007 г. две независимые группы впервые показали, что клетки-фибробласты человека можно перепрограммировать в полипотентные стволовые клетки просто путем активации небольшого набора подавленных генов (Takahashi K. et al. (2007) Cell 131: 861-872; Yu J. et al. (2007) Science 318: 1917-1920). Эти клетки назвали индуцированными полипотентными стволовыми клетками, и их можно поддерживать и криосохранять подобно клеточным линиям. Это открытие открывает возможность для разработки большого количества происходящих от человеческих iPS клеточных моделей, которые напоминают полностью функционирующие дифференцированные соматические клетки человека, и не требуют какого-либо использования животных.

В выборе клеток iPS для использования в системах и способах, описанных в настоящем описании, является предпочтительным, чтобы клетки можно было бы надежно и воспроизводимо продуцировать и генерировать чистые популяции дифференцированных клеток в достаточном количестве для таких исследований. В некоторых вариантах осуществления такие клетки являются доступными от Cellular Dynamics Inc. (Мэдисон, штат Висконсин).

Эксперименты, проведенные во время разработки вариантов осуществления настоящего изобретения, показали, что нейроны, происходящие от человеческих iPS, являются высокочувствительной, селективной и видоспецифичной клеточной моделью для детектирования ботулинических нейротоксинов, нейтрализующих антител и ингибиторов, и для исследований вхождения BoNT в клетку и перемещения там. Эти нейроны являются пригодными для замены МВА для определения силы BoNT, также как и для детектирования антител, скрининга ингибиторов и исследовательских применений.

1. Клетки

В том виде, как они описаны в настоящем описании, в вариантах осуществления настоящего изобретения создаются происходящие от полипотентных стволовые клетки для применения в детектировании и анализе отравляющих веществ, таких как BoNT. В некоторых вариантах осуществления клетки являются человеческими (т.е. нервные клетки, происходящие от индуцированных полипотентных стволовых клеток (hiPS) человека, или человеческие эмбриональные стволовые клетки). Способы генерации клеток iPS описаны, например, в Yu et al., Science, 2009 May 8; 324(5928): 797-801, Epub 2009, WO 2011056971 и WO 2011025852, каждая из которых является включенной в настоящее описание во всей своей полноте путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления клетки iPS являются дифференцированными в нейроны с использованием подходящих способов (например, описанных в патентных заявках США US 2010/0279403 и US 2010/0216181, каждая из которых является включенной в настоящее описание во всей своей полноте путем ссылки).

В некоторых вариантах осуществления нейроны составляют популяцию пан-нейронной GABA-эргических, допаминэргических и глутаматэргических нейронов с чистотой 98%, и продуцируются и криосохраняются в виде дифференцированных клеток. В некоторых вариантах осуществления используют доступные на рынке клетки iPS нейронального происхождения (например, доступные от Cellular Dynamics Inc. (Мэдисон, штат Висконсин) или GlobalStem (Роквилл, штат Мэриленд)), хотя можно использовать другие источники. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой нервные клетки hiPS.

В другом аспекте клетки представляют собой по существу чистую пан-нейронную популяцию GABA-эргических, допаминэргических и глутаматэргических нейронов, и продуцируются и криосохраняются в виде дифференцированных клеток, где клетки являются, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95% или, по меньшей мере, на 96% чистыми относительно нервных клеток.

Настоящее изобретение не является ограниченным клетками, описанными в настоящем описании. Можно использовать дополнительные клеточные линии и первичные клеточные культуры. Например, в некоторых вариантах осуществления используют холинэргические нейроны.

В некоторых вариантах осуществления пригодные клеточные линии экспрессируют рецепторы и субстраты, необходимые или существенные для интоксикации BoNT.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении создаются системы и наборы, включающие в себя клеточные линии, описанные в настоящем описании, вместе с компонентами, необходимыми, достаточными или пригодными для осуществления детектирования и анализа BoNT. Например, в некоторых вариантах осуществления наборы включают в себя клетки и реагенты клеточной культуры (например, плашки, буферы), реагенты для анализа, контроли (положительные и отрицательные контроли BoNT и/или ингибитора) и инструкции для проведения и интерпретации анализов.

В аспекте изобретения нервная клетка, происходящая от клетки hiPS, является получаемой или полученной путем дифференцирования и/или выдерживания клетки hiPS, генерированной способом, как указано выше, в нервную клетку. Такой дифференциации клетки, в одном аспекте, можно достичь путем культивирования клеток hiPS примерно при 37°С и примерно при 5% СО₂. В аспекте среда для культивирования может представлять собой среду Neurobasal, дополненную В27 и глутамаксом (Invitrogen, Inc., США). Во еще другом аспекте клетки культивируют в покрытых полилизином плашках, и в еще другом аспекте плашки дополнительно покрыты матригелем (BD Bioscience, США). В аспекте для культивации используют 96-луночную плашку, где клетки выращивают с плотностью примерно в 40000 клеток на лунку. В аспекте клеткам дают возможность расти в течение примерно 24 ч. После этого клеткам дают в аспекте возможность созревать в течение от примерно 2 до примерно 28 дней, в аспекте от примерно 4 до примерно 14, или в аспекте от примерно 4 до примерно 7 дней.

В аспекте указанные нервные клетки, происходящие от клетки hiPS, получают, по существу, путем способа дифференциации и выдерживания, как указано в сопровождающих примерах ниже.

Варианты осуществления настоящего изобретения также относятся к нервной клетке, происходящей от клетки hiPS, полученной путем вышеуказанного способа дифференциации и выдерживания.

В аспекте такая нервная клетка, происходящая от клетки hiPS, отличается наличием одного или более или, в аспекте, всех из следующих маркеров: β3-тубулин, NeuN, vGAT, vGLUT2, NSE нейрон-специфичная енолаза или Tbr1 (фактор транскрипции домена 1). Для β3-тубулина или NeuN предусмотрено, что количество положительных клеток в культуре нервных клеток, происходящих от клетки hiPS, по изобретению составляет примерно 99%. Для vGAT или vGLUT2 в аспекте предусмотрено, что, по меньшей мере, часть клеток культуры являются положительными по отношению к указанным маркерам.

В аспекте такая нервная клетка, происходящая от клетки hiPS, отличается отсутствием одного или более или, в аспекте, всех из следующих маркеров: GFAP, TH, NNE (ненейронная енолаза), Tbr2 (фактор транскрипции домена 2) или NoGo a,C. Для GFAP предусмотрено, что количество положительных клеток в культуре нервных клеток, происходящих от клетки hiPS, является сильно небольшим и, в аспекте, ниже примерно 5% или даже ниже примерно 1%; для остальных маркеров в аспекте предусмотрено, что они, если они вообще присутствуют, присутствуют в количестве ниже детектируемого количества.

Присутствие или отсутствие количества вышеуказанных маркеров можно, в аспекте, определить путем обычных иммуногистологических приемов окрашивания, анализа клеточных лизатов вестерн-блоттингом или, если имеются в виду β3-тубулин или NeuN, анализом FACS. Описаны дополнительные приемы детектирования (см., например, US 2012/0178083, US 2008/0280301, Englund 2005, J Neurosci 25: 247-251; Dupuis 2002, Neurobiology of Diseases 10: 358-365; каждый из которых является включенным в настоящее описание во всей своей полноте путем ссылки).

В дополнительном аспекте нервная клетка, происходящая от клетки hiPS, отличается, по меньшей мере, одним и, в аспекте, всеми следующими электрофизиологическими свойствами: ингибирование каналов Na2+ тетродотоксином (TTX), ингибирование каналов К+ тетраэтиламмонием, ингибирование каналов Са2+ L-типа нифедипином, ингибирование каналов Са2+ P/Q типа w-агатоксином IVA, или ингибирование каналов Са2+ N-типа w-конотоксином GVIA. Такие электрофизиологические свойства можно испытать стандартными электрофизиологическими измерениями включая, например, измерения фиксации потенциала до и после обработки клеток соответствующими ингибиторами.

В другом аспекте нервная клетка, происходящая от клетки hiPS, отличается чувствительностью к BoNT и, в аспекте, BoNT/A. Более того, клетки, в аспекте, являются также чувствительными к другим нейротоксическим соединениям дозозависимым образом и, в частности, по меньшей мере, к одному или всем из следующих соединений: стауроспорину, конкурентному ингибитору киназы АТР, хлорпромазоину или фенотиазину. Чувствительность к вышеуказанным соединениям можно определить, например, анализами жизнеспособности клеток.

В аспекте нервные клетки, происходящие от клетки hiPS, являются также чувствительными относительно разрастания неврита, по меньшей мере, к одному и, в аспекте, ко всем из следующих соединений: антимицину А, митомицину С, МК571, PD98092 или стауроспорину.

Дополнительно, в аспекте нервные клетки, происходящие от клетки hiPS, являются чувствительными по отношению к потере потенциала митохондриальной мембраны, по меньшей мере, к одному и, в аспекте, ко всем из следующих соединений: антимицину А или валиномицину.

II. Анализы и применения

В вариантах осуществления настоящего изобретения созданы композиции и способы анализа BoNT. Анализы находят применение в исследованиях, клинических, диагностических и терапевтических применениях.

В некоторых вариантах осуществления в анализах используют полипотентные клетки (например, нервные клетки, происходящие от hiPS). Использование клеток человека дает преимущество видоспецифической модели. В дополнение, нейроны, происходящие от полипотентных клеток, являются представителями нормальных, здоровых нейронов в противопоставление нейронам, происходящим от раковых клеточных линий или модифицированных клеточных линий, которые могут не являться отражающими соматические нейроны.

В некоторых вариантах осуществления в анализах используют нервные клетки, например, нервные клетки, происходящие от hiPS, для скрининга силы BoNT. В других вариантах осуществления в анализах проводят скрининг токсичности BoNT. В еще других вариантах осуществления в анализах проводят скрининг на наличие свойств нейтрализующих антител к BoNT или других биологических фармацевтических препаратов на активность. В некоторых вариантах осуществления анализы являются количественными, в то время как в других они являются качественными.

В некоторых вариантах осуществления клетки сначала культивируют на пригодной матрице. В некоторых вариантах осуществления клетки культивируют с целью достичь вызревания нейронов. Полипотентные клетки, используемые в вариантах осуществления настоящего изобретения, обеспечивают преимущество более быстрого созревания, чем клетки, используемые в существующих анализах. В некоторых вариантах осуществления клетки затем подвергают воздействию токсина (например, BoNT) в течение подходящего периода времени. После воздействия токсина, желаемые параметры (например, ЕС50) рассчитывают с использованием пригодных способов. Анализы, описанные в настоящем описании, являются пригодными для детектирования и очищенного BoNT, и BoNT в комплексах (например, в комплексе с другими белками, как обнаруживается в природных условиях и в некоторых фармацевтических препаратах). Анализы, описанные в настоящем описании, являются пригодными для детектирования любого количества серотипов BoNT (например, BoNT A, B, C, D, E, F и G) или вариантов, или химер такового. В некоторых вариантах осуществления BoNT экспрессируются рекомбинантно. В других вариантах осуществления их очищают от бактериальных клеток.

В некоторых вариантах осуществления анализы защиты антителами осуществляют для испытания нейтрализующих антител. Хотя BoNT эффективно используют для лечения большого количества пациентов от различных состояний (обзор у Dhaked et al., Indian J Med Res 132: 489-503), некоторые будут вырабатывать нейтрализующие антитела, которые будут препятствовать успеху дальнейшего лечения. Например, в лечении цервикальных дистоний считается, что ~5% пациентов будут вырабатывать нейтрализующие BoNT антитела, которые будут затруднять дальнейшее лечение (Kessler et al., (1999) J Neurol 246: 265-274). В настоящее время пациентов не отслеживают в течение курса их лечения на выработку нейтрализующих антител, так как высокочувствительный и количественный анализ не является доступным на рынке (Sesardic et al., (2004) Mov Disord 19 Suppl 8: S85-91). Испытательная платформа, представленная здесь, с использованием нейронов iPS, обеспечивает чувствительное и количественное детектирование нейтрализующих BoNT антител в сыворотках пациентов, которые получали регулярные терапевтические или косметические инъекции BoNT. Нейтрализующие антитела можно детектировать в любом количестве типов образцов (например, очищенные антитела, сыворотка, антитоксины и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления испытывают малые молекулярные ингибиторы BoNT (например, для исследования или для скрининга лекарств). Например, в некоторых вариантах осуществления клетки либо сначала подвергают воздействию BoNT, затем ингибитора, совместно подвергают воздействию обоих, или клетки подвергают воздействию сначала ингибитора, затем BoNT.

Для анализа активности BoNT можно использовать любое количество пригодных измерений граничных точек. Примеры включают в себя (но не ограничиваются ими) вестерн-блоттинг, высвобождение нейромедиатора, ELISA (Nuss JE, et al. (2010) J Biomol Screen 15: 42-51) или внутриклеточно экспрессируемые репортеры (Dong et al., (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101: 14701-14706).

В некоторых вариантах осуществления анализы, описанные в настоящем описании, находят применение в испытании контроля качества во время продуцирования BoNT или производных в качестве фармацевтических препаратов или для исследовательского применения, в диагностической оценке, в оптимизации и дозировке клинического лечения, и в выборе терапевтической модальности.

Дополнительные применения анализов, описанных в настоящем описании, включают в себя (но не ограничиваются ими) детектирование ингибиторов, и диагностические, клинические, скрининговые и исследовательские использования.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении создан способ анализа нейротоксина Clostridium botulinum (BoNT) на активность, включающий: а) контактирование нервной клетки, происходящей от hiPS, с композицией, включающей в себя BoNT; и b) анализ BoNT на биологическую активность.

В аспекте указанного способа анализ может включать в себя определение присутствия или отсутствия биологической активности BoNT. Такой анализ может иногда также называться в настоящем описании качественным анализом. Будет понятно, что на основании присутствия или отсутствия биологической активности BoNT можно сделать заключение о присутствии или отсутствии биологически активного BoNT в композиции, включающей в себя подозрение на содержание указанного биологически активного BoNT. Более того, в еще другом аспекте анализ может охватывать определение количества биологически активного BoNT в композиции, включающей в себя указанный биологически активный BoNT. Будет понятно, что количество биологически активного BoNT можно вывести от количества биологической активности, анализированной на указанный BoNT в композиции. Такой анализ может иногда также называться в настоящем описании количественным анализом.

В аспекте способа по настоящему изобретению BoNT представляет собой нейротоксин, выбранный из различных серотипных групп нейротоксинов клостридий, например, выбранный из, например, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F или BoNT/G. Более того, в аспекте в качестве нейротоксина в способах в соответствии с настоящим изобретением можно использовать столбнячный токсин (TeNT).

Бактерии Clostridium botulinum и Clostridium tetani естественным образом продуцируют эти крайне сильные нейротоксины, например, токсины ботулизма (BoNT) и столбнячный токсин (TeNT), соответственно. Эти нейротоксины специфично связываются с нервными клетками и нарушают высвобождение нейромедиатора. Каждый токсин синтезируется в качестве неактивного одноцепочечного белка приблизительно в 150 КДа. Посттрансляционный процессинг включает в себя формирование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (разрывание) бактериальной(ыми) протеазой(ами). Активный двухцепочечный нейротоксин состоит из двух цепей, N-концевой легкой цепи приблизительно в 50 КДа и тяжелой цепи приблизительно в 100 КДа, связанных дисульфидной связью. Нейротоксины структурно состоят из трех доменов, например, каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, охватывающей транслокационный домен (N-концевая половина) и рецептор-связывающий домен (С-концевая половина), см., например, Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Структуры полипептидов BoNT и полипептида TeNT были описаны в вышеуказанных ссылках.

Семь антигенно различных серотипов BoNT и TeNT представляют собой Zn²⁺-эндопротеазы, которые блокируют синаптический экзоцитоз путем расщепления белков SNARE. Нейротоксины вызывают слабый мышечный паралич, наблюдаемый в ботулинических и столбнячных расстройствах, см. Fischer 2007, Proc Natl. Acad. Sci. USA 104, 10447.

В еще другом аспекте активность модифицированного BoNT или TeNT можно анализировать в способе по изобретению. Такой модифицированный BoNT можно создать из вышеуказанных BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F или BoNT/G, или из TeNT путем ввода, по меньшей мере, одной замены, присоединения и/или делеции в аминокислотную последовательность BoNT или TeNT. Такой модифицированный BoNT или TeNT, таким образом, может иметь аминокислотную последовательность, являющуюся, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентичной аминокислотной последовательности любого одного из BoNT или TeNT, названных выше. Термин “идентичная”, в том виде, как он используется в настоящем описании, относится к идентичности последовательности, отличающейся определением количества идентичных аминокислот между двумя аминокислотными последовательностями, где последовательности построены так, чтобы получалось наивысшее совпадение порядка. Его можно рассчитать с использованием опубликованных приемов и способов, закодированных в компьютерных программах, таких как, например, BLASTP или FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Значения доли идентичности рассчитывают, в одном аспекте, по всей аминокислотной последовательности. Для сравнения различных последовательностей квалифицированному специалисту доступен ряд программ, основанных на ряде алгоритмов. В этом контексте алгоритмы Нидлмана и Вунша или Смита и Ватермана дают особенно надежные результаты. Для проведения сравнений последовательностей можно использовать программу PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) или программы Gap and BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), которые являются частью программного пакета GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Мэдисон, шт. Висконсин, США, 53711). Значения идентичности последовательностей, указанные выше в процентах (%), следует в другом аспекте изобретения определять с использованием программы GAP по всей области последовательности со следующими параметрами: штраф за открытие гэпа: 50, штраф за удлинение гэпа: 3, среднее совпадение: 10000 и среднее несовпадение: 0,000, которые, если не указано иначе, всегда будут использоваться в качестве стандартных параметров для сравнения последовательностей.

В аспекте каждый из вышеуказанных полипептидов BoNT или TeNT сохраняет одно или более и, в другом аспекте, все из биологических свойств соответствующего немодифицированного полипептида, т.е. BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G или TeNT. Специалисты в данной области техники поймут, что полная биологическая активность сохраняется после протеолитической активации, даже если вероятно, что необработанный предшественник может выполнять некоторые биологические функции или являться частично активным. “Биологические свойства”, в том виде, как они используются в настоящем описании, относятся к (а) связыванию с рецептором, (b) интернализации, (с) транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (d) эндопротеолитическому расщеплению белков, участвующих в мембранном синтезе синаптической везикулы. Анализы in vivo для оценки биологической активности включают в себя мышиный анализ LD50 и полудиафрагменный мышиный анализ ex vivo, как описано, например, у Dressler et al. (Dressler 2005, Mov Disord 20: 1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). Биологическую активность обычно выражают в мышиных единицах (MU). В том виде, как она используется в настоящем описании, 1 MU представляет собой количество нейротоксического компонента, который убивает 50% указанной популяции мышей после внутриперитональной инъекции, т.е. мышиная LD50 при и.п. В дополнительном аспекте модифицированные полипептиды могут обладать улучшенными или измененными биологическими свойствами, например, они могут включать в себя участки расщепления, которые являются улучшенными для распознавания ферментов, или могут являться улучшенными для связывания с рецепторами, или любое другое свойство, указанное выше.

В аспекте модифицированные BoNT или TeNT можно анализировать на одно или более и, в аспекте, на все биологические свойства, указанные выше, способом, описанным в настоящем описании.

В аспекте изобретения модифицированный BoNT или TeNT выбирают из, например, гибридов BoNT или BoNT/TeNT, перенацеленных BoNT, перенацеленных TeNT и химерных BoNT или TeNT. Описаны модифицированные BoNT и TeNT.

В аспекте способа по изобретению контактирование включает в себя приведение, по меньшей мере, двух различных компонентов в физическое близкое расположение, чтобы сделать возможным физическое и/или химическое взаимодействие указанных компонентов. В вышеуказанном способе нервную клетку, происходящую от hiPS, приводят в контакт с композицией, включающей в себя или подозреваемой на содержание биологически активного BoNT. Контактирование проводят в течение времени и при условиях, достаточных для того, чтобы дать возможность биологически активному BoNT, содержащемуся в композиции, проявить свою биологическую активность в отношении нервной клетки, происходящей от клетки hiPS. В аспекте, таким образом, контактирование дает возможность для (а) связывания с рецептором, (b) интернализации, (с) транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (d) эндопротеолитического расщепления белков, участвующих в мембранном синтезе синаптической везикулы или субстратов, мимикрирующих указанный процесс в нервной клетке, происходящей от клетки hiPS. Специалисту в данной области техники хорошо известно, какие условия необходимо применить для данной культуры нервных клеток, происходящих от клетки hiPS. Контактирование можно провести, в аспекте, в системе клеточной культуры, в которой нервные клетки, происходящие от клетки hiPS, культивируются в луночных плашках в подходящей культуральной среде и в стабильных культуральных условиях путем добавления к культуральной среде образца композиции для анализа на активность BoNT способами, описанными в настоящем описании.

В аспекте подходящие культуральные условия включают в себя культивирование при примерно 37°С и примерно под 5% СО₂. В аспекте среда для культивирования представляет собой среду Neurobasal, дополненную В27 и глутамаксом (Invitrogen Inc., США). Во все еще другом аспекте нервные клетки, происходящие от клетки hiPS, культивируют в плашках, покрытых полилизином и, в еще дополнительном аспекте, используют плашки, которые дополнительно являются покрытыми матригелем (BD Bioscience, США). В аспекте для культивирования используют 96-луночную плашку, где клетки выращивают с плотностью от примерно 10000 до примерно 100000 клеток, в дополнительном аспекте от примерно 20000 до примерно 60000 клеток, и в еще дополнительном аспекте - примерно 40000 клеток на лунку. В аспекте клеткам дают возможность расти в течение примерно 24 ч. В аспекте, после этого клеткам дают возможность созревать в течение от примерно 2 до примерно 28 дней, в аспекте, от примерно 4 до примерно 14, или в аспекте, от примерно 4 до примерно 7 дней до того, как проведут контактирование.

В очередном аспекте указанное контактирование проводят так, как описано в сопровождающих примерах ниже.

В аспекте способа по настоящему изобретению композиция, включающая в себя биологически активный BoNT, представляет собой композицию, про которую известно, что она включает в себя биологически активный BoNT, или композицию, подозреваемую на содержание биологически активного BoNT. Композиция может включать в себя другие ингредиенты в дополнение к указанному биологически активному BoNT, такие как, например, пригодный растворитель и/или стабилизирующие средства, такие как белки и, в аспекте, комплексующие с BoNT белки (HA70, HA17, HA33 или NTNH (NBP)) или другие белковые стабилизаторы. Композиция может также дополнительно включать в себя белки, которые способствуют биологической активности BoNT, например, путем усиления любой из биологических активностей BoNT, названных где-либо еще в настоящем описании. В очередном аспекте композиция может включать в себя более чем один BoNT.

В аспекте композиция представляет собой клеточный лизат Botulinum или других бактериальных клеток или небактериальных клеток, включающих в себя биологически активный BoNT. В аспекте такая композиция также представляет собой препарат BoNT, полученный из такого клеточного лизата путем частичной очистки, например, сырого экстракта, или очистки BoNT, например, очищенный препарат BoNT. В другом аспекте композиция представляет собой искусственную композицию, включающую в себя смешанные компоненты. В очередном аспекте композиция представляет собой препарат для использования в качестве фармацевтической композиции, как определено где-либо еще в настоящем описании.

В аспекте способа по настоящему изобретению анализ BoNT на биологическую активность проводят путем определения эндопротеолитического расщепления белков, участвующих в синтезе мембраны синаптической везикулы, или других субстратов, расщепляемых биологически активным BoNT, если они присутствуют в нервной клетке, происходящей от клетки hiPS.

В некоторых вариантах осуществления белки, участвующие в синтезе мембраны синаптической везикулы, или другие субстраты обладают сайтом расщепления нейротоксином, распознаваемым анализируемыми BoNT или TeNT. Сайт расщепления нейротоксином, в том виде, как он используется в настоящем описании, относится к сайту расщепления, который распознается и расщепляется эндогенной протеазой полипептида нейротоксина. Описаны сайты расщепления, которые распознаются протеазами нейротоксинов (см., например, EP 1926744 B1; является включенным в настоящее описание во всей своей полноте путем ссылки). В принципе, сайт расщепления нейротоксином может представлять собой сайт расщепления, который естественным образом встречается в субстрате или который является искусственно сконструированным сайтом расщепления, распознаваемым и расщепляемым протеазой полипептидов нейротоксина.

Сайт расщепления нейротоксином, распознаваемый и расщепляемый протеазой BoNT/A, в аспекте изобретения происходит от белка, который является чувствительным к расщеплению BoNT/A. В аспекте такой белок представляет собой человеческий SNAP25A или В, или гомолог, паралог или ортолог такового из крысы, мыши, быка, Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea или Aplysia. Пригодные сайты расщепления, происходящие от указанных белков, раскрыты в EP 1926744 B1.

Сайт расщепления нейротоксином, распознаваемый и расщепляемый протеазой BoNT/В, в аспекте изобретения происходит от белка, который является чувствительным к расщеплению BoNT/В. В аспекте такой белок представляет собой человеческий или мышиный VAMP-1, VAMP-2 и VAMP-3/целлубревин, бычий VAMP-2, крысиный VAMP-2 или VAMP-3, VAMP-1, VAMP-2 или VAMP-3 цыпленка, VAMP-1 Torpedo, VAMP Strongylocentrotus, Drosophila sybA, synB, synC, synD, или syn, VAMP Hirudo, VAMP-2 или VAMP-3 Xenopus, VAMP-1 или VAMP-2 Danio, VAMP Loligo, VAMP Lymnaea, VAMP Aplysia или Caenorhabditis SNB1-подобный, или любой гомолог, паралог или ортолог таковых. Пригодные сайты расщепления, происходящие от указанных белков, раскрыты, например, в EP 1926744 B1.

Сайт расщепления нейротоксином, распознаваемый и расщепляемый протеазой BoNT/С1, в аспекте изобретения происходит от белка, который является чувствительным к расщеплению BoNT/С1. В аспекте такой белок представляет собой человеческий и мышиный Синтаксин 1A, Синтаксин 1B1, Синтаксин 2-1, Синтаксин 2-2, Синтаксин 2-3, Синтаксин 3A или Синтаксин 1B2, бычий или крысиный Синтаксин 1A, Синтаксин 1B1 или Синтаксин 1B2, крысиный Синтаксин 2 или крысиный синтаксин 3, мышиный Синтаксин 1A, Синтаксин 1B1, Синтаксин 1B2, Синтаксин 2, Синтаксин 3A, Синтаксин 3B или Синтаксин 3C, Синтаксин 1A или Синтаксин 2 цыпленка; Синтаксин 1A или Синтаксин 1B Xenopus, Синтаксин 1A Danio, Синтаксин 1B или Синтаксин 3, Синтаксин 1A или Синтаксин 1B Torpedo, Синтаксин 1A или Синтаксин 1B Strongylocentrotus, Синтаксин 1A или Синтаксин 1B Drosophila, Синтаксин 1A или Синтаксин 1B Hirudo, Синтаксин 1A или Синтаксин 1B Loligo, Синтаксин 1A или Синтаксин IB Lymnaea, или любой гомолог, паралог или ортолог таковых. Пригодные сайты расщепления, происходящие от белков, раскрыты, например, в EP 1926744 B1.

Сайт расщепления нейротоксином, распознаваемый и расщепляемый протеазой BoNT/D, в аспекте изобретения происходит от белка, который является чувствительным к расщеплению BoNT/D. В аспекте такой белок представляет собой человеческий или мышиный VAMP-1, VAMP-2 и VAMP-3/целлубревин, бычий VAMP-2, крысиный VAMP-2 или VAMP-3, VAMP1, VAMP-2 или VAMP-3 цыпленка, VAMP-1 Torpedo, VAMP Strongylocentrotus, Drosophila sybA, synB, synC, synD, или syn, VAMP Hirudo, VAMP-2 или VAMP-3 Xenopus, VAMP-1 или VAMP-2 Danio, VAMP Loligo, VAMP Lymnaea, VAMP Aplysia или Caenorhabditis SNB1-подобный, или любой ортолог, паралог или гомолог таковых. Пригодные сайты расщепления, происходящие от белков, раскрыты, например, в EP 1926744 B1.

Сайт расщепления нейротоксином, распознаваемый и расщепляемый протеазой BoNT/Е, в аспекте изобретения происходит от белка, который является чувствительным к расщеплению BoNT/Е. В аспекте такой белок представляет собой человеческий SNAP25A или В, или гомолог, паралог или ортолог такового из крысы, мыши, быка, Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea или Aplysia. Пригодные сайты расщепления, происходящие от указанных белков, раскрыты в EP 1926744B1.

Сайт расщепления нейротоксином, распознаваемый и расщепляемый протеазой BoNT/F, в аспекте изобретения происходит от белка, который является чувствительным к расщеплению BoNT/F. В аспекте такой белок представляет собой человеческий или мышиный VAMP-1, VAMP-2 и VAMP-3/целлубревин, бычий VAMP-2, крысиный VAMP-2 или VAMP-3, VAMP-1, VAMP-2 или VAMP-3 цыпленка, VAMP-1 Torpedo, VAMP Strongylocentrotus, Drosophila sybA, synB, synC, synD, или syn, VAMP Hirudo, VAMP-2 или VAMP-3 Xenopus, VAMP-1 или VAMP-2 Danio, VAMP Loligo, VAMP Lymnaea, VAMP Aplysia или Caenorhabditis SNB1-подобный, или любой ортолог, паралог или гомолог таковых. Пригодные сайты расщепления, происходящие от белков, раскрыты, например, в EP 1926744 B1.

Сайт расщепления нейротоксином, распознаваемый и расщепляемый протеазой BoNT/G, в аспекте изобретения происходит от белка, который является чувствительным к расщеплению BoNT/G. В аспекте такой белок представляет собой человеческий или мышиный VAMP-1, VAMP-2 и VAMP-3/целлубревин, бычий VAMP-2, крысиный VAMP-2 или VAMP-3, VAMP-1, VAMP-2 или VAMP-3 цыпленка, VAMP-1 Torpedo, VAMP Strongylocentrotus, Drosophila sybA, synB, synC, synD, или syn, VAMP Hirudo, VAMP-2 или VAMP-3 Xenopus, VAMP-1 или VAMP-2 Danio, VAMP Loligo, VAMP Lymnaea, VAMP Aplysia или Caenorhabditis SNB1-подобный, или любой ортолог, паралог или гомолог таковых. Пригодные сайты расщепления, происходящие от белков, раскрыты, например, в EP 1926744 B1.

Сайт расщепления нейротоксином, распознаваемый и расщепляемый протеазой TeNT, в аспекте изобретения происходит от белка, который является чувствительным к расщеплению TeNT. В аспекте такой белок представляет собой человеческий или мышиный VAMP-1, VAMP-2 и VAMP-3/целлубревин, бычий VAMP-2, крысиный VAMP-2 или VAMP-3, VAMP-1, VAMP-2 или VAMP-3 цыпленка, VAMP-1 Torpedo, VAMP Strongylocentrotus, Drosophila sybA, synB, synC, synD, или syn, VAMP Hirudo, VAMP-2 или VAMP-3 Xenopus, VAMP-1 или VAMP-2 Danio, VAMP Loligo, VAMP Lymnaea, VAMP Aplysia или Caenorhabditis SNB1-подобный, или любой ортолог, паралог или гомолог таковых. Пригодные сайты расщепления, происходящие от белков, раскрыты, например, в EP 1926744 B1.

Сайт расщепления нейротоксином, распознаваемый и расщепляемый протеазами BoNT, в другом аспекте изобретения происходит от сайтов аутокаталитического расщепления, обнаруживаемых в белках BoNT. В аспектах сайт расщепления нейротоксином для использования в соответствии с настоящим изобретением и который происходит от сайта аутокаталитического расщепления данного BoNT или TeNT включает в себя, по меньшей мере, 6, по меньшей мере, 8, по меньшей мере, 10 или, по меньшей мере, 15 последовательных участков, включая остатки BoNT 250Tyr-251Tyr, остатки BoNT/B 256Phe-257Phe, остатки BoNT/C1 257Phe-258Tyr, остатки BoNT/D 257Phe-258Phe, остатки BoNT/E 239Pro-240Leu, остатки BoNT/F 254Pro-255Leu, остатки BoNT/G 256Phe-257Phe, остатки TeNT 259Ile-260Tyr, остатки BoNT/A Phe266-Gly267, остатки BoNT/B Phe272-Gly273, остатки BoNT/C1 Phe273-Gly274, остатки BoNT/D Phe273-Gly274, остатки BoNT/E Phe255-Gly256, остатки BoNT/F Phe270-Gly271, остатки BoNT/G Phe272-Gly273 или остатки TeNT Phe275-Gly276. Пригодные сайты расщепления, происходящие от белков, раскрыты, например, в EP 1926744 B1.

В аспекте настоящего изобретения расщепление вышеуказанных сайтов расщепления нейротоксином для BoNT и TeNT можно анализировать путем определения одного или более продуктов расщепления, полученных путем расщепления вышеуказанных белков. Продукты, происходящие от белков, можно определять при помощи антител, которые специфически связываются с указанными расщепленными продуктами, но не с нерасщепленными белками. Связывание таких специфически связывающихся антител с продуктами можно определить при помощи приемов, описанных в настоящем описании или где-либо еще. Например, специфически связывающиеся антитела могут быть ковалентно или нековалентно присоединены к детектируемой метке. Такая детектируемая метка может представлять собой детектируемую часть, ковалентно присоединенную к специфически связывающемуся антителу, или она может представлять собой средство детектирования, такое как детекторное антитело или аптамер, который специфически связывается со специфически связывающим антителом и делает возможным детектирование, например, при помощи детектируемой части, ковалентно связанной с ним. Таким образом можно использовать различные типы таких иммуноанализов для определения расщепленных продуктов и, таким образом, для анализа биологической активности BoNT или TeNT.

В одном аспекте расщепление протеинов, имеющих сайт расщепления нейротоксином, как определено в настоящем описании, можно определять вестерн-блоттингом. В другом аспекте указанное расщепление можно определять при помощи ELISA, RIA или других форматов иммунологического анализа, включая таковые, указанные где-либо еще в настоящем описании.

В другом аспекте можно использовать искусственный субстрат, который включает в себя сайт расщепления нейротоксином, как указано выше, и который по расщеплении в указанном сайте изменяется, по меньшей мере, в одном физическом и/химическом свойстве. Например, субстраты, предусмотренные в таком аспекте, могут включать в себя первую и вторую части, способные взаимодействовать физически и/или химически друг с другом и разделенные линкером, имеющим сайт расщепления нейротоксином. В результате расщепления на сайте расщепления вышеуказанное взаимодействие между двумя частями будет изменено. Пригодные части включают в себя, например, донорные и акцепторные флуорофоры, которые проявляют резонансный перенос энергии в нерасщепленном состоянии, при этом указанный резонансный перенос энергии прерывается после расщепления. Альтернативным образом, можно применять флуорофор и гаситель, где эффект гашения гасителя обращается после расщепления. Субстраты такого рода описаны, например, в любом из EP 1438586 B1, EP 2208067 A1, EP 1543329 A2, EP 1869459 B1, EP 2293064 B1, EP 1920248 B1, EP 2264458 A1, EP 2332959 A2, WO 2011/47241, EP 1901069 B1, EP 2293064 B1, EP 1807698 B1 или EP 2107112 B1; каждый из которых является включенным в настоящее описание во всей своей полноте путем ссылки.

В еще одном конкретном аспекте способа по изобретению анализ проводят путем определения количества расщепленного SNAP-25, присутствующего в нервной клетке, происходящей от клетки hiPS, путем определения количества расщепленного SNAP-25 с использованием первого антитела и, в аспекте, моноклонального антитела, которое специфически связывается с указанным расщепленным SNAP-25. Более того, общее количество SNAP-25, присутствующего в клетках, например, расщепленного и нерасщепленного SNAP-25, определяют при помощи второго антитела, и, в аспекте, поликлонального антитела, связывающегося с указанным общим SNAP-25. В аспекте количество связанного первого антитела и количество связанного второго антитела можно определить при помощи средства детектирования, в аспекте, одного или нескольких антител, дающих возможность сделать различие между количеством связанного первого и количеством связанного второго антител.

Например, можно использовать первое детекторное антитело, соединенное с первой меткой и связывающееся с первым антителом, и второе детекторное антитело, соединенное со второй меткой и связывающееся со вторым антителом. Количество связанного первого и связанного второго антитела и, таким образом, количество расщепленного и всего SNAP-25 можно впоследствии вывести из количества определенной первой и второй меток. В аспекте, первая метка, предусмотренная в настоящем описании, может представлять собой фермент, такой как пероксидаза хрена. В другом аспекте вторая метка, предусмотренная в настоящем описании, может представлять собой фермент, такой как щелочная фосфатаза. Метки можно использовать для катализа детектируемого превращения не флуоресцентных субстратов во флуоресцентные субстраты.

В еще другом аспекте способа по настоящему изобретению анализ проводят путем определения высвобождения нейромедиатора, например, в культуральную среду. Количество высвободившегося и невысвободившегося нейромедиатора можно определить при помощи приемов, описанных в настоящем описании или где-либо еще.

Преимущественно, способы, предусмотренные настоящим изобретением, основаны на неживотных ресурсах, например, нервных клетках, происходящих от клетки hiPS, и, следовательно, избегают испытаний на животных. Тем не менее, нервные клетки, происходящие от клетки hiPS, дают возможность испытывать все требуемые биологические активности BoNT, например, (а) связывание с рецептором, (b) интернализацию, (с) транслокацию через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (d) эндопротеолитическое расщепление белков, участвующих в мембранном синтезе синаптической везикулы. Соответственно, способы можно использовать для мер контроля безопасности или качества, также как и для разработки BoNT с модифицированными биологическими свойствами, обычно требующими, например, скрининговых подходов большого масштаба.

Настоящее изобретение также относится к способу определения количества биологически активного BoNT в препарате, включающем в себя биологически активный BoNT, включающему стадии (а) контактирования нервной клетки, происходящей от клетки hiPS, с образцом указанного препарата; и (b) определения количества биологически активного BoNT, присутствующего в препарате, путем анализа образца на биологическую активность BoNT.

Изобретение также относится к использованию нервной клетки, происходящей от клетки hiPS, для анализа активности BoNT в композиции, как указано где-либо еще в настоящем описании.

В аспекте анализ охватывает определение присутствия или отсутствия активности BoNT и/или биологически активного BoNT. Качественный анализ на биологически активный BoNT можно использовать, например, в применениях, имеющих целью оценку опасности для предотвращения какого-либо вреда, вызываемого BoNT, например, как меру контроля безопасности во время процесса производства, или во время фармацевтических или косметических применений BoNT, или для предотвращения преступлений, основанных на BoNT, таких как биотерроризм.

В другом аспекте анализ охватывает определение количества активности BoNT и/или биологически активного BoNT. Количественный анализ на биологически активный BoNT можно использовать во время процесса производства BoNT или для подбора подходящей дозировки биологически активного BoNT для косметических и фармацевтических применений. Соответственно, такой анализ может также являться пригодным в качестве средства контроля качества или для составления подходящих фармацевтических или косметических продуктов.

Изобретение также относится к использованию нервной клетки, происходящей от клетки hiPS, для определения количества биологически активного BoNT в препарате, включающем в себя указанный биологически активный BoNT, как указано где-либо еще в настоящем описании.

Ссылки, процитированные в этом описании выше, настоящим включаются в настоящее описание путем ссылки по отношению ко всей полноте их содержания раскрытия, и содержания раскрытия, конкретно указанного в этом описании.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Следующие примеры приведены с целью показать и дополнительно проиллюстрировать конкретные предпочтительные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, и не должны толковаться как ограничивающие объем такового.

Пример 1

А. Способы

Нервные клетки: Нейроны, происходящие от человеческих iPS, поставлялись замороженными Cellular Dynamics Inc. (Madison, WI). Нейроны размораживали в соответствии с инструкциями Cellular Dynamics, и живые клетки считали при помощи анализа на вытеснение трипанового синего. Клетки высевали с плотностью 40000 клеток на лунку в 96-луночные плашки (TPP, MidSci), покрытые 0,01% поли-L-орнитином (SIGMA) и 8,3 мкг/см² матригелем (Neurobasal, дополненный В27 и глутамаксом, все от Invitrogen и поставляемые CDI) при 37°С, 5% СО₂ для указанных времен созревания. Через 24 ч после высевания среду полностью меняли, а половину среды заменяли каждые 2-3 дня после этого.

Материнские клетки спинного мозга крысы (RSC) подготавливали, как описано ранее (Pellett et al., 2007 и 2010), и высевали в 96-луночные плашки, покрытые матригелем с плотностью в 75000 клеток на лунку.

Ботулинический нейротоксин: Чистый ботулинический нейротоксин (BoNT) A, B, C и Е (150 кДа) и комплекс BoNT/A получали из штаммов C. Botulinum Hall A hyper, Okra B, Brazil C, и Beluga E, как описано ранее (Malizio et al., (2000) Methods Mol Biol 145: 27-39; Prabakaran et al., (2001) Toxicon 39: 1515-1531), в то время как очистку BoNT/C проводили при помощи способа Malizio et al. (2000) с дополнительной стадией добавления 0,2 мг/мл дрожжевой РНК (SIGMS) к культуре перед осаждением сульфатом аммония. Токсины растворяли в фосфатно-буферном солевом растворе, рН 7,4 и 40% глицерине, и хранили при -20°С до использования. Активность препаратов BoNT/A, /B, /C, /E и комплекса BoNT/A определяли при помощи мышиного биоанализа (Hatheway C.L. (1988), выше; Schantz E.J. & Kautter D.A. (1978) J Assoc Off Anal Chem 61: 96-99), и удельная токсичность составляла 7×10⁷ мышиных единиц LD₅₀/мг (BoNT/A1), 7,7×10⁷ единиц LD₅₀/мг (комплекс BoNT/A1), 1×10⁸ единиц LD₅₀/мг (BoNT/B), 1,1×10⁷ единиц LD₅₀/мг (BoNT/C) и 7,6×10⁷ единиц LD₅₀/мг (BoNT/E).

Анализы нейротоксичности: Для всех анализов нейротоксичности нейроны iPS подвергали воздействию последовательных разбавлений BoNT в 50 мкл нейронной среды, как указано, если не указано иначе. Материнские клетки спинного мозга крысы использовали в качестве контрольных клеток в некоторых анализах, как указано в результатах. Все образцы испытывали минимум трижды, и всегда включали отрицательный контрольный образец без токсина. После указанного времени воздействия раствор токсина удаляли, и клетки лизировали 50 мкл 1 х буфером для образца LDS (Invitrogen). Клеточные лизаты анализировали вестерн-блоттингом на расщепление SNAP-25 или VAMP2, как описано ранее (Pellett et al., (2007), выше; Pellett et al., (2010), выше). Расщепленные и нерасщепленные полосы квантифицировали денситометрией с использованием системы Foto/Analyst FX и программного обеспечения TotalLab Quant (Fotodyne). С использованием программного обеспечения PRISM подготавливали графические представления данных и делали производные от ЕС₅₀.

Выбор матрицы: Для выбора оптимальной матрицы поверхности нейроны высевали на семь различных матриц. Матрицы состояли из плашек, покрытых поли-D-лизином (BD Biosciences), покрытых либо 1,0 мкг/см² ламинином (ламинин PDL), либо 8,3 мкг/см² матригелем (матригель PDL), плашек, покрытых 0,01% поли-L-орнитином, с последующим покрытием либо 1,0 мкг/см² ламинином (ламинин PLO), либо 8,3 мкг/см² матригелем (матригель PLO), покрытых PLO-ламинином, закупленных у BD Biosciences (PLO-ламинин (BD)), покрытых PDL плашек от BD Biosciences (PDL(BD)) или покрытых 0,01% PLO плашек (PLO(CDI)). Нейронам давали возможность созревать в течение 14 дней, и чувствительность к BoNT/A определяли путем воздействия на нейроны последовательными разбавлениями токсина в течение 48 ч. Некоторые из нейронов сохраняли в течение 6 недель и испытывали снова, как выше.

Анализ экспрессии рецептора: Для анализа экспрессии рецептора нейроны iPS выращивали в 24-луночных плашках с плотностью 210000 клеток/лунка с объемом в 0,75 мл. Клетки из 3 лунок соответственно собирали на 4, 7, 10, 14 и 21 дни после выращивания в 75 мкл 1 х буфере для образца LDS (Invitrogen). Клеточные лизаты анализировали вестерн-блоттингом на экспрессию изоформ SV2A, В и С, синаптотагмина I и II, SNAP-25, VAMP с использованием антитела, которое распознает изоформы VAMP 1, 2 и 3, и синтаксин. В качестве контроля загрузки использовали бета-актин, а в качестве положительного контроля использовали материнские клетки спинного мозга крысы. Антитело SV2C (Janz R. & Sudhof T.C. (1999) Neuroscience 94: 1279-1290) было любезно предоставлено Роджером Янцем. Все остальные антитела - от Synaptic Systems (Геттинген, Германия). Все антитела распознают белки человека.

Для анализа мРНК при помощи кПЦР в реальном времени в течение указанных периодов времени соответственно поддерживали три независимые культуры нейронов iPS. Клетки лизировали прямо в плашке, и РНК очищали с использованием мини-набора RNeasy и набора РНКаза-свободная ДНКаза (Agilent Technologies, Санта-Клара, штат Калифорния). Для всех образцов кДНК генерировали с использованием синтетического набора кДНК Superscript VILO (Life Technologies, Карлсбад, штат Калифорния). Амплификацию кПЦР в реальном времени проводили на LightCycler® 480 II (Roche, Базель, Швейцария) с использованием TaqMan® Gene Expression Master Mix и следующих анализов экспрессии гена человека TaqMan: SNAP25 (Hs00938962_m1); STX1A (Hs00270282_m1); STX1B (Hs01041315_m1); VAMP1 (Hs00249911_m1); VAMP2 (Hs00360269_m1); VAMP3 (Hs00922166_m1); SV2A (Hs00372069_m1); SV2B (Hs00208178_m1); SV2C (Hs00392676_m1); SYT1 (Hs00194572_m1); SYT2 (Hs00980604_m1) и набора человеческих эндогенных праймеров GAPDH (все от Life Technologies). Абсолютный количественный анализ 2-й производной осуществляли со всеми образцами, и значения С_р конвертировали в относительное кратное изменение путем нормализации к С_р для экспрессии эндогенного GAPDH. Средние значения и стандартное отклонение рассчитывали для каждого гена внутри трех биологических реплик. Для каждого гена проводили четырехкратные технические реакции ПЦР.

Анализы на зависимое от активности поглощение ВoNT/A1: ВoNT/A1 разбавляли до концентрации в 55-275 U на 50 мкл клеточно-стимулирующей (среда Invitrogen custom Neurobasal, содержащая 2,2 мМ CaCl₂ и 56 мМ KCl, дополненная В27 и глутамаксом) или нейронной сред, и добавляли к CDI нейроны iPS, вызревавшие в течение 4 дней, и клетки RSC. Клетки инкубировали с токсином в течение 1, 5, 10 и 15 мин соответственно. Для отрицательного контроля к клеткам добавляли соответствующую среду без токсина. Токсин удаляли, и клетки немедленно дважды промывали 200 мкл нейронной среды с последующим инкубированием в 200 мкл свежей нейронной среды в течение 24 ч. Образцы собирали в репликах по 4.

Для определения минимальной требуемой концентрации токсина для зависимого от активности поглощения ВoNT/A1 в течение 5 мин токсин разбавляли до концентраций между 1,72-55 U на 50 мкл клеточно-стимулирующей среды. Созревшие четырехдневные нейроны iPS подвергали воздействию разбавлений токсина в течение 5 мин, с последующим удалением токсина и двумя промываниями нейронной средой, и инкубированием в нейронной среде в течение 24 ч. Все разбавления испытывали в репликах по 4.

Анализ защиты антителами: Специфичные на BoNT/A1 антитела получали в соответствии с Johnson et al., 1993. Ингибирование активности BoNT/A1 в нейронах iPS путем нейтрализации антител анализировали с использованием двух различных способов. Для первого анализа 55 U BoNT/A1 объединяли с последовательно разбавленным антителом в клеточно-стимулирующей среде и инкубировали в течение 1 ч при 37°С для дачи возможности взаимодействия токсин-антитело. Четырехдневные созревшие нейроны iPS подвергали воздействию смеси токсин-антитело в течение 5 мин с последующим удалением смеси токсин-антитело и двумя стадиями промывания нейронной средой и инкубированием в нейронной среде в течение 24 ч. Для второго анализа 1,5 U BoNT/A1 объединяли с последовательными разбавлениями антитела в нейронной среде и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Нейроны iPS подвергали воздействию смеси токсин-антитело в течение 24 ч. В сравнении с мышиным биоанализом использовали последовательное разбавление антитела, заранее инкубированного с 5-10 U BoNT/A1 в течение 1,5 ч при комнатных температурах в объеме 167 мкл. Объем доводили до 500 мкл и вводили четырем мышам на разбавление.

В. Результаты.

Нейроны iPS экспрессируют важные для интоксикации BoNT рецепторы: Для определения, можно ли использовать нейроны, происходящие от человеческих iPS, для детектирования активности BoNT, экспрессию рецепторов и ферментативных мишеней, необходимых для входа BoNT в клетку и каталитической активности, анализировали вестерн-блоттингом и количественной ПЦР (кПЦР) соответственно (фиг. 1). Вестерн-блоттинг привел к сигналам для SV2A, слабой полосе для SV2B, синаптотагмина 1, синтаксина, SNAP-25, VAMP2 и бета-актина, которые не менялись в течение периода времени в 21 день после выращивания клеток (фиг. 1А). В то время как VAMP2 детектировали при помощи специфичного к VAMP2 антитела, антитело, которое распознает все три изоформы VAMP, привело к отсутствию сигнала, указывая на то, что VAMP2 является преобладающей изоформой VAMP в нейронах iPS. Лизат материнских клеток спинного мозга крысы использовали в качестве положительного контроля для детектирования антитела, и различные интенсивности в полосах нейронов iPS по сравнению с клетками RSC могут быть обусловлены различным распознаванием антителом или различными уровнями экспрессии. Анализ уровней мРНК одинаковых белков при помощи кПЦР показывал экспрессию всех анализируемых белков (фиг. 2В), включая изоформы SV2B и С, синаптотагмин 2 и VAMP1, и 3, которые не детектировались вестерн-блоттингом. Однако уровни мРНК этих изоформ составляли, по меньшей мере, в 200 раз меньше, чем таковые у изоформ, детектированных вестерн-блоттингом (SV2А, синаптотагмин 1 и VAMP2). Таким образом, данные кПЦР подтверждают данные вестерн-блоттинга и указывают на то, что нейроны iPS экспрессируют, в основном, SV2A, синаптотагмин 1 и изоформы VAMP2 этих белков, что согласуется с нейронами, представляющими нейроны переднего мозга ((Janz R. & Sudhof T.C. (1999) Neuroscience 94: 1279-1290). Уровни экспрессии всех белков не изменялись в течение периода исследований, указывая на то, что клетки являются полностью созревшими за 4 дня после выращивания, и остаются стабильными в течение, по меньшей мере, 21 дня.

Матрица поверхности не влияет на качество клеток для анализа BoNT/A1: Для определения, влияла ли матрица для выращивания на чувствительность к BoNT, нейроны, выращенные на семи различных матрицах, испытывали на чувствительность к BoNT/A1. Нейроны присоединяли и выдерживали на всех матрицах, формируя увеличивающуюся сеть аксонов и дендритов. Наблюдали значительные морфологические различия между клетками, выращенными на плашках с ламинином или матригелем или без них. Клетки, выращенные на плашках с PDL (BD Biosciences), ламинином или матригелем, или на плашках с PLO (Cellular Dynamics), ламинином или матригелем, росли, в основном в монослое, но формировали определенные агрегаты с длинными аксонами, выходящими из них, в основном, по периметру плашек. Напротив, клетки, выращенные на плашках с PLO или PDL, оставались в одиночном монослое клеток с аксонами и дендритами, распространяющимися между сетью клеток. Клетки, выращенные на ламинине PLO (BD Biosciences), напоминали клетки, выращенные на плашках с PLO или PDL.

Нейроны подвергали воздействию последовательных разбавлений BoNT/A после 14 дней созревания, и анализ клеточных лизатов вестерн-блоттингом показал, что расщепление SNAP-25 являлось практически идентичным для всех испытанных субстратов (фиг. 23). Предел детектирования составлял 0,05 единиц мышиной LD₅₀, и расщепление было полным между 1,75 и 3,5 U. ЕС₅₀ варьировались от 0,21 до 0,31.

Эти данные показывают, что клетки можно выращивать на любой из испытанных матриц поверхности для этого анализа. Все следующие эксперименты проводили на плашках, покрытых PLO-матригелем. Для снижения агрегации клеток использовали плашки TPP (MidSci), которые имеют более плоскую площадь поверхности. Это полностью ликвидировало агрегацию по периметру лунки.

Вызревание клеток в течение 4-14 дней обеспечивает прекрасную и чувствительную платформу для испытания на BoNT/A1: Для определения, влияет ли время созревания клеток на чувствительность нейронов iPS к BoNT, клетки анализировали на чувствительность к BoNT/A1 на 4 и 7 день после выращивания параллельно, используя одни и те же разбавления токсина. Материнские клетки спинного мозга крысы (клетки RSC) также испытывали параллельно, для сравнения чувствительности нейронов iPS с клетками RSC, которые в настоящее время являются самыми чувствительными описанными клетками для детектирования ВoNT (Pellet et al., 2007, выше; Pellett et al., (2010) J Pharmacol Toxicol Methods). Полученные данные согласованно показывали отсутствие статистически значимых отличий в чувствительности клеток, созревавших в течение 4 или 7 дней, с ЕС₅₀ в ~0,3 U (фиг. 3). Это напоминает ЕС₅₀, наблюдавшиеся выше для клеток 14 дня (фиг. 2) и для клеток RSC, и 100% расщепление достигалось с 1,75 U, в то время как 100% расщепление не достигалось в клетках RSC с использованными концентрациями токсина. Это, вероятно, обусловлено высокой чистотой нейронов iPS. Таким образом, клетки, созревавшие в течение 4-14 дней, обеспечивают воспроизводимую и высокочувствительную модель на клеточной основе для детектирования и квантификации BoNT/A1. В дополнение, испытание четырех различных наборов клеток iPS не показало серьезного отличия в чувствительности на BoNT/A1.

Чувствительность нейронов iPS увеличивается с большими временами воздействия: Зависимость детектирования BoNT в нейронах iPS от времени рассматривали путем подвергания клеток воздействию последовательных разбавлений BoNT/A1 и отбора образцов через 6, 16, 24 и 48 ч после добавления токсина. Полученные данные согласованно указывали на то, что воздействие в 48 ч давало наивысшую чувствительность с ~3-кратным увеличением по сравнению с анализом в 24 ч, и ~6-кратное увеличение по сравнению с анализом в 16 ч (фиг. 4). 6-часовое воздействие токсина приводило к ~130-кратному уменьшению чувствительности, с ЕС₅₀ примерно в 40 единиц.

Нейроны iPS обладают большей скоростью поглощения BoNT/A1, чем клетки RSC: Скорость поглощения BoNT/A1 в нейроны iPS по сравнению с клетками RSC рассматривали путем подвергания нейронов iPS и клеток RSC воздействию 82 U BoNT/A1 параллельно, и оценивая расщепление SNAP-25 чрез 2, 4, 6, 8 и 10 ч. Для различения между зависимым от активности и независимым поглощением токсина использовали две различные среды, так как сообщалось, что нейронная активность приводит к более быстрому поглощению BoNT (Keller et al., (2004), выше). Первая среда представляла собой нейронную среду (ММ), а вторая представляла собой клеточно-стимулирующую среду (CSM), которая представляет собой модифицированную версию нейронной среды, которая содержит 56 мМ KCl и 2,2 мМ CaCl₂ для химического стимулирования нейронной активности.

Нейроны iPS привели к значительно более раннему и более полному расщеплению SNAP-25, чем клетки RSC. В нейронах iPS 100% расщепление SNAP-25 достигалось за 8 ч, а 50% расщепление SNAP-25 за ~4 ч (фиг. 5). Клетки RSC, напротив, достигали лишь ~70-80% расщепления SNAP-25 по истечении 10 ч, и ~50% расщепления SNAP-25 наблюдалось после 6 ч. Никакой разницы между нейронной и клеточно-стимулирующей средой для каждого из типа клеток не наблюдалось, указывая на то, что за временной интервал испытанная нейронная активность не влияет на поглощение ВoNT в клетки. Эти данные показывают, что нейроны iPS являются значительно более чувствительными к BoNT/A, чем клетки RSC, и поглощают токсин с большей скоростью, хотя этот анализ и не делает различий между более быстрым поглощением токсина и более быстрым расщеплением SNAP-25.

Нейроны iPS поглощают BoNT/A1 значительно быстрее, чем клетки RSC в анализе, зависимом от активности: Для дальнейшего рассмотрения, поглощают ли нейроны iPS BoNT зависимым от активности образом, созревавшие в течение 4 дней нейроны iPS и клетки RSC подвергали воздействию 55 и 275 U BoNT/A1 в клеточно-стимулирующей среде соответственно. Клетки подвергали воздействию токсина в течение 1, 5, 10 или 15 мин с последующим полным удалением токсина и инкубированием в нейронной среде в течение 24 ч для дачи возможности расщепления SNAP-25. Значительное расщепление SNAP-25 наблюдалось в нейронах iPS уже после 1 мин воздействия 55 U BoNT/A1 (фиг. 6А). После 5 мин примерно 75% SNAP-25 расщеплялось, и значительного изменения с более долгими воздействиями токсина не наблюдалось, показывая завершение поглощения в течение 5 мин. Воздействие 275 U привело к полному расщеплению SNAP-25 во всех испытанных временах воздействия (Фигура 6А). Напротив, подвергание клеток RSC воздействию 55 единиц BoNT/A1 не приводило к значительному расщеплению SNAP-25 после времен воздействия вплоть до 15 мин, и только примерно 30-40% SNAP-25 расщеплялось после, по меньшей мере, 10 минут воздействия 275 U (фиг. 6А). Это указывает на то, что нейроны iPS поглощают BoNT/A1 зависимым от активности образом, и то, что это поглощение происходит заметно более эффективно и быстрее, чем в клетках RSC.

Для подтверждения того, что быстрое поглощение в нейроны iPS является зависимым от активности, нейроны подвергали воздействию 55 U BoNT/A в течение 1, 5 или 10 мин в клеточно-стимулирующей среде или нейронной среде. В клетках, обработанных клеточно-стимулирующей средой, присутствовало значительно большее расщепление SNAP-25, с 50% расщеплением SNAP-25, наблюдаемым после 1 мин и 70% расщеплением после 5 мин (фиг. 6В). В нейронной среде, напротив, только примерно 20% SNAP-25 расщеплялось после 10 мин (фиг. 6В). Это указывает на то, что быстрое поглощение BoNT/A1 в нейроны iPS является зависимым от активности.

Для определения зависимости зависящего от активности поглощения нейронами iPS BoNT/A1 от концентрации клетки подвергали воздействию 1,7-55 U BoNT/A1 в клеточно-стимулирующей среде в течение 5 мин. После удаления токсина клетки инкубировали в течение 24 ч для дачи возможности произойти расщеплению SNAP-25. Наблюдали зависимое от концентрации увеличение расщепления SNAP-25 с увеличением концентрации токсина, при этом 50% расщепления SNAP-25 происходило примерно с 30 U (фиг. 6С).

Специфичные к BoNT/A1 антитела защищают нейроны iPS от расщепления SNAP-25 BoNT/A1: Специфичность анализа BoNT iPS подтверждали анализом защиты антителами с использованием двух различных форматов анализа. В первом анализе клетки подвергали воздействию смесей токсин-антитело в течение 24 ч, используя минимальное количество токсина, требуемое для достижения практически полного расщепления SNAP-25 (1,5 единиц). Во втором анализе клетки подвергали воздействию смесей 55 U BoNT/A и последовательно разбавленного антитела в течение 5 мин в клеточно-стимулирующей среде с последующим удалением токсина и инкубированием в течение 24 ч. Первый анализ давал значительно более высокую чувствительность в детектировании антитела. Нейроны были полностью защищены от расщепления SNAP-25 уже 0,0025 мкл антитела. Значительная частичная защита наблюдалась вплоть до 0,000625 мкл антитела (фиг. 7А). Та же система защиты наблюдалась ранее, когда антитело испытывали с клетками RSC с использованием 0,5 U BoNT/A1 и 48 ч воздействия. Испытание тех же самых разбавлений антитела при помощи мышиного биоанализа указывало на, по меньшей мере, в ~10 раз большую чувствительность анализов на клеточной основе по сравнению с мышиным биоанализом, на что также указывали предыдущие данные. Показано, что анализ RSC являлся более чувствительным в нейтрализации детектирования антитела, чем мышиный биоанализ (Pellett, S. 2007, выше). Второй (зависимый от активности) анализ являлся примерно в 10 раз менее чувствительным, требующим 0,016 мкл антитела на 50 мкл для полной защиты, и частичная защита наблюдалась с 0,004 мкл (фиг. 7В).

Это подтверждает специфичность этого анализа и указывает на то, что нейроны iPS обеспечивают превосходный и высокочувствительный анализ на детектирование нейтрализующих антител, и то, что более долгое воздействие меньшим количеством токсина является более чувствительным, чем зависимый от активности анализ, который требует больше токсина, но меньшего времени воздействия. Зависимый от активности анализ является пригодным для некоторых целей, таких как скрининг соединений или антитоксина, которые могут являться цитотоксичными или требуют растворения в растворителях, которые со временем могут повредить нейроны.

Детектирование токсина BoNT/A1 в его природном комплексе является более чувствительным, чем детектирование очищенного токсина: BoNT экспрессируются у клостридий в виде комплекса с несколькими другими белками (нетоксичный негемагглютининовый белок (NTNH) и гемагглютинины (НА) в случае BoNT/A (обзор у Johnson E.A. & Bradshaw M. (2001) Toxicon 39: 1703-1722)). Считается, что нетоксичные белки комплекса защищают токсин от разрушающего рН пищеварительного тракта (Oguma et al., (2000) Microbial Foodborne Diseases: Mechanisms of Pathogenesis and Toxin Synthesis 273-293). Наиболее часто использующиеся медицинские препараты BoNT/A (препараты BOTOX® и Dysport®) состоят из полного комплекса токсина, хотя более новые составы, содержащие только очищенный BoNT (препарат Xeomin®), в настоящее время одобрены FDA. Для определения, детектируется ли BoNT/A1 в его природном комплексе с равной чувствительностью, как и чистый BoNT/A1 в нейронах iPS, клетки параллельно подвергали воздействию равных количеств комплекса BoNT/A1 или очищенного BoNT/A1. Комплекс состоит примерно из 24% BoNT/A1 и 76% других нетоксичных связанных белков, как определено денситометрией (фиг. 8А). Очищенный препарат BoNT/A1 и комплекс BoNT/A1 обладали похожими удельными активностями (7×10⁷ U/мг и 7,3×10⁷ U/мг). В прямом сравнении, значительно меньше токсинового компонента комплекса требовалось для достижения полного расщепления SNAP-25 (фиг. 8В). Это открытие указывает на то, что нетоксичные белки комплекса увеличивают активность BoNT/A1 в этом анализе, возможно, из-за защитного эффекта нейронной среды.

Нейроны iPS являются высокочувствительной клеточной моделью для детектирования серотипов BoNT В, С и Е: Анализы рецепторов BoNT показали, что нейроны iPS экспрессируют белки SNARE и рецепторы, требуемые для входа в клетку всех серотипов BoNT (фиг. 1). BoNT/A и /Е расщепляют SNAP-25, BoNT/В расщепляет VAMP, и BoNT/С расщепляет SNAP-25 и синтаксин (Humeau et al., (2000) Biochimie 82: 427-446). Для испытания чувствительностей нейронов к различным серотипам последовательные разбавления BoNT/В, С или Е параллельно добавляли к нейронам iPS или клеткам RSC в течение 48 ч, и клеточные лизаты анализировали вестерн-блоттингом на расщепление их соответствующего нейронного субстрата. Нейроны iPS согласованно детектировали все серотипы BoNT с равной или большей чувствительностью, чем клетки RSC (фиг. 9). Значения ЕС₅₀ для нейронов iPS и клеток RSC составляли 15,71 U и 29,22 U для BoNT/B (фиг. 9А), 0,4 U и 0,36 U для BoNT/C (фиг. 9В) и 1,79 U для BoNT/E в нейронах iPS (фиг. 9С). Значение ЕС₅₀ для BoNT/E в клетках RSС было невозможно вывести при помощи программного обеспечения PRISM, но оно оценивается как подобное таковому у нейронов iPS (фиг. 9С).

Все публикации, патенты, патентные заявки и учетные номера, указанные в вышеприведенном описании, являются включенными в настоящее описание во всей своей полноте путем ссылки. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение, как оно заявлено, не должно быть чрезмерно ограниченным такими конкретными вариантами осуществления. В самом деле, различные модификации и вариации описанных композиций и способов изобретения будут являться очевидными средним специалистам в данной области техники и подразумеваются как входящие в объем следующей формулы изобретения.

1. Способ анализа нейротоксина Clostridium botulinum (BoNT) на активность, включающий:

a) контактирование нервной клетки, происходящей от индуцированной полипотентной стволовой клетки (hiPS) человека, с композицией, включающей BoNT; и

b) анализ указанного BoNT на биологическую активность путем определения присутствия или отсутствия расщепления субстрата BoNT в подвергшейся контакту нервной клетке, происходящей от hiPS, и/или присутствия или отсутствия высвобождения нейромедиатора из подвергшейся контакту нервной клетки, происходящей от hiPS.

2. Способ по п. 1, в котором указанный BoNT обладает серотипом, выбранным из группы, состоящей из А, В, С, Е и модифицированных вариантов указанных BoNT.

3. Способ по п. 1, в котором указанный субстрат BoNT выбирают из группы, состоящей из SNAP-25 и VAMP2.

4. Способ по п. 1, в котором указанный анализ является качественным.

5. Способ по п. 1, в котором указанный анализ является количественным.

6. Способ по п. 1, в котором указанный BoNT является очищенным.

7. Способ по п. 1, в котором указанный BoNT не находится в комплексе.

8. Способ по п. 1, в котором указанный BoNT находится в комплексе.

9. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию контактирования указанного BoNT с пробным веществом перед контактированием с указанными нервными клетками, происходящими от hiPS.

10. Способ по п. 9, в котором указанное пробное вещество представляет собой антитело.

11. Способ по п. 10, в котором указанное антитело представляет собой нейтрализующее антитело.

12. Способ по п. 11, в котором указанное нейтрализующее антитело находится в образце, выбранном из группы, состоящей из очищенных антител, сыворотки и антитоксинов.

13. Способ анализа нейротоксина Clostridium botulinum (BoNT) на активность, включающий:

a) контактирование нервной клетки, происходящей от индуцированной полипотентной стволовой клетки (hiPS) человека, с композицией, включающей i) BoNT; и ii) нейтрализующее антитело; и

b) анализ указанного BoNT на биологическую активность путем определения присутствия или отсутствия расщепления субстрата BoNT в подвергшейся контакту нервной клетке, происходящей от hiPS, и/или присутствия или отсутствия высвобождения нейромедиатора из подвергшейся контакту нервной клетки, происходящей от hiPS.

14. Способ по п. 13, в котором указанный BoNT обладает серотипом, выбранным из группы, состоящей из А, В, С, Е и модифицированных вариантов указанных BoNT.

15. Способ по п. 13, в котором указанный субстрат BoNT выбирают из группы, состоящей из SNAP-25 и VAMP2.

16. Способ по п. 13, в котором указанный анализ является качественным.

17. Способ по п. 13, в котором указанный анализ является количественным.

18. Способ по п. 13, в котором указанный BoNT является очищенным.

19. Способ по п. 13, в котором указанный BoNT не находится в комплексе.

20. Способ по п. 13, в котором указанный BoNT находится в комплексе.

21. Способ по п. 13, в котором указанное нейтрализующее антитело находится в образце, выбранном из группы, состоящей из очищенных антител, сыворотки и антитоксинов.

22. Способ определения количества биологически активного BoNT в препарате, включающем биологически активный BoNT, при этом указанный способ включает стадии:

(a) контактирования нервной клетки, происходящей от клетки hiPS, с образцом препарата, включающим биологически активный BoNT; и

(b) определения количества биологически активного BoNT, присутствующего в препарате, путем анализа образца на биологическую активность BoNT путем определения количества расщепления субстрата BoNT в подвергшейся контакту нервной клетке, происходящей от hiPS, и/или определения количества высвобождения нейромедиатора из подвергшейся контакту нервной клетки, происходящей от hiPS.

23. Применение нервной клетки, происходящей от индуцированной полипотентной стволовой клетки (hiPS) человека, для анализа BoNT на активность.