Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто)

Изобретение относится к биохимии. Описаны способы детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (РТО)). В настоящем изобретении применяется ингибирование гибридизации посредством образования мишень-зависимого удлиненного дуплекса. Таким образом, согласно настоящему изобретению можно осуществлять детекцию последовательностей-мишеней даже тогда, когда гибридизующийся олигонуклеотид (НО) не расщепляется. Поэтому можно без труда сконструировать последовательность 5'-концевого тегирующего участка РТО, последовательности захватывающего и матричного олигонуклеотида (СТО) и НО и легко определить условия реакции. В связи с этим детекцию гибрида между СТО и НО можно осуществить в другом сосуде, не в сосуде для удлинения СТО. 6 н. и 30 з.п. ф-лы, 23 ил., 5 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка притязает на приоритеты заявки на патент Кореи №2012-0154834, поданной 27 декабря 2012 года, заявки на патент Кореи №2013-0008580, поданной 25 января 2013 года, и заявки на патент Кореи №2013-0034670, поданной 29 марта 2013 года, в Ведомство по охране прав интеллектуальной собственности Республики Корея, описания которых включены в данное описание посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с PCE-NH (РТО Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization - отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (РТО).

СВЕДЕНИЯ О РОДСТВЕННОМ УРОВНЕ ТЕХНИКИ

Гибридизация ДНК представляет собой фундаментальный процесс в молекулярной биологии, и на него влияют ионная сила, состав оснований, длина фрагмента, до которого укорочена нуклеиновая кислота, степень ошибочного спаривания и присутствие денатурирующих агентов. Основанные на гибридизации ДНК технологии были бы чрезвычайно полезным средством в определении конкретной нуклеиновокислотной последовательности и были бы, несомненно, необходимы в области клинической диагностики, генетических исследований и лабораторной судебно-медицинской экспертизы. Однако в традиционных методах и способах, основанных главным образом на гибридизации, с большой вероятностью получаются ложноположительные результаты вследствие неспецифической гибридизации зондов с последовательностями, не являющимися мишенями. Ввиду этого, остаются проблемы, требующие разрешения с точки зрения повышения надежности этих способов.

Помимо способов с гибридизацией зондов были предложены различные подходы с использованием дополнительных ферментативных реакций, например способ с применением TaqMan™-зондов.

В способе с применением TaqMan™-зондов меченый зонд, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется под действием 5'-нуклеазной активности ДНК-полимеразы, зависящей от располагающегося "вверх по течению" праймера, генерируя сигнал, указывающий на присутствие последовательности-мишени (патенты США №№5210015, 5538848 и 6326145). Согласно способу с применением TaqMan™-зондов предлагается два подхода для генерирования сигнала: зависящее от полимеризации расщепление и не зависящее от полимеризации расщепление. При зависящем от полимеризации расщеплении удлинение располагающегося "вверх по течению" праймера должно происходить до того, как полимераза нуклеиновых кислот встретится с 5'-концом меченого зонда. По мере продолжения реакции удлинения полимераза постепенно расщепляет 5'-конец меченого зонда. При не зависящем от полимеризации расщеплении располагающийся "вверх по течению" праймер и меченый зонд гибридизуются с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в непосредственной близости, так что связывание полимеразы нуклеиновых кислот с 3'-концом располагающегося "вверх по течению" праймера приводит ее в контакт с 5-концом меченого зонда, результатом чего является высвобождение метки. Кроме того, в способе с применением TaqMan™-зондов описывается, что меченый зонд, имеющий на своем 5'-конце 5'-хвостовой участок, не гибридизующийся с последовательностью-мишенью, также расщепляется с образованием фрагмента, содержащего данный 5'-хвостовой участок.

Сообщалось о некоторых способах, в которых зонд, имеющий 5'-хвостовой участок, некомплементарный последовательности-мишени, расщепляется под действием 5'-нуклеазы с высвобождением фрагмента, содержащего данный 5'-хвостовой участок.

Например, в патенте США №5691142 описывается расщепляемая структура, которая должна перевариваться под действием 5'-нуклеазной активности ДНК-полимеразы. Приводится пример данной расщепляемой структуры, в которой олигонуклеотид, содержащий 5'-участок, не комплементарный матрице, и 3'-участок, комплементарный матрице, гибридизуется с данной матрицей, и в непосредственной близости с этой матрицей гибридизуется располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид. Такая расщепляемая структура расщепляется ДНК-полимеразой, обладающей 5'-нуклеазной активностью, или модифицированной ДНК-полимеразой со сниженной способностью к синтезу с высвобождением 5-участка, не комплементарного данной матрице. Высвободившийся 5'-участок далее гибридизуется с олигонуклеотидом, имеющим шпилечную структуру, с образованием расщепляемой структуры, индуцируя тем самым прогрессирующие реакции расщепления, необходимые для детекции последовательности-мишени.

В патенте США №7381532 описывается способ, в котором расщепляемая структура, содержащая располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид с блокированным 3'-концом, расщепляется ДНК-полимеразой, обладающей 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазой FEN (флэп-эндонуклеаза) с высвобождением некомплементарного 5'-концевого одноцепочечного "свисающего" участка (флэпа), и детекцию этого высвободившегося 5'-концевого "свисающего" участка осуществляют, используя анализ по размеру или систему двух взаимодействующих меток. В патенте США №6893819 описывается, что детектируемые высвободившиеся "свисающие" участки получаются в результате применения зависящего от синтеза нуклеиновой кислоты, флэп-опосредованного способа амплификации последовательностей. В этом способе высвободившийся из первой расщепляемой структуры "свисающий" участок опосредует зависящим от синтеза нуклеиновой кислоты образом расщепление второй расщепляемой структуры, высвобождая "свисающий" участок из второй расщепляемой структуры, и высвободившиеся "свисающие" участки детектируют.

В патенте США №7309573 описывается способ, включающий образование высвободившегося "свисающего" участка, полученного в результате синтеза нуклеиновой кислоты; удлинение этого высвободившегося "свисающего" участка; расщепление олигонуклеотида во время удлинения этого "свисающего" участка и детекцию сигнала, генерируемого в результате расщепления данного олигонуклеотида.

Используя гибридизацию меченных флуоресцентной меткой зондов в жидкой фазе, можно осуществить одновременную детекцию множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с применением флуоресцентной метки даже одного типа путем анализа кривой плавления. Однако традиционные технологии детекции последовательностей-мишеней с применением 5'-нуклеаза-опосредованного расщепления зондов, содержащих систему двух взаимодействующих меток, требуют наличия флуоресцентных меток различных типов для различных последовательностей-мишеней при детекции множественных мишеней, что ограничивает число детектируемых последовательностей-мишеней ввиду ограниченного количества типов флуоресцентных меток.

В публикации заявки на патент США 2008/0241838 описывается способ детекции мишени с использованием расщепления зонда, содержащего 5'-концевой участок, не комплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и гибридизации зонда захвата. Метка расположена на некомплементарном 5'-концевом участке. Меченый зонд, гибридизованный с последовательностью-мишенью, расщепляется с высвобождением фрагмента, после чего этот фрагмент далее гибридизуется с зондом захвата для детекции присутствия последовательности-мишени. В этом способе необходимо, чтобы нерасщепленный/интактный зонд не гибридизовался с зондом захвата. Для этого зонд захвата, имеющий меньшую длину, должен быть иммобилизован на твердой подложке. Однако такое ограничение приводит к снижению эффективности гибридизации на твердой подложке, а также к затруднениям в оптимизации реакционных условий.

Таким образом, в данной области техники сохраняется давно назревшая необходимость в разработке новых подходов к детекции последовательности-мишени, предпочтительно множественных последовательностей-мишеней, в жидкой фазе и на твердой фазе, не только посредством гибридизации, но также с использованием ферментативных реакций, таких как 5'-нуклеолитическая реакция, более удобным, надежным и воспроизводимым образом. Кроме того, в данной области техники также существует необходимость в новом способе детекции мишени, не ограниченном количеством типов меток (в частности, флуоресцентными метками).

По всей этой заявке сделаны ссылки на различные патенты и публикации, и упоминания о них приведены в круглых скобках. Тем самым описание этих патентов и публикаций во всей их полноте включено в эту заявку посредством ссылок с целью более полного описания данного изобретения и состояния области техники, к которой это изобретение имеет отношение.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью разработки новых подходов для детекции последовательностей-мишеней, характеризующихся более высокой точностью и удобством, помимо прочего, в режиме множественной детекции. В результате авторы изобретения разработали новые протоколы для детекции последовательностей-мишеней, в которых детекция мишени осуществляется посредством гибридизации зондов, ферментативного расщепления зондов, удлинения и детекции удлиненного продукта с использованием гибридизующегося олигонуклеотида (НО). Протоколы по настоящему изобретению хорошо адаптированы как к реакциям в жидкой фазе, так и к реакциям на твердой фазе, и это дает возможность осуществлять детекцию множественных последовательностей-мишеней с более высокой точностью и более удобным образом.

Соответственно, данным изобретением решается задача разработки способа детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО).

Другой задачей данного изобретения является создание набора для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО).

Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующего далее подробного описания в сочетании с прилагаемыми формулой изобретения и графическими материалами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 схематически показаны структуры зондирующего и метящего олигонуклеотида (РТО), захватывающего и матричного олигонуклеотида (СТО), использованных в анализе с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО (PCE-NH). В частности, 3'-концы РТО, СТО и НО блокируют, чтобы препятствовать их удлинению.

На Фиг. 2 схематически представлен первый аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления. НО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель. Образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО посредством ингибирования гибридизации НО с СТО.

На Фиг. 3 схематически представлен первый аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления. НО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель. Образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО в результате расщепления НО, а также посредством ингибирования гибридизации НО с СТО.

На Фиг. 4 схематически представлен первый аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления. НО содержит репортерную молекулу, а СТО содержит молекулу-гаситель.

На Фиг. 5 схематически представлен первый аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления. НО содержит одиночную флуоресцентную метку, чтобы демонстрировать различную интенсивность сигнала в зависимости от ее присутствия в составе одноцепочечной структуры или двухцепочечной структуры.

На Фиг. 6 схематически представлен первый аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления. НО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель. НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО в плане гибридизации с СТО.

На Фиг. 7 схематически представлен первый аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления. НО содержит репортерную молекулу, а СТО содержит молекулу-гаситель. НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО в плане гибридизации с СТО.

На Фиг. 8 схематически представлен второй аспект PCE-NH-анализа с использованием одиночной метки на твердой фазе. СТО содержит одиночную метку, а НО иммобилизован на твердой подложке. Образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО посредством ингибирования гибридизации НО с СТО.

На Фиг. 9 схематически представлен второй аспект PCE-NH-анализа с использованием одиночной метки на твердой фазе. СТО содержит одиночную метку, а НО иммобилизован на твердой подложке. Образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО в результате расщепления или вытеснения НО, а также посредством ингибирования гибридизации НО с СТО.

На Фиг. 10 схематически представлен второй аспект PCE-NH-анализа с использованием одиночной метки на твердой фазе. НО содержит одиночную метку, а СТО иммобилизован на твердой подложке. Образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО посредством ингибирования гибридизации НО с СТО.

На Фиг. 11 схематически представлен второй аспект PCE-NH-анализа с использованием одиночной метки на твердой фазе. НО содержит одиночную метку, а СТО иммобилизован на твердой подложке. Образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО в результате расщепления или вытеснения НО, а также посредством ингибирования гибридизации НО с СТО.

На Фиг. 12 схематически представлен второй аспект PCE-NH-анализа с использованием одиночной метки на твердой фазе. СТО содержит одиночную метку, а НО иммобилизован на твердой подложке. НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО в плане гибридизации с СТО.

На Фиг. 13 схематически представлен второй аспект PCE-NH-анализа с использованием одиночной метки на твердой фазе. НО содержит одиночную метку, а СТО иммобилизован на твердой подложке. НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО в плане гибридизации с СТО.

На Фиг. 14 схематически представлен третий аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя детекцию при предварительно заданной температуре, основанную на новой реакции, в которой образование удлиненного дуплекса ингибирует гибридизацию НО с СТО. НО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель.

На Фиг. 15 схематически представлен третий аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя детекцию при предварительно заданной температуре, основанную на новой реакции, в которой образование удлиненного дуплекса ингибирует гибридизацию НО с СТО. НО содержит репортерную молекулу, а СТО содержит молекулу-гаситель.

На Фиг. 16 схематически представлен третий аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя детекцию при предварительно заданной температуре, основанную на новой реакции, в которой образование удлиненного дуплекса ингибирует гибридизацию НО с СТО. НО содержит одиночную флуоресцентную метку, чтобы демонстрировать различную интенсивность сигнала в зависимости от ее присутствия в составе одноцепочечной структуры или двухцепочечной структуры.

На Фиг. 17 схематически представлен третий аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя детекцию при предварительно заданной температуре, основанную на новой реакции, в которой образование удлиненного дуплекса ингибирует гибридизацию НО с СТО. НО содержит репортерную молекулу и молекулу-гаситель. НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО в плане гибридизации с СТО.

На Фиг. 18 схематически представлен третий аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя детекцию при предварительно заданной температуре, основанную на новой реакции, в которой образование удлиненного дуплекса ингибирует гибридизацию НО с СТО. НО содержит репортерную молекулу, а СТО содержит молекулу-гаситель. НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО в плане гибридизации с СТО.

На Фиг. 19А представлены результаты оценки того, ингибируется ли гибридизация НО с СТО удлиненным дуплексом. Syn-ES означает синтетические удлиненные цепи.

На Фиг. 20А представлены результаты детекции мишени с использованием PCE-NH-анализа в режиме реального времени при предварительно заданной температуре (темп, гибридизации 55°С). Эти результаты относятся к детекции мишени с использованием сигналов, полученных в результате ингибирования удлиненным дуплексом.

На Фиг. 20В представлены результаты детекции мишени с использованием PCE-NH-анализа в режиме реального времени при предварительно заданной температуре (темп, денатурации 95°С). Этот результат демонстрирует, что во время этой реакции некоторые НО могут подвергаться расщеплению.

На Фиг. 20С представлены результаты детекции мишени посредством PCE-NH-анализа с применением анализа плавления.

На Фиг. 21А представлены результаты детекции мишени с использованием PCE-NH-анализа в режиме реального времени при предварительно заданной температуре (темп. гибридизации 60°С). НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО в плане гибридизации с СТО. Получение детектируемого сигнала обеспечивается в результате ингибирования гибридизации НО с СТО. Получение сигнала в результате расщепления НО, исключено.

На Фиг. 21В представлены результаты детекции мишени с использованием PCE-NH-анализа в режиме реального времени при предварительно заданной температуре (темп. денатурации 95°С). НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО в плане гибридизации с СТО. Этот результат демонстрирует, что расщепления НО во время реакции не происходило.

На Фиг. 21С представлены результаты детекции мишени посредством PCE-NH-анализа с применением анализа плавления. НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО в плане гибридизации с СТО.

На Фиг. 22 представлены результаты детекции мишени посредством PCE-NH-анализа с использованием меченного одиночной меткой СТО и иммобилизованного на твердой фазе НО.

На Фиг. 23 представлены результаты детекции мишени посредством PCE-NH-анализа с использованием меченного одиночной меткой СТО и иммобилизованного на твердой фазе НО, в котором стадию удлинения и стадию гибридизации НО осуществляли в отдельных пробирках, и НО не претерпевал расщепления.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому способу детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО) и набору для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в PCE-NH-анализе. Настоящее изобретение осуществляется посредством гибридизации зондов, ферментативного расщепления зондов, удлинения и детекции удлиненного продукта с использованием НО (гибридизующегося олигонуклеотида). В настоящем изобретении может быть выделено три аспекта в соответствии со способами детекции удлиненного продукта с использованием НО.

I. Первый аспект способа детекции мишени в PCE-NH-анализе

В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5'

(1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;

(e) проведение анализа плавления или анализа гибридизации для продукта со стадии (d) в диапазоне температур с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала; при этом сигнал обеспечивается посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и

(f) детекцию сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью разработки новых подходов для детекции последовательностей-мишеней, характеризующихся более высокой точностью и удобством, помимо прочего, в режиме множественной детекции. В результате авторы изобретения разработали новые протоколы для детекции последовательностей-мишеней, в которых детекция мишеней осуществляется посредством гибридизации зондов, ферментативного расщепления зондов, удлинения и анализа плавления (или анализа гибридизации) с использованием НО (гибридизующегося олигонуклеотида). Протоколы по настоящему изобретению хорошо адаптированы как к реакциям в жидкой фазе, так и к реакциям на твердой фазе, и это дает возможность осуществлять детекцию множественных последовательностей-мишеней с более высокой точностью и более удобным образом.

В настоящем изобретении реализуются последовательные события, включающие гибридизацию зондов; расщепление РТО (зондирующего и метящего олигонуклеотида) и удлинение; образование удлиненного дуплекса; и анализ плавления или анализ гибридизации с использованием НО. При проведении анализа плавления или анализа гибридизации отсутствие образования гибрида с НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Поэтому способ называется анализом с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО).

Поскольку удлиненный дуплекс образуется, препятствуя образованию гибрида между СТО и НО, только в том случае, если имеется нуклеиновая кислота-мишень, то отсутствие какого-либо сигнала, указывающего на присутствие гибрида с СТО, указывает на присутствие этой нуклеиновой кислоты-мишени.

Термин "препятствует образованию гибрида между СТО и НО", относящийся к удлиненному дуплексу, означает все события, связанные с отсутствием образования гибрида между СТО и НО ввиду наличия удлиненного дуплекса. Например, термин включает в себя ингибирование гибридизации НО с СТО ввиду наличия удлиненного дуплекса и расщепление НО (т.е. расщепление НО во время удлинения фрагмента РТО), приводящее к расходованию НО в связи с образованием гибрида.

Настоящее изобретение характеризуется использованием величины Т_пл для гибрида СТО/НО в качестве дискриминирующего фактора присутствия или отсутствия гибрида СТО/НО при детекции. Гибрид СТО/НО имеет свою отличительную величину Т_пл, которая зависит от последовательности и/или длины СТО и НО. Проводя анализ плавления или анализ гибридизации, присутствие или отсутствие гибрида СТО/НО определяют на основании величины его Т_пл.

В частности, настоящее изобретение применимо для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени даже тогда, когда НО не расщепляется (т.е. когда гибридизация НО с СТО ингибируется в результате образования удлиненного дуплекса), а также тогда, когда НО расщепляется.

Традиционные технологии с генерированием сигнала от зондов, гибридизованных с последовательностями-мишенями и затем подвергающихся расщеплению, могут не обеспечить получение кривой плавления. В противоположность этому, в настоящем изобретении используется гашение (или ослабление) сигналов при плавлении гибрида между СТО и НО, последовательности которых нерелевантны последовательностям мишеней. Таким образом, согласно настоящему изобретению можно осуществить детекцию последовательностей-мишеней с применением анализа плавления даже тогда, когда расщепление НО зависит от присутствия последовательностей-мишеней.

Первый аспект PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации, далее будет описан более подробно.

Стадия (а). Гибридизация располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и РТО с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью

Согласно настоящему изобретению нуклеиновокислотная последовательность-мишень сначала гибридизуется с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РТО (зондирующим и метящим олигонуклеотидом).

Использованный в данном описании термин "нуклеиновая кислота-мишень", "нуклеиновокислотная последовательность-мишень" или "последовательность-мишень" относится к представляющей интерес для детекции нуклеиновокислотной последовательности, на которой отжигают зонд или праймер, либо которую гибридизуют с зондом или праймером в условиях гибридизации, отжига или амплификации.

Использованный в данном описании термин "зонд" относится к молекуле одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей участок или участки, по существу комплементарный(ые) нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Термин "праймер", использованный в данном описании, относится к олигонуклеотиду, который способен действовать в качестве точки инициации синтеза при помещении в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты (матрице), т.е. в присутствии нуклеотидов и агента для полимеризации, такого как ДНК-полимераза, и при подходящих значениях температуры и рН.

В одном из воплощений зонд и праймер представляют собой одноцепочечные молекулы, состоящие из дезоксирибонуклеотидов. Зонды или праймеры, использованные в данном изобретении, могут содержать природный dNMP (т.е. dAMP, dGMP, dCMP и dTMP), модифицированный нуклеотид или неприродный нуклеотид. Зонды или праймеры также могут включать рибонуклеотиды.

Праймер должен иметь достаточную длину, чтобы праймировать синтез продуктов удлинения в присутствии агента для полимеризации. Точная длина праймеров будет зависеть от многих факторов, включая температуру, способ применения и источник праймера. Термин "отжиг" или "праймирование", использованный в данном описании, относится к присоединению олигодезоксинуклеотида или нуклеиновой кислоты к являющейся матрицей нуклеиновой кислоте, при этом данное присоединение позволяет полимеразе осуществлять полимеризацию нуклеотидов с образованием молекулы нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеиновой кислоте, являющейся матрицей, или ее части.

Термин "гибридизация", использованный в данном описании, относится к образованию двухцепочечной нуклеиновой кислоты из комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот. Гибридизация может осуществляться между двумя цепями нуклеиновой кислоты, полностью сопоставимыми или по существу сопоставимыми при некотором количестве ошибочных спариваний. Комплементарность, необходимая для гибридизация, может зависеть от условий гибридизации, в частности от температуры.

Гибридизация нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РТО может быть осуществлена в подходящих условиях гибридизации, определенных в установленном порядке путем оптимизации методик. Такие условия, как температура, концентрация компонентов, продолжительность гибридизации и промывки, компоненты буферов, их рН и ионная сила, могут быть изменены в зависимости от различных факторов, включая длину и GC-состав олигонуклеотида (располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и РТО) и нуклеотидной последовательности-мишени. Например, при использовании относительно короткого олигонуклеотида предпочтительно, чтобы были приняты условия низкой жесткости. Подробные условия гибридизации можно найти в Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); и M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag, New York Inc., N.Y. (1999).

Не предполагается различия между терминами "отжиг" и "гибридизация", и эти термины будут использованы взаимозаменяемо.

Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид и РТО содержат гибридизующиеся нуклеотидные последовательности, комплементарные нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Термин "комплементарный" используется в данном описании для указания на то, что праймеры или зонды являются достаточно комплементарными, чтобы избирательно гибридизоваться с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в намеченных условиях отжига или в жестких условиях, охватывая термины "по существу комплементарный" и "полностью комплементарный", например, "полностью комплементарный".

5'-Концевой тегирующий участок РТО содержит нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Термин "некомплементарный" используется в данном описании для указания на то, что праймеры или зонды являются достаточно некомплементарными, чтобы не гибридизоваться избирательно с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в намеченных условиях отжига или в жестких условиях, охватывая термины "по существу некомплементарный" и "полностью некомплементарный", например, "полностью некомплементарный".

Например, термин "некомплементарный" в отношении 5-концевого тегирующего участка РТО означает, что 5'-концевой тегирующий участок является достаточно некомплементарным, чтобы не гибридизоваться избирательно с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в намеченных условиях отжига или в жестких условиях, охватывая термины "по существу некомплементарный" и "полностью некомплементарный", например, "полностью некомплементарный".

Использованный в данном описании термин "зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО)" означает олигонуклеотид, содержащий (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, служащий в качестве зонда, и (2) 5'-концевой тегирующий участок с нуклеотидной последовательностью, не комплементарной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, который высвобождается в результате нуклеолитической реакции из РТО после гибридизации с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью. 5'-Концевой тегирующий участок и 3'-концевой узнающий мишень участок в РТО должны располагаться в направлении 5'→3'. РТО схематически показан на Фиг. 1.

В одном из воплощений гибридизацию на стадии (а) проводят в жестких условиях, так что 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью.

Для РТО не предусматривается какой-либо конкретной длины. Например, длина РТО может составлять 15-150 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 20-150 нуклеотидов, 20-100 нуклеотидов, 20-80 нуклеотидов, 20-60 нуклеотидов, 20-50 нуклеотидов, 30-150 нуклеотидов, 30-100 нуклеотидов, 30-80 нуклеотидов, 30-60 нуклеотидов, 30-50 нуклеотидов, 35-100 нуклеотидов, 35-80 нуклеотидов, 35-60 нуклеотидов или 35-50 нуклеотидов. 3'-Концевой узнающий мишень участок РТО может быть любой длины при условии, что он специфически гибридизуется с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями. Например, длина 3'-концевого узнающего мишень участка РТО может составлять 10-100 нуклеотидов, 10-80 нуклеотидов, 10-50 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-50 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов, 20-100 нуклеотидов, 20-80 нуклеотидов, 20-50 нуклеотидов, 20-40 нуклеотидов или 20-30 нуклеотидов. 5'-Концевой тегирующий участок может быть любой длины при условии, что он специфически гибридизуется с захватывающим участком СТО и далее удлиняется. Например, длина 5'-концевого тегирующего участка РТО может составлять 5-50 нуклеотидов, 5-40 нуклеотидов, 5-30 нуклеотидов, 5-20 нуклеотидов, 10-50 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 10-20 нуклеотидов, 15-50 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов или 15-20 нуклеотидов.

На 3'-конце РТО может находиться группа 3'-ОН. В конкретном воплощении 3'-конец РТО "блокируют", чтобы препятствовать его удлинению.

Блокирование может быть достигнуто традиционными методами. Например, блокирование можно осуществить путем добавления химической группировки, такой как биотин, метки, фосфатная группа, алкильная группа, ненуклеотидный линкер, фосфотионат или алкандиол, к 3'-гидроксильной группе последнего нуклеотида. Альтернативно, блокирование может быть выполнено посредством удаления 3'-гидроксильной группы последнего нуклеотида или путем использования нуклеотида, лишенного 3'-гидроксильной группы, такого как дидезоксинуклеотид.

Альтернативно, РТО может быть сконструирован так, чтобы принимать шпилечную структуру.

Отсутствие гибридизации 5'-концевых тегирующих участков РТО с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью означает отсутствие образования из них стабильной двухцепочечной структуры в определенных условиях гибридизации. Согласно одному из воплощений данного изобретения 5'-концевой тегирующий участок РТО, не вовлеченный в гибридизацию с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, образует одноцепочечную структуру.

Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО.

Помимо этого, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь, гибридизованная с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

Индукция расщепления РТО при посредстве располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида может протекать двумя путями: (1) как индукция расщепления, не зависящего от удлинения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида; и (2) как индукция расщепления, зависящего от удлинения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида.

В том случае, когда располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован достаточно близко к РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, тогда фермент, связавшийся с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом, расщепляет РТО без реакции удлинения. В отличие от этого, когда располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован в отдалении от РТО, тогда фермент, обладающий полимеразной активностью (например, матричная полимераза), катализирует удлинение располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида (например, располагающегося "вверх по течению" праймера), а фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, связавшийся с удлиненным продуктом, расщепляет РТО.

Следовательно, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может быть локализован относительно РТО двумя способами. Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может быть локализован достаточно близко к РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО не зависящим от удлинения образом. Альтернативно, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может быть локализован достаточно далеко от РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО зависящим от удлинения образом.

Использованный в данном описании термин "расположенный в непосредственной близости" в отношении расположений или локализаций означает, что располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован вблизи 3'-концевого узнающего мишень участка РТО с образованием "ника" (одноцепочечного разрыва). Кроме того, этот термин означает, что располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован на расстоянии 1-30 нуклеотидов, 1-20 нуклеотидов или 1-15 нуклеотидов от 3'-концевого узнающего мишень участка РТО.

Использованный в данном описании термин "отдаленный" в отношении расположений или локализаций, включает в себя любые расположения или локализации, достаточные для обеспечения протекания реакций удлинения.

Согласно одному из воплощений располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован на достаточном отдалении от РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО зависящим от удлинения образом.

Согласно одному из воплощений располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд. Располагающийся "вверх по течению" праймер подходит для индукции не зависящего от удлинения расщепления или для индукции зависящего от удлинения расщепления, а располагающийся "вверх по течению" зонд подходит для индукции не зависящего от удлинения расщепления.

Альтернативно, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может иметь последовательность, частично перекрывающуюся с 5'-концевой частью 3'-концевого узнающего мишень участка РТО. В конкретном воплощении длина перекрывающейся последовательности составляет 1-10 нуклеотидов, 1-5 нуклеотидов или 1-3 нуклеотида. В том случае, когда располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид имеет последовательность, частично перекрывающуюся с 5'-концевой частью 3'-концевого узнающего мишень участка РТО, этот 3'-концевой узнающий мишень участок частично расщепляется наряду с 5'-концевым тегирующим участком в реакции расщепления на стадии (b). Помимо этого, присутствие перекрывающейся последовательности позволяет расщеплять желаемый сайт 3'-концевого узнающего мишень участка.

Согласно одному из воплощений располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

В настоящем изобретении могут быть применены традиционные технологии для реакций расщепления с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов при условии, что располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид индуцирует расщепление РТО, гибридизованного с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, с высвобождением фрагмента, содержащего 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО. Например, в настоящем изобретении могут быть применены патенты США №№5210015, 5487972, 5691142, 5994069 и 7381532 и публикация заявки на патент США №2008/0241838.

Согласно одному из воплощений данный способ осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера. Располагающийся "вниз по течению" праймер дополнительно образует нуклеиновокислотную последовательность-мишень, которая будет гибридизоваться с РТО, повышая чувствительность детекции мишени.

Согласно одному из воплощений, когда используют располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, дополнительно для удлинения этих праймеров применяют матричную полимеразу нуклеиновых кислот.

Согласно одному из воплощений располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид (располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд), располагающийся "вниз по течению" праймер и/или 5'-концевой тегирующий участок РТО имеют структуру олигонуклеотида с двойным праймированием (DPO), разработанную автором настоящего изобретения. Олигонуклеотиды, имеющие структуру DPO, демонстрируют значительно улучшенную специфичность к мишени по сравнению с традиционными праймерами и зондами (см. WO 2006/095981; Chun et. al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses и SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35: 6e40(2007)).

Согласно одному из воплощений 3'-концевой узнающий мишень участок РТО имеет структуру модифицированного олигонуклеотида с двойной специфичностью (mDSO), разработанную автором настоящего изобретения. Структура модифицированного олигонуклеотида с двойной специфичностью (mDSO) демонстрирует значительно улучшенную специфичность к мишени по сравнению с традиционными зондами (см. WO 2011/028041).

Стадия (b): Высвобождение фрагмента в результате расщепления РТО

Далее, продукт со стадии (а) приводят в контакт с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО. РТО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, высвобождая фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО.

Использованный в данном описании термин "условия для расщепления РТО" означает условия, достаточные для осуществления расщепления РТО, гибридизованного с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, такие как температура, рН, ионная сила, буфер, длина и последовательность олигонуклеотидов и ферменты. Например, когда в качестве фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, используют Taq ДНК-полимеразу, условия для расщепления РТО включают трис-HCl буфер, KCl, MgCl₂ и температуру.

Когда РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, его 3'-концевой узнающий мишень участок вовлечен в гибридизацию, а 5'-концевой тегирующий участок образует одноцепочечную структуру без гибридизации с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью (см. Фиг. 2). По существу, олигонуклеотид, содержащий как одноцепочечную, так и двухцепочечную структуры, может быть расщеплен с использованием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с применением разнообразных технологий, известных специалисту в данной области.

Сайты расщепления РТО варьируют в зависимости от типа располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов (располагающегося "вверх по течению" зонда или располагающегося "вверх по течению" праймера), сайтов гибридизации располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов и условий расщепления (см. патенты США №№5210015, 5487972, 5691142, 5994069 и 7381532 и публикацию заявки на патент США №2008/0241838).

Большое число традиционных технологий может быть применено для проведения реакции расщепления РТО, приводящей к высвобождению фрагмента, содержащего 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка.

Кратко, на стадии (b) могут быть три сайта расщепления. Во-первых, сайтом расщепления является соединительный сайт между гибридизующимся участком РТО (3'-концевым узнающим мишень участком) и негибридизующимся участком (5-концевым тегирующим участком). Второй сайт расщепления представляет собой сайт, локализованный на расстоянии нескольких нуклеотидов в 3'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО. Второй сайт расщепления локализован в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка РТО. Третий сайт расщепления представляет собой сайт, локализованный на расстоянии нескольких нуклеотидов в 5'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО.

Согласно одному из воплощений первоначальным сайтом расщепления РТО матричной полимеразой, обладающей 5'-нуклеазной активностью, после удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера является исходная точка двойной цепи между РТО и нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью или сайт на расстоянии 1-3 нуклеотидов от этой исходной точки.

В связи с этим использованный в данном описании термин "фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО" в отношении расщепления РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, применяется для обозначения (1) 5'-концевого тегирующего участка, (2) 5'-концевого тегирующего участка и 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка и (3) части 5'-концевого тегирующего участка. В данной заявке термин "фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО" также можно описать как "фрагмент РТО".

Согласно одному из воплощений РТО имеет блокирующий участок, содержащий блокатор, устойчивый к расщеплению ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, и этот блокирующий участок используют для регулирования начального сайта расщепления и/или последующих расщеплений.

Согласно одному из воплощений РТО имеет блокирующий участок, содержащий в качестве блокатора по меньшей мере один нуклеотид, устойчивый к расщеплению ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

Например, чтобы индуцировать расщепление в соединительном сайте между гибридизующимся участком РТО (3'-концевым узнающим мишень участком) и негибридизующимся участком (5'-концевым тегирующим участком) 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка РТО можно заблокировать блокаторами.

Число блокаторов, содержащихся в блокирующем участке, может быть неограниченным, включая 1-10, 2-10, 3-8 или 3-6 блокаторов. Блокаторы, присутствующие в РТО, могут быть расположены непрерывно или через промежутки, предпочтительно непрерывно. Нуклеотиды, служащие в качестве блокаторов, имеющие остов, устойчивый к 5'→3'-экзонуклеазной активности, включают любые нуклеотиды, известные специалисту в данной области. Например, они содержат различные фосфотиоатные связи, фосфонатные связи, фосфоамидатные связи и модификации по положению 2' углеводной части. Согласно одному из воплощений нуклеотиды, имеющие остов, устойчивый к 5'→3'-экзонуклеазе, содержат фосфотиоатную связь, алкилфосфотриэфирную связь, арилфосфотриэфирную связь, алкилфосфонатную связь, арилфосфонатную связь, гидрофосфонатную связь, алкилфосфоамидатную связь, арилфосфоамидатную связь, фосфоселенатную связь, модификацию 2'-O-аминопропил, модификацию 2'-O-алкил, модификацию 2'-O-аллил, модификацию 2'-O-бутил, α-аномерный олигодезоксинуклеотид и модификацию 1-(4'-тио-β-D-рибофуранозил).

Согласно одному из воплощений нуклеотид, используемый в качестве блокатора, включает LNA ("закрытая" нуклеиновая кислота).

Термин "часть", использованный в отношении РТО или СТО, например, часть 5'-концевого тегирующего участка РТО, 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка РТО и 5-'концевая часть захватывающего участка СТО, относится к нуклеотидной последовательности, состоящей из 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 или 1-5 нуклеотидов, предпочтительно из 1, 2, 3 или 4 нуклеотидов.

Согласно одному из воплощений фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой ДНК-полимеразу, обладающую 5-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN, соответственно, термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.

Подходящей ДНК-полимеразой, обладающей 5'-нуклеазной активностью, в данном изобретении является термостабильная ДНК-полимераза, полученная из ряда бактериальных видов, включая Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus и Aquifex aeolieus. В конкретном воплощении термостабильная ДНК-полимераза представляла собой Taq полимеразу.

Альтернативно, в настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразы, обладающие 5'-нуклеазной активностью, модифицированные с целью уменьшения полимеразной активности.

Используемая нуклеаза FEN (флэп-эндонуклеаза) представляет собой флэп-специфичную 5'-нуклеазу.

Подходящая для настоящего изобретения нуклеаза FEN включает нуклеазы FEN, полученные из ряда бактериальных видов, включая Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix и Archaeaglobus veneficus.

Когда располагающийся "вверх по течению" праймер используют на стадии (а), условия для расщепления РТО могут включать реакцию удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера.

Согласно одному из воплощений на стадии (а) используют располагающийся "вверх по течению" праймер, для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу, и эта матричная полимераза идентична ферменту, обладающему 5'-нуклеазной активностью.

Возможно, что на стадии (а) используют располагающийся "вверх по течению" праймер, для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу, и эта матричная полимераза отличается от фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью.

Стадия (с). Гибридизация фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО

Фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с СТО (захватывающим и матричным олигонуклеотидом).

СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО.

СТО действует в качестве матрицы для удлинения фрагмента, высвободившегося из РТО. Этот фрагмент, служащий в качестве праймера, гибридизуется с СТО и удлиняется с образованием удлиненного дуплекса.

Матричный участок может содержать любую последовательность при условии, что он не комплементарен 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО. Кроме того, матричный участок может содержать любую последовательность при условии, что он может действовать в качестве матрицы для удлинения фрагмента, высвободившегося из РТО.

Как описано выше для случаев, когда высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок РТО, захватывающий участок СТО может быть сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку. Для случаев, когда высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок и 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка, захватывающий участок СТО может быть сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка. Для случаев, когда высвобождается фрагмент, содержащий часть 5'-концевого тегирующего участка РТО, захватывающий участок СТО может быть сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную части 5'-концевого тегирующего участка.

Кроме того, возможно конструирование захватывающего участка СТО с предполагаемыми сайтами расщепления РТО. Например, если захватывающий участок СТО сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку, тогда либо фрагмент, содержащий часть 5'-концевого тегирующего участка, либо фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок, мог бы гибридизоваться с захватывающим участком и затем удлиняться. Когда фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующего участок и 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка высвобождается, он может гибридизоваться с захватывающим участком СТО, сконструированным так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку, и затем успешно удлиняться, несмотря на присутствие некомплементарных нуклеотидов на 3'-концевом участке фрагмента. Это возможно потому, что праймеры могут удлиняться в зависимости от реакционных условий, несмотря на то, что их 3'-конец содержит некоторое количество некомплементарных нуклеотидов (например, 1-3 некомплементарных нуклеотида).

Если высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок и 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка, то 5'-концевая часть захватывающего участка СТО (см. Фиг. 1) может быть сконструирована так, чтобы она содержала нуклеотидную последовательность, комплементарную расщепляемой 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, в результате чего преодолеваются проблемы, связанные с некомплементарными нуклеотидами.

В одном из воплощений нуклеотидная последовательность 5'-концевой части захватывающего участка СТО, комплементарная расщепляемой 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, может быть выбрана в зависимости от предполагаемых сайтов расщепления на 3'-концевом узнающем мишень участке РТО. Длина нуклеотидной последовательности 5'-концевой части захватывающего участка СТО, комплементарной расщепляемой 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, может составлять 1-10 нуклеотидов, 1-5 нуклеотидов или 1-3 нуклеотида.

На 3'-конце СТО могут содержаться дополнительные нуклеотиды, не вовлеченные в гибридизацию с фрагментом. Кроме того, захватывающий участок СТО может содержать нуклеотидную последовательность, комплементарную только части фрагмента (например, части фрагмента, содержащей его 3'-концевой участок), при условии, что она стабильно гибридизуется с этим фрагментом.

Использованный термин "захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка" охватывает в данном описании различные конструкции и составы захватывающего участка СТО, как обсуждалось выше.

СТО может быть сконструирован так, чтобы принимать шпилечную структуру.

Длина СТО может варьировать в широких пределах. Например, длина СТО составляет 7-1000 нуклеотидов, 7-500 нуклеотидов, 7-300 нуклеотидов, 7-100 нуклеотидов, 7-80 нуклеотидов, 7-60 нуклеотидов, 7-40 нуклеотидов, 15-1000 нуклеотидов, 15-500 нуклеотидов, 15-300 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 20-1000 нуклеотидов, 20-500 нуклеотидов, 20-300 нуклеотидов, 20-100 нуклеотидов, 20-80 нуклеотидов, 20-60 нуклеотидов, 20-40 нуклеотидов, 30-1000 нуклеотидов, 30-500 нуклеотидов, 30-300 нуклеотидов, 30-100 нуклеотидов, 30-80 нуклеотидов, 30-60 нуклеотидов или 30-40 нуклеотидов. Захватывающий участок СТО может иметь любую длину при условии, что он специфически гибридизуется с фрагментом, высвободившимся из РТО. Например, длина захватывающего участка СТО составляет 5-100 нуклеотидов, 5-60 нуклеотидов, 5-40 нуклеотидов, 5-30 нуклеотидов, 5-20 нуклеотидов, 10-100 нуклеотидов, 10-60 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 10-20 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов или 15-20 нуклеотидов. Матричный участок СТО может иметь любую длину при условии, что он может действовать в качестве матрицы при удлинении фрагмента, высвободившегося из РТО. Например, длина матричного участка СТО составляет 2-900 нуклеотидов, 2-400 нуклеотидов, 2-300 нуклеотидов, 2-100 нуклеотидов, 2-80 нуклеотидов, 2-60 нуклеотидов, 2-40 нуклеотидов, 2-20 нуклеотидов, 5-900 нуклеотидов, 5-400 нуклеотидов, 5-300 нуклеотидов, 5-100 нуклеотидов, 5-80 нуклеотидов, 5-60 нуклеотидов, 5-40 нуклеотидов, 5-30 нуклеотидов, 10-900 нуклеотидов, 10-400 нуклеотидов, 10-300 нуклеотидов, 15-900 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов или 15-20 нуклеотидов.

На 3'-конце СТО может находиться группа 3'-ОН. В связи с этим 3'-конец СТО блокируют, чтобы препятствовать его удлинению. Препятствующее удлинению блокирование СТО может быть достигнуто традиционными методами. Например, блокирование можно осуществить путем добавления химической группировки, такой как биотин, метки, фосфатная группа, алкильная группа, ненуклеотидный линкер, фосфотиоат или алкандиол, к 3'-гидроксильной группе последнего нуклеотида СТО. Альтернативно, блокирование может быть выполнено посредством удаления 3'-гидроксильной группы последнего нуклеотида или путем использования нуклеотида, лишенного 3'-гидроксильной группы, такого как дидезоксинуклеотид.

Фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с СТО, в результате чего получается структура, подходящая для удлинения фрагмента. Несмотря на то, что нерасщепленный РТО также гибридизуется с захватывающим участком СТО через свой 5'-концевой тегирующий участок, его 3'-концевой узнающий мишень участок не гибридизуется с СТО, что препятствует образованию удлиненного дуплекса.

Гибридизация на стадии (с) может быть описана более подробно со ссылкой на описания, приведенные на стадии (а).

Стадия (d). Удлинение фрагмента

Реакцию удлинения проводят, используя продукт со стадии (с) и матричную полимеразу нуклеиновых кислот. Фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, образуя тем самым удлиненный дуплекс. В отличие от этого, нерасщепленный РТО, гибридизованный с захватывающим участком СТО, не удлиняется, в результате чего удлиненного дуплекса не образуется.

Использованный в данном описании термин "удлиненная цепь" в отношении фрагмента обозначает последовательность, состоящую из фрагмента и удлиняющей его последовательности. Использованный в данном описании термин "удлиненный дуплекс" обозначает дуплекс, образованный путем реакции удлинения, в которой фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с использованием матричного участка СТО в качестве матрицы и матричной полимеразы нуклеиновых кислот.

Матричная полимераза нуклеиновых кислот, используемая на стадии (d), может включать любую полимеразу нуклеиновых кислот, например кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I из Е. coli, термостабильную ДНК-полимеразу и ДНК-полимеразу бактериофага Т7. Конкретно, полимераза представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, которая может быть получена из ряда бактериальных видов, включая Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus (Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus и Aquifex aeolieus. Более конкретно, матричная полимераза нуклеиновых кислот представляет собой Taq полимеразу.

Согласно одному из воплощений фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, используемый на стадии (b), идентичен матричной полимеразе нуклеиновых кислот, используемой на стадии (d). Конкретно, фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, используемый на стадии (b), матричная полимераза нуклеиновых кислот, используемая для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера, и матричная полимераза нуклеиновых кислот, используемая на стадии (d), идентичны друг другу.

Стадия (е). Анализ плавления или гибридизации с НО

После осуществления реакции удлинения проводят анализ плавления или анализ гибридизации с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО) для продукта со стадии (d) в диапазоне температур для измерения того, генерируется ли сигнал, указывающий на присутствие гибрида между СТО и НО, или нет.

Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО. Если в образце нуклеиновой кислоты присутствует нуклеиновокислотная последовательность-мишень, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала.

Стадию (е) проводят, используя НО.

НО содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО. Если удлиненный дуплекс не образуется, и потому СТО находится в составе одиночной цепи, то НО гибридизуется с СТО с образованием гибрида. Образование и/или плавление гибрида осуществляется в диапазоне температур во время анализа плавления или гибридизации с получением сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО. Если удлиненный дуплекс образуется, и потому СТО находится в составе двойной цепи, то присутствие удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение какого-либо сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО, во время анализа плавления или гибридизации.

Длину НО можно варьировать в широких пределах. Например, длина НО составляет 5-100 нуклеотидов, 5-80 нуклеотидов, 5-60 нуклеотидов, 5-40 нуклеотидов, 5-20 нуклеотидов, 5-10 нуклеотидов, 10-100 нуклеотидов, 10-80 нуклеотидов, 10-60 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 10-20 нуклеотидов, 15-100 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов, 15-20 нуклеотидов, 20-100 нуклеотидов, 20-80 нуклеотидов, 20-60 нуклеотидов, 20-40 нуклеотидов или 20-30 нуклеотидов.

Согласно настоящему изобретению удлиненный дуплекс СТО/удлиненная цепь может представлять собой более стабильный дуплекс, чем гибрид СТО/НО. В этом случае величина Т_пл для НО может быть ниже таковой для СТО. Согласно одному из воплощений величина Т_пл для гибрида СТО/НО ниже по меньшей мере на 10°С, 20°С, 30°С или 40°С, чем таковая для удлиненного дуплекса СТО/удлиненная цепь.

В одном из воплощений данного изобретения НО блокирован по своему 3'-концу, чтобы препятствовать его удлинению.

Препятствовать образованию гибрида между СТО и НО посредством удлиненного дуплекса можно различными способами в зависимости от момента осуществления возможного контакта между СТО и НО.

Например, когда СТО и НО впервые приводят в контакт друг с другом на стадии (е) (например, при проведении стадий (a)-(d) и (e)-(f) в отдельных реакционных сосудах), настоящее изобретение может быть осуществлено так, как показано на Фиг. 2. НО не приводят в контакт с СТО до удлинения фрагмента РТО, но он участвует в гибридизации с продуктом реакции удлинения. На стадии анализа плавления образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида СТО/НО вследствие ингибирования гибридизации НО с СТО.

Когда СТО и НО приводят в контакт друг с другом на стадии (d) (например, при проведении стадий (a)-(f) в одном реакционном сосуде), настоящее изобретение может быть осуществлено так, как показано на Фиг. 3. НО может гибридизоваться с СТО до удлинения и участвовать в реакции удлинения. Если НО гибридизуется с СТО до удлинения фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО. В частности, если НО расщепляется во время реакции удлинения, то образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида СТО/НО на стадии анализа плавления ввиду расходования НО в результате расщепления. Если НО гибридизуется с СТО на стадии (d), то образование удлиненного дуплекса может дать возможность для высвобождения (вытеснения) НО из комплекса с СТО (замещение цепи НО). В таком случае вытесненный НО не может образовать гибрида с СТО в анализе плавления или гибридизации ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО.

Согласно одному из воплощений расщепление и/или замещение цепи НО в результате удлинения фрагмента РТО зависит от типов матричной полимеразы нуклеиновых кислот или реакционных условий.

Даже если у СТО и НО есть шанс контактирования друг с другом на стадии (d), некоторые из НО могут вообще не гибридизоваться с СТО до удлинения. В этом случае НО не могут образовать гибрида с СТО на стадии (е) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО.

Согласно одному из воплощений при корректировке реакционных условий (например, температуры реакции и величины Т_пл для НО и фрагмента РТО) на стадии (d), НО может не гибридизоваться с СТО до удлинения и не участвовать в реакции удлинения.

Безотносительно стадии, на которой НО впервые приводят в контакт с СТО, образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени посредством следующих способов (1) ингибирования гибридизации НО с СТО и/или (2) расходования НО в результате расщепления.

В отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени удлиненный дуплекс не образуется, и поэтому образуется гибрид между СТО и НО.

Согласно одному из воплощений стадию (d) проводят в присутствии НО, и НО гибридизуются с СТО и/или не гибридизуются с СТО. Согласно одному из воплощений стадию (d) проводят в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения данного фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО, тем самым образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО на стадии (е) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО и/или расходования НО в результате расщепления.

Согласно одному из воплощений осуществление гибридизации НО с СТО может преобладать или не преобладать по сравнению со случаем, когда гибридизация не осуществляется, в зависимости от условий реакции удлинения фрагмента, гибридизованного с СТО.

Образование мишень-зависимого удлиненного дуплекса препятствует гибридизации НО с СТО даже тогда, когда НО содержит последовательность, комплементарную СТО. Даже тогда, когда НО гибридизуется с СТО до образования удлиненного дуплекса, он отделяется от СТО, высвобождается или удаляется из комплекса с СТО (например, посредством расщепления или вытеснения НО).

НО содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО. Нуклеотидная последовательность НО может быть сконструирована так, чтобы она была комплементарна участку СТО, отличному от участка, подлежащего гибридизации с фрагментом РТО. В этом случае НО не конкурирует с фрагментом РТО (или нерасщепленным РТО) за связывание с СТО.

Согласно одному из воплощений НО содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную матричному участку СТО.

В конкретном воплощении НО может быть сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом (или нерасщепленным РТО) в плане гибридизации с СТО (см. Фиг. 6 и 7). В конкретном воплощении такой конкурирующий НО не расщепляется при участии фрагмента или продукта его удлинения либо не вытесняется во время реакции удлинения. Например, НО может быть сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с захватывающим участком СТО.

Термин "нуклеотидная последовательность, способная к гибридизации с захватывающим участком СТО", использованный в связи с последовательностью НО, относится к части НО, предусмотренной для образования двойной цепи с захватывающим участком СТО, когда НО гибридизуется с СТО. Нуклеотидная последовательность НО, способная к гибридизации с захватывающим участком СТО, может представлять собой всю последовательность или часть последовательности НО. Нуклеотидная последовательность, способная к гибридизации с захватывающим участком СТО, соответствует всей последовательности или части последовательности (например, 10%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90% или 95%) НО.

Если НО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с захватывающим участком СТО, то он может содержать последовательность, перекрывающуюся с фрагментом РТО и/или 5'-концевым тегирующим участком нерасщепленного РТО. В этом случае (1) НО и фрагмент РТО или (2) НО и 5'-концевой тегирующий участок нерасщепленного РТО конкурируют в плане гибридизации с СТО.

Использованный в данном описании термин "конкурирующий НО" относится к НО, содержащему последовательность, конкурирующую с фрагментом РТО или нерасщепленным РТО (например, 5'-концевым тегирующим участком нерасщепленного РТО) в плане гибридизации с СТО. Согласно одному из воплощений конкурирующий НО является менее конкурирующим, чем фрагмент РТО (фактически, удлиненная цепь фрагмента РТО), и более конкурирующим, чем 5'-концевой тегирующий участок нерасщепленного РТО в плане гибридизации с СТО.

Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует и конкурирующий НО присутствует на стадии (с) и/или (d), конкуренция между конкурирующим НО и фрагментом РТО при гибридизации с СТО может стать проблематичной. В таком случае предпочтительно, чтобы фрагмент РТО, а не конкурирующий НО, гибридизовался с СТО и удлинялся с получением удлиненной цепи. То, что фрагмент РТО, гибридизованный с СТО, удлиняется, является более выгодным, чем гибридизация конкурирующего НО с СТО.

В конкретном воплощении стадию (с) осуществляют в условиях, более благоприятных для гибридизации фрагмента РТО с СТО, чем для гибридизации НО с СТО. Такие благоприятные условия могут быть достигнуты различными способами. Например, для создания благоприятных условий 3'-конец НО может быть блокирован. НО с блокированным 3'-концом гибридизуется с СТО, но не удлиняется, что увеличивает вероятность диссоциации из комплекса с СТО ввиду конкуренции с фрагментом РТО. Фрагмент РТО, гибридизованный с СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, которая может поддерживаться более стабильно. Таким образом, удлиненный дуплекс значительно преобладает в продукте после стадий (с) и (d) по сравнению с гибридом СТО/НО. В связи с этим относительное число (или количество) гибрида СТО/НО уменьшается из-за наличия удлиненного дуплекса в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени по сравнению со случаем отсутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует, то расщепления РТО не происходит, при этом РТО остается нерасщепленным. Если присутствуют и нерасщепленный РТО, и конкурирующий НО, то при гибридизации с СТО 5'-концевой тегирующий участок нерасщепленного РТО и конкурирующий НО конкурируют, поскольку они содержат перекрывающуюся друг с другом последовательность. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует, то при гибридизации с СТО конкурирующий НО должен иметь больше преимуществ, чем 5'-концевой тегирующий участок нерасщепленного РТО, поскольку принцип, лежащий в основе настоящего изобретения, требует гибридизации НО с СТО.

Если величина Т_пл для фрагмента РТО выше таковой для конкурирующего НО, то при гибридизации с СТО РТО является более предпочтительным, чем конкурирующий НО. С учетом конкуренции между 5'-концевым тегирующим участком нерасщепленного РТО и конкурирующим НО более высокая величина Т_пл для фрагмента РТО не всегда является предпочтительной. Даже если величина Т_пл для фрагмента РТО ниже таковой для конкурирующего НО, он может быть более предпочтительным, чем конкурирующий НО при гибридизации с СТО ввиду удлинения фрагмента РТО, гибридизованного с СТО. В таком случае при гибридизации с СТО конкурирующий НО может быть более предпочтительным, чем 5'-концевой тегирующий участок нерасщепленного РТО.

Подходящие конкурирующие НО должны быть сконструированы с учетом описанных выше факторов или проблем. Согласно одному из воплощений разница в величинах Т_пл для гибрида СТО/НО и гибрида (фрагмент РТО)/СТО находится в пределах ±40°С, ±30°С, ±20°С, ±15°С, ±10°С, ±5°С или ±3°С.

Согласно одному из воплощений разница в величинах Т_пл для гибрида СТО/НО и гибрида (5'-концевой тегирующий участок нерасщепленного РТО)/СТО находится в пределах ±40°С, ±30°С, ±20°С, ±15°С, ±10°С, ±5°С или ±3°С.

Согласно одному из воплощений, если НО и нерасщепленный РТО могут гибридизоваться с СТО конкурентным образом, то величина Т_пл для СТО/НО может превышать (например, по меньшей мере на 2°С, 4°С, 6°С, 8°С, 10°С, 15°С или 20°С) таковую для СТО/(нерасщепленный РТО).

Величину Т_пл для гибрида (нерасщепленный РТО)/СТО определяют, исходя из участка последовательности РТО, подлежащего гибридизации с СТО. Например, если 5'-концевой тегирующий участок нерасщепленного РТО подлежит гибридизации с СТО, то величина Т_пл для 5'-концевого тегирующего участка является определяющим фактором для величины Т_пл в случае гибрида (нерасщепленный РТО)/СТО.

Использованный в данном описании термин "величина Т_пл для нерасщепленного РТО" означает величину Т_пл, определенную по участку последовательности нерасщепленного РТО, подлежащего гибридизации с СТО, если не указано иное.

Согласно одному из воплощений удлиненная цепь фрагмента имеет более высокую величину Т_пл, чем НО, а НО имеет более высокую величину Т_пл, чем 5'-концевой тегирующий участок РТО.

Согласно одному из воплощений с учетом гибридизации с СТО величина Т_пл для удлиненной цепи фрагмента РТО превышает таковую для НО, а величина Т_пл для НО превышает таковую для нерасщепленного РТО.

Согласно одному из воплощений, НО и фрагмент РТО конструируют такими, чтобы они не гибридизовались с СТО только через участок, отличающийся от перекрывающегося участка. В этом случае можно препятствовать одновременной гибридизации НО и фрагмента РТО с СТО.

Величина Т_пл определяется длиной и содержанием G/C-пap в гибридизованных нуклеотидах. Согласно одному из воплощений величину Т_пл можно рассчитать традиционными методами, такими как правило Уоллеса (R.B. Wallace et al., Nucleic Acids Research, 6: 3543-3547 (1979)) и метод ближайших соседей (SantaLucia J. Jr., et al., Biochemistry, 35: 3555-3562 (1996); Sugimoto N., et al., Nucleic Acids Res., 24: 4501-4505 (1996)).

Согласно одному из воплощений величина Т_пл относится к фактическим величинам Т_пл в реакционных условиях, реально используемых на практике.

В PCE-NH-анализе, включающем в себя анализ плавления или гибридизации, получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО, можно обеспечить посредством различных систем меток: (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки.

Согласно одному из воплощений при условии, что сигнал в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется, в настоящем изобретении могут быть применены различные типы и локализация меток. В принципе, согласно настоящему изобретению необходимо обеспечить получение сигнала, подходящего в анализе плавления или гибридизации. В этом отношении, приведенное выше выражение имеет, например, следующее смысловое значение: при условии, что сигнал, поступающий в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга, в настоящем изобретении могут быть применены различные типы и локализация меток. Использованное в данном описании выражение "сигнал в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется", включает, например, следующее смысловое значение: "сигнал, поступающий в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга". Метки, используемые для передачи сигнала, описанные ниже, должны обладать следующим свойством: сигнал, поступающий в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.

Согласно одному из воплощений данное различие в сигналах обуславливается таким явлением, как генерирование сигнала, и отличительным признаком сигнала.

Согласно одному из воплощений данное различие в сигналах обуславливается таким явлением как изменение интенсивности (усиление сигнала и ослабление сигнала).

Метки, полезные для использования в настоящем изобретении, включают большое количество меток, известных специалисту в данной области техники, в том числе, например одиночную метку, систему двух взаимодействующих меток и интеркалирующую метку.

Метка, использованная в настоящем изобретении, включает систему двух взаимодействующих меток (см. Фиг. 2-4 и 6-7).

В качестве репрезентативной системы взаимодействующих меток система меток при резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET) включает флуоресцентную репортерную молекулу (донорную молекулу) и молекулу-гаситель (акцепторную молекулу). При FRET донор энергии является флуоресцентным, а акцептор энергии может быть флуоресцентным или не быть флуоресцентным. Для другой формы систем взаимодействующих меток донор энергии не является флуоресцентным, например, является хромофором, а акцептор энергии является флуоресцентным. Для еще одной формы систем взаимодействующих меток донор энергии является люминесцентным, например биолюминесцентным, хемилюминесцентным, электрохемилюминесцентным, а акцептор является флуоресцентным. Донорная молекула и акцепторная молекула могут быть описаны в настоящем изобретения как репортерная молекула и молекула-гаситель, соответственно. Система двух взаимодействующих меток включает пару меток, обеспечивающих получение детектируемого сигнала в результате опосредованного контактом гашения (Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30), №21, e122 и Johansson et al., J. Am. Chem. Soc, 2002 (124), pp. 6950-6956). В настоящем изобретении система взаимодействующих меток включает любые или все случаи, приводящие к изменениям сигнала в результате взаимодействия по меньшей мере двух молекул (например, молекул красителей).

Согласно одному из воплощений данного изобретения сигнал, указывающий на присутствие или отсутствие гибрида СТО-НО, генерируется системами взаимодействующих меток, в частности, системой FRET-меток (т.е. системой двух взаимодействующих меток).

Согласно одному из воплощений НО или СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.

Согласно одному из воплощений НО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель.

Если НО находится в одноцепочечном состоянии, то репортерная молекула и молекула-гаситель на НО конформационно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует и образуется гибрид СТО/НО, то репортерная молекула и молекула-гаситель на НО конформационно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, и это приводит к изменению сигнала с получением сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО во время анализа плавления или гибридизации (см. Фиг. 2 и 3). Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует и гибрид СТО/НО не образуется, то изменения сигнала не происходит, что не обеспечивает получение какого-либо сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО во время анализа плавления или гибридизации (см. Фиг. 2 и 3).

Использованное в данном описании выражение "репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно расположены в непосредственной близости" означает, что репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно приближены друг к другу благодаря наличию конформационной структуры у НО или СТО, такой как случайная спираль и шпилечная структура.

Использованное в данном описании выражение "репортерная молекула и молекула-гаситель конформационно разделены" означает, что репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно разделены в результате изменения конформационной структуры НО или СТО после образования двойной цепи.

Согласно одному из воплощений матричный участок СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а НО содержит последовательность, комплементарную связанному с меткой участку СТО. Если СТО находится в одноцепочечной форме, то репортерная молекула и молекула-гаситель на СТО конформационно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует и образуется гибрид СТО/НО, то репортерная молекула и молекула-гаситель на СТО конформационно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, вызывая тем самым изменение сигнала с получением сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО во время анализа плавления или гибридизации. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует и гибрид СТО/НО не образуется, то изменения сигнала не происходит, что не обеспечивает получения какого-либо сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО во время анализа плавления или гибридизации.

В том случае, когда в настоящем изобретении применяют СТО с системой двух взаимодействующих меток, удлиненный дуплекс СТО/удлиненная цепь может обеспечивать получение сигналов в анализе плавления. Поскольку величина Т_пл для удлиненного дуплекса отличается от таковой для гибрида СТО/НО, то детекция сигнала от гибрида СТО/НО и сигнала от удлиненного дуплекса может осуществляться по-разному. Следует понимать, что настоящее изобретение, в котором применяют сигналы от гибрида СТО/НО, совершенно отличается от таких, в которых применяют сигналы от удлиненных дуплексов.

Согласно одному из воплощений репортерная молекула и молекула-гаситель могут быть расположены в любом месте на НО и СТО, при условии, что гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществляется в зависимости от плавления гибрида СТО/НО или гибридизации СТО с НО.

Согласно одному из воплощений одна из молекул на НО, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 5'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 5'-конца, а другая расположена так, чтобы гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации НО. Согласно одному из воплощений одна из молекул на НО, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 3'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 3'-конца, а другая расположена так, чтобы гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации НО. В конкретном воплощении и репортерная молекула, и молекула-гаситель каждая расположена на обоих концах НО.

Согласно одному из воплощений одна из молекул на СТО, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 5'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 5'-конца, а другая расположена так, чтобы гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации СТО. Согласно одному из воплощений одна из молекул на СТО, репортерная молекула или молекула-гаситель, расположена на его 3'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 3'-конца, а другая расположена так, чтобы гашение и негашение сигнала от репортерной молекулы осуществлялось в зависимости от конформации СТО.

Репортерная молекула и молекула-гаситель, полезные для использования в настоящем изобретении, могут включать флуоресцентную метку, описанную в данной заявке.

Подходящие пары репортер-гаситель описаны в ряде публикаций, которые приведены ниже: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2^nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6^th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); патенты США №№3996345 и 4351760.

Стоит отметить, что в настоящем изобретении может быть использована нефлуоресцентная "черная" молекула-гаситель (или темная молекула-гаситель), способная гасить флуоресценцию в широком диапазоне длин волн или на конкретной длине волны. Примерами таких гасителей являются BHQ и DABCYL. В системе генерирования сигналов, содержащей репортер и гаситель, термин "репортер" охватывает донора FRET, а термин "гаситель" охватывает другого партнера (акцептора) FRET. Например, в качестве репортера используют краситель на основе флуоресцеина, а в качестве гасителя краситель на основе родамина.

Согласно одному из воплощений, когда молекула-гаситель представляет собой флуоресцентную молекулу, детекцию сигнала осуществляют путем измерения изменения сигнала от молекулы-гасителя или измерения изменений сигналов как от молекулы-гасителя, так и от репортерной молекулы.

В настоящем изобретении может применяться внутрицепочечная система двух взаимодействующих меток (см. Фиг. 4).

Согласно одному из воплощений НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.

Во внутрицепочечной системе двух взаимодействующих меток используется взаимодействие между меткой, соединенной с СТО (например, донорной молекулой), и меткой на НО (например, акцепторной молекулой).

НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток. Гибридизация СТО с НО вызывает изменение сигнала от внутрицепочечной системы двух взаимодействующих меток, обеспечивая получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО (см. Фиг. 4). В конкретном воплощении метка присоединена к матричному участку СТО.

В конкретном воплощении репортерная молекула и молекула-гаситель обе присоединены к 3'-концу НО и 5'-концу СТО.

В конкретном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют, используя один дополнительный НО, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, и два НО гибридизуются с СТО в непосредственной близости друг к другу; при этом один из двух НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а другой из этих двух НО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и двумя НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и этими двумя НО не образуется.

Если два НО не гибридизуются с СТО, то они располагаются в отдалении друг от друга, при этом отодвигая репортерную молекулу от молекулы-гасителя, тем самым никакого гашения сигнала от репортерной молекулы не происходит. Если два НО гибридизуются с СТО в непосредственной близости друг к другу, то гибридизация позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, тем самым вызывая изменение сигнала, указывающее на присутствие гибрида СТО/НО, во время анализа плавления или гибридизации. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует и гибрид СТО/НО не образуется, то изменение сигнала не обеспечивает получение какого-либо сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО во время анализа плавления или гибридизации.

Если используется одиночная метка, то она может быть присоединена или к НО, или СТО (см. Фиг. 5).

Согласно одному из воплощений НО или СТО содержит одиночную метку; при этом одиночная метка располагается в таком месте, что сигнал от одиночной метки в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от одиночной метки в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.

Одиночная метка должна обладать способностью обеспечивать получение разных сигналов в зависимости от ее присутствия на двухцепочечной или одноцепочечной структуре. Одиночная метка представляет собой флуоресцентную метку, люминесцентную метку, хемилюминесцентную метку, электрохимическую метку и металлическую метку. Предпочтительно, чтобы одиночная метка представляла собой флуоресцентную метку.

В конкретном воплощении одиночная метка представляет собой флуоресцентную метку, способную генерировать сигналы разной интенсивности в зависимости от того, находятся ли нуклеиновокислотные последовательности, имеющие эту одиночную метку, в одноцепочечной или двухцепочечной структуре.

На Фиг. 5 проиллюстрировано настоящее изобретение с использованием одиночной метки. На Фиг. 5 НО содержит одиночную метку. Если в анализе плавления НО гибридизуется с СТО, то сигнал от одиночной метки на НО изменяется. И наоборот, если НО не гибридизуется с СТО, то сигнал от одиночной метки на НО не изменяется.

В одном из воплощений, где СТО имеет одиночную метку, НО содержит последовательность, комплементарную участку СТО с присоединенной меткой. Если во время анализа плавления НО гибридизуется с СТО, то сигнал от одиночной метки на СТО изменяется. И наоборот, если НО не гибридизуется с СТО, то сигнал от одиночной метки на СТО не изменяется. В этом случае удлиненный дуплекс СТО/удлиненная цепь может обеспечивать получение сигналов в анализе плавления. Поскольку величина Т_пл для удлиненного дуплекса отличается от таковой для гибрида СТО/НО, то детекция сигнала от гибрида СТО/НО и сигнала от удлиненного дуплекса может осуществляться по-разному. Следует понимать, что настоящее изобретение, в котором применяют сигналы от гибрида СТО/НО, совершенно отличается от таких, в которых применяют сигналы от удлиненных дуплексов.

В одном из воплощений матричный участок СТО содержит одиночную метку, а НО содержит последовательность, комплементарную участку СТО с присоединенной меткой.

Типы и места расположения флуоресцентной метки описаны в патентах США №№7537886 и 7348141.

Флуоресцентная метка для использования в настоящем изобретении может включать любые молекулы, известные в данной области техники. Примерами их являются: Су2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), кальцеин (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), родамин 110 (520), Oregon Green™ (500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (родаминовый зеленый) (527), родамин 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), фикоэритрин R&B (575), родамин-фаллоидин (575), Calcium Orange™ (576), пиронин Y (580), родамин В (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), техасский красный (615), нильский красный (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-фикоцианин (642), С-фикоцианин (648), TO-PRO™-3 (660), ТОТО3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), тиадикарбоцианин (671), Cy5.5 (694), HEX (556), ТЕТ (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), флуоресцеин (520), флуоресцеин-С3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) и Quasar 705 (610). Числа в скобках представляют собой длину волны, соответствующую максимуму излучения, в нанометрах.

Например, флуоресцентная метка включает JOE, FAM, TAMRA, ROX и метку на основе флуоресцеина.

Метка может быть присоединена традиционными методами или к НО, или к СТО. Например, метку присоединяют к НО или СТО через спейсер, содержащий атомы углерода (например, 3-углеродный спейсер, 6-углеродный спейсер или 12-углеродный спейсер).

В настоящем изобретении для получения сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО, можно использовать интеркалирующую метку. Примеры интеркалирующих красителей для применения в данном изобретении включают SYBR™ Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO™43, SYTO™44, SYTO™45, SYTOX™Blue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PRO™1, TO-PRO™1, SYTO™11, SYTO™13, SYTO™15, SYTO™16, SYTO™20, SYTO™23, TOTO™-3, YOYO™3, GelStar™ и триазоловый оранжевый. Эти интеркалирующие красители специфически интеркалируют в двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, генерируя сигналы.

В том случае, когда в настоящем изобретении применяют интеркалирующие красители, получение сигналов в анализе плавления или гибридизации может обеспечивать удлиненный дуплекс СТО/удлиненная цепь. Поскольку величина Т_пл для удлиненного дуплекса отличается от таковой для гибрида СТО/НО, то детекция сигнала от гибрида СТО/НО и сигнала от удлиненного дуплекса может осуществляться по-разному. Следует понимать, что настоящее изобретение, в котором применяют сигналы от гибрида СТО/НО, совершенно отличается от таких, в которых применяют сигналы от удлиненных дуплексов

НО, использованный в настоящем изобретении, может представлять собой любой зонд при условии, что он способен генерировать сигналы в результате гибридизации во время анализа плавления или гибридизации, включая Molecular beacon™ (US 5925517), Hybeacons™ (D.J. French et al., Molecular and Cellular Probes (2001), 13, 363-374 и US 7348141), самогасящийся зонд с двумя метками (US 5876930), LUX™ (I.A. Nazarenko et al., Nucleic Acids Res., 2002, 30: 2089-2095 и патент США №7537886) и гибридизационный зонд (Bernard PS et al., Clin. Chem., 2000, 46, 147-148 и Deepti Parashar et al., Indian J. Med. Res., 124, обзорная статья, октябрь 2006, 385-398).

Анализ плавления или гибридизации на стадии (е) может быть осуществлен различными методами, известными специалисту в данной области техники.

Использованный в данном описании термин "анализ плавления" означает метод, с использованием которого сигнал, указывающий на присутствие гибрида СТО/НО, получают в результате плавления дуплекса, включая метод измерения сигналов при двух различных температурах, анализ кривой плавления, анализ картины плавления и анализ пиков плавления.

Использованный в данном описании термин "анализ гибридизации" (или "анализ скорости отжига") означает метод, с использованием которого сигнал от мишени, указывающий на присутствие гибрида СТО/НО, получают в результате образования дуплекса, включая метод измерения сигналов при двух различных температурах, анализ кривой гибридизации, анализ картины гибридизации и анализ пиков гибридизации.

В общем случае, если сигнал от мишени может генерироваться в анализе плавления, он также может быть получен в анализе гибридизации, и наоборот. Если в данном описании не указано иное, то подразумевается, что термин "анализ плавления" охватывает анализ гибридизации.

Кривая плавления или кривая гибридизации может быть получена с использованием традиционных технологий, например, как описано в патентах США №№6174670 и 5789167, Drobyshev et al., Gene 188: 45 (1997); Kochinsky and Mirzabekov, Human Mutation, 19: 343 (2002); Livehits et al., J. Biomol. Structure Dynam., 11: 783 (1994) и Howell et al., Nature Biotechnology, 17: 87 (1999). Например, кривая плавления или кривая гибридизации может представлять собой графическое изображение или отображение изменения выходного сигнала в зависимости от изменения такого параметра, как жесткость условий гибридизации. Можно построить график зависимости выходного сигнала непосредственно от параметра гибридизации. В типичном случае кривая плавления или кривая гибридизации будут характеризоваться выходным сигналом, например флуоресценцией, который указывает на относительное количество дуплексной структуры (то есть на степень гибридизации), отложенным по оси Y, и параметром гибридизации, отложенным по оси X.

Стадия (f). Детекция сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО

В анализе плавления или гибридизации детектируют сигнал, указывающий на присутствие гибрида между СТО и НО. Присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, а отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

В конкретном воплощении анализ плавления проводят по меньшей мере дважды с целью количественного определения. Величина площади или высоты пиков плавления, полученная в анализе плавления, изменяется под влиянием гибрида СТО/НО, обеспечивая получение информации относительно изначального количества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней. Для определения количества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней измеряют число циклов в анализе плавления, при котором достигается пороговая величина для площади или высоты пиков плавления.

Например, настоящее изобретение может быть осуществлено путем (1) повторения стадий (a)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами, (2) проведения анализа плавления гибрида СТО/НО и (3) повторения стадий (1) и (2) по меньшей мере дважды. Данные могут быть получены по меньшей мере по двум точкам в предварительно заданном интервале повторяемости. Затем строят график зависимости данных анализа плавления (например, площади или высоты пиков плавления) от каждого числа циклов (или суммарного числа циклов) в анализе плавления и проводят сравнение, определяя тем самым количество нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней. Число повторов стадий (а)-(d) возможно можно корректировать.

Альтернативно, строят график зависимости данных анализа плавления (например, площади или высоты пиков плавления) от каждого числа циклов (или суммарного числа циклов) в анализе плавления и проводят сравнение, определяя тем самым количество нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно одному из воплощений сигнал в случае присутствия последовательностей-мишеней отличается от сигнала в случае отсутствия последовательностей-мишеней. Если детекцию последовательности-мишени осуществляют посредством анализа плавления или анализа гибридизации, то такое различие в сигналах включает разницу в значениях высоты пиков плавления или площади под пиками плавления. В одном из воплощений такое различие в сигналах составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 90%.

Согласно одному из воплощений способ осуществляют с использованием контрольной группы, не имеющей никакой нуклеиновокислотной последовательности-мишени или имеющей предварительно заданное количество нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Настоящее изобретение осуществляют для образца представляющей интерес нуклеиновой кислоты совместно с контрольной группой и результаты сравнивают, обеспечивая более точное определение присутствия или количества нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение может быть осуществлено или в жидкой фазе, или на твердой фазе.

Детекция мишени на твердой фазе

Согласно одному из воплощений настоящее изобретение осуществляют на твердой фазе, и один из СТО и НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала осуществляют на твердой подложке.

Иммобилизацию СТО или НО можно выполнить двумя способами.

Согласно первому способу, на стадиях (c)-(f) используют либо СТО, либо НО, уже иммобилизованные на твердой подложке. Согласно второму способу, на стадиях (с), (d) или (е) либо СТО, либо НО используют в неиммобилизованной форме, а затем иммобилизуют на твердой подложке.

Согласно одному из воплощений один из СТО и НО будет иммобилизован на твердой подложке между стадией (d) и стадией (е) в PCE-NH-анализе, включающем в себя анализ плавления или гибридизации.

Система меток для реакции на твердой фазе может быть такой же, как и в случае систем меток, описанных выше. Кроме того, одиночная метка для реакции на твердой фазе является более универсальной, чем описанные выше. В случае проведения реакции на твердой фазе нет необходимости в том, чтобы одиночная метка обладала способностью генерировать сигналы разной интенсивности в зависимости от ее присутствия в составе нуклеиновых кислот, имеющих одноцепочечную или двухцепочечную структуру.

Одиночная метка представляет собой, но не ограничивается этим, химическую метку (например, биотин), ферментативную метку (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу, β-галактозидазу и β-глюкозидазу), радиоизотопную метку (например, I¹²⁵ и С¹⁴), флуоресцентную метку, люминесцентную метку, хемилюминесцентную метку и металлическую метку (например, золото).

Для проведения реакции на твердой фазе иммобилизация СТО или НО может быть проведена непосредственно или опосредованно (главным образом опосредованно) через его 5'-конец или 3'-конец (главным образом 3'-конец) на поверхности твердой подложки. Кроме того, иммобилизацию СТО или НО на поверхности твердой подложки можно проводить ковалентным или нековалентным образом. В тех случаях, когда иммобилизованные СТО или НО иммобилизуют на поверхности твердой подложки опосредованно, используют подходящие линкеры. Линкеры, полезные в данном изобретении, могут включать любые линкеры, используемые для иммобилизации зондов на поверхности твердой подложки. Например, в качестве линкеров для иммобилизации служат алкильные или арильные соединения с аминной функциональной группой либо алкильные или арильные соединения с тиоловой функциональной группой. Помимо этого, поли(Т)-хвост или поли(А)-хвост могут служить в качестве линкеров и значительно уменьшать пространственные затруднения, являющиеся ингибирующим фактором для действия ферментов (например, для реакций ферментативного расщепления), что вносит вклад в повышение эффективности гибридизации. Поли(Т)-хвост или поли(А)-хвост в качестве линкеров не рассматривается как входящий в последовательность зондов.

Согласно одному из воплощений СТО или НО может быть иммобилизован на твердой подложке с использованием взаимодействия между партнерами по связыванию (например, пары биотин/стрептавидин). Например, СТО или НО с одним из партнеров по связыванию (биотином и стрептавидином) может быть иммобилизован на твердой подложке, поверхность которой модифицирована другим партнером по связыванию.

Согласно одному из воплощений СТО или НО может быть иммобилизован на твердой подложке с использованием нуклеотидной последовательности для иммобилизации. Например, твердую подложку, поверхность которой модифицирована нуклеотидной последовательностью для иммобилизации, можно использовать для иммобилизации СТО или НО с дополнительной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности для иммобилизации.

Согласно одному из воплощений твердая подложка, используемая в настоящем изобретении, представляет собой микрочип. Микрочип, обеспечивающий соблюдение условий реакции в данном изобретении, может включать любой из микрочипов, которые известны специалисту в данной области техники. Все процессы в настоящем изобретении, то есть гибридизацию с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями, расщепление, удлинение, плавление и детекцию флуоресценции осуществляют на микрочипе. Иммобилизованные на микрочипе СТО или НО служат в качестве гибридизуемых элементов чипа. Твердая подложка для изготовления микрочипа включает, но не ограничивается этим, металлы (например, золото, сплав золота и меди, алюминий), оксид металла, стекло, керамику, кварц, кремний, полупроводник, пластинку из Si/SiO₂, германий, арсенид галия, углерод, углеродную нанотрубку, полимеры (например, полистирол, полиэтилен, полипропилен и полиакриламид), сефарозу, агарозу и коллоиды. Твердая подложка может быть в форме индикаторной полоски, пластинки, частицы (например, гранулы), колонки с аффинным сорбентом и мембраны. Большинство используемых в данном изобретении иммобилизованных СТО или НО может быть иммобилизовано на доступном участке либо двух или более доступных участках на твердой подложке, которая может содержать 2-1000000 доступных участков. Чтобы получить микрочип или микрочипы для заданного применения, иммобилизованные СТО или НО могут быть изготовлены с использованием традиционных технологий изготовления, таких как фотолитография, технология струйной печати, механическое точечное нанесение пятен и их производные.

Согласно настоящему изобретению, осуществляемому на твердой фазе, можно проводить одновременную детекцию множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с использованием метки даже одного типа, поскольку метки на олигонуклеотидах физически отделены друг от друга. В этом отношении, количество подлежащих детекции нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней по настоящему изобретению на твердой фазе является неограниченным.

Используя для детекции конфокальные устройства, можно осуществить детекцию только сигнала на твердой подложке без влияния меток, суспендированных в жидкой фазе.

Согласно одному из воплощений данный способ осуществляют без применения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, и расщепление РТО на стадии (b) происходит без какого-либо участия располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида или его удлиненной цепи. Воплощение с использованием 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, далее будет описано более подробно.

Детекция мишени посредством PCE-NH-анализа, основанного на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом РТО, гибридизованный с нуклеиновой кислотой-мишенью, расщепляется ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;

(e) проведение анализа плавления или анализа гибридизации для продукта со стадии (d) в диапазоне температур с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала; при этом сигнал обеспечивается посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и

(f) детекцию сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Поскольку способ по настоящему изобретению, основанный на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, аналогичен таковому, описанному в качестве первого аспекта PCE-NH-анализа с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов, за исключением того, что располагающиеся "вверх по течению" олигонуклеотиды в этом случае не применяются, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

Интересно, что способ по настоящему изобретению, основанный на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, фактически обеспечивает получение сигналов от мишени в PCE-NH-анализе даже без использования располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов.

В способе по настоящему изобретению можно использовать традиционные ферменты, обладающие 5'-нуклеазной активностью, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида. Среди матричных полимераз, обладающих 5'-нуклеазной активностью, существуют различные ферменты, обладающие 5'-нуклеазной активностью, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, например Taq ДНК-полимераза.

С учетом амплификации нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней и эффективности расщепления РТО, PCE-NH-анализ по настоящему изобретению предпочтительно проводят с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов.

Набор для детекции мишени

В еще одном аспекте данного изобретения предложен набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), содержащий:

(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;

(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и

(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;

при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала; при этом набор дополнительно содержит (1) метку, соединенную с НО, (2) метку, соединенную с СТО, (3) метку, соединенную с НО, и метку, соединенную с СТО, или (4) интеркалирующую метку.

Поскольку набор по данному изобретению составлен для осуществления описанного выше способа детекции по настоящему изобретению, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

В одном из воплощений данного изобретения набор дополнительно содержит фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью. В одном из воплощений данного изобретения набор дополнительно содержит матричную полимеразу нуклеиновых кислот.

Другие воплощения наборов по настоящему изобретению могут быть описаны со ссылкой на наборы, применяемые в способе по настоящему изобретению, описанном выше.

Все наборы по настоящему изобретению, описанные выше, возможно могут содержать реагенты, необходимые для проведения амплификации мишени с использованием реакций ПЦР (например, ПЦР-реакций), такие как буферы, кофакторы ДНК-полимеразы и дезоксирибонуклеотид-5-трифосфаты. Возможно, что данные наборы также могут содержать молекулы различных полинуклеотидов, обратную транскриптазу, различные буферы и реагенты, и антитела, ингибирующие ДНК-полимеразную активность. Наборы также могут содержать реагенты, необходимые для проведения реакций положительного и отрицательного контроля. Оптимальные количества реагентов, которые будут использоваться в заданной реакции, могут быть легко определены специалистом на основе информации, содержащейся в настоящем описании. Эти наборы обычно устроены так, чтобы содержать описанные выше компоненты в разных упаковках или отделах.

II. Второй аспект способа детекции мишени в PCE-NH-анализе

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты на твердой фазе в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:

(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;

(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f); при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; и

(f) детекцию сигнала на твердой подложке с целью обнаружения гибрида между СТО и НО на твердой подложке; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Второй аспект данного изобретения, как и первый аспект данного изобретения, основан на подходе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО). Второй аспект данного изобретения характеризуется тем, что один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала можно осуществлять при предварительно заданной температуре.

Второй аспект данного изобретения можно рассматривать как измененную версию подхода с PCE-NH для эффективной реализации детекции мишени с использованием твердой подложки и одиночной метки, в котором генерирование сигнала от одиночной метки на твердой подложке происходит в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, а гашение или ослабление сигнала от одиночной метки на твердой подложке происходит в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени в результате применения комбинации двух олигонуклеотидов, СТО и НО. Для достижения этого, один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала от метки осуществляют при температуре, подходящей для гибридизации СТО с НО.

Как и первый аспект данного изобретения, второй аспект также применим для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени даже тогда, когда НО не расщепляется (т.е. гибридизация НО с СТО ингибируется в результате образования удлиненного дуплекса), а также тогда, когда НО расщепляется.

Второй аспект PCE-NH-анализа на твердой фазе далее будет описан более подробно.

Стадия (а). Гибридизация располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и РТО с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью

Стадия (а) может быть описана со ссылкой на описания, приведенные для стадии (а) первого аспекта PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Стадия (b). Высвобождение фрагмента в результате расщепления РТО

Стадия (b) может быть описана со ссылкой на описания, приведенные для стадии (b) первого аспекта PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Стадия (с). Гибридизация фрагмента, высвободившегося из РТО. с СТО

Стадия (с) может быть описана со ссылкой на описания, приведенные для стадии (с) первого аспекта PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Стадия (d). Удлинение фрагмента

Стадия (d) может быть описана со ссылкой на описания, приведенные для стадии (d) первого аспекта PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Стадия (е). Гибридизация удлиненного дуплекса с НО

После осуществления реакции удлинения продукт со стадии (d) гибридизуется с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО. Один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f).

Второй аспект настоящего изобретения характеризуется тем, что меченный одиночной меткой олигонуклеотид не иммобилизован на твердой подложке и обеспечивает получение сигналов на твердой подложке только тогда, когда он гибридизуется с иммобилизованным на твердой подложке олигонуклеотидом.

Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке. Согласно одному из воплощений между стадией (е), используемой для гибридизации НО с продуктом со стадии (d), и стадией (f), используемой для детекции сигнала, проводят стадию промывки. Согласно одному из воплощений перед промывкой необходимо, чтобы один из СТО или НО был иммобилизован на подложке.

В альтернативном случае стадии промывки не требуется. Используя конфокальные устройства для детекции на твердой фазе, можно осуществить детекцию сигнала, присутствующего только на твердой подложке без какого-либо влияния сигнала от меток, присутствующих в реакционном растворе.

Подробности, касающиеся НО, могут быть описаны со ссылкой на описания для НО в первом аспекте PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Согласно одному из воплощений СТО содержит одиночную метку, а НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f) (например, Фиг. 8-9 и 12). Альтернативно, НО содержит одиночную метку, а СТО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f) (например, Фиг. 10-11 и 13).

Согласно одному из воплощений одиночная метка может представлять собой любую метку.

Одиночная метка представляет собой, но не ограничивается этим, химическую метку (например, биотин), ферментативную метку (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу, β-галактозидазу и β-глюкозидазу), радиоизотопную метку (например, I¹²⁵ и С¹⁴), флуоресцентную метку, люминесцентную метку, хемилюминесцентную метку и металлическую метку (например, золото).

Согласно способу по настоящему изобретению НО или СТО содержит одиночную метку; при этом одиночная метка располагается в таком месте, что сигнал от одиночной метки в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от одиночной метки в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.

На Фиг. 8 проиллюстрирован второй аспект данного изобретения с использованием СТО, содержащего одиночную метку, и иммобилизованного НО. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки в СТО на твердой подложке. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки в СТО на твердой подложке.

Подробности того, как удлиненный дуплекс препятствует образованию гибрида между СТО и НО, также могут быть описаны со ссылкой на их описания в первом аспекте PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Например, когда СТО и НО впервые приводят в контакт друг с другом на стадии (е) (например, при проведении стадий (a)-(d) и (e)-(f) в отдельных реакционных сосудах), настоящее изобретение может быть осуществлено так, как показано на Фиг. 8 и 10. НО не приводят в контакт с СТО до удлинения фрагмента РТО, но он участвует в гибридизации с продуктом реакции удлинения. На стадии (е) образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида СТО/НО ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО.

Когда СТО и НО приводят в контакт друг с другом на стадии (d) (например, при проведении стадий (a)-(f) в одном реакционном сосуде), настоящее изобретение может быть осуществлено так, как показано на Фиг. 9 и 11. НО может гибридизоваться с СТО до удлинения и участвовать в реакции удлинения. Если НО гибридизуется с СТО до удлинения фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО. В частности, если НО расщепляется во время реакции удлинения, то образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида СТО/НО на стадии (е) ввиду расходования НО в результате расщепления.

Даже если у СТО и НО есть шанс контактирования друг с другом на стадии (d), некоторые из НО могут вообще не гибридизоваться с СТО до удлинения. В этом случае НО не могут образовать гибрида с СТО на стадии (е) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО.

Безотносительно стадии, на которой НО впервые приводят в контакт с СТО, образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени посредством следующих способов (1) ингибирования гибридизации НО с СТО и/или (2) расходования НО в результате расщепления.

В отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени удлиненный дуплекс не образуется, и поэтому образуется гибрид между СТО и НО.

Согласно одному из воплощений стадию (d) проводят в присутствии НО, и НО гибридизуются с СТО и/или не гибридизуются с СТО. Согласно одному из воплощений стадию (d) проводят в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения данного фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО, тем самым образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО на стадии (f) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО и/или расходования НО в результате расщепления.

НО содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО. Нуклеотидная последовательность НО может быть сконструирована так, чтобы она была комплементарна участку СТО, отличному от участка, подлежащего гибридизации с фрагментом РТО. В конкретном воплощении НО может быть сконструирован так, чтобы он содержал нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом (или нерасщепленным РТО) в плане гибридизации с СТО (см. Фиг. 12 и 13). Конкретно, такой конкурирующий НО не расщепляется при участии фрагмента или продукта его удлинения.

Подробности, касающиеся конкурирующего НО, также могут быть описаны со ссылкой на их описания в первом аспекте PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Согласно одному из воплощений один из СТО и НО будет иммобилизован на твердой подложке между стадией (d) и стадией (е) или между стадией (е) и стадией (f).

Стадия (f). Детекция сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО

Окончательно, детекцию гибрида между СТО и НО на твердой подложке осуществляют путем измерения сигнала на твердой подложке. Присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, а отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Согласно одному из воплощений сигнал в случае присутствия последовательностей-мишеней отличается от сигнала в случае отсутствия последовательностей-мишеней. Если детекцию последовательности-мишени осуществляют с использованием способа по настоящему изобретению, то такое различие в сигналах включает разницу в интенсивности сигналов. В одном из воплощений такое различие в сигналах составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 90%.

Настоящее изобретение характеризуется тем, что один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f). Подход по настоящему изобретению, заключающийся в том, что генерирование сигнала от одиночной метки на твердой подложке происходит в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, а гашение или ослабление сигнала от одиночной метки на твердой подложке происходит в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени, реализуется на практике в результате применения такой комбинации двух олигонуклеотидов.

Согласно одному из воплощений детекцию сигнала на твердой подложке осуществляют путем измерения сигнала на твердой подложке при предварительно заданной температуре, при этом гибрид между СТО и НО сохраняет свою двухцепочечную форму.

Детекция на стадии (f) может быть осуществлена в режиме реального времени, в режиме конечной точки или в режиме предварительно заданного интервала времени. Если способ по настоящему изобретению дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами, то детекция сигналов может быть осуществлена для каждого цикла такого повторения при предварительно заданной температуре (т.е. в режиме реального времени), в конце повторения при предварительно заданной температуре (т.е. в режиме конечной точки) или в каждый из предварительно заданных интервалов времени в процессе повторения при предварительно заданной температуре.

Согласно одному из воплощений детекцию сигнала на твердой подложке осуществляют с использованием анализа плавления или гибридизации в диапазоне температур. Подробности, касающиеся анализа плавления или гибридизации, могут быть описаны со ссылкой на описания для анализа плавления или гибридизации в первом аспекте PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Детекцию сигналов можно осуществить в соответствии с традиционными методами, например, с использованием настольных флуориметров, многолуночных планшетных ридеров для измерения флуоресценции, оптико-волоконных флуориметров, флуоресцентных микроскопов и микрочиповых/микрофлюидных систем в сочетании с детекцией флуоресценции.

Согласно одному из воплощений данный способ осуществляют без применения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, и расщепление РТО на стадии (b) происходит без какого-либо участия располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида или его удлиненной цепи. Воплощение с использованием 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, далее будет описано более подробно.

Детекция мишени посредством PCE-NH-анализа, основанного на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты на твердой фазе в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом РТО, гибридизованный с нуклеиновой кислотой-мишенью, расщепляется ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;

(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО; в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке непосредственно перед детекцией сигнала на стадии (f); при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; и

(f) детекцию сигнала на твердой подложке с целью обнаружения гибрида между СТО и НО на твердой подложке; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Поскольку способ по настоящему изобретению, основанный на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, аналогичен таковому, описанному в качестве второго аспекта PCE-NH-анализа с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов, за исключением того, что располагающиеся "вверх по течению" олигонуклеотиды в этом случае не применяются, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

В способе по настоящему изобретению можно использовать традиционные ферменты, обладающие 5'-нуклеазной активностью, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида. Среди матричных полимераз, обладающих 5'-нуклеазной активностью, существуют различные ферменты, обладающие 5'-нуклеазной активностью, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, например Taq ДНК-полимераза.

Наборы для детекции мишени

В еще одном аспекте данного изобретения предложен набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), содержащий:

(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;

(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и

(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;

при этом один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке непосредственно перед детекцией сигнала от одиночной метки; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке.

Поскольку набор по данному изобретению составлен для осуществления описанного выше способа детекции по настоящему изобретению, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

III. Третий аспект способа детекции мишени в PCE-NH-анализе

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:

а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;

(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО; при этом сигналы обеспечиваются посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и

(f) детекцию первого сигнала или второго сигнала при предварительно заданной температуре, при которой гибрид между СТО и НО сохраняет свою двухцепочечную форму; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом разница в первом сигнале и втором сигнале позволяет определить присутствие или отсутствие гибрида между СТО и НО, что указывает на присутствие или отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты.

Третий аспект данного изобретения, как и первый аспект данного изобретения, основан на походе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО). Однако третий аспект данного изобретения характеризуется тем, что он сфокусирован на том явлении, что удлиненный дуплекс в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени ингибирует гибридизацию НО с СТО и что детекцию сигнала осуществляют при предварительно заданной температуре.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что образование удлиненного дуплекса индуцирует ингибирование гибридизации НО с СТО, в результате чего гибрид СТО/НО не образуется даже тогда, когда НО не расщепляется, что можно с успехом применять для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени. При использовании этого основного принципа в настоящем изобретении необходимо, чтобы сигнал в случае, когда НО не расщепляется с сохранением одноцепочечной формы, отличался от сигнала в случае, когда НО принимает участие в образовании гибрида СТО/НО.

Поскольку в настоящем изобретении нет необходимости в обязательном расщеплении НО для удлинения фрагмента РТО, то удлинение фрагмента РТО (т.е. стадии (a)-(d)) и гибридизация НО с СТО и детекция (т.е. стадии (e)-(f)) могут быть выполнены по отдельности. Если используется НО, имеющий систему двух взаимодействующих меток, и присутствует нуклеиновокислотная последовательность-мишень, то сигнал в результате расщепления НО демонстрирует характерный профиль, отличающийся от такового для сигнала в результате ингибирования гибридизации интактного НО с СТО.

Использованный в данном описании термин "ингибирует гибридизацию НО с СТО", относящийся к удлиненному дуплексу, означает, что наличие удлиненной цепи в удлиненном дуплексе ингибирует связывание (или отжиг) нерасщепленного или интактного НО с СТО. Термин "ингибирует гибридизацию НО с СТО" может рассматриваться как ограничивающий вариант термина "препятствует образованию гибрида между СТО и НО".

Соответственно, для третьего аспекта данного изобретения необходимо обязательное осуществление ингибирования гибридизации НО с СТО. Как обсуждается ниже, такое необходимое условие не исключает возможности препятствовать образованию гибрида между СТО и НО в результате расщепления или вытеснения НО посредством с участием удлиненной цепи.

Третий аспект PCE-NH-анализа далее будет описан более подробно.

Стадия (а). Гибридизация располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и РТО с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью

Стадия (а) может быть описана со ссылкой на описания, приведенные для стадии (а) первого аспекта PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Стадия (b). Высвобождение фрагмента в результате расщепления РТО

Стадия (b) может быть описана со ссылкой на описания, приведенные для стадии (b) первого аспекта PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Стадия (с). Гибридизация фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО

Стадия (с) может быть описана со ссылкой на описания, приведенные для стадии (с) первого аспекта PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Стадия (d). Удлинение фрагмента

Стадия (d) может быть описана со ссылкой на описания, приведенные для стадии (d) первого аспекта PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Стадия (е). Гибридизация удлиненного дуплекса с НО

После осуществления реакции удлинения продукт со стадии (d) гибридизуется с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО.

Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО. Если в образце нуклеиновой кислоты присутствует нуклеиновокислотная последовательность-мишень, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО.

Гибридизация СТО с НО может впервые произойти на стадии (е). Альтернативно, гибридизация СТО с НО может впервые произойти на стадии (d). В конкретном воплощении стадию (d) проводят в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО.

Образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени посредством следующих способов: (1) ингибирования гибридизация НО с СТО и/или (2) расходования НО в результате расщепления.

Способ по настоящему изобретению характеризуется тем, что в нем используют изменение сигнала, обусловленное ингибированием гибридизации нерасщепленного или интактного НО с СТО. В настоящем изобретении сигнал, получаемый в случае, если НО гибридизуется с СТО, отличается от сигнала, получаемого в случае, если гибридизация нерасщепленного или интактного НО с СТО ингибируется посредством удлиненного дуплекса при предварительно заданной температуре, подходящей для гибридизации СТО с НО.

Если стадию (d) проводят в присутствии НО, то некоторые НО могут расщепляться во время удлинения фрагмента РТО, и одновременно может присутствовать сигнал, обусловленный расщеплением.

Подробности, касающиеся НО, могут быть описаны со ссылкой на описания для НО в первом аспекте PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

НО содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО. Нуклеотидная последовательность НО может быть сконструирована так, чтобы она была комплементарна участку СТО, отличному от участка, подлежащего гибридизации с фрагментом РТО. Альтернативно, НО может содержать нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом в плане гибридизации с СТО (см. Фиг. 17 и 18). Конкретно, такой конкурирующий НО не расщепляется при участии фрагмента или продукта его удлинения.

Первый и второй сигналы обусловлены использованием (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки.

Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, при условии, что сигнал, поступающий в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга, в настоящем изобретении могут быть применены различные типы и локализация меток.

Использованный в данном описании термин "НО", касающийся выражения "СТО и НО диссоциированы друг от друга", относится к нерасщепленному или интактному НО.

Согласно одному из воплощений НО или СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга (см. Фиг. 14 и 17).

Если используется НО, имеющий систему двух взаимодействующих меток, то сигнал в результате расщепления НО демонстрирует характерную картину, отличающуюся от таковой для сигнала в результате ингибирования гибридизации НО с СТО.

Если НО находится в одноцепочечном состоянии, то репортерная молекула и молекула-гаситель на НО конформационно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует и образуется гибрид СТО/НО, то репортерная молекула и молекула-гаситель на НО конформационно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы.

Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует, то образование мишень-зависимого удлиненного дуплекса ингибирует гибридизацию НО с СТО, позволяя тем самым НО находиться в одноцепочечном состоянии, что приводит к гашению сигнала от репортерной молекулы. Количество НО в форме одиночной цепи увеличивается в результате увеличения количества удлиненного дуплекса, и в свою очередь интенсивность детектируемого в конечном итоге сигнала демонстрирует тенденцию к уменьшению.

В то же время, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует, то НО, гибридизованный с СТО, может расщепляться во время удлинения фрагмента РТО. Расщепление приводит к тому, что репортерная молекула и молекула-гаситель будут окончательно отделены друг от друга, результатом чего является полное негашение сигнала от репортерной молекулы. Степень негашения в результате расщепления НО больше степени негашения в результате гибридизации НО с СТО. Таким образом, если осуществляют детекцию сигнала, поступающего в результате расщепления НО, то интенсивность сигнала демонстрирует тенденцию к увеличению благодаря увеличению количества расщепленных НО.

Поскольку одновременно могут иметь место обе ситуации, включая ингибирование гибридизации интактного НО с СТО и расщепление НО, то получаемая для сигнала картина может зависеть от преобладающей ситуации.

Согласно одному из воплощений НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга (см. Фиг. 15 и 18).

В конкретном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют, используя один дополнительный НО, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, и два НО гибридизуются с СТО в непосредственной близости друг к другу; при этом один из двух НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а другой из этих двух НО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и эти два НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и эти два НО диссоциированы друг от друга.

Согласно одному из воплощений НО или СТО содержит одиночную метку; при этом одиночная метка располагается в таком месте, что сигнал от одиночной метки в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от одиночной метки в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга (см. Фиг. 16). Подробности (включая механизм передачи сигнала и расположение меток и т.д.), касающиеся систем меток, могут быть описаны со ссылкой на описания для систем меток в первом аспекте PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Стадия (f). Детекция первого или второго сигнала при предварительно заданной температуре

Окончательно, детекцию первого сигнала или второго сигнала осуществляют при предварительно заданной температуре, при которой гибрид между СТО и НО сохраняет свою двухцепочечную форму.

Присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Разница в первом сигнале и втором сигнале позволяет определить присутствие или отсутствие гибрида между СТО и НО, что указывает на присутствие или отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты.

Согласно одному из воплощений первый сигнал и второй сигнал различают благодаря такому явлению, как генерирование сигнала, и отличительному признаку сигнала.

Согласно одному из воплощений первый сигнал и второй сигнал различают благодаря такому явлению, как изменение интенсивности (усиление сигнала и ослабление сигнала).

Согласно одному из воплощений сигнал в случае присутствия последовательностей-мишеней отличается от сигнала в случае отсутствия последовательностей-мишеней. Если детекцию последовательности-мишени осуществляют с использованием способа по настоящему изобретению, то такое различие в сигналах включает разницу в интенсивности сигнала. В одном из воплощений такое различие в сигналах составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 90%.

Температура, при которой гибрид между СТО и НО сохраняет свою двухцепочечную форму, может быть определена в установленном порядке с учетом величин Т_пл для СТО и НО.

Детекция на стадии (f) может быть осуществлена в режиме реального времени, в режиме конечной точки или в режиме предварительно заданного интервала времени. Если способ по настоящему изобретению дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами, то детекция сигналов может быть осуществлена для каждого цикла такого повторения при предварительно заданной температуре (т.е. в режиме реального времени), в конце повторения при предварительно заданной температуре (т.е. в режиме конечной точки) или в каждый из предварительно заданных интервалов времени в процессе повторения при предварительно заданной температуре.

Согласно одному из воплощений способ осуществляют с использованием контрольной группы, не имеющей никакой нуклеиновокислотной последовательности-мишени или имеющей предварительно заданное количество нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Настоящее изобретение может быть осуществлено или в жидкой фазе, или на твердой фазе.

Детекция мишени на твердой фазе

Согласно одному из воплощений настоящее изобретение осуществляют на твердой фазе, и один из СТО и НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала осуществляют на твердой подложке.

Согласно одному из воплощений один из СТО и НО будет иммобилизован на твердой подложке между стадией (d) и стадией (е) или между стадией (е) и стадией (f)

Подробности, касающиеся детекции мишени на твердой фазе для третьего аспекта, будут описаны со ссылкой на описания в первом аспекте PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления или гибридизации.

Согласно одному из воплощений данный способ осуществляют без применения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, и расщепление РТО на стадии (b) происходит без какого-либо участия располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида или его удлиненной цепи. Воплощение с использованием 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, далее будет описано более подробно.

Детекция мишени посредством PCE-NH-анализа, основанного на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом РТО, гибридизованный с нуклеиновой кислотой-мишенью, расщепляется ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;

(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО; при этом сигнал обеспечивается посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и

(f) детекцию первого сигнала или второго сигнала при предварительно заданной температуре, при которой гибрид между СТО и НО сохраняет свою двухцепочечную форму; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом разница в первом сигнале и втором сигнале позволяет определить присутствие или отсутствие гибрида между СТО и НО, что указывает на присутствие или отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты.

Поскольку способ по настоящему изобретению, основанный на использовании 5'-нуклеазной активности, не зависящей от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, аналогичен таковому, описанному в качестве третьего аспекта PCE-NH-анализа с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов, за исключением того, что располагающиеся "вверх по течению" олигонуклеотиды в этом случае не применяются, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.

Набор для детекции мишени

В еще одном аспекте данного изобретения предложен набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), содержащий:

(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид; содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;

(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и

(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;

при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО; при этом набор дополнительно содержит (1) метку, соединенную с НО, (2) метку, соединенную с СТО, (3) метку, соединенную с НО, и метку, соединенную с СТО, или (4) интеркалирующую метку.

Общее описание для аспектов настоящего изобретения

Общее описание для первого, второго и третьего аспектов настоящего изобретения приведено ниже.

Праймер, РТО, СТО и НО могут содержать природные dNMP и/или NMP. Альтернативно, праймер, РТО, СТО и НО могут содержать модифицированный нуклеотид или неприродный нуклеотид, как например, PNA (пептидо-нуклеиновая кислота; см. публикацию РСТ №WO 92/20702) и LNA ("закрытая" нуклеиновая кислота, см. публикации РСТ №№ WO 98/22489, WO 98/39352 и WO 99/14226). Праймер, РТО, СТО и НО могут содержать универсальные основания, такие как дезоксиинозин, инозин, 1-(2'-дезокси-бета-D-рибофуранозил)-3-нитропиррол и 5-нитроиндол. Термин "универсальное основание" относится к основанию, способному образовывать пары оснований с каждым из природных оснований ДНК/РНК с небольшим отличием между ними.

Как описано выше, РТО может расщепляться в сайте, локализованном в 3'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО. Этот сайт расщепления может быть расположен в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка РТО. Если фрагмент РТО содержит 5'-концевую часть 3'-концевого узнающего мишень участка РТО, то сайт СТО, гибридизованный с 5'-концевой частью 3'-концевого узнающего мишень участка, может содержать универсальное основание, вырожденную последовательность или их комбинацию. Например, если РТО расщепляется в сайте, локализованном на расстоянии одного нуклеотида в 3'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО, то выгодно, чтобы 5'-концевая часть захватывающего участка СТО содержала универсальное основание для гибридизации с данным нуклеотидом. Если РТО расщепляется в сайте, локализованном на расстоянии двух нуклеотидов в 3'-направлении от 3'-конца 5'-концевого тегирующего участка РТО, то выгодно, чтобы 5'-конец захватывающего участка СТО содержал вырожденную последовательность, а ближайший к нему в 3'-направлении нуклеотид содержал универсальное основание. Соответственно, если расщепление РТО происходит в различных сайтах 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, то использование универсальных оснований и вырожденных последовательностей в СТО является полезным. Помимо этого, если для скрининга множественных нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней в условиях индукции расщепления, зависящего от удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера, используют РТО, имеющие один и тот же 5'-концевой тегирующий участок, то могут быть созданы фрагменты РТО, имеющие различные 5'-концевые части 3'-концевого узнающего мишень участка. В таких случаях полезно использование в СТО универсальных оснований и вырожденных последовательностей. Стратегии с использованием универсальных оснований и вырожденных последовательностей в СТО позволяют применять один тип или минимальное количество типов СТО для скрининга множественных нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно одному из воплощений способ по настоящему изобретению дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами. Это повторение позволяет амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень и/или сигнал от мишени. Согласно одному из воплощений, стадии (a)-(b), (a)-(d) или (a)-(f) можно повторить с денатурацией. Возможно, что в конкретном воплощении число повторяющихся циклов можно корректировать. Денатурация может быть осуществлена с использованием традиционных методов, включая, но не ограничиваясь этим, нагревание, обработку щелочью, формамидом, мочевиной и глиоксалем, ферментативные методы (например, действие геликазы) и связывание белков. Например, плавления можно достичь посредством нагревания при температуре, изменяющейся в диапазоне от 80°С до 105°С. Общие методы осуществления такой обработки приведены в Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).

Согласно одному из воплощений стадии (a)-(f) осуществляют в одном реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах. Например, стадии (а)-(b), (c)-(d) или (e)-(f) могут быть осуществлены в одном реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах. Например, если последовательности РТО и СТО и реакционные условия устанавливают такими, чтобы гибридизация 3'-концевого узнающего мишень участка РТО с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью могла быть проведена в более жестких условиях, чем гибридизация фрагмента РТО с СТО, то стадии (а)-(b) можно повторить без осуществления стадий (c)-(f). После повторения стадий (а)-(b) можно повторить стадии (c)-(f).

В конкретном воплощении стадии (a)-(d) или (e)-(f) могут быть осуществлены в отдельных реакционных сосудах.

В конкретном воплощении стадии (а)-(b) можно повторить с денатурацией.

Специалисту в данной области техники будет очевидно, что повторение некоторых стадий, введение денатурации при повторении, отдельное выполнение определенной(ых) стадии(ий) и момент времени детекции можно широко варьировать.

Согласно одному из воплощений, если повторение выполняют с денатурацией, используя располагающийся "вверх по течению" праймер к РТО, то такое повторение осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера, в частности, в соответствии с ПЦР. С использованием располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера к РТО можно амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень.

Согласно одному из воплощений, если повторение выполняют с денатурацией, используя располагающийся "вверх по течению" зонд к РТО, то повторение осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера к РТО.

Использованный в данном описании термин "образец нуклеиновой кислоты" относится к небиологическому образцу (например, пище, воде, воздуху, почве и отходам) или биологическому образцу, содержащему молекулы нуклеиновых кислот. Биологический образец может быть выделен из животного, растения, человека, грибка, бактерии и вируса. Биологический образец может представлять собой клетку, ткань или жидкость из биологического источника, кровь, плазму крови, сыворотку крови, лимфу, молоко, мочу, фекалии, внутриглазную жидкость, слюну, семенную жидкость, экстракты головного мозга, спинномозговую жидкость, аппендикс, экстракты ткани селезенки и миндалин.

В настоящем изобретении нет необходимости в том, чтобы нуклеиновокислотные последовательности-мишени, подлежащие детекции и/или амплификации, имели какую-либо определенную последовательность или длину, включая любые молекулы ДНК (гДНК (геномной ДНК) и кДНК) и РНК. Нуклеиновокислотная последовательность-мишень может быть одно- или двухцепочечной.

Если в качестве исходного материала используют мРНК, то перед проведением стадии отжига необходима стадия обратной транскрипции, детали которой можно найти в Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); и Noonan K.F. et al., Nucleic Acids Res., 16: 10366 (1988). Для обратной транскрипции в качестве праймера можно использовать случайный гексамер или олигонуклеотид dT, способный гибридизоваться с мРНК.

Нуклеиновокислотные последовательности-мишени, которые могут подлежать детекции и/или амплификации, включают любую природную нуклеиновую кислоту прокариотического, эукариотического (например, из простейших и паразитов, грибов, дрожжей, высших растений, низших и высших животных, в том числе млекопитающих и человека), вирусного (например, из вируса герпеса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса гриппа, вируса Эпштейна-Барр, вируса гепатита, полиовируса и т.д.) или вироидного происхождения.

Нуклеиновокислотная последовательность-мишень, подлежащая детекции согласно настоящему изобретению, включает большое разнообразие нуклеиновокислотных последовательностей, например, последовательности в геноме, искусственно выделенные или фрагментированные последовательности и синтезированные последовательности (например, последовательности кДНК и штрихкодовые последовательности). Например, нуклеиновокислотная последовательность-мишень включает маркерные нуклеиновокислотные последовательности для иммуно-ПЦР (иПЦР). В иПЦР применяют конъюгаты, образованные между нуклеиновокислотными маркерными последовательностями и антителами, в сочетании с ПЦР, что широко используется для детекции различных типов мишеней, включая белки (см. Sano et al., Science, 258, pp: 120-122 (1992), патент США №5665539, Niemeyer et al., Trends in Biotechnology, 23, pp: 208-216 (2005), публикацию заявки на патент США №2005/0239108 и Ye et al., Journal of Environmental Science, 22, pp: 796-800 (2010)).

Молекула нуклеиновой кислоты-мишени по настоящему изобретению включает маркеры нуклеиновых кислот, которые используются в методе иПЦР, и настоящее изобретение может быть применено для детекции маркеров нуклеиновых кислот в методе иПЦР.

Настоящее изобретение также применяется для детекции нуклеотидной вариации. Предпочтительно, чтобы нуклеиновокислотная последовательность-мишень содержала нуклеотидную вариацию. Термин "нуклеотидная вариация", использованный в данном описании, относится к любым одиночным или множественным нуклеотидным заменам, делециям или вставкам в последовательности ДНК в конкретном положении среди непрерывных сегментов ДНК, которые в других случаях являются одинаковыми в последовательности. Такие непрерывные сегменты ДНК включают ген или любую другую часть хромосомы. Такие нуклеотидные вариации могут быть результатом мутации или представлять собой вариации полиморфных аллелей. Например, нуклеотидная вариация, детектируемая в настоящем изобретении, включает SNP (однонуклеотидный полиморфизм), мутацию, делецию, вставку, замену и транслокацию. Примером нуклеотидной вариации являются многочисленные вариации в геноме человека (например, вариации в гене MTHFR (метилентетрагидрофолат-редуктазы)), вариации, вовлеченные в возникновение лекарственной устойчивости у патогенных микроорганизмов, и вызывающие онкогенез вариации. Термин "нуклеотидная вариация", использованный в данном описании, включает в себя любую вариацию в конкретном положении в нуклеиновокислотной последовательности. Другими словами, термин нуклеотидная вариация включает в себя дикий тип и любой его мутантный тип в конкретном положении в нуклеиновокислотной последовательности.

В настоящем изобретении для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в том случае, когда используемые праймеры или зонды имеют последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в данной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, нуклеиновокислотная последовательность-мишень, содержащая такую нуклеотидную вариацию, описывается в данном изобретении как сопоставимая матрица. В том случае, когда используемые праймеры или зонды имеют последовательность, не комплементарную последовательности с этой нуклеотидной вариацией этой в данной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, нуклеиновокислотная последовательность-мишень, содержащая такую нуклеотидную вариацию, описывается в данном изобретении как несопоставимая матрица.

Для детекции нуклеотидных вариаций 3'-конец располагающегося "вверх по течению" праймера можно сконструировать таким образом, чтобы он располагался напротив сайта нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Согласно одному из воплощений 3'-конец располагающегося "вверх по течению" праймера имеет последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. 3'-Конец располагающегося "вверх по течению" праймера, имеющего последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в этой нуклеиновокислотной последовательности-мишени, отжигают с сопоставимой матрицей и удлиняют, чтобы индуцировать расщепление РТО. Полученный фрагмент РТО гибридизуется с СТО и удлиняется, и образуется молекула нуклеиновой кислоты, обеспечивая получение сигнала от мишени. В отличие от этого, когда 3'-конец располагающегося "вверх по течению" праймера не соответствует нуклеотидной вариации в несопоставимой матрице, он не удлиняется в условиях, необходимых для отжига 3'-конца праймеров и являющихся существенными для удлинения, даже когда располагающийся "вверх по течению" праймер гибридизуется с несопоставимой матрицей, ввиду этого никакого сигнала от мишени не генерируется.

Альтернативно, можно использовать расщепление РТО в зависимости от гибридизации РТО, имеющего последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Например, в регулируемых условиях РТО, имеющий последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновокислотной последовательности-мишени, гибридизуется с сопоставимой матрицей и затем расщепляется. Полученный фрагмент РТО гибридизуется с СТО и удлиняется с образованием удлиненного дуплекса, препятствующего образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО. Вместе с тем в данных регулируемых условиях РТО не гибридизуется с несопоставимой матрицей, имеющей последовательность, не комплементарную последовательности в месте расположения нуклеотидной вариации, и не расщепляется. В этом случае предпочтительно, чтобы последовательность в РТО, комплементарная последовательности с нуклеотидной вариацией, была расположена в середине 3'-концевого узнающего мишень участка РТО.

Согласно одному из воплощений применение искусственного некомплементарного нуклеотида усиливает способность РТО к распознаванию нуклеотидных вариаций.

Альтернативно, в настоящем изобретении используют РТО, имеющий сайт распознавания нуклеотидной вариации, расположенный в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, для обеспечения селективности РТО к конкретной нуклеотидной вариации. 5'-Концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка в РТО ориентирована по отношению к нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени для детекции этой нуклеотидной вариации, и 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка в РТО имеет последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Если РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации (т.е. с сопоставимой матрицей), то 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с сопоставимой матрицей; однако если РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации (т.е. с несопоставимой матрицей), то 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с несопоставимой матрицей.

Использованный в данном описании термин "сайт распознавания нуклеотидной вариации" со ссылкой на РТО обозначает последовательность в 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка в РТО, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

Согласно предпочтительному воплощению сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на расстоянии 10 нуклеотидов, более предпочтительно 8 нуклеотидов, еще более предпочтительно 6 нуклеотидов, наиболее предпочтительно 4 нуклеотидов, 3 нуклеотидов, 2 нуклеотидов или 1 нуклеотида от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка в РТО. Предпочтительно, сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на 5'-конце 3'-концевого узнающего мишень участка в РТО.

Термин "сайт" со ссылкой или на сайт распознавания нуклеотидной вариации в зондах, или на сайт нуклеотидной вариации в последовательностях-мишенях, используется в данном описании для включения не только одного нуклеотида, но также и множества нуклеотидов.

Следует отметить, что такие разные картины гибридизации в случае представляющей интерес нуклеотидной вариации отвечают за различие в начальных сайтах расщепления в РТО, в результате чего образуются два типа фрагментов РТО, обуславливая различие в сигналах в зависимости от присутствия представляющей интерес нуклеотидной вариации.

В присутствии представляющей интерес нуклеотидной вариации образуется первый фрагмент в результате расщепления гибрида между РТО и сопоставимой матрицей, а в отсутствие представляющей интерес нуклеотидной вариации образуется второй фрагмент в результате расщепления гибрида между РТО и несопоставимой матрицей. Второй фрагмент содержит дополнительный 3'-концевой участок, благодаря которому второй фрагмент отличается от первого фрагмента.

В одном из воплощений, предназначенном для детекции однонуклеотидной вариации, 5'-конец 3'-концевого узнающего мишень участка РТО имеет последовательность, комплементарную последовательности однонуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Как описано выше, расщепление РТО, гибридизованного с сопоставимой матрицей, может быть индуцировано в сайте, расположенном в непосредственной близости в 3'-направлении к 5'-концу 3'-концевого узнающего мишень участка РТО, например, в условиях индукции расщепления, зависящего от удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера. 3'-Конец фрагмента РТО имеет нуклеотид, комплементарный однонуклеотидной вариации. Фрагмент РТО гибридизуется с СТО, имеющим захватывающий участок, содержащий последовательность, соответствующую нуклеотидной вариации, и затем удлиняется с образованием удлиненного дуплекса, который препятствует образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида СТО/НО. Если тот же РТО гибридизуется с несопоставимой матрицей, имеющей последовательность, идентичную сопоставимой матрице за исключением однонуклеотидной вариации, то расщепление РТО может происходить в сайте, локализованном на расстоянии двух нуклеотидов в 3'-направлении от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка РТО. 3'-Конец фрагмента РТО имеет дополнительно расщепляемый нуклеотид кроме нуклеотида, комплементарного однонуклеотидной вариации. Если сайт в СТО, гибридизуемом с дополнительно расщепляемым нуклеотидом, сконструирован таким, что он имеет последовательность, не комплементарную дополнительно расщепляемому нуклеотиду, то 3'-конец фрагмента РТО не гибридизуется с СТО, в результате никакого удлинения фрагмента РТО в регулируемых условиях не происходит.

Согласно одному из воплощений сайт расщепления РТО, имеющего последовательность, комплементарную последовательности с нуклеотидной вариацией в своей 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка, оказывается разным в зависимости от гибридизации с сопоставимой матрицей или с несопоставимой матрицей, вследствие чего фрагмент РТО, высвободившийся в результате любого гибридизационного события, имеет разную последовательность, предпочтительно в своей 3'-концевой части, более предпочтительно, на своем 3'-конце.

Согласно одному из воплощений выбор нуклеотидной последовательности СТО с учетом различия в 3'-концевых частях фрагментов РТО позволяет различить сопоставимую матрицу и несопоставимую матрицу.

Согласно одному из воплощений образование любых фрагментов РТО можно отчетливо детектироваться посредством реакции удлинения на СТО.

Согласно одному из воплощений СТО имеет последовательность, выбранную такой, что СТО не гибридизуется с дополнительным 3'-концевым участком второго фрагмента, препятствуя удлинению второго фрагмента при его гибридизации с захватывающим участком СТО.

Как описано выше, детекцию удлинения первого фрагмента осуществляют по отсутствию гибридизации с НО ввиду образования удлиненного дуплекса.

Согласно одному из воплощений 5'-концевая часть 3'-концевого узнающего мишень участка в РТО содержит группировку, не подходящую для спаривания оснований, локализованную на расстоянии 1-10 нуклеотидов (более предпочтительно 1-5 нуклеотидов) от сайта распознавания нуклеотидной вариации.

Группировка, не подходящая для спаривания оснований, препятствует образованию двойной цепи между 5'-концевой частью 3'-концевого узнающего мишень участка и нуклеотидной последовательностью-мишенью, когда РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания данной вариации.

Использование группировки, не подходящей для спаривания оснований, (например, искусственного некомплементарного нуклеотида) усиливает способность РТО к распознаванию нуклеотидных вариаций.

Согласно одному из воплощений группировка, не подходящая для спаривания оснований, не ингибирует образования двойной цепи между 5'-концевой частью и нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, когда РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна сайту распознавания данной нуклеотидной вариации.

Согласно одному из воплощений присутствие группировки, не подходящей для спаривания оснований, увеличивает расстояние между начальным сайтом расщепления на гибриде, образованном РТО и сопоставимой матрицей, и начальным сайтом расщепления на гибриде, образованном РТО и несопоставимой матрицей.

Согласно одному из воплощений введение в последовательность группировки, не подходящей для спаривания оснований, дает возможность корректировать начальный сайт расщепления, в частности, начальный сайт расщепления на гибриде, образованном РТО и несопоставимой матрицей.

Согласно одному из воплощений группировка, не подходящая для спаривания оснований, располагается "вниз по течению" относительно сайта распознавания нуклеотидной вариации.

Группировка, не подходящая для спаривания оснований, включает любые группировки, не образующие пары оснований между нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями. Предпочтительно, чтобы группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляла собой (1) нуклеотид, содержащий искусственное некомплементарное основание, природное/неприродное основание, не способное образовывать пару оснований, основание, модифицированное таким образом, что оно не способно образовывать пару оснований, или универсальное основание, (2) нуклеотид, не подходящий для спаривания оснований, модифицированный таким образом, что он не способен образовывать пару оснований, или (3) химическое соединение, не подходящее для спаривания оснований.

Например, группировка, не подходящая для спаривания оснований, включает алкиленовую группу, рибофуранозил-нафталин, дезоксирибофуранозил-нафталин, метафосфат, фосфотиоатную связь, алкилфосфотриэфирную связь, арилфосфотриэфирную связь, алкилфосфонатную связь, арилфосфонатную связь, гидрофосфонатную связь, алкилфосфоамидатную связь и арилфосфоамидатную связь. В качестве группировок, не подходящих для спаривания оснований, также используют традиционные углеродные спейсеры. Универсальные основания в качестве группировок, не подходящих для спаривания оснований, полезны для корректировки сайтов расщепления в РТО.

Поскольку пары оснований, содержащие универсальные основания, такие как дезоксиинозин, 1-(2'-дезокси-бета-D-рибофуранозил)-3-нитропиррол и 5-нитроиндол, характеризуются меньшей способностью к связыванию по сравнению с природными основаниями, эти универсальные основания в определенных условиях гибридизации можно использовать в качестве группировок, не подходящих для спаривания оснований.

Группировка, не подходящая для спаривания оснований, введенная в 5'-концевую часть, содержит предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1-5, еще более предпочтительно 1-2 группировки. Ряд группировок, не подходящих для спаривания оснований, могут быть расположены в 5'-концевой части непрерывно или через промежутки. Предпочтительно, группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 2-5 следующих одна за другой группировок.

Предпочтительно, группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляет собой не подходящее для спаривания оснований химическое соединение.

Согласно одному из воплощений сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в РТО на расстоянии 10 нуклеотидов (более предпочтительно 8 нуклеотидов, 7 нуклеотидов, 6 нуклеотидов, 5 нуклеотидов, 4 нуклеотидов, 3 нуклеотидов, 2 нуклеотидов или 1 нуклеотида, наиболее предпочтительно 1 нуклеотида) от 5'-конца 3'-концевого узнающего мишень участка.

Согласно одному из воплощений РТО имеет блокирующий участок, содержащий в качестве блокатора по меньшей мере один нуклеотид, устойчивый к расщеплению ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, и этот блокирующий участок расположен так, чтобы регулировать расположение начального сайта расщепления или препятствовать расщеплению в каком-либо сайте или каких-либо сайтах.

Для улучшения эффективности детекции нуклеотидных вариаций настоящее изобретение может быть осуществлено с применением метода "клэмпинга". Репрезентативный пример метода "клэмпинга" с использованием PNA изложен в Henrik et al., Nucleic Acid Research, 21: 5332-5336 (1993) и Luo et al., Nucleic Acid Research, Vol.34, №2, e12 (2006).

Например, технология "клэмпинга" с использованием PNA позволяет амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность, имеющую нуклеотидную вариацию мутантного типа, но не амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность, имеющую нуклеотидную вариацию дикого типа, после чего выполнить способ, изложенный в данном описании, обеспечивая более эффективную детекцию нуклеотидных вариаций. В частности, поскольку технология "клэмпинга" позволяет амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность, имеющую нуклеотидную вариацию только конкретного типа, ее сочетание со способом по настоящему изобретению позволит осуществлять детекцию редких вариантов более эффективным образом.

Термин "блокатор амплификации" в настоящем изобретении означает олигонуклеотид, используемый для "клэмпинга".

В общем случае блокаторы амплификации для "клэмпинга" гибридизуются только с матрицами, имеющими последовательность, полностью комплементарную блокаторам амплификации в тех же самых условиях, и которые сконструированы так, чтобы не гибридизоваться с матрицами, имеющими даже одно основание, обуславливающее ошибочное спаривание. Матрица, гибридизованная с блокатором амплификации, ингибирующим отжиг праймеров или удлинение цепи, не амплифицируется, а амплифицируется только матрица, не гибридизованная с блокатором амплификации. Такие аналоги нуклеиновых кислот, как PNA и LNA, полезны в качестве блокаторов амплификации в том смысле, что они демонстрируют значительные различия в Т_пл даже в случае различия в одно основание.

Согласно одному из воплощений в настоящем изобретении также используется блокатор амплификации, в частности, для детекции неосновных вариантов. Согласно одному из воплощений блокатор амплификации препятствует удлинению праймера, локализованного "вверх по течению" относительно блокатора амплификации. Согласно одному из воплощений использованные блокатор амплификации и РТО могут быть сконструированы так, чтобы гибридизоваться с одной и той же цепью в двойной цепи или с разными цепями. Согласно одному из воплощений блокатор амплификации состоит из нуклеозидов/нуклеотидов с остовом, устойчивым к 5'-нуклеазной активности. Согласно одному из воплощений блокатор амплификации содержит пептидо-нуклеиновую кислоту (PNA), "закрытую" нуклеиновую кислоту (LNA), морфолино, гликоль-нуклеиновую кислоту (GNA), треозо-нуклеиновую кислоту (TNA), мостиковые нуклеиновые кислоты (BNA), N3'-Р5'-фосфоамидатные (NP) олигомеры, связанные с малобороздочным лигандом олигонуклеотиды (MGB-связанные олигонуклеотиды), фосфотиоатные (PS) олигомеры, С₁-С₄алкил-фосфонатные олигомеры, фосфоамидаты, β-фосфодиэфир-олигонуклеотиды, α-фосфодиэфир-олигонуклеотиды или их комбинацию.

Если зонд, имеющий на своем 5'-концевом участке сайт распознавания нуклеотидной вариации, гибридизуется с несопоставимой матрицей, его 5'-концевой участок в определенных условиях может образовывать одиночную цепь. Данный зонд может соответствовать РТО. Сигнал можно генерировать, используя анализ по настоящему изобретению с применением РТО. Этот подход может быть полезен для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна сайту распознавания нуклеотидной вариации в зондах.

Согласно одному из воплощений нуклеиновокислотная последовательность-мишень, использованная в настоящем изобретении, представляет собой предварительно амплифицированную нуклеиновокислотную последовательность. Использование предварительно амплифицированной нуклеиновокислотной последовательности дает возможность значительно повысить чувствительность и специфичность детекции мишени по настоящему изобретению.

Согласно одному из воплощений способ осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера к РТО.

Преимущества настоящего изобретения могут быть особо отмечены при одновременной (множественной) детекции по меньшей мере двух нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно одному из воплощений способ осуществляют с целью детекции по меньшей мере двух типов (более конкретно по меньшей мере трех типов, еще более конкретно по меньшей мере пяти типов) нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

Согласно одному из воплощений способ осуществляют с целью детекции по меньшей мере двух типов (более конкретно по меньшей мере трех типов, еще более конкретно по меньшей мере пяти типов) нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид включает по меньшей мере два типа (более конкретно по меньшей мере три типа, еще более конкретно по меньшей мере пять типов) олигонуклеотидов, РТО включает по меньшей мере два типа (более конкретно по меньшей мере три типа, еще более конкретно по меньшей мере пять типов) РТО, СТО включает по меньшей мере два типа (конкретно по меньшей мере три типа, более конкретно по меньшей мере пять типов) СТО, и НО включает по меньшей мере два типа (конкретно по меньшей мере три типа, более конкретно по меньшей мере пять типов) НО.

В конкретном воплощении, если присутствуют по меньшей мере два типа нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, то обеспечивается получение по меньшей мере двух типов соответствующих им сигналов.

Согласно одному из воплощений настоящее изобретение осуществляют с использованием по меньшей мере двух типов располагающихся "вниз по течению" праймеров к РТО.

Кроме того, можно получить дополнительные фрагменты, которые могут удлиняться на СТО для увеличения количества удлиненных цепей, посредством проведения дополнительной реакции расщепления 5'-нуклеазой, используя дополнительный РТО, который содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную удлиненной цепи, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную удлиненной цепи, но комплементарную захватывающему участку СТО. Существует возможность применения дополнительного располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, содержащего гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную удлиненной цепи и локализованную "вверх по течению" относительно дополнительного РТО, для проведения реакции расщепления 5'-нуклеазой. Согласно одному из воплощений НО может играть роль дополнительного РТО.

Отличительным признаком вышеупомянутого предпочтительного воплощения является то, что образование дополнительных фрагментов зависит от образования удлиненной цепи.

Альтернативно, дополнительные фрагменты можно получить путем использования дополнительного РТО, который содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную СТО, но комплементарную захватывающему участку СТО.

Согласно одному из воплощений дополнительные удлиненные дуплексы образуются благодаря дополнительному получению удлиненных цепей, что способствует усилению сигнала от мишени.

Отличительные признаки и преимущества данного изобретения будут обобщены ниже.

(а) В настоящем изобретении для определения присутствия последовательностей-мишеней используют (1) РТО, который предназначен для гибридизации с последовательностями-мишенями, (2) СТО, способный образовывать удлиненный дуплекс зависящим от мишени образом, и (3) НО, который предназначен для гибридизации с СТО, что способствует тем самым значительному повышению специфичности в отношении последовательностей-мишеней. Помимо этого, условия, необходимые для генерирования сигнала, можно регулировать независимо от последовательностей-мишеней, и поэтому реакционные условия для способов по настоящему изобретению могут быть легко определены. Такой признак позволяет не только легко определить условия для генерирования сигнала, но также предотвратить получение ложноположительных сигналов при детекции множественных мишеней в образцах, среди прочего, в разноплановых клинических образцах.

(b) Величину Т_пл для гибрида между СТО и НО можно регулировать последовательностью и/или длиной НО, и поэтому задавать произвольным образом. Благодаря использованию такого признака: (1) отличительная величина Т_пл для гибрида СТО/НО может служить в качестве дискриминирующего фактора присутствия гибрида СТО/НО (например, в анализе плавления); и (2) можно легко определить температуры детекции, необходимые для сохранения структуры гибрида СТО/НО и реакционные условия для проведения множественной детекции по меньшей мере в случае двух нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.

(c) В настоящем изобретении применяется ингибирование гибридизации интактного НО с СТО посредством образования мишень-зависимого удлиненного дуплекса. Таким образом, согласно настоящему изобретению можно осуществлять детекцию последовательностей-мишеней даже тогда, когда НО не расщепляется. В связи с этим детекцию гибрида между СТО и НО можно осуществить в другом сосуде, не в сосуде для удлинения СТО.

(d) В первом и третьем аспектах настоящего изобретения применяется ингибирование гибридизации интактного НО с СТО, а также расщепление НО. Поэтому можно без труда сконструировать последовательность 5'-концевого тегирующего участка РТО, последовательности СТО и НО и легко определить условия реакции.

(e) В первом и третьем аспектах настоящего изобретения для детекции последовательностей-мишеней можно использовать различные метки.

(f) В первом аспекте настоящего изобретения для детекции по меньшей мере двух последовательностей-мишеней, когда гибриды между СТО и НО имеют разную величину Т_пл, можно осуществить детекцию по меньшей мере двух нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней посредством анализа кривой плавления даже с использованием системы меток, обеспечивающей получение сигналов с одинаковыми характеристиками флуоресценции. Данное преимущество позволяет не иметь ограничений, связанных с числом детектируемых флуоресцентных меток при множественной детекции в режиме реального времени.

(g) Традиционные технологии, при применении которых гибриды между зондами и последовательностями-мишенями или ПЦР-ампликонами последовательностей-мишеней анализируют с помощью анализа плавления, с большой долей вероятности демонстрируют отклонения в данных анализа предрасположенных к нуклеотидным вариациям образцов, таких как клинические образцы. Однако согласно первому аспекту в настоящем изобретении используют СТО и НО, последовательности которых могут быть сконструированы нерелевантными в отношении последовательностей мишеней, и таким образом, результаты анализа образцов могут быть получены без каких-либо отклонений.

(h) При использовании традиционных реакций на твердой фазе для детекции последовательностей-мишеней путем прямой гибридизации иммобилизованных олигонуклеотидов с последовательностями-мишенями можно не получить эффективных результатов реакций вследствие ограничений, налагаемых условиями для твердой фазы. В противоположность этому, в настоящем изобретении используется гибридизация СТО с НО на твердой фазе без какого-либо участия последовательностей-мишеней, так что даже в общих реакционных условиях можно продемонстрировать более эффективные результаты реакций.

(i) В реакции на твердой фазе по настоящему изобретению можно осуществить одновременную детекцию по меньшей мере двух последовательностей-мишеней даже с использованием одиночной метки.

(j) Если НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом в плане гибридизации с СТО, то его расщепление по существу может быть исключено. В этом случае детекция последовательностей-мишеней может быть осуществлена без какого-либо участия расщепления НО.

(k) Если НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом в плане гибридизации с СТО, то с большей долей вероятности в одном реакционном сосуде РТО будет гибридизоваться с последовательностью-мишенью, а не с СТО, поскольку НО ингибирует связывание РТО с СТО.

(l) В одном из воплощений с использованием НО, содержащего нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом в плане гибридизации с СТО, можно использовать относительно короткий СТО, что улучшает эффективность синтеза и экономическую эффективность с точки зрения получения СТО.

Теперь настоящее изобретение будет описано более подробно в примерах. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что эти примеры предназначены для более конкретного иллюстрирования, и объем настоящего изобретения, как он изложен в прилагаемой формуле изобретения, не ограничивается данными примерами.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Оценка влияния образования удлиненного дуплекса на гибридизацию НО с СТО

Авторы изобретения исследовали, будет ли гибридизация гибридизующегося олигонуклеотида (НО) с СТО ослабляться в результате увеличения количества удлиненных дуплексов, что будет указывать на то, что образование удлиненного дуплекса ингибирует гибридизацию НО с СТО. Получали синтетическую удлиненную цепь (Syn-ES), имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, чтобы контролировать количество удлиненного дуплекса, и для образования удлиненного дуплекса с фиксированным количеством СТО использовали различное количество Syn-ES.

Syn-ES и СТО не содержат никакой метки. СТО блокирован углеродным спейсером по своему 3'-концу. НО имеет флуоресцентную репортерную молекулу (Cal Fluor Red 610) на своем 5'-конце и имеет молекулу-гаситель (BHQ-2) на своем 3'-конце.

В этом примере детекцию присутствия гибрида СТО-НО осуществляли с использованием анализа плавления.

Последовательности Syn-ES, СТО и НО, использованных в этом примере, представляют собой:

2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea)); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); и реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С. По окончании денатурации получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 40°С, выдерживая при 40°С в течение 10 мин и медленно нагревая от 40°С до 85°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации гибрида СТО-НО. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 19А и 19 В, для Syn-ES в диапазоне от 0 до примерно 0,5 пмоль детектировали пики плавления при 57,0°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл для гибрида СТО-НО, и их высота уменьшалась обратно пропорционально количеству Syn-ES. При использовании Syn-ES в количестве, превышающем 1 пмоль, никаких пиков не детектировали.

Этот результат показывает, что гибридизация НО с СТО ослабляется, поскольку образуется удлиненный дуплекс, что указывает на то, что образование удлиненного дуплекса ингибирует гибридизацию НО с СТО.

ПРИМЕР 2. Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени с использованием PCE-NH-анализа

Далее авторы изобретения исследовали, можно ли посредством PCE-NH-анализа детектировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень при детекции (1) в режиме реального времени при предварительно заданной температуре или (2) с использованием анализа плавления.

Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью.

РТО и СТО не содержат никакой метки. РТО и СТО блокированы углеродным спейсером по своим 3'-концам. В качестве матрицы-мишени использовали геномную ДНК гена Neisseria gonorrhoeae (NG). НО имеет флуоресцентную репортерную молекулу (Cal Fluor Red 610) на своем 5'-конце и имеет молекулу-гаситель (BHQ-2) на своем 3'-конце.

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО, СТО и НО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

2-1. Детекция в режиме реального времени при предварительно заданной температуре во время проведения ПЦР

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК из NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 4), 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 5), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 6), 0,5 пмоль СТО (SEQ ID NO: 2), 0,5 пмоль НО (SEQ ID NO: 3) и 10 мкл смеси 2х Master Mix (содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы Н-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea)); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 50 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 55°С и 30 с при 72°С. Детекцию сигнала осуществляли на стадии гибридизации (55°С) каждого цикла, при этом ожидалось, что гибрид СТО-НО сохраняет двухцепочечную форму. Кроме того, сигнал измеряли на стадии денатурации (95°С) каждого цикла.

В PCE-NH-анализе, включающем в себя детекцию в режиме реального времени при предварительно заданной температуре, используется тот факт, что сигнал от двойной цепи, образованной в результате гибридизации НО с СТО, отличается от сигнала от одноцепочечного НО, остающегося в результате ингибирования гибридизации НО с СТО.

Если НО находится в одноцепочечном состоянии, то репортерная молекула и молекула-гаситель на НО конформационно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы. Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует и образуется гибрид СТО/НО, то репортерная молекула и молекула-гаситель на НО конформационно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы.

Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует, то образование мишень-зависимого удлиненного дуплекса ингибирует гибридизацию НО с СТО, позволяя тем самым НО находиться в одноцепочечном состоянии, что приводит к гашению сигнала от репортерной молекулы. Вследствие этого количество НО в форме одиночной цепи увеличивается в результате увеличения количества удлиненного дуплекса, и в свою очередь интенсивность детектируемого в конечном итоге сигнала демонстрирует тенденцию к уменьшению.

В то же время, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует, то НО, гибридизованный с СТО, может расщепляться во время удлинения фрагмента РТО. Расщепление приводит к тому, что репортерная молекула и молекула-гаситель будут окончательно отделены друг от друга, результатом чего является полное негашение сигнала от репортерной молекулы. Степень негашения в результате расщепления НО больше степени негашения в результате гибридизации НО с СТО. Таким образом, если осуществляют детекцию сигнала, поступающего в результате расщепления НО, то интенсивность сигнала демонстрирует тенденцию к увеличению благодаря увеличению количества расщепленных НО. Детекцию сигнала, поступающего в результате расщепления НО, можно осуществлять при различных температурах. Осуществляя детекцию при более высоких температурах, можно исключить сигналы, поступающие в результате гибридизации НО с СТО.

В этом примере, поскольку одновременно могут иметь место обе ситуации, включая ингибирование гибридизации интактного НО с СТО и расщепление НО, получаемая для сигнала картина может зависеть от преобладающей ситуации.

Как показано на Фиг. 20А, в присутствии мишени интенсивность сигнала флуоресценции, измеренного на стадии гибридизации (55°С), демонстрировала тенденцию к уменьшению. В отсутствие мишени никакого сигнала не детектировали.

Этот результат показывает, что с использованием PCE-NH-анализа можно обнаружить нуклеиновокислотную последовательность-мишень при детекции в режиме реального времени и, кроме того, что ингибирование гибридизации интактного НО с СТО позволяет осуществлять детекцию присутствия последовательности-мишени с помощью PCE-NH-анализа.

Помимо этого, чтобы наблюдать наличие расщепления некоторых НО во время реакции, детекцию сигнала также проводили на стадии денатурации (95°С) каждого цикла во время указанной выше реакции. Как показано на Фиг. 20В, интенсивность сигнала флуоресценции увеличивалась в присутствии мишени. В отсутствие мишени никакого сигнала не детектировали.

Этот результат показывает, что некоторые НО могут расщепляться во время данной реакции.

2-2. Анализ плавления

По окончании реакции в примере 2-1 получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 40°С, выдерживая при 40°С в течение 10 мин и медленно нагревая от 40°С до 85°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации гибрида СТО-НО. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 20С, пик плавления при 59,0°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл для гибрида СТО-НО, детектировали в отсутствие мишени. В присутствии мишени никакого пика не детектировали.

Этот результат показывает, что посредством PCE-NH-анализа можно детектировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень с использованием анализа плавления.

ПРИМЕР 3. Оценка применимости PCE-NH-анализа с использованием конкурирующего НО для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени

Далее авторы изобретения исследовали, можно ли посредством PCE-NH-анализа детектировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень, используя сигнал, получаемый в результате ингибирования гибридизации интактного НО с СТО, без сигнала, получаемого в результате расщепления НО, при детекции (1) в режиме реального времени при предварительно заданной температуре или (2) с использованием анализа плавления. Чтобы исключить эффект расщепления НО во время удлинения фрагмента РТО, конкурирующий НО конструируют таким, чтобы он конкурировал с фрагментом РТО за сайт гибридизации на СТО. Конкурирующий НО в этом примере содержит последовательность фрагмента РТО и дополнительную последовательность в своей 3'-концевой части, комплементарную матричному участку СТО.

Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью.

РТО и СТО не содержат никакой метки. РТО и СТО блокированы углеродным спейсером по своим 3'-концам. В качестве матрицы-мишени использовали геномную ДНК гена NG. Конкурирующий НО имеет флуоресцентную репортерную молекулу (Cal Fluor Red 610) на своем 5'-конце и имеет молекулу-гаситель (BHQ-2) на своем 3'-конце.

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО, СТО и конкурирующего НО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

3-1. Детекция в режиме реального времени при предварительно заданной температуре

Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК из NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 7), 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 8), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 6), 0,5 пмоль СТО (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль конкурирующего НО (SEQ ID NO: 9) и 10 мкл смеси 2× Master Mix (содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 1,6 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea)); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 50 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С и 30 с при 72°С. Детекцию сигнала осуществляли на стадии гибридизации (60°С), при этом ожидалось, что гибрид СТО-НО сохраняет двухцепочечную форму. Кроме того, сигнал измеряли на стадии денатурации (95°С) каждого цикла.

Как показано на Фиг. 21А, в присутствии мишени наблюдали тенденцию к уменьшению интенсивности сигнала флуоресценции, измеренного на стадии гибридизации (60°С). В отсутствие мишени никакого сигнала не детектировали.

Этот результат показывает, что посредством PCE-NH-анализа можно детектировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень, используя ингибирование гибридизации интактного НО с СТО без расщепления НО.

Помимо этого, чтобы наблюдать наличие расщепления некоторых НО во время реакции, детекцию сигнала также проводили на стадии денатурации (95°С) каждого цикла во время указанной выше реакции. Как показано на Фиг. 21В, в присутствии мишени, а также в отсутствие мишени никакого сигнала не детектировали.

3-2. Анализ плавления

По окончании реакции в примере 3-1 получали кривую плавления, охлаждая реакционную смесь до 55°С, выдерживая при 55°С в течение 30 с и медленно нагревая от 55°С до 85°С. Флуоресценцию измеряли непрерывно в процессе повышения температуры для мониторинга диссоциации гибрида СТО-НО. Из данных кривой плавления получали данные о пике плавления.

Как показано на Фиг. 21С, пик плавления при 70,0°С, соответствующей ожидаемой величине Т_пл для гибрида СТО-НО, детектировали в отсутствие мишени. В присутствии мишени никакого пика не детектировали.

Этот результат показывает, что посредством PCE-NH-анализа, включающего в себя анализ плавления, можно детектировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень с использованием ингибирования гибридизации интактного НО с СТО без расщепления НО.

ПРИМЕР 4. Оценка применимости PCE-NH-анализа с использованием меченного одиночной меткой СТО и иммобилизованного НО на микрочипе

Далее авторы изобретения исследовали применимость PCE-NH-анализа с использованием меченного одиночной меткой СТО и иммобилизованного НО на микрочипе. Расщепление РТО и удлинение фрагмента РТО, гибридизацию СТО с иммобилизованным НО осуществляли одновременно на микрочипе. По окончании реакции проводили анализ присутствия или отсутствия дуплекса СТО-НО. В том случае, когда фрагмент РТО удлиняется в присутствии НО, можно препятствовать образованию гибрида между СТО и НО посредством (1) ингибирования гибридизации НО с СТО и/или (2) расщепления НО во время удлинения фрагмента РТО.

Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, расщепления и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью. РТО блокирован углеродным спейсером по своему 3'-концу. СТО имеет флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar670) на своем 3'-конце. НО содержит поли(Т)₁₀ в качестве линкерной ножки, и его иммобилизовали на поверхности стеклянной пластинки, используя аминогруппу (аминоС7) на его 3'-конце. Маркерный зонд, содержащий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar670) на своем 5'-конце, иммобилизовали на поверхности стеклянной пластинки, используя аминогруппу на его 3'-конце.

Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО, СТО и НО, использованных в этом примере, представляют собой:

(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).

Для изготовления НО и маркера (SEQ ID NO: 11 и 12) использовали NHS-пластинки NSB9 (NSBPOSTECH, Korea). НО и маркер, растворенные в NSB-буфере для точечного нанесения в конечной концентрации 50 мкМ, печатали на NSB9 NHS-пластинках с использованием споттера для микрочипов PersonalArrayer™16 (CapitalBio, China). НО и маркер наносили в виде пятен по одной линии в формате 2×1 (пятна в двух повторах) и полученный микрочип инкубировали в камере с поддержанием ~85%-ной влажности в течение ночи. Затем пластинки промывали в буферном растворе, содержащем 2×SSPE (0,3 М хлорид натрия; 0,02 М гидрофосфат натрия и 2,0 мМ EDTA), рН 7,4, и 7,0 мМ SDS, при 37°С в течение 30 мин для удаления неспецифически связавшихся НО и маркера и промывали дистиллированной водой. Затем ДНК-функционализированные пластинки сушили с применением центрифуги для пластинок и хранили в темноте при 4°С до применения.

Реакцию с PCE-NH проводили в конечном объеме 30 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 7), 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 8), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 6), 0,5 пмоль СТО (SEQ ID NO: 10) и 15 мкл смеси 2× Master Mix (содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 2,4 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea)); смесь целиком помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит НО (SEQ ID NO: 11). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (Genepro B4I, China). Реакцию с PCE-NH проводили следующим образом: денатурация в течение 15 мин при 95°С и затем 40 циклов по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С, 30 с при 72°С и гибридизация в течение 5 мин при 55°С.

После проведения этой реакции пластинки промывали дистиллированной водой в течение 1 мин. Получение изображений осуществляли с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.

Как показано на Фиг. 22, интенсивность флуоресценции заметно уменьшалась в присутствии мишени в сравнении с таковой в отсутствие мишени.

Интенсивность флуоресценции

Этот результат показывает, что в PCE-NH-анализе с использованием меченного одиночной меткой СТО и иммобилизованного НО на микрочипе можно осуществлять детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

ПРИМЕР 5. Оценка применимости PCE-NH-анализа с использованием меченного одиночной меткой СТО и иммобилизованного НО на микрочипе без расщепления НО

Далее авторы изобретения исследовали применимость PCE-NH-анализа с использованием меченного одиночной меткой СТО и иммобилизованного НО на микрочипе. Расщепление РТО и удлинение фрагмента РТО проводили в сосуде и полученный материал переносили в микрочип, где происходила иммобилизация НО, что позволяет исключить расщепление НО во время удлинения фрагмента РТО. По окончании реакции гибридизации проводили анализ присутствия или отсутствия дуплекса СТО-НО.

Использовали такие же Taq ДНК-полимеразу, РТО, СТО, НО и маркер, как и в примере 4.

Подготовку пластинок проводили в соответствии с тем же протоколом, который использовали в примере 4.

Расщепление РТО и удлинение фрагмента РТО проводили в конечном объеме 30 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 7), 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 8), 5 пмоль РТО (SEQ ID NO: 6), 0,5 пмоль СТО (SEQ ID NO: 10) и 15 мкл смеси 2× Master Mix (содержащей 2,5 мМ MgCl₂, 200 мкМ dNTP и 2,4 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea)); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 40 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С, 30 с при 72°С.

Полученную смесь помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит НО (SEQ ID NO: 11). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (Genepro B4I, China). Реакцию гибридизации проводили в течение 30 мин при 55°С. В конце пластинку промывали дистиллированной водой в течение 1 мин. Получение изображений осуществляли с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.

Как показано на Фиг. 23, интенсивность флуоресценции заметно уменьшалась в присутствии мишени в сравнении с таковой в отсутствие мишени.

Интенсивность флуоресценции

Этот результат показывает, что в PCE-NH-анализе с использованием меченного одиночной меткой СТО и иммобилизованного НО на микрочипе можно осуществлять детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени без проведения стадии расщепления НО.

Основываясь на описании предпочтительного воплощения настоящего изобретения, следует понимать, что его варианты и модификации, соответствующие сущности изобретения, могут стать очевидными специалистам в данной области техники, и объем данного изобретения следует определять прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

1. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты посредством анализа с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО (зондирующего и метящего олигонуклеотида), включающий:

(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО) и олигонуклеотидом, располагающимся "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; место гибридизации располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида локализовано "вверх по течению" относительно места гибридизации РТО;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;

(e) проведение анализа плавления или анализа гибридизации для продукта со стадии (d) в диапазоне температур с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала; при этом сигнал обеспечивается посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и

(f) детекцию сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

2. Способ по п. 1, где стадию (d) проводят в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения данного фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО, тем самым образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО на стадии (е) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО и/или расходования НО в результате расщепления.

3. Способ по п. 1, где НО или СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.

4. Способ по п. 1, где НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.

5. Способ по п. 1, который осуществляют, используя один дополнительный НО, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, и два НО гибридизуются с СТО в непосредственной близости друг к другу; при этом один из двух НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а другой из этих двух НО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и двумя НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и этими двумя НО не образуется.

6. Способ по п. 1, где НО или СТО содержит одиночную метку; при этом одиночная метка располагается в таком месте, что сигнал от одиночной метки в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от одиночной метки в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.

7. Способ по п. 1, где один из СТО и НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала осуществляют на твердой подложке.

8. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты на твердой фазе посредством анализа с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО, включающий:

(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО), при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;

(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f); при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; и

(f) детекцию сигнала на твердой подложке с целью обнаружения гибрида между СТО и НО на твердой подложке; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

9. Способ по п. 8, где стадию (d) проводят в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения данного фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО, тем самым образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО на стадии (е) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО и/или расходования НО в результате расщепления.

10. Способ по п. 8, где (1) СТО содержит одиночную метку, а НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), или (2) НО содержит одиночную метку, а СТО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f).

11. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты посредством анализа с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО, включающий:

(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;

(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;

(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;

(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО; при этом сигналы обеспечиваются посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и

(f) детекцию первого сигнала или второго сигнала при предварительно заданной температуре, при которой гибрид между СТО и НО сохраняет свою двухцепочечную форму; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом разница в первом сигнале и втором сигнале позволяет определить присутствие или отсутствие гибрида между СТО и НО, что указывает на присутствие или отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты.

12. Способ по п. 11, где стадию (d) осуществляют в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО.

13. Способ по п. 11, где НО или СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.

14. Способ по п. 11, где НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.

15. Способ по п. 11, который осуществляют, используя один дополнительный НО, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, и два НО гибридизуются с СТО в непосредственной близости друг к другу; при этом один из двух НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а другой из этих двух НО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и эти два НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и эти два НО диссоциированы друг от друга.

16. Способ по п. 11, где НО или СТО содержит одиночную метку; при этом одиночная метка располагается в таком месте, что сигнал от одиночной метки в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от одиночной метки в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.

17. Способ по п. 11, где один из СТО и НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала осуществляют на твердой подложке.

18. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом в плане гибридизации с СТО.

19. Способ по п. 18, где НО не расщепляется при участии фрагмента или продукта его удлинения.

20. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где стадии (a)-(f) осуществляют в одном реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.

21. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где РТО, СТО и/или НО блокированы по своему 3'-концу, чтобы препятствовать его удлинению.

22. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.

23. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован достаточно близко к РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

24. Способ по п. 23, где располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.

25. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где захватывающий участок СТО содержит в своей 5'-концевой части нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка РТО.

26. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют с использованием контрольной группы, не имеющей никакой нуклеиновокислотной последовательности-мишени или имеющей предварительно заданное количество нуклеиновокислотной последовательности-мишени.

27. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, дополнительно включающий повторение всех или некоторых из стадий (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами.

28. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид включает по меньшей мере два типа олигонуклеотидов, РТО включает по меньшей мере два типа РТО, СТО включает по меньшей мере два типа СТО, и НО включает по меньшей мере два типа НО.

29. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и фермент на стадии (b), обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера.

30. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN (флэп-эндонуклеазу).

31. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень содержит нуклеотидную вариацию.

32. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.

33. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют без применения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, и расщепление РТО на стадии (b) происходит без какого-либо участия располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида или его удлиненной цепи.

34. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты посредством анализа с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО, содержащий:

(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;

(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и

(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;

при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала; при этом набор дополнительно содержит (1) метку, соединенную с НО, (2) метку, соединенную с СТО, (3) метку, соединенную с НО, и метку, соединенную с СТО, или (4) интеркалирующую метку.

35. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты на твердой фазе посредством анализа с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО, содержащий:

(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;

(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и

(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;

при этом один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала от одиночной метки; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке.

36. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты посредством анализа с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО, содержащий:

(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;

(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;

(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и

(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;

при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО; при этом набор дополнительно содержит (1) метку, соединенную с НО, (2) метку, соединенную с СТО, (3) метку, соединенную с НО, и метку, соединенную с СТО, или (4) интеркалирующую метку.