Питательная среда для глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов

Авторы патента:

Ларин Виктор Александрович (RU)

Кузнецов Олег Ювенальевич (RU)

Кузнецов Антон Олегович (RU)

Пятачков Андрей Александрович (RU)

Шашков Василий Андреевич (RU)

Калинина Нина Геннадьевна (RU)

C12N1/14 - микробные грибки (культуры грибов A01G 1/04; грибы в качестве нового вида растений A01H 15/00); питательные среды для них

A01G1/04 - Садоводство; разведение овощей, цветов, риса, фруктов, винограда, хмеля или морских водорослей; лесное хозяйство; орошение (сбор фруктов, овощей, хмеля и т.п. A01D 46/00; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; устройства для срезания верхней части растений или очистки от кожуры лука или цветочных луковиц A23N 15/08; размножение одноклеточных водорослей C12N 1/12; культуры растительных клеток C12N 5/00)

Владельцы патента RU 2621870:

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ивановская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена питательная среда для глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов, содержащая пивное сусло, углеводы, муку зерновых и воду с добавлением перекиси водорода (0,01%-0,02%) и водного раствора коллоидного серебра (0,0015%-0,0045%). Изобретение обеспечивает сохранение асептических условий в ходе длительного культивирования базидиомицетов. 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано, в частности, для приготовления жидкой питательной среды с целью глубинного культивирования высших базидиальных грибов при выращивании их мицелия.

Известна питательная среда для культивирования высших базидиальных грибов на основе пивного сусла (Александрова Е.А., Завьялова Л.А., Терешина в.М., Гарибова Л.В., Феофилова Е.П. Получение плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing. [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] // Микробиология, 1998. T. 67. №5. C. 649-654).

Недостатком этой среды является небольшой выход биомассы мицелия высших базидиальных грибов из-за отсутствия в ней достаточного количества минеральных веществ и энергетического субстрата (углеводов).

Известно получение посевного мицелия высших базидиомицетов с использованием стерильной жидкой питательной среды, предусматривающей наличие следующих компонентов (г/л воды): пшеничная мука - 10-40 г/л, картофельный отвар - 50-200 г/л, при последующем добавлении в среду стимулятора роста высших базидиомицетов, в качестве которого используют суточную культуру бактерий рода Azospirillum. Приготовленную стерильную питательную среду засевают базидиомицетом, культивируют при 26°С в течение 3-х дней, а затем в полученную мицелиальную биомассу вносят суспензию бактерий Azospirillum из расчета 10 мл суспензии на 200 мл среды и затем осуществляют совместное культивирование базидиомицета и вышеуказанных бактерий в течение 14 дней (RU 2249614 С2, 10.04.2005).

Таким образом, в данной питательной среде одновременно происходит культивирование двух микробных культур - необходимого мицелия высших базидиальных грибов и бактерий рода Azospirillum, стимулирующих развитие данного мицелия.

Основным недостатком описанной питательной среды является ее трудоемкость приготовления, поскольку необходимо дополнительно готовить питательную среду для бактерий и отдельно осуществлять их культивирование, а также последующий асептический подсев бактерий в среду, используемую для получения основного интересуемого мицелия базидиальных грибов.

Здесь происходит резкое возрастание риска нарушения асептических условий из-за многозвенности процесса приготовления окончательного объема стерильной жидкой питательной среды, что может негативно сказаться на гарантии качества данной среды (нарушение стерильности и возможное присутствие в среде посторонних микробов-конкурентов).

Известен способ достижения ингибирования развития микробных контаминатов различной природы в составе питательной среды, предназначенной для последующего культивирования в ней необходимого грибного мицелия за счет внесения в состав питательной среды перекиси водорода в конечной концентрации 0,03-0,15% (R. Rush Wayne, Ph.D. Growing Mushrooms the Easy Way Home Mushroom Cultivation with Hydrogen Peroxide Volume I. Growing Mushrooms the Easy WayHome Mushroom Cultivation with Hydrogen Peroxide Copyright © 1999.).

Недостатки данного способа заключаются в следующем. В концентрациях, совместимых с ростом базидиальных грибов, перекись водорода не будет уничтожать все живые формы плесеневых контаминантов, находящихся в среде, (небольшие источники заражения при этом погибнут) и затем подвергнется быстрому разложению под воздействием энзимов, содержащихся в составе питательной среды.

Наиболее близким по техническому результату к заявляемому объекту является питательная среда на основе пивного сусла, содержащая концентрат («Концентрат КС») наноструктурных частиц коллоидного серебра в водной дисперсии (Герасименя В.П. Инновационные биотехнологии промышленного культивирования грибов Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm, используемых в фармакологической практике для создания медицинских препаратов / В.П. Герасименя, С.В. Захаров, В.М. Брусникин, М.А. Клыков, Л.П. Семашева; под ред. В.П. Герасимени, В.Ю. Полякова. - М.: Институт химической физики имени Н.Н. Семенова РАН, ООО «Инбиофарм», 2013, с. 158-160; 168).

Данная среда содержит добавку наносеребра, которая применяется в технологическом процессе двухстадийного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137, в качестве дополнительного вспомогательного средства к способам аэрации питательной среды в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл с объемом среды 300 мл, при одновременном создании асептических (стерильных) условий для глубинного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 на качалках в течение 7 суток (I пассаж) и глубинного культивирования ферментативного мицелия (II пассаж) до момента получения его биомассы в увеличенном объеме. Конечная концентрация наносеребра (коллоидного серебра) в водной фазе по данному изобретению составляет 0,005%.

Недостатком данной питательной среды для создания селективности при культивировании мицелия внутри ферментеров с помощью нанодисперсного серебра, взвешенного в водной фазе, является факт отсутствия 100% гарантии ингибирования культур нитчатых грибов-контаминантов, которые могут быть внесены вместе с необходимым для культивирования мицелием интересующего нас гриба.

Известно, что отдельные широко распространенные виды и штаммы нитчатых грибов способны расти в присутствии наноструктурного серебра, находящегося в составе питательной среды (Ребрикова Н.Л. Исследование действия наносеребра и нитрата серебра на рост микроскопических грибов. Перспективы использования наносеребра для защиты реставрационных материалов. Иммунопатология, аллергология, инфектология, Антимикотики и фунгициды. 2010, №1, с. 224).

Данные грибы-конкуренты при случайном попадании (нарушении правил асептики) в среду культивирования могут впоследствии составить серьезную конкуренцию культивируемому мицелию высших базидиальных грибов и вызвать порчу всего используемого объема питательной среды.

Таким образом, практически невозможно добиться гарантированной селективности данной жидкой питательной среды, используемой для длительного культивирования глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов. Другими словами, использование только одного коллоидного серебра как компонента, защищающего среду от возможной контаминации микробными агентами (бактериями и грибами), не может полноценно обеспечить длительную защиту всего объема питательной среды во время роста и развития в ней базидиальных грибов.

Задачей заявленного способа является обеспечение селективности среды для глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов в течение длительного времени без снижения его жизнеспособности и биологической активности, а также расширение области применения среды по заявляемому изобретению для более широкого круга видов базидиомицетов.

Питательная среда по заявляемому изобретению готовится на основе следующих компонентов: неохмеленное пивное сусло - 8-10%, углеводы - как энергетическая добавка и источник углерода, например глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза или их смесь (до 4%); мука зерновых в качестве источника азота (до 0,2%) и селективная добавка: перекись водорода и водный раствор коллоидного серебра (ТУ 9392-001-87997849-2009. Раствор серебра коллоидный. Иваново, 2009) в следующей конечной концентрации: перекись водорода 0,01-0,02% и водный раствор коллоидного серебра 0,0015-0,0045%.

Технический результат заключается в том, что добавление перекиси водорода и водного раствора коллоидного серебра в следующей конечной концентрации (перекись водорода 0,01-0,02% и водный раствор коллоидного серебра 0,0015-0,0045%) в состав питательной среды не вызывает ингибирующего воздействия на развитие мицелия базидиомицетов в ходе глубинного культивирования и предотвращает развитие в ходе длительного культивирования в ней случайно попавших из-за возможных нарушений правил асептики конкурентных микроорганизмов.

Пример 1

В жидкую питательную среду, содержащую пивное сусло (8-10%), углеводы (3,5%), муку зерновых (0,15%) и воду (остальное), добавляли перекись водорода - 0,01-0,02% и водный раствор коллоидного серебра - 0,0015%. Данную жидкую питательную среду засевали культурой Pleurotus ostreatus (Jacg.Fr) Kumm (3%) и смесью культур грибов Penicillun chrysogenum, Aspergillus niger van Thieghem, Trichoderma viride Pers.ex. Fr в виде суспензии спор (0,1%) как грибов-конкурентов. Пересев, выращивание культуры плесневых грибов, указанных выше, с оценкой их жизнеспособности выполняли по ГОСТ 9.048 (приложение 3). Суспензию спор, используемую в дальнейшем в эксперименте, готовили по ГОСТ 9.048 (приложение 4) в концентрации 1,0-2,0 млн/см³.

После внесения культур грибов в жидкую питательную среду осуществляли их глубинное совместное культивирование в термостатируемых условиях при 27°С в течение 4 суток. По окончании культивирования выполняли высевы полученного биологически активного материала, полученного в ходе длительного глубинного культивирования, на агаризованную питательную среду в чашках Петри без присутствия ингибиторов роста для нитчатых грибов - пивное сусло-агар и осуществляли культивирование данных чашек в течение 7-10 дней. Контролем в данном эксперименте был аналогичный эксперимент глубинного культивирования Pleurotus ostreatus (Jacg.Fr) Kumm и смеси нитчатых грибов без наличия в среде перекиси водорода и водного раствора коллоидного серебра. На всех чашках опыта в дальнейшем было обнаружено отсутствие роста культур нитчатых грибов и рост культуры гриба Pleurotus ostreatus (Jacg.Fr) Kumm.

Результатом данного эксперимента было подтверждение селективности жидкой питательной среды в отношении гриба Pleurotus ostreatus (Jacg.Fr) Kumm и ингибирование развития нитчатых грибов.

Пример 2

В жидкую питательную среду, содержащую пивное сусло (8-10%), углеводы (3,5%), мука зерновых (0,15%) и воду (остальное), добавляли перекись водорода - 0,01-0,02% и водный раствор коллоидного серебра - 0,0045%. Данную жидкую питательную среду засевали культурой Lentinus edodes (Berk.) Singer (3%) и смесью культур грибов Penicillun chrysogenum, Aspergillus niger van Thieghem, Trichoderma viride Pers. ex. Fr в виде суспензии спор (0,1%) как грибов-конкурентов. Пересев, выращивание культуры плесневых грибов, указанных выше, с оценкой их жизнеспособности выполняли по ГОСТ 9.048 (приложение 3). Суспензию спор, используемую в дальнейшем в эксперименте, готовили по ГОСТ 9.048 (приложение 4) в концентрации 1,0-2,0 млн/см³.

После внесения культур в жидкую питательную среду осуществляли их глубинное совместное культивирование в термостатируемых условиях при 27°С в течение 5-7 суток. По окончании культивирования выполняли высевы полученного биологически активного материала, полученного в ходе длительного глубинного культивирования, на агаризованную питательную среду в чашках Петри без присутствия ингибиторов роста для нитчатых грибов - пивное сусло-агар и осуществляли культивирование данных чашек в течение 10-14 дней. Контролем в данном эксперименте был аналогичный эксперимент глубинного культивирования Lentinus edodes (Berk.) Singer и смеси нитчатых грибов без наличия в среде перекиси водорода и водного раствора коллоидного серебра. На всех чашках в опыте было обнаружено отсутствие роста культуры гриба Penicillun sp.и рост культуры гриба Lentinus edodes (Berk.) Singer.

Результатом данного эксперимента было подтверждение селективности жидкой питательной среды в отношении гриба Lentinus edodes (Berk.) Singer и ингибирования развития всех нитчатых грибов по данному примеру.

Питательная среда для глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов, характеризующаяся тем, что она содержит следующие компоненты в количествах, %:

пивное сусло	8-10
углеводы	до 4
мука зерновых	до 0,2
перекись водорода	0,01-0,02
водный раствор коллоидного серебра	0,0015-0,0045
вода	остальное

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к штамму грибка Trichoderma asperellum ВКПМ F-1087 и его применению в качестве перспективного лекарственного средства для подавления активности противоопухолевых клеток человека.

Базовая композиция комплексного биопрепарата для растениеводства // 2620937

Изобретение относится к биологическим средствам для повышения продуктивности культурных растений и защиты их от болезней. Изобретение представляет собой базовую композицию комплексного биопрепарата для растениеводства, включающую в себя комплекс жирных кислот с преобладанием арахидоновой кислоты, продуцируемых микромицетом Mortierella alpina ВКПМ F-1134 и целевые добавки: биоразлагаемый детергент, а также аскорбиновую кислоту или α-токоферол или β-каротин, а среди жирных кислот присутствуют гептадекановая и эйкозановая кислоты, в ее составе также присутствуют продуцируемые штаммом Mortierella alpina ВКПМ F-1134 миристиновая, пентадекановая, пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, γ-линоленовая, дигомо- γ-линоленовая, эйкозадиеновая и гондоиновая жирные кислоты, содержание и соотношение которых не нормируется.

Штамм базидиомицета fomitopsis pinicola вкпм f-1285 - продуцент липидов // 2620078

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм базидиомицета Fomitopsis pinicola МТ-5.21 обладает способностью продуцировать липиды в условиях погруженного культивирования, с высоким содержанием липидной фракции.

Имеющая растительную основу альтернатива рубленому мясу // 2619290

Пищевой продукт на растительной основе, содержащий по меньшей мере 50 масс. % белка, в котором белок является глютеном, или белковой смесью, или экстрактом, содержащим по меньшей мере 80% глютеновой фракции, полученной из пшеницы, ячменя, риса, ржи или их комбинации после экстракции крахмала, в форме гранул, полученных экструзией, и подвергнут ферментации плесневыми грибами, выбранными из одного из видов, включающих Rhizopus, Mucor, Neurospora и Amylomyces, при этом продукт имеет структуру рубленого мяса.

Штамм гриба penicillium canescens - продуцент комплексного ферментного препарата, включающего пенициллопепсин, эндо-ксиланазу и β-глюканазу, способ получения ферментного препарата и его применение // 2616276

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм мицелиального гриба Penicillium canescens Рер-4 ВКМ F-4677D, являющийся продуцентом комплексного ферментного препарата, включающего пенициллопепсин (кислую протеазу), эндо-ксиланазу и бета-глюканазу.

Способ получения биологически активной добавки // 2615568

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано при производстве биологически активных добавок (БАД) пищевого, кормового и медицинского назначения.

Штамм базидиального гриба trametes hirsuta - продуцент этилового спирта // 2614263

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta МТ-24.24 обладает способностью продуцировать этиловый спирт.

Штамм гриба из класса sordariomycetes - продуцент антибиотика эремоксиларина а. // 2614126

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes ИНА 01108 обладает способностью продуцировать антибиотик эремоксиларин А.

Система культивирования клеток // 2612915

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложена система культивирования клеток, система для оценки эффекторных агентов кишечника, содержащая систему культивирования клеток, также предложены способы культивирования клеток, получения кишечного органоида и оценки лечения эффекторных агентов кишечника.

Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cs15, продуцирующий целлюлазу clostridium thermocellum, и способ его культивирования // 2612158

Настоящее изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и микробиологической промышленности, в частности к рекомбинантному штамму мицелиального гриба Penicillium canescens CS15 ВКМ F-4679D, секретирующего термостабильную целлюлазу Cel48S из Clostridium thermocellum.

Способ определения зоны почвенного питания бахчевых культур // 2621737

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Способ включает определение площади, занятой растениями, высеваемыми по гексагональной схеме.

Способ получения миниклубней картофеля // 2621571

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Способ получения миниклубней картофеля включает культивирование растительного материала in vitro посредством черенкования на одноглазковые микрочеренки в стерильных условиях на искусственной питательной среде, поэтапное черенкование по мере отрастания растений, укорачивание корневой системы и обработку места среза ростовым веществом.

Способ выращивания плодовых растений // 2621261

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к плодоводству. В способе при выращивании плодовых деревьев формируют кроны путем отгибания веток на уровне, не превышающем высоту снежного покрова.

Способ выращивания сои на семена в условиях среднего урала // 2621258

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к растениеводству. Способ включает подготовку почвы, семян, посев, уход за посевами и уборку.

Искусственные насаждения и способ их производства // 2621040

Группа изобретений относится к садоводству, в частности к области моделирования и выращиванию искусственных насаждений. Решение заключается в изготовлении трехмерного фиксирующего каркаса и закапывании части трехмерного фиксирующего каркаса в землю; установке ряда вспомогательных кольцевых зон выращивания в направлении восхождения на внешней окружной поверхности части трехмерного фиксирующего каркаса, расположенной над землей; прививке побегов в виде заданной формы, для сформирования блоков привитых побегов; высадке ряда блоков привитых побегов в каждую вспомогательную кольцевую зону выращивания и креплении блоков привитых побегов к трехмерному фиксирующему каркасу; формировании блока перепривитых побегов посредством прививки блоков привитых побегов соседних вспомогательных кольцевых зон выращивания; и формирование искусственного насаждения после того, как блоки перепривитых побегов разрастутся по истечении заданного периода времени.

Способ подбора сортов малины для выращивания в условиях республики коми // 2620012

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Способ включает оценку интродуцируемых в условиях Республики Коми растений малины относительно их отношения к метеорологическим условиям интродукционного района, оценку реакции этих растений, находящихся в фазе критического периода роста по показателям, в том числе к болезням, характерным для данного интродукционного района.

Способ определения зоны почвенного питания сельскохозяйственных культур // 2620009

Способ увеличения продуктивности топинамбура // 2619306

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Способ заключается в искусственном сокращении длины светового дня в течение определенного времени путем завязывания 5-6 верхних листьев над точкой роста.

Способ и устройство возделывания агрокультур по управляемым зонам // 2617340

Группа изобретений относится к области сельского хозяйства, в частности к реализации управляемых технологий земледелия, и может быть использовано в отрасли полевого растениеводства.

Способ выращивания рассады земляники в защищенном грунте // 2616835

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к садоводству. Способ включает посадку маточных растений и получение розеток.

Способ понижения радионуклидов в почве // 2621982

Изобретение относится к области сельского хозяйства и экологии, в частности к земледелию, и может найти применение при снижении радиоактивности почвы. Способ снижения радионуклидов в почве включает внесение минеральных и органических удобрений, известкование, посев сельскохозяйственных культур. На загрязненную почву вносят цеолитсодержащие глины: аланит, лескенит и диалбекулит, содержащие кальций в пределах 28-37% с реакцией среды (ph) более 8 по 1,5- 2 т/га каждого компонента в смеси с органическим удобрением - птичьим пометом в количестве 150-200 кг/га. Полученную смесь насыщают 0,2% водным раствором гумата калия с последующим посевом радиоаккумулирующих культур рыжика озимого и клевера инкарнатного в соотношении 1:2, а весной, в фазу бутонизации клевера зеленую массу скашивают и утилизируют. Способ позволяет снизить затраты на осуществление технического решения и радиацию почв на 82% за достаточно короткий период. 2табл., 1 пр.