Способ определения активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца



Способ определения активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца
Способ определения активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца
G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2622753:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный научно-практический центр сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННПЦССХ им. А.Н. Бакулева" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине и касается способа определения активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца, характеризующегося тем, что получают гомогенат биоптата ткани сердца, супернатант, полученный путем центрифугирования гомогената, разбавляют, затем один объем разбавленного супернатанта добавляют к пяти объемам смеси, состоящей из пептидного субстрата, содержащего дипептид His-Leu на С-конце, и ингибитора аминопептидазы, растворенных в буфере с рН 7,5-8,3, проводят реакцию, после чего определяют в реакционной среде содержание образованного дипептида His-Leu, при этом активность ангиотензин-превращающего фермента определяют по количеству микромолей His-Leu, образованному в единицу времени. Изобретение обеспечивает повышение точности определения активности ангиотензин-превращающего фермента в гомогенатах тканей, в которых его содержание невелико, в частности в биоптатах тканей сердца. 2 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для определения активности ангиотензин-превращающего фермента в биоптатах тканей сердца как потенциального маркера проаритмогенной активности.

Фибрилляция предсердий (синоним - мерцательная аритмия) - разновидность наджелудочковой тахиаритмии с хаотической электрической активностью предсердий с частотой импульсов 350-700 в минуту, что исключает возможность их координированного сокращения. Фибрилляция предсердий - наиболее часто встречающийся вид нарушений сердечного ритма, являющийся фактором риска развития тромбоэмболических осложнений и летальных исходов. Этим заболеванием страдают 1-2% общей популяции, этот показатель растет, и, по прогнозам экспертов, этот показатель в развитых странах будет увеличиваться в связи со старением населения. Приблизительно 1% больных относятся к возрастной группе старше 60 лет; тогда как уже 12% находятся в возрасте от 75 до 84 лет. Более трети больных с фибрилляцией предсердий относятся к возрастной группе 80 лет и старше [1-4].

Фибрилляция предсердий ассоциируется с 2-кратным увеличением смертности у женщин и 1,5-кратным у мужчин, 5-кратным увеличением риска инсульта, 3-6 кратным повышением риска сердечной недостаточности, 2-кратным риском развития деменции [2, 5]. Исследования показали, что у 20-30% больных с ишемическим инсультом диагностирована фибрилляция предсердий [3]. Поражение белого вещества головного мозга, нарушение когнитивных функций, снижение качества жизни, депрессивные состояния - сопутствующие проявления данного заболевания. Ежегодно от 10 до 40% пациентов с фибрилляцией предсердий госпитализируются в медицинские стационары [4].

Помимо того, что фибрилляция предсердий является причиной серьезных осложнений и инвалидизации пациентов, данное заболевание влечет за собой колоссальные экономические потери. Так, например, затраты, связанные с фибрилляцией предсердий, составляют около 1% от общего объема расходов на здравоохранение в Великобритании. Известно, что в США расходуется от 6 до 26 млн. долларов в год на лечение фибрилляции предсердий и ее многочисленных осложнений [2-5]. Не вызывает сомнения тот факт, что при отсутствии своевременной диагностики и эффективного лечения расходы, связанные с данным заболеванием, будут неуклонно расти.

В настоящее время не существует биохимических маркеров, позволяющих предсказать риск развития фибрилляции предсердий. Известно, однако, что в патогенезе фибрилляции предсердий важную роль играют компоненты ренин-ангиотензиновой системы [6, 7]. Показано, что у пациентов с фибрилляцией предсердий уровень экспрессии ангиотензин-превращающего фермента, продуцирующего ангиотензин II, в тканях сердца значительно (в 3 раза) повышен по сравнению с уровнем экспрессии фермента в сердце других пациентов [8]. Повышен у таких пациентов и уровень рецепторов к ангиотензину II [9]. У трансгенных мышей, у которых уровень экспрессии ангиотензин-превращающего фермента в сердце был значительно превышен по сравнению с нормой, наблюдались увеличенный размер предсердий, развитие фибрилляции предсердий и высокая частота случаев внезапной смерти [10]. Повышение экспрессии ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца приводит к уменьшению экспрессии коннексинов и к значительному снижению электропроводимости предсердий и желудочков, что может быть причиной развития аритмии [11]. Увеличение содержания ангиотензина II при повышении экспрессии ангиотензин-превращающего фермента способствует повышению содержания кальциевых каналов и уменьшению натриевых, что также увеличивает риск аритмии [7].

Таким образом, несомненна прямая связь повышенной экспрессии ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца и увеличения риска развития фибрилляции предсердий, то есть повышение уровня ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца является потенциальным маркером риска развития аритмии.

Уровень экспрессии фермента можно оценить методом иммуноферментного анализа с помощью моноклональных антител, направленных к ангиотензин-превращающему ферменту человека [12]. Метод является высокочувствительным, но дорогостоящим, сложным и требующим высокой профессиональной подготовки. Гораздо более распространенными являются методы, позволяющие оценивать уровень экспрессии ангиотензин-превращающего фермента косвенно, по его ферментативной активности.

Среди наиболее широко используемых в настоящее время на практике методов определения активности ангиотензин-превращающего фермента необходимо отметить следующие: 1) Спектрофотометрический метод, основанный на изменении оптической плотности среды при ферментативном гидролизе субстратов, содержащих хромофорную группу [13]. Метод несложный, но не позволяющий определять активность фермента в гомогенатах тканей при низком содержании фермента. 2) Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии [14] позволяет определять активность фермента в различных средах, в том числе в гомогенатах тканей, с использованием субстратов разнообразной структуры. Недостатком метода является сложность в проведении анализа, дороговизна и непригодность для массовых определений активности фермента. 3) Флуоресцентный метод, основанный на детекции продуктов гидролиза субстратов под действием ангиотензин-превращающего фермента с помощью их модификации с образованием флуорогена. Метод относительно дешев и пригоден для широкомасштабных измерений, поскольку может быть использован не только флуориметр, но и микропланшетный ридер.

В качестве прототипа предлагаемого способа нами выбран известный способ определения активности ангиотензин-превращающего фермента по скорости гидролиза синтетических трипептидных субстратов, содержащих дипептид His-Leu на С-конце. В результате ферментативного гидролиза происходит отщепление этого пептида, который затем модифицируют орто-фталевым альдегидом с образованием флуорогена и определяют его количество по флуоресценции при λвозб 370 нм, λэмис 500 нм, сравнивая сигнал флуоресценции с сигналом контрольного His-Leu [15].

Недостатком прототипа является то, что он обладает ограничениями применительно к тканям, в которых содержание ангиотензин-превращающего фермента невелико. Для достижения значимых сигналов флуоресценции за рациональное время (по крайней мере, в течение рабочего дня) необходимо использовать относительно концентрированные гомогенаты таких тканей, присутствие в которых эндогенных ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, а также аминопептидазы, расщепляющей His-Leu, может значительно искажать определяемые значения активности фермента, а именно приводить к существенному занижению результатов.

Известно, что в сердце содержание ангиотензин-превращающего фермента мало [16, 17], поэтому возникает необходимость создания метода корректного определения активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца как потенциального маркера риска развития фибрилляции предсердий.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, заключается в повышении точности определения активности ангиотензин-превращающего фермента в гомогенатах тканей, в которых его содержание невелико, в частности в биоптатах тканей сердца.

Заявляемый способ позволяет учесть присутствие эндогенных ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента и аминопептидазы в биоптатах тканей и определить в них истинную активность ангиотензин-превращающего фермента.

Технический результат достигается за счет того, что активность ангиотензин-превращающего фермента определяется при необходимом для диссоциации комплексов «эндогенный ингибитор - ангиотензин-превращающий фермент» разбавлении гомогенатов тканей сердца и при подавлении активности сопутствующей аминопептидазы.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для определения активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца получают гомогенат биоптата ткани сердца из исходного весового отношения ткани к буферу, равного 1:9. Супернатант, полученный путем центрифугирования гомогената, разбавляют в 10-30 раз. Затем один объем разбавленного супернатанта добавляют к пяти объемам смеси, состоящей из 0,2-2,5 мМ пептидного субстрата, содержащего дипептид His-Leu на С-конце, и 5-50 мкМ ингибитора аминопептидазы, растворенных в буфере с pH 7,5-8,3, содержащем 0,3 М NaCl, 1 мкМ ZnCl2. Проводят реакцию в течение 1-4 часов при 25-37°С. После чего определяют в реакционной среде содержание образованного дипептида His-Leu. При этом активность ангиотензин-превращающего фермента определяют по количеству микромолей His-Leu, образованному в единицу времени.

На фиг. 1 представлены зависимости наблюдаемой активности ангиотензин-превращающего фермента, выраженные в мЕд/мл (А) и в % (Б) от максимального значения, при гидролизе субстрата Cbz-L-Phe-L-His-L-Leu от разбавления супернатантов гомогенатов тканей сердца. Активность фермента определялась по скорости накопления продукта реакции His-Leu.

Обозначения: левое предсердие - черные ромбики, правое предсердие - прозрачные ромбики, левый желудочек - черные круги, правый желудочек - прозрачные круги.

На фиг. 2 представлены зависимости наблюдаемой активности ангиотензин-превращающего фермента, выраженные в мЕд/мл (А) и в % (Б) от максимального значения, при гидролизе субстрата Cbz-L-Phe-L-His-L-Leu в присутствии ингибитора аминопептидазы бестатина от разбавления супернатантов гомогенатов тканей сердца. Активность фермента определялась по скорости накопления продукта реакции His-Leu.

Обозначения: левое предсердие - черные ромбики, правое предсердие - прозрачные ромбики, левый желудочек - черные круги, правый желудочек - прозрачные круги.

Способ осуществляют следующим образом.

Из биоптатов тканей сердца получают гомогенаты при весовом соотношении ткань : буфер = 1:9 (г/г). После проведения экстракции фермента в буферный раствор гомогенаты центрифугируют для отделения нерастворимой фракции. Полученную жидкую фракцию гомогената разбавляют в 10-30 раз для диссоциации комплексов фермент-ингибитор и проводят гидролиз субстрата под действием ангиотензин-превращающего фермента в присутствии 5-50 мкМ ингибитора аминопептидазы. Для этого выбранный объем супернатанта добавляют к 5 объемам смеси, состоящей из 0,2-2,5 мМ пептидного субстрата, содержащего дипептид His-Leu на С-конце, например Cbz-Phe-His-Leu или Hip-His-Leu, и 5-50 мкМ ингибитора аминопептидазы, например бестатина, растворенных в буфере с pH 7,5-8,3, содержащем 0,3 М NaCl, 1 мкМ ZnCl2, и проводят реакцию в течение 1-4 часов при 25-37°С.

Останавливают реакцию путем добавления 2,5 объемов 1 н. NaOH и модифицируют продукт ферментативной реакции His-Leu путем внесения 0,5 объема 0,15 М орто-фталевого альдегида в метаноле. После инкубации в течение 10-20 мин и внесения одного объема 5 н. НС1 измеряют развившуюся флуоресценцию на флуориметре или микропланшетном ридере при длине волны возбуждения 379 нм и длине волны эмиссии 500 нм.

Фоновую флуоресценцию определяют аналогично, но супернатант вносят в реакционную смесь уже после добавления раствора щелочи.

Определяют флуоресценцию стандартных растворов продукта ферментативного гидролиза - His-Leu. Для этого к пяти объемам раствора His-Leu концентрацией от 0,005 до 0,25 мМ в том же буфере, в котором проводился гидролиз субстрата, добавляют по одному объему того же буфера для достижения общего объема раствора, равного объему реакционной смеси субстрата с супернатантом, а затем добавляют растворы щелочи, орто-фталевого альдегида и кислоты, как описано выше. Определяют флуоресценцию конечных растворов при указанных длинах волн. Строят калибровочную прямую по зависимости полученной флуоресценции от концентрации His-Leu.

Концентрацию продукта реакции His-Leu в реакционной смеси определяют по флуоресценции, полученной в результате проведения ферментативной реакции и последующей модификации продукта реакции орто-фталевым альдегидом, из величины которой вычитают фоновую флуоресценцию, а затем полученное значение соотносят с соответствующим значением флуоресценции на калибровочной прямой. Единица активности фермента представляет собой то количество препарата, которое образует 1 мкмоль His-Leu за 1 мин в указанных условиях.

Приводим конкретные примеры осуществления предлагаемого способа.

Пример 1. Ткани желудочков пациентов №1 и №3.

По 0,1 г ткани левого и правого желудочков из сердца разных пациентов измельчали в гомогенизаторе типа Поттер и проводили экстракцию белков, в том числе ангиотензин-превращающего фермента, 0,05 М фосфатным буфером, pH 7,5, содержащим 0,15 М NaCl, 1 мкМ ZnCl2 и 0,25% Тритон Х-100, при соотношении ткань : буфер = 1:9 (г/г). После инкубации гомогенатов в течение 16 часов при 4°С отделяли нерастворимый осадок центрифугированием, а супернатант использовали для определения активности ангиотензин-превращающего фермента по способу-прототипу, но при разных предварительных разведениях супернатанта. Для этого к 100 мкл 2,4 мМ раствора субстрата Cbz-Phe-His-Leu в 0,1 М фосфатном буфере, pH 8,3, содержащем 0,3 М NaCl и 1 мкМ ZnCl2, добавляли 20 мкл полученного супернатанта, предварительно разбавленного тем же буфером от 1 до 30 раз, и проводили реакцию в течение 1 часа. Образованный продукт реакции His-Leu модифицировали орто-фталевым альдегидом и измеряли флуоресценцию при длине волны возбуждения 370 нм и длине волны эмиссии 500 нм. Аналогично измеряли фоновую флуоресценцию для всех разведений супернатанта, но супернатант вносили в реакционную смесь после внесения раствора щелочи. Независимо строили калибровочный график флуоресценции при концентрациях His-Leu от 5 мкМ до 100 мкМ.

Определяли величины активности ангиотензин-превращающего фермента по соотнесению полученной в результате проведения ферментативной реакции флуоресценции, из которой была вычтена фоновая флуоресценция для соответствующего разведения супернатанта, с флуоресценцией на калибровочной прямой, и определению, таким образом, концентрации His-Leu, при которой такая флуоресценция наблюдалась. Определенная концентрация His-Leu соответствует той концентрации субстрата, которая подверглась гидролизу под действием фермента за время проведения реакции. За единицу активности ангиотензин-превращающего фермента принимали то его количество, которое гидролизует 1 мкмоль субстрата за 1 мин.

На фиг. 1 представлены зависимости величин определяемой активности ангиотензин-превращающего фермента от исходного разбавления супернатантов, полученных из гомогенатов желудочков, в пересчете на неразбавленные. Определяемые величины активности фермента в гомогенатах желудочков разных пациентов, выраженные как в единицах активности, так и в процентах от максимальной величины, зависели от разбавления супернатантов гомогенатов тканей нелинейно, а именно приведенная активность, то есть активность, пересчитанная на неразбавленный супернатант, росла с разбавлением, что указывает на присутствие в желудочках эндогенных ингибиторов фермента. Таким образом, определение активности по способу-прототипу без учета разбавления супернатантов, полученных при центрифугировании гомогенатов желудочков, может приводить к существенным ошибкам в определении активности фермента. Для того чтобы можно было пренебречь интерферирующим действием ингибиторов, супернатанты гомогенатов желудочков необходимо разбавить в 10-30 раз.

Пример 2. Ткани предсердий пациентов №2 и №5.

По 0,1 г ткани левого и правого предсердий разных пациентов измельчали в гомогенизаторе типа Поттер и проводили экстракцию белков, в том числе ангиотензин-превращающего фермента, как описано в примере №1, при соотношении ткань : буфер = 1:9 (г/г). После инкубации гомогената в течение 16 часов при 4°С отделяли нерастворимый осадок центрифугированием, а супернатант использовали для определения активности ангиотензин-превращающего фермента, как описано в примере 1.

На фиг. 1 представлены зависимости величин определяемой активности ангиотензин-превращающего фермента от исходного разбавления супернатантов, полученных из гомогенатов предсердий, в пересчете на неразбавленные. Определяемые величины активности фермента в гомогенатах предсердий разных пациентов, выраженные как в единицах активности, так и в процентах от максимальной величины, зависели от разбавления супернатантов гомогенатов тканей нелинейно, а именно приведенная активность росла с разбавлением, что указывает на присутствие в предсердиях эндогенных ингибиторов фермента. Таким образом, определение активности по способу-прототипу без учета разбавления супернатантов, полученных при центрифугировании гомогенатов предсердий, может приводить к существенным ошибкам в определении активности фермента. Для того чтобы можно было пренебречь интерферирующим действием ингибиторов, супернатанты гомогенатов предсердий необходимо разбавить в 10-30 раз.

Пример 3. Ткани желудочков пациентов №1 и №3.

По 0,1 г ткани левого и правого желудочков разных пациентов измельчали в гомогенизаторе типа Поттер и проводили экстракцию белков, в том числе ангиотензин-превращающего фермента, как описано в примере 1, при соотношении ткань : буфер = 1:9. После инкубации гомогенатов в течение 16 часов при 4°С отделяли нерастворимый осадок центрифугированием, а супернатант использовали для определения активности ангиотензин-превращающего фермента по предложенному способу. Для этого к 100 мкл 2,4 М раствора субстрата Cbz-Phe-His-Leu и 5 мкМ ингибитора аминопептидазы бестатина в 0,1 М фосфатном буфере, pH 8,3, содержащем 0,3 М NaCl, 1 мкМ ZnCl2, добавляли 20 мкл полученного супернатанта, предварительно разбавленного от 1 до 30 раз, и проводили реакцию в течение 4 часов. Определяли концентрацию образованного продукта реакции His-Leu, как описано в примере 1.

На фиг. 2 представлены зависимости величин определяемой активности ангиотензин-превращающего фермента в присутствии ингибитора аминопептидазы от исходного разбавления супернатантов, полученных из гомогенатов желудочков, в пересчете на неразбавленные. Определяемые таким образом активности ангиотензин-превращающего фермента, выраженные как в единицах активности, так и в процентах от максимальной величины, зависели от разбавления супернатантов, но слабее, чем в отсутствие ингибитора аминопептидазы. Более того, полученные по предложенному способу величины активности ангиотензин-превращающего фермента при максимальных разбавлениях супернатантов гомогенатов желудочков превышали аналогичные значения, полученные в отсутствие ингибитора аминопептидазы, как описано в примере 1 и представлено на фиг. 1.

Таким образом, внесение в реакционную среду субстрата с ферментом ингибитора аминопептидазы приводит к увеличению наблюдаемой активности ангиотензин-превращающего фермента при небольших предварительных разведениях супернатантов гомогенатов желудочков до 10 раз, что связано с блокированием активности аминопептидазы и сохранением тем самым накапливающегося His-Leu в реакционной среде. В целом, необходимое предварительное разведение супернатантов гомогенатов желудочков вкупе с проведением ферментативной реакции в присутствии ингибитора аминопептидазы позволяет минимизировать возможные ошибки в определении активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях желудочков.

Пример 4. Ткани предсердий пациента №2 и №5.

По 0,1 г ткани левого и правого предсердий разных пациентов измельчали в гомогенизаторе типа Поттер и проводили экстракцию белков, в том числе ангиотензин-превращающего фермента, как описано в примере 1, при соотношении ткань : буфер = 1 : 9. После инкубации гомогената в течение 16 часов при 4°С отделяли нерастворимый осадок центрифугированием, а супернатант использовали для определения активности ангиотензин-превращающего фермента по предложенному способу. Для этого к 100 мкл 2,4 М раствора субстрата Cbz-Phe-His-Leu и 50 мкМ ингибитора аминопептидазы бестатина в 0,1 М фосфатном буфере, pH 8,3, содержащем 0,3 М NaCl, 1 мкМ ZnCl2, добавляли 20 мкл полученного супернатанта, предварительно разбавленного от 1 до 30 раз, и проводили реакцию в течение 4 часов. Определяли концентрацию образованного продукта реакции His-Leu, как описано в примере 1.

На фиг. 2 представлены зависимости величин определяемой активности ангиотензин-превращающего фермента в присутствии ингибитора аминопептидазы от исходного разбавления супернатантов, полученных из гомогенатов предсердий, в пересчете на неразбавленные. Определяемые таким образом активности ангиотензин-превращающего фермента зависели от разбавления супернатантов, но слабее, чем в отсутствие ингибитора аминопептидазы. Более того, полученные по предложенному способу величины активности ангиотензин-превращающего фермента при максимальных разбавлениях супернатантов гомогенатов предсердий превышали аналогичные значения, полученные в отсутствие ингибитора аминопептидазы, как описано в примере 2 и представлено на фиг. 1.

Таким образом, внесение в реакционную среду субстрата с ферментом ингибитора аминопептидазы приводит к увеличению наблюдаемой активности ангиотензин-превращающего фермента при небольших предварительных разведениях супернатантов гомогенатов предсердий до 10 раз, что связано с блокированием активности аминопептидазы и сохранением тем самым накапливающегося His-Leu в реакционной среде. В целом, необходимое предварительное разведение супернатантов гомогенатов предсердий вкупе с проведением ферментативной реакции в присутствии ингибитора аминопептидазы позволяет минимизировать возможные ошибки в определении активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях предсердий.

Всего по предложенному способу определение активности ангиотензин-превращающего фермента было выполнено на 36 образцах тканей (левого и правого желудочков, а также левого и правого предсердий) разных отделов сердца пациентов, полученных post mortem.

Верификацию предложенного способа осуществляли сопоставляя величины активности ангиотензин-превращающего фермента в супернатантах, полученных из гомогенатов тканей сердца, а также активности очищенного фермента, гомогенного по SDS-электрофорезу, с определяемым количеством активного иммунореактивного белка, преципитируемого на плашке с иммобилизованными моноклональными антителами к ангиотензин-превращающему ферменту по [12]. При определении активности ангиотензин-превращающего фермента предложенным методом соотношение величин активности и иммунореактивного белка было одинаковым для высокоочищенного фермента и фермента в супернатантах, полученных из гомогенатов разных отделов сердца. В то же время определение активности ангиотензин-превращающего фермента по способу-прототипу [15] приводило к занижению активности фермента в супернатантах, полученных из гомогенатов тканей сердца, в 1,5-3 раза.

Таким образом, предложенный способ позволяет оценить истинное содержание ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца.

Литература:

1. Go A.S., Hylek Е.М., Phillips K.А., et al. Prevalence of diagnosed atrial fibrillation in adults: national implications for rhythm management and stroke prevention: the Anticoagulation and Risk Factors in Atrial Fibrillation (ATRIA) Study. JAMA, 2001, 285, 2370-5.

2. January et al. Executive Summary: AHA/ACC/HRS Atrial Fibrillation Guideline. JACC, 201, 64, 2246-80.

3. Диагностика и лечение фибрилляции предсердий. Рекомендации РКО, ВНОА и АССХ, 2012 г.

4. 2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS. EHJ-August, 2016.

5. T.F.. Atrial fibrillation and stroke: risk factors, anticoagulation, and left atrial appendage occluders. Eur Heart J, 2016, 37, 2443-2445.

6. Ehrlich JR, Hohnloser SH, Nattel S. Role of angiotensin system and effects of its inhibition in atrial fibrillation: clinical and experimental evidence. Eur Heart J, 2006, 27, 512-518.

7. Iravanian S, Dudley SC. The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) and cardiac arrhythmias. Heart Rhythm, 2008, 5, S12-S17.

8. Goette A., Staack Т., С., et al. Increased expression of extracellular signal-regulated kinase and angiotensin-converting enzyme in human atria during atrial fibrillation. J. Am. Coll. Cardiol., 2000, 35, 1669-77.

9. Boldt A., Wetzel U., Weigl J., et al. Expression of angiotensin II receptors in human left and right atrial tissue in atrial fibrillation with and without underlying mitral valve disease. J. Am. Coll. Cardiol., 2003, 42, 1785-1792.

10. Xiao H.D., Fuchs S., Campbell D.J., et al. Mice with cardial-restricted angiotensin-converting enzyme (ACE) have atrial enlargement, cardiac arrithmia, and sudden death. Am. J. Pathol., 2004, 165, 1019-1032.

11. Kasi V.S., Xiao H.D., Shang L.L., et al. Cardiac-restricted angiotensin-converting enzyme overexpression causes conduction defects and connexin dysregulation. Am. J. Heart Circ. Physiol, 2007, 293, 182-192.

12. Danilov S, Savoie F, Lenoir B, et al. Development of enzyme-linked immunoassays for human angiotensin I converting enzyme suitable for large-scaled studies. J Hypertens, 1996, 14, 719-727.

13. Holmquist В, P, Riordan JF. A continuous spectrophotometric assay for angiotensin-converting enzyme. Anal Biochem, 1979, 95, 540-548.

14. Menq QC, Balcells E, Dell'Italia L, et al. Sensitive method of quantitation of angiotensin-converting enzyme (ACE) activity in tissue. Biochem Pharmacol, 1995, 50, 1445-1450.

15. Piquilloud Y., Reinharz A., Roth M. Studies on the angiotensin converting enzyme with different substrates. Biochim. Biophys. Acta-Enzymology, 1970, 206, 136-142.

16. Vago T, Bevilacqua M, Conci F, et al. (1992) Angiotensin converting enzyme binding sites in human heart and lung: comparison with rat tissues. Br J Pharmacol 197: 821-825.

17. Barreto-Chaves ML, Heimann A, Krieger JE (2000) Stimulatory effect of dexamethasone on angiotensin-converting enzyme in neonatal rat cardiac myocytes. Braz J Med Biol Res 33: 661-664.

Способ определения активности ангиотензин-превращающего фермента в тканях сердца, характеризующийся тем, что получают гомогенат биоптата ткани сердца с весовым соотношением ткани к буферу, равным 1:9, супернатант, полученный путем центрифугирования гомогената, разбавляют в 10-30 раз, затем один объем разбавленного супернатанта добавляют к пяти объемам смеси, состоящей из 0,2-2,5 мМ пептидного субстрата, содержащего дипептид His-Leu на С-конце, и 5-50 мкМ ингибитора аминопептидазы, растворенных в буфере с рН 7,5-8,3, содержащем 0,3 М NaCl, 1 мкМ ZnCl2, проводят реакцию в течение 1-4 часов при 25-37°С, после чего определяют в реакционной среде содержание образованного дипептида His-Leu, при этом активность ангиотензин-превращающего фермента определяют по количеству микромолей His-Leu, образованному в единицу времени.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики вагинита у девочек в возрасте до 8 лет, заключающийся в том, что используют ПЦР в режиме реального времени с определением в образце числа геномов Lactobacillus spp.

Изобретение относится к области профилактической медицины, экологии человека, педиатрии и может быть использовано для диагностики у детей функционального расстройства центральной нервной системы, ассоциированного с сочетанным техногенным воздействием.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) тяжелой или средней степени тяжести в программе ЭКО.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения протеогликанов из мочи. Способ заключается в том, что мочу первоначально охлаждают, выдерживают до образования агрегатов, центрифугируют для выпадения осадка, не содержащего протеогликана, после чего к надосадочной жидкости для осаждения протеогликана добавляют осадитель в соотношении 1:1, состав которого включает 4 объема 96° этилового спирта и 1 объем 0,01 N раствора гидроксида натрия, после чего смесь оставляют, не изменяя температурный режим, на 20 мин для образования агрегатов, которые отделяют центрифугированием, а затем осадок протеогликана отделяют от надосадочной жидкости в режиме охлаждения при 0°C центрифугированием, осадок отмывают повторным добавлением охлажденного до 0°C осадителя в соотношении 1:10, выдерживают в течение 5 мин для образования агрегатов, вновь центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость, полученный осадок растворяют добавлением 0,01 N раствора HCl, снижая значения pH конечного продукта до pH 7,2, оставшийся незначительный нерастворимый осадок отделяют центрифугированием, а надосадочную жидкость, содержащую очищенный протеогликан, используют по назначению.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ отбора веществ для направленной модуляции иммунного ответа при вакцинации против чумы людей, характеризующийся тем, что выполняется ex vivo на суспензии клеток крови, полученной до и через месяц после вакцинации, инкубированных с тестируемым веществом при 37°С в течение 24 ч с определением в образцах продукции цитокинов - IL-17, IFN-γ, TNF-α, IL-4 и последующей математической обработкой полученных данных с использованием коэффициентов и индексов, и при значении коэффициента эффективности стимуляции тестируемым веществом Т-клеточного звена иммунной системы (КЭИ) тестируемого вещества, превышающего КЭИ для контроля 2 в диапазоне от 1,5 до 3,0 раз, тестируемое вещество считается пригодным для направленной модуляции иммунного ответа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, и предназначено для прогнозирования развития ВПЧ-ассоциированных цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN).
Изобретение относится к медицине, а именно к психофизиологической диагностике, и может быть использовано для выявления риска аддиктивного поведения у подростков и лиц юношеского возраста, учащихся образовательных учреждений.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики врожденного нефротического синдрома финского типа у детей с использованием технологии секвенирования нового поколения.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики гликогеновой болезни IXa типа у детей с использованием технологии секвенирования нового поколения.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования развития коморбидной формы артериальной гипертензии (АГ) и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии и инфекционным болезням, и может быть использовано для прогнозирования развития постинфекционной гастроэнтерологической патологии у детей, реконвалесцентов острых вирусных гастроэнтеритов. Сущность способа: определяют уровень аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови в острый период болезни, рассчитывают показатели линейных дискриминантных функций ЛДФ1 (отсутствие развития гастроэнтерологической патологии) и ЛДФ2 (наличие развития гастроэнтерологической патологии) по формуламЛДФ1 = -6,03+2,40X1+0,83Х2++0,64Х3-1,42X4+0,64Х5;ЛДФ2 = -12,63+2,75X1+1,13X2++0,93Х3+2,02X4+5,09Х5, где X1 - характер лихорадки в первые сутки болезни (1 - субфебрильная: 37,0-37,9°С; 2 - фебрильная: 38,0-38,9°С; 3 - высокая фебрильная: 39,0-39,9°С; 4 - гиперпиретическая: 40,0°С и более); Х2 - частота жидкого стула в первые сутки болезни; Х3 - количество эпизодов рвоты в первые сутки болезни; Х4 - уровень аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови в острый период болезни (0 - нормальный; 1 - повышенный); Х5 - применение антибактериальных препаратов для лечения на догоспитальном этапе (0 - нет; 1 - есть). Сравнивают значения показателей ЛДФ1 и ЛДФ2 и прогнозируют развитие постинфекционной функциональной гастроэнтерологической патологии при ЛДФ2>ЛДФ1. Использование способа позволит повысить эффективность профилактики и предупредить формирование постинфекционных заболеваний органов пищеварения функциональной природы, уменьшить число неблагоприятных исходов реабилитации. 2 пр., 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, и предназначено для прогнозирования риска снижения эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелем и препаратами ацетилсалициловой кислоты (АСК) у больных ишемической болезнью сердца (ИБС), подвергшихся стентированию коронарных артерий. Из венозной крови пациентов выделяют ДНК. Полиморфные варианты Т-786С гена NOS3 определяют путем аллель-специфичной ПЦР. Детекцию продуктов ПЦР проводят электрофоретическим методом. Повышенный риск снижения эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелем и препаратами ацетилсалициловой кислоты прогнозируют у носителей генотипа -786СС гена NOS3. Изобретение позволяет провести оценку риска формирования резистентности к антиагрегантным препаратам и своевременно скорректировать проводимую терапию и повысить качество лечения. 2 табл., 3 пр.
Группа изобретений относится к медицине и касается способа диагностики дифтерии, предусматривающего забор клинического материала от больного, выделение из него ДНК, смешивание выделенной ДНК и смеси №1, содержащей ПЦР буфер, смесь нуклеотидов (dNTP), MgCl2, раствор Betaine, праймеры, нагревание, последующее охлаждение, добавление смеси №2, содержащей рабочее разведение Bst полимеразы; проведение изотермальной амплификации, детекцию продуктов амплификации при горизонтальном электрофорезе в агарозном геле путем сравнения электрофоретической подвижности полученных фрагментов ДНК с подвижностью контрольного образца ДНК токсигенного штамма Corynebacterium diphtheriae и диагностику дифтерии. Группа изобретений также касается набора для диагностики дифтерии. Группа изобретений обеспечивает ускорение, упрощение диагностики дифтерии, высокую чувствительность и специфичность за счет одновременной верификации токсигенных и нетоксигенных штаммов возбудителя с уточнением механизмов отсутствия экспрессии гена дифтерийного токсина. 2 н.п. ф-лы, 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано у недоношенных новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела. Способ заключается в том, что у новорожденного с очень низкой и экстремально низкой массой тела на 1-2 сутки жизни определяют показатель тромбоэластограммы 30-минутный лизис сгустка крови (LY30). Затем учитывают вид респираторной терапии, концентрацию кислорода во вдыхаемом воздухе (fiO2) на момент взятия крови и рассчитывают дискриминантную функцию (Y) по формуле:Y=8,288-0,081×X1-2,553×Х2-0,056×Х3, гдеX1 - показатель LY30 в %;Х2 - вид респираторной терапии:назальный СРАР - 1 балл, ИВЛ - 2 балла;Х3 - концентрация fiO2 в %и при значении Y<0 прогнозируют кровотечение. Предлагаемый способ с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью обеспечивает возможность прогнозирования кровотечений у новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела, что позволяет своевременно определить тактику лечебных мероприятий. 4 пр., 1 табл.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу оценки фибринолитической активности слезной жидкости. Способ оценки фибринолитической активности слезной жидкости включает отбор слезы из нижнего конъюнктивального свода глаз, титрование анализируемой слезной жидкости путем проведения серии из двукратных разведений с помощью буферного раствора, добавление к полученным образцам латексного реагента, содержащего мышиные моноклональные антитела к Д-димеру фибрина, далее смесь перемешивают, регистрируют реакцию агглютинации в пробе при наибольшей величине разведения и рассчитывают концентрацию Д-димера по формуле:С(Д-димер)=200×d, нг/мл,где С - концентрация Д-димера (нг/мл), d - наибольшая величина разведения, 200 - чувствительность реагента, при этом концентрацию Д-димера 3200 нг/мл считают пороговой для подтверждения повышения активности системы фибринолиза слезной жидкости для оценки фибринолитической активности слезной жидкости с использованием в качестве маркера концентрацию Д-димера в слезной жидкости в слезной жидкости. Вышеописанный способ позволяет эффективно проводить оценку фибринолитической активности слезной жидкости. 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. Для выбора индивидуального объема локорегионарной лучевой терапии после хирургической операции по поводу люминального подтипа рака молочной железы (МЖ) проводят морфологическое исследование подмышечных лимфоузлов с метастазами. При этом определяют экспрессию Ki 67. В случае Ki 67<20% проводят облучение оставшейся ткани МЖ или послеоперационного рубца после ее удаления, а также тканей передней грудной стенки и зоны нижних и средних лимфатических узлов подмышечной области. При Ki 67≥20% проводят облучение оставшейся ткани МЖ или послеоперационного рубца после ее удаления, а также тканей передней грудной стенки и зоны лимфатических узлов подмышечной и подключичной области. Способ обеспечивает существенное снижение лучевой нагрузки при облучении пациентов раком МЖ, короткие сроки реабилитации. 2 пр.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования инвалидности у детей с ишемическим инсультом. Определяют 28 параметров: оценка по шкале Апгар, тромботические события у кровных родственников в возрасте до 50 лет, диспансерное наблюдение у невролога в течение первого года жизни, инфекционное заболевание до инсульта, «часто болеющий ребенок, первоначально диагноз «инсульт» не был установлен, в течение первых 6 часов имелись признаки парезов или параличей конечностей, при проведении нейровизуализации очаг инфаркта зафиксирован в течение первых суток, инсульт локализуется в бассейне задней мозговой артерии, внутривенная инфузия включала раствор MgSO4, применение антибактериальной терапии, гемотрансфузионной терапии, признаки комы сохраняются на 7-е сутки пребывания в стационаре, судорожный синдром сохраняется или появился на 7-е сутки пребывания в стационаре, признаки пареза или паралича конечностей сохраняются на 7-е сутки пребывания в стационаре, признаки бульбарного паралича сохраняются на 7-е сутки пребывания в стационаре, признаки пареза глазодвигательной группы черепных нервов сохраняются на 7-е сутки пребывания в стационаре, потребность в искусственной вентиляции легких сохраняется на 7-е сутки пребывания в стационаре, антитромботическая и антиэпилептическая терапия рекомендована при выписке из стационара, количество эритроцитов, количество лейкоцитов, количество тромбоцитов, тромбоцитопения, СОЭ, лейкоцитарная формула, фибриноген в общем анализе крови в остром периоде болезни, в остром периоде болезни зафиксирована патология строения сердца по результатам эхокардиографии. Рассчитывают интегративный прогностический индекс (ИПИ) по заявленной формуле. При значении ИПИ меньше нуля прогнозируют отсутствие инвалидности. При ИПИ больше нуля – прогнозируют присвоение инвалидности после окончания восстановительного периода ишемического инсульта в детском возрасте. Способ позволяет точно прогнозировать развитие инвалидности у детей с ишемическим инсультом за счет комплексной оценки наиболее значимых параметров. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ полиморфизмов генов. При выявлении сочетания генетических вариантов матриксных металлопротеиназ: генотипа АА rs1320632 MMР-8 и аллеля С rs11225395 MMР-8 прогнозируют высокий риск развития эссенциальной гипертензии. Изобретение позволяет на доклиническом этапе формировать среди индивидуумов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития заболевания. 3 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения кардио-генеративного потенциала клеток млекопитающих, включающий сбор измеренных уровней экспрессии в клетках млекопитающих генов Nkx2.5, Tbx5, MEF2C, GATA4, GATA6, Mesp1, FOG1 и определение коэффициента кардиального генеративного потенциала (CARPI) как среднего значения измеренных уровней экспрессии указанных генов указанных клеток. Изобретение обеспечивает хорошую прогнозируемость успеха восстановления сердца. 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и касается способа прогнозирования эффективности терапии ишемии миокарда у больных ХОБЛ и ИБС. Сущность способа заключается в том, что проводят оценку в остром периоде при поступлении в клинику уровня маркеров воспаления в крови, ИЛ-6, СРБ, ФНО-α и инструментальные исследования спирографию, холтеровское мониторирование ЭКГ. Далее рассчитывают коэффициент прогнозирования по формуле:КпрогнДлит = 1,19532 - 0,171896*lechen - 0,00392163*CRB + 0,000232908*IL_6- 0,00328536*FNO - 0,00626344*OFB_1 + 0,00898338*prist_1 +0,00282975*dlit_1 - 0,00522293*kachel + 0,000463957*mokrota, где lechen – вид лечения (1- стандартная терапия, 2 – терапия с добавлением рофлумиласта), CRB – С-реактивный белок, измеренный в венозной крови, мг/л, IL_6 – интерлейкин-6, измеренный в венозной крови, пг/мл, FNO – фактор некроза опухоли α, измеренный в венозной крови, пг/мл, OFB_1 – ОФВ-1 по результатам спирографии, %, prist_1 – количество приступов стенокардии в неделю по дневнику самоконтроля, dlit_1 – длительность ишемии миокарда в сутки по результатам холтеровского мониторирования ЭКГ, kachel – количество кашлевых толчков в сутки по дневнику самоконтроля, шт.; mokrota – количество выделяемой мокроты в сутки по дневнику самоконтроля, мл, и при КпрогнДлит 0,63 и более эффективность стандартной терапии, включающей беродуал, дексаметазон, цефтриаксон, эуфиллин, высокая и дополнительных назначений лекарственных средств не требуется; при выявлении КпрогнДлит менее при выявлении КпрогнДлит менее 0,63 стандартная терапия не даст должный эффект и потребуется добавление рофлумиласта. Использование способа позволяет с высокой точностью спрогнозировать эффективность схемы противовоспалительной терапии еще до её практического применения у пациентов с ХОБЛ в сочетании с ИБС. 2 табл.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2016-11-17 2017-06-23T07:34:34
Наверх