Штамм haemophilus influenzae spb тип в - высокоактивный продуцент капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата

Авторы патента:

Трухин Виктор Павлович (RU)

Начарова Елена Петровна (RU)

Конон Анастасия Дмитриевна (RU)

Петровский Станислав Викторович (RU)

Красильников Игорь Викторович (RU)

Евтушенко Анатолий Эдуардович (RU)

Салимова Елена Леонидовна (RU)

Уйба Станислав Валентинович (RU)

C12R1/21 - Схема кодирования для подклассов C12C-C12Q или C12S, относящаяся к микроорганизмам

C12P19/04 - полисахариды, т.е. соединения, содержащие более пяти сахаридных радикалов, связанных друг с другом гликозидными связями

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

A61K39/02 - бактериальные антигены

Владельцы патента RU 2624014:

Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства России (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, обладающий высокоактивной продуктивностью капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-7884. Изобретение обеспечивает синтез полирибозилрибитолфосфата 250-300мкг/мл при минимальном времени культивирования (6 часов). 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Штамм HAEMOPHILUS INFLUENZAE SPB тип b - высокоактивный продуцент капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата (далее - изобретение) относится к области биотехнологии и медицины. Целью данного изобретения является получение капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата для дальнейшего промышленного производства иммунобиологических препаратов. Для достижения поставленной цели предлагается штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, выделенный от больного ребенка в г. Санкт-Петербург и депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под номером В-7884. Данный штамм обладает способностью синтезировать полирибозилрибитолфосфат в высокой концентрации при росте на полусинтетической питательной среде.

Для профилактики инфекций, вызванных Haemophilus influenzae тип b, используют моно- и комбинированные вакцины, действующим веществом в которых является полирибозилрибитолфосфат - капсульный полисахарид возбудителя. Одними из основных факторов, влияющих на эффективность промышленного производства данных вакцин, являются продуктивность штамма, скорость его роста, себестоимость питательной среды.

Известен способ получения капсульного полисахарида при помощи штамма Haemophilus influenzae b Mech №1, который при росте на синтетической и полусинтетической (на основе аминопептина) питательных средах синтезировал полирибозилрибитолфосфат в количестве 100 и 50 мкг/мл соответственно (патент RU 2257412, 27.07.2005 С1, Елкина СИ., Ястребова Н.Е., Орлова О.Е., Ванеева Н.П., Сергеев В.В., Апарин П.Г., Львов В.Л. «Штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 - продуцент капсульного полисахарида - полирибозилрибитолфосфата»). Время культивирования в жидкой питательной среде составляет 6-8 часов после достижения культурой стационарной фазы роста.

В патенте (патент RU 2465316, 27.10.2012, Ванеева Н.П., Елкина СИ., Апарин П.Г. «Штамм бактерий Haemophilus influenzae b 326, стабильный продуцент капсульного полисахарида») описан штамм Haemophilus influenzae В 326 - стабильный продуцент капсульного полисахарида. При росте на синтетической (среда Klein с факторами роста) и полусинтетической (дополнительно содержит казеиновый пептон) питательных средах данный штамм синтезирует 90-150 и 80-130 мкг/мл полирибозилрибитолфосфата соответственно. Длительность культивирования не превышает 8 часов.

Задачей настоящего изобретения является получения продуктивного штамма-продуцента полирибозилрибитолфосфата.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении продукции полирибозилрибитолфосфата.

В отличии от аналогов предлагаемый штамм Haemophilus influenzae SPB тип b (№В-7884 в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека) синтезирует большее количество полирибозилрибитолфосфата (250-300 мкг/мл) за меньший период культивирования (6 часов).

Первичная идентификация культуры Haemophilus influenzae SPB тип b была проведена по фенотипическим и серологическим признакам на базе Федерального государственного унитарного предприятия «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России).

Вторичная идентификация была проведена по фенотипическим, серологическим и генотипическим признакам на базе Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Серологическое исследование провели с использованием моновалентной сыворотки тип b (Becton, Dickinson and Company, США), генетическое - с помощью масс-спектрометра MALDI-Biotyper (Bruker, Германия) и анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК.

Морфологические признаки Haemophilus influenzae SPB тип b

Культура представлена мелкими неподвижными грамотрицательными неспорообразующими палочками овоидной формы размером 0,3-0,5×0,2-0,3 мкм, возможен полиморфизм, деление клеток происходит перетяжкой. На поверхности клеток образуется легкоотделяемый капсульный полисахарид. По отношению к кислороду культура - факультативный анаэроб.

Культуральные особенности Haemophilus influenzae SPB тип b

На твердой питательной среде шоколадный агар образует округлые мелкие (0,5-3 мм) выпуклые матовые колонии серого цвета с гладкой поверхностью. У молодых колоний края ровные, которые по мере старения культуры становятся волнистыми. При культивировании данного штамма на полусинтетической жидкой питательной среде для культивирования Haemophilus influenzae тип b (состав приведен в примере 1) наблюдается равномерное помутнение среды и незначительный придонный рост.

Биохимические свойства Haemophilus influenzae SPB тип b

Штамм оксидазо- и каталазоположительный, по типу питания- хемоорганотроф. Штамм является ауксотрофом и требует для роста факторов роста никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и протопорфирин IX (или протогем).

Серологические свойства Haemophilus influenzae SPB тип b

Штамм проявляет агглютинирующие свойства к сыворотке специфичной к Н. influenzae типа b.

Антигенные свойства Haemophilus influenzae SPB тип b

Штамм синтезирует антиген полирибозилрибитолфосфат - капсульный полисахарид, который играет основную роль в его вирулентности.

Генетические характеристики Haemophilus influenzae SPB тип b

При анализе нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК была определена последовательность размером 1395 п.н.

Штамм Haemophilus influenzae SPB тип b хранят при температуре - (80±3)°С в полусинтетической питательной среде для культивирования Haemophilus influenzae тип b (состав приведен в примере 1) в смеси с 80% глицерином (соотношение 1:4).

Подробное получение капсульного полисахарида на жидкой полусинтетической питательной среде для культивирования Haemophilus influenzae тип b (состав приведен в примере 1) в зависимости от способа подготовки посевного материала описано далее в примерах.

Пример 1. Синтез полирибозилрибитолфосфата штаммом Haemophilus influenzae SPB тип b в зависимости от различных компонентных комбинаций шоколадного агара, используемого при получении инокулята

Культуру из криопробирки в объеме 0,2 мл пересевали на шоколадный агар различного состава. Инкубацию посевов проводили в СО₂-инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при температуре (35±2)°С в течение 24 ч. Для культивирования использовали готовые чашки с шоколадным агаром (вариант 1, производитель Becton and Dickinson), приготовленный в лабораторных условиях шоколадный агар с добавкой IsoVitaleX (1%, объемная часть) согласно инструкции (вариант 2, основа шоколадного агара и добавка IsoVitaleX производства Becton and Dickinson, среда приготовлена ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) и приготовленный в лабораторных условиях шоколадный агар с добавкой IsoVitaleX (1%, объемная часть) с дополнительно внесенными факторами роста, а именно НАД - 0,02 г/л; гемин - 0,04 г/л, (вариант 3, основа шоколадного агара и добавка IsoVitaleX производства Becton and Dickinson, среда приготовлена ФГУП СПбНИИВС ФМБА России).

Далее культуру с поверхности чашек смывали физиологическим раствором (титр 10⁵КОЕ/мл) и засевали колбы (10% от объема питательной среды), содержащие по 100 мл жидкой полусинтетической питательной среды для культивирования Haemophilus influenzae тип b следующего состава (г/л): Na₂HPO₄⋅2H₂O - 1,5, КСl - 0,5, NaCl - 2,3, NH₄Cl - 0,5, пептон бактериологический - 7,5, дрожжевой экстракт - 2,0, НАД - 0,02, гемин - 0,04, глюкоза - 4,0. Культивирование проводили на шейкер-инкубаторе при температуре (35±2)°С, при 150 об/мин в течение 6 часов.

По завершении культивирования концентрацию полисахарида определяли следующим образом. Биомассу инактивировали нагреванием (55°С, в течение 15 минут) и после охлаждения до (8-10)°С отделяли центрифугированием (4500 об/мин, в течение 30 мин). Содержание полирибозилрибитолфосфата в полученном супернатанте определяли по содержанию рибозы спектрофотометрическим методом.

В таблице 1 представлены данные по количественному содержанию полирибозилрибитолфосфата в супернатанте в зависимости от состава шоколадного агара.

Таким образом, максимальное количество капсульного полисахарида (265-275 мкг/мл) получено при использовании посевного материала, выращенного на шоколадном агаре с добавкой IsoVitaleX, в состав которого дополнительно входит 0,02 г/л НАД и 0,04 г/л гемина.

Пример 2. Влияние концентрации клеток Haemophilus influenzae SPB тип b в инокуляте на количество синтезированного капсульного полисахарида

Посевной материал получали при условиях, описанных в примере 1. Культуру выращивали на шоколадном агаре с повышенным содержание факторов роста (пример 1, вариант 3). Далее путем смыва культуры с поверхности агаризованной среды физиологическим раствором готовили суспензию с различной концентрацией клеток Haemophilus influenzae SPB тип b: 10⁴КОЕ/мл, 10⁵КОЕ/мл, 10⁶КОЕ/мл, 10⁷КОЕ/мл, 10⁸КОЕ/мл. Засев, культивирование, определение концентрации полирибозилрибитолфосфата проводили, как описано в примере 1.

На рис. 1 представлены данные по количественному содержанию полирибозилрибитолфосфата в супернатанте в зависимости от концентрации клеток в суспензии для засева жидкой полусинтетической питательной среды для культивирования Haemophilus influenzae тип b.

Как видно из данных, представленных на рис. 1, максимальная концентрация полисахарида (290-300 мкг/мл) наблюдалась при концентрации клеток в инокуляте 10⁶КОЕ/мл.

Штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под номером В-7884, продуцент капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата.

Изобретение относится к области микробиологии. Способ предусматривает культивирование Tetrahymena pyriformis на LB- бульоне с антибиотиками в количестве, необходимом для проведения эксперимента.

Микробиологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур в жидкой форме // 2623156

Изобретение относится к биотехнологии. Микробиологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур состоит из смеси концентрата бактериальной суспензии штамма Micrococcus luteus ПБТ-1 и концентрата суспензии штамма микроскопического гриба Penicillium sp.

Днк-конструкция, кодирующая модифицированный вариант протективного антигена bacillus anthracis // 2622085

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к искусственному гену, позволяющему экспрессировать в клетках бактерий изолированный домен 1 протективного антигена PAG из Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ.

Штамм amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика эремомицина и способ получения эремомицина // 2621866

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для производства антибиотика эремомицина. Предложены штамм Amycolatopsis orientalis и способ получения антибиотика эремомицина.

Применение штамма мицелиального гриба aspergillus awamori в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов // 2621279

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к применению штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori ВКПМ F-148 в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов.

Штамм trichoderma asperellum - продуцент гидролитических ферментов и пептидных метаболитов и его применение // 2620971

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к штамму грибка Trichoderma asperellum ВКПМ F-1087 и его применению в качестве перспективного лекарственного средства для подавления активности противоопухолевых клеток человека.

Питательная среда для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков // 2620965

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного обнаружения патогенных маннитположительных стафилококков в пищевых продуктах, клиническом материале и других объектах.

Рекомбинантная плазмидная днк pdualrep2 и штамм, трансформированный ею для выявления веществ и смесей, ингибирующих биосинтез белка и/или вызывающих sos-ответ у бактерий // 2620074

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к методам поиска антибактериальных веществ природного и синтетического происхождения с одновременным анализом механизма их действия, и может быть использовано для идентификации соединений, ингибирующих биосинтез белка и/или вызывающих SOS-ответ у бактерий.

Оптимизированный ген, кодирующий рекомбинантный белок - аналог интерферона альфа-17 человека // 2620073

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков человека, и может быть использовано для получения рекомбинантного белка аналога интерферона альфа-17.

Способ получения ферментированного растительного сырья с хрустящей консистенцией // 2620062

Изобретение относится к технологии производства ферментированного растительного сырья с хрустящей консистенцией. Способ предусматривает подготовку рецептурных компонентов, их укладку.

Гидролиз целлюлозы с корректированием ph // 2609001

Настоящее изобретение относится к способу переработки лигноцеллюлозы и может быть использовано в химической промышленности. Предложенный способ включает подготовку лигноцеллюлозной биомассы, которая содержит первую твердую фракцию, содержащую целлюлозу и лигнин, первую жидкую фракцию; отделение указанной первой твердой фракции от указанной первой жидкой фракции; смешивание указанной первой твердой фракции с водой с образованием суспензии; где указанная суспензия имеет рН от рН 3,0 до рН 4,5; повышение указанного рН указанной суспензии на величину от 0,5 единицы рН до 5,0 единиц рН, чтобы получить суспензию со скорректированным рН; где указанная суспензия со скорректированным рН имеет рН от рН 5,0 до рН 8,0; необязательно, предварительное нагревание указанной суспензии со скорректированным рН до температуры, которая ниже критической точки воды; приведение указанной суспензии со скорректированным рН в контакт с текучим веществом для второй реакции, содержащим сверхкритическое или близкое к сверхкритическому текучее вещество, с получением реакционной смеси, которая содержит вторую твердую фракцию, содержащую лигнин; и вторую жидкую фракцию, содержащую растворимый С6-сахарид, выбранный из группы, состоящей из целлоолигосахаридов, глюкозы, галактозы, маннозы, фруктозы и их смесей; где указанное сверхкритическое или близкое к критическому текучее вещество содержит воду и, необязательно, СО2 при температуре, равной 300°С или выше, и давлении, по меньшей мере достаточно высоком для того, чтобы гарантировать, что все текучее вещество для второй реакции находится в жидкой фазе или сверхкритической фазе; и где указанное приведение указанной суспензии со скорректированным рН в контакт с указанным текучим веществом для второй реакции имеет длительность больше чем 2 секунды; необязательно, снижение температуры указанной реакционной смеси до температуры ниже 280°С; и необязательно, гидролиз указанной второй жидкой фракции с образованием С6-сахарида, выбранного из группы, состоящей из С6-олигосахарида, имеющего звенья с меньшей степенью полимеризации, глюкозы, галактозы, маннозы, фруктозы и их смесей.

Повышенный выход продукта растворимых с5-сахаров // 2609000

Настоящее изобретение относится к способу гидролиза лигноцеллюлозы и может быть использовано в химической промышленности. Предложенный способ включает предоставление фракционированной лигноцеллюлозной биомассы, содержащей фракцию твердых веществ, содержащую необязательно нерастворимый С5-олигосахарид, целлюлозу и лигнин, и первую жидкую фракцию при первой температуре не более 240°С, содержащую растворимые C5-сахариды, выбранные из C5-олигосахаридов, ксилозы, арабинозы, ликсозы, рибозы и их смесей; контактирование указанной первой жидкой фракции с твердым кислотным катализатором с образованием второй жидкой фракции при температуре не более 240°С; где указанная вторая температура меньше, чем указанная первая температура; где указанное контактирование сдвигает молекулярно-массовое распределение указанных растворимых C5-сахаридов к меньшей средней молекулярной массе; необязательно гидролиз указанной второй жидкой фракции с использованием кислоты или фермента с получением C5-сахаридов, выбранных из C5-олигосахаридов, содержащих меньше мономерных звеньев, ксилозы, арабинозы, ликсозы, рибозы и их смесей; где указанную фракционированную лигноцеллюлозную биомассу получают приведением указанной целлюлозной биомассы в контакт с первой реакционной жидкостью, содержащей горячую воду под давлением и необязательно диоксид углерода; где указанная первая реакционная жидкость дополнительно содержит кислоту, где указанная лигноцеллюлозная биомасса содержит древесину мягких пород; где указанная первая реакционная жидкость находится при температуре менее 100°С под давлением, достаточным для поддержания указываемой первой реакционной жидкости в жидкой форме.

Многостадийный гидролиз целлюлозы и быстрое охлаждение с использованием и без использования кислоты // 2608999

Настоящее изобретение относится к способам переработки лигноцеллюлозной биомассы. Предложенный способ включает подачу лигноцеллюлозной биомассы, включающей первую твердую фракцию целлюлозы и лигнина и первую жидкую фракцию; необязательно, разделение указанных твердой и жидкой фракций; смешение указанной твердой фракции с водой с образованием пульпы с предварительным нагреванием пульпы до 210°С-240°С при 225-250 бар; контактирование указанной пульпы со второй реакционной жидкостью с образованием второй реакционной смеси, включающей вторую твердую фракцию лигнина и вторую жидкую фракцию растворимого С6 сахарида, выбранного из С6 моносахаридов, С6 олигосахаридов и их смесей; где указанная вторая реакционная жидкость включает сверхкритическую воду и, необязательно, диоксид углерода и находится при температуре, по меньшей мере, 374,2°С и давлении, достаточном для поддержания указанной второй реакционной жидкости в сверхкритическом состоянии; понижение температуры указанной пульпы ниже 140°С; необязательно кислотный гидролиз указанной второй жидкой фракции с образованием композиции, включающей С6 сахарид, выбранный из С6 олигосахарида, имеющего меньшее число элементарных звеньев, глюкозы, галактозы, маннозы, фруктозы и их смесей.

Способ получения капсульного полисахарида с пневмококковым серотипом // 2606022

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения капсульного полисахарида с пневмококковым серотипом.

Макромолекулярный комплекс бактериального происхождения и его применение для предотвращения или лечения ревматоидного артрита // 2599422

Предложен бактериальный макромолекулярный комплекс для профилактики или лечения воспалительного ревматизма и остеоартрита. Комплекс продуцирован штаммом бактерий Bifidobacterium longum CNCM I-3994.

Способы получения сахарной цепи, содержащей сиаловую кислоту // 2597975

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы получения сиалированной сахарной цепи.

Способ получения бактериальной целлюлозы // 2597291

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы. Предложен способ получения бактериальной целлюлозы, включающий культивирование симбиотической культуры Medusomyces gisevii на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка.

Композиции с высоким содержанием олигосахаридов арабиноксилана // 2596400

Предложены жидкая композиция для изготовления хлебобулочных изделий, способ ее получения и ее применение в пищевых производствах. Указанная композиция включает ферментированную(ые) фракцию(и) измельченного зерна, молочнокислые бактерии и необязательно дрожжи, где указанные молочнокислые бактерии выбраны из Leuconostoc или lactobacilli; эндоксиланазу.

Способ выделения липополисахарида chlamydia trachomatis // 2593946

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выделения липополисахарида Chlamydia trachomatis.

Способ получения экзополисахарида левана // 2574211

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения левана микробиологическим способом. Способ предусматривает внесение штамма микроорганизма Azotobacter vinelandii штамм Д-08 в питательную среду, приготовленную путем разведения мелассы дистиллированной водой до концентрации 7 или 10% с последующим культивированием при температуре 28-30°C в течение 72 часов в термостатируемом шейкере при 250 об/мин.