Живая стрептококковая вакцина и способ её получения

Авторы патента:

Владельцы патента RU 2624068:

Кадыров Рашит Накипович (RU)
Песня Дмитрий Сергеевич (RU)

Изобретения относятся к области микробиологии и касаются способа получения живой стрептококковой вакцины и непосредственно вакцины. Представленный способ включает инкубирование на жидкой питательной среде живой культуры слабовирулентного штамма MPK-12 β-гемолитических стрептококков группы A (Streptococcus pyogenes), с последующим добавлением в полученную биомассу, содержащую смесь живых бактерий и продукты метаболизма, защитной среды высушивания. Разливают вакцину в ампулы и/или флаконы и проводят лиофильную сушку с последующей укупоркой. Предложенные изобретения могут быть использованы для профилактики стрептококковых инфекций, профилактики и лечения онкологических заболеваний, энзимотерапии, а так же как противовирусный, тромболитический и иммуномодулирующий препарат. 2 н.п. ф-лы, 2 пр.

Изобретение относится к микробиологии, производству медицинских и ветеринарных биологических препаратов, а в частности к способам получения из бактерий вида Streptococcus pyogenes препаратов, обладающих онкопротекторной, тромболитической, противовирусной и иммуномодулирующей активностью.

В научной литературе описаны противораковые и иммуномодулирующие свойства бактерий вида Streptococcus pyogenes. Так, известно, что липотейхоевые кислоты, липополисахариды и фрагменты ДНК Streptococcus pyogenes действует на рецепторы дендритных клеток, макрофагов и лимфоцитов, запуская выработку каскада цитокинов, которые приводят в конечном итоге к усилению неспецифического иммунитета в организме и повышению сопротивляемости вирусным инфекциям (Linnebacher М., Maletzki С., Klier U., Klar Е. Bacterial immunotherapy of gastrointestinal tumors [Text] / M. Linnebacher et al. // Langenbecks. Arch. Surg. - 2012. - Vol. 397. - P. 557-568.). Важный противораковый механизм препаратов на основе Streptococcus pyogenes связан с ускорением созревания дендритных клеток. Установлено, что активация дендритных клеток вызывается взаимодействием ТПР-9 с фрагментами ДНК Streptococcus pyogenes. При этом дендроциты начинают активно вырабатывать интерлейкин-12 и гамма-интерферон, увеличивают экспрессию антигенов (CD40, CD80, CD83, CD86), молекул клеточной адгезии (ICAM-1) и индуцируют появление цитотоксических лейкоцитов, в том числе Т-лимфоцитов с противоопухолевой активностью. Таким образом, компоненты клеток Streptococcus pyogenes, активируя дендритные клетки организма человека, стимулируют противораковый иммунитет (Hovden А.-О., Karlsen М., Jonsson R., Aarstad Н.J., Silke Appel Maturation of monocyte derived dendritic cells with OK432 boosts IL-12p70 secretion and conveys strong T-cell responses / A.-O. Hovden et al. // BMC Immunology. - 2011. - Vol. 12. - P. 2-5.).

Установлено прямое противораковое действие протеолитических ферментов Streptococcus pyogenes на 4 типа клеток карцином человека (Eslami-Nejad Z., Nematollahi-Mahani S.N., Saffari F., Mollaii H., Arabzadeh S. A. M. Cell death induction by Streptococcus pyogenes in four types of malignant cell lines / Z. Eslami-Nejad et al. // Med. J. of the Islamic Repub. of Iran. - 2010. - Vol. 23(4). - P. 207-217.).

Бактерии Streptococcus pyogenes вырабатывают гликопротеин SAGP, белок, который действуя на опухоль напрямую, угнетает митотическую активность опухолевых клеток и вызывает их апоптоз, а также оказывает иммуномодулирующее действие (Yoshida J., Takamura S., Nishio M. Characterization of a streptococcal antitumor glycoprotein (SAGP) [Text] / J. Yoshida et al. // Life Sciences. - 1998. - Vol. 62(12). - P. 1043-1053.).

Из патентной литературы известен способ получения иммуностимулирующего препарата Пицибанил (ОК-432), включающий выращивание бактерий Streptococcus pyogenes на питательной среде с последующей инактивацией с помощью процесса пастеризации, затем обработки пенициллином, лиофилизацией, удалением пенициллина и повторной лиофилизацией (US 4328218 А - Method for the treatment of cells of Streptococcus pyogenes).

Недостатком данного метода является вирулентность используемого штамма, которая требует сложного процесса инактивации и, как следствие, невозможность использования живого штамма. В то же время известно, что живые бактерии Streptococcus pyogenes гораздо более эффективно вызывают регрессию различных видов опухолей и предотвращают метастазы, чем убитые термической обработкой (Maletzki С., Linnebacher М., Kreikemeyer В., Emmrich J. Pancreatic cancer regression by intratumoural injection of live Streptococcus pyogenes in a syngeneic mouse model / C. Maletzki // Gut. - 2008. - Vol. 57. - P. 483-491.).

Известен способ получения энзимотерапевтического, противовирусного и иммуномодулирующего препарата из живой слабовирулентной культуры Streptococcus pyogenes штамм «Гуров», в котором штамм бактерий выращивают сначала на жидкой питательной среде, затем пересевают на чашки Петри на твердую питательную среду и после инкубации смывают с чашек Петри физиологическим раствором (патент №2086246).

Недостатком данного способа является его технологическая непригодность для промышленного производства препарата, так как при производстве препарата высока доля ручного труда и отсутствует возможность автоматизации процесса, так как при помощи смыва с чашки Петри препарат можно получать лишь в небольших количествах.

К дополнительным недостаткам данного способа относится повышенная вероятность контаминации патогенной микрофлорой на этапах пересева и при смыве с чашек Петри физиологическим раствором, а также короткий срок жизнеспособности бактерий в физиологическом растворе (4-5 часов), что не позволяет приготовить живой лиофилизированный препарат. В то же время оптимальным методом сохранения живых бактерий Streptococcus pyogenes является лиофильная сушка. Но проведенные опыты по лиофильной сушке Streptococcus pyogenes в физиологическом растворе, даже в присутствии питательного бульона дают очень плохие результаты.

Полученный вышеописанным способом препарат может быть применен только по месту производства и не может транспортироваться на дальние расстояния.

Кроме того, продукты метаболизма бактерий Streptococcus pyogenes содержат важные для лечения компоненты: липотейхоевые кислоты, липополисахариды и фрагменты ДНК Streptococcus pyogenes, гликопротеин SAGP, фермент Стрептокиназу, гиалуроновую кислоту и другие. При описанном выше способе приготовления препарата эти важные и нужные вещества в организм не поступают. Они начнут продуцироваться только после того, как бактерии Streptococcus pyogenes начнут размножаться в организме. Эксперименты, проведенные на добровольцах, показывают, что при введении интрадермально одного и того же количества бактериальных клеток вместе с продуктами метаболизма вызывает тромболитический эффект в течение 20 минут после введения. А при введении очищенных от продуктов метаболизма бактериальных клеток, такой же эффект проявляется только через 5-6 часов. Таким образом, препарат, содержащий бактериальные клетки вместе с продуктами метаболизма, может использоваться для экстренной медицинской помощи в качестве тромболитика.

Предлагаемый способ получения препарата включает выращивание β-гемолитических стрептококков группы A (Streptococcus pyogenes), выбранных среди слабовирулентных штаммов, например штамм «Гуров», штамм MPK-12, или аналогичных и/или смесь разных штаммов на жидкой питательной среде, затем в полученную биомассу, содержащую смесь живых бактерий и продукты метаболизма, добавляют защитную среду высушивания, разливают в ампулы и/или флаконы и проводят лиофильную сушку с последующей укупоркой.

При таком способе производства возможно применение промышленных технологий автоматизации выращивания культуры и обеспечивается более высокая степень стерильности при производстве препарата, так как уменьшается доля ручного труда, уменьшается количество операций, и соответственно уменьшается вероятность контаминации патогенной микрофлорой. Также обеспечивается возможность продолжительного хранении и транспортировки препарата. Лиофильно высушенная культура бактерий, запаянная в ампулы, сохраняет жизнеспособность в течение длительного времени (до 10 лет). Ампулы с препаратом могут перевозиться любым видом транспорта на любые расстояния.

Пример 1. В бутыль объемом 0,5 литра с 400 мл питательного бульона с 2% глюкозы и 2% экстракта дрожжей добавляют 20 мл лошадиной сыворотки и вносят лиофилизированную культуру β-гемолитических стрептококков группы А штамма MPK-12. Бутыль с культурой помещают в термостат и инкубируют при 37°C в течение 24-36 часов. После образования в бутыли хлопьевидного осадка культуру проверяют на стерильность, добавляют защитную среду высушивания, разливают по ампулам и/или флаконам и проводят лиофильную сушку с последующей укупоркой.

Пример 2. В пробирку объемом 10 мл с 7 мл питательного бульона с 2% глюкозы вносят лиофилизированную культуру β-гемолитических стрептококков группы А штамма MPK-12. Пробирку с культурой помещают в термостат и инкубируют при 37°C 24-36 часов до образования хлопьевидного осадка. Затем проводят пересев культуры из пробирки в бутыль объемом 0,5 литра с 400 мл питательного бульона с 2% глюкозы, добавляют 20 мл крови человека и вносят лиофилизированную культуру β-гемолитических стрептококков группы А штамма MPK-12. Бутыль с культурой помещают в термостат и инкубируют при 37°C в течение 24-36 часов. После образования в бутыли хлопьевидного осадка культуру проверяют на стерильность, добавляют защитную среду высушивания, разливают по ампулам и/или флаконам и проводят лиофильную сушку с последующей укупоркой.

1. Способ получения живой стрептококковой вакцины, которая может быть использована для профилактики стрептококковых инфекций, профилактики и лечения онкологических заболеваний, энзимотерапии, а так же как противовирусный, тромболитический и иммуномодулирующий препарат, заключающийся в том, что живую культуру слабовирулентного штамма MPK-12 β-гемолитических стрептококков группы A (Streptococcus pyogenes) инкубируют на жидкой питательной среде, затем в полученную биомассу, содержащую смесь живых бактерий и продукты метаболизма, добавляют защитную среду высушивания, разливают в ампулы и/или флаконы и проводят лиофильную сушку с последующей укупоркой.

2. Живая стрептококковая вакцина, которая может быть использована для профилактики стрептококковых инфекций, профилактики и лечения онкологических заболеваний, энзимотерапии, а так же как противовирусный, тромболитический и иммуномодулирующий препарат, представляющая собой бактерии живой культуры слабовирулентного штамма MPK-12 β-гемолитических стрептококков группы A (Streptococcus pyogenes), инкубированные на жидкой питательной среде, подвергнутые лиофильной сушке вместе с продуктами метаболизма и защитной средой высушивания.

Изобретения касаются вакцинных составов против Streptococcus pneumoniae и их применения. Представленные вакцинные составы содержат фармацевтически приемлемый носитель и первый полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 265, 266 или 268, и второй полипептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 10, 20, 21, 6, 7, 18 или 19.

Иммуногенная композиция презентации множественных антигенов, относящиеся к ней способы и применения // 2619176

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным системам презентации множественных антигенов, и может быть использовано в медицине. Иммуногенная композиция против одного или более из антигенного полисахарида, пептидного антигена или полипептидного антигена содержит по меньшей мере один антигенный полисахарид, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген и по меньшей мере одну комплементарную пару аффинных молекул.

Новая бактерия и ее экстракты и их применение в терапии // 2615140

Группа изобретений относится к бактериальному экстракту для лечения воспалений и его применению. Бактериальный экстракт получен после культивирования и лизиса бактерии, депонированной в CNCM 8 апреля 2010 г.

Комбинированная вакцина с цельноклеточным коклюшем // 2613295

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения комбинированной жидкой вакцины. Полностью жидкая стабильная комбинированная вакцина содержит антигены дифтерии (D), столбняка (Т), цельноклеточного коклюша (wP), IPV и Haemophilus influenzae (Hib).

Мультивалентная композиция на основе конъюгатов пневмококковый полисахарид-белок // 2613148

Группа изобретений относится к медицине и касается мультивалентной иммуногенной композиции, содержащей 13 различных конъюгатов полисахарид-белок вместе с физиологически приемлемой средой, где каждый из конъюгатов полисахарид-белок содержит капсульный полисахарид от отдельного серотипа Streptococcus pneumoniae, конъюгированный с белком-носителем CRM197, и капсульные полисахариды получены от 12 серотипов, выбранных из группы, состоящей из 1, 3, 4, 5, 6А, 6B, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, и серотипа 22F или 33F.

Фармацевтическая композиция для профилактики и(или) лечения заболеваний вич у людей // 2609769

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для профилактики и/или лечения заболевания ВИЧ у человека, которому это необходимо. Пероральная фармацевтическая композиция включает смесь крупнодисперсного антигена, который содержит один или несколько эпитопов из белков ВИЧ - Gag и/или Pol, и непатогенную не являющуюся рекомбинантной бактерию, выбранную из группы, состоящей из бактерии рода Lactobacillus и BCG.

Иммуногенные композиции // 2608905

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения иммуногенной композиции. Иммуногенная композиция содержит а) конъюгат, который представляет собой капсулярный сахарид GBS серотипа Ia, конъюгированный с белком-носителем; b) конъюгат, который представляет собой капсулярный сахарид GBS серотипа Ib, конъюгированный с белком-носителем; и с) конъюгат, который представляет собой капсулярный сахарид GBS серотипа III, конъюгированный с белком-носителем, где (i) где каждый капсулярный сахарид GBS присутствует в количестве 5 мкг, 10 мкг или 20 мкг на единицу дозы, (ii) белок-носитель в а), b) и с) представляет собой токсоид дифтерии или CRM197, и iii) иммуногенная композиция не содержит адъювант на основе соли алюминия.

Вакцины streptococcus pneumoniae // 2607024

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и иммунологии. Описана иммуногенная композиция, включающая множество капсульных полисахаридов из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F, конъюгированных с белком-носителем.

Способ бездетергентного получения везикул наружной мембраны грамотрицательной бактерии // 2607021

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ бездетергентного получения бактериальных везикул наружной мембраны (OMV) грамотрицательных бактерий рода Neisseria.

Мультивалентная композиция на основе конъюгатов пневмококковый полисахарид-белок // 2606152

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения иммуногенной композиции. Мультивалентная иммуногенная композиция содержит 13 различных конъюгатов полисахарид-белок вместе с физиологически приемлемой средой.

Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция // 2627156

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения капсульного полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы X, его конъюгат с белком-носителем и иммуногенная композиция на основе конъюгата для приготовления вакцин против менингита. Способ осуществляют с использованием ферментационной среды, включающей казаминкислоту, оптимальной стратегии добавления питательного раствора и улучшенного процесса выделения и очистки полисахарида, исключающего любые хроматографические методы. Соотношение полисахарида к белку в конъюгате находится в пределах от 0,2 до 0,6. Изобретения позволяют получать очищенный полисахарид Neisseria meningitidis серогруппы X с выходом от 300 до 550 мг/л, средней молекулярной массой от 400 до 550 кДа, выходом на стадии очистки от 60% до 65% и содержанием менее 0,5% белков, менее 0,5% нуклеиновых кислот и менее 5 EU/мкг эндотоксинов. Полисахарид X доводят до размера от 150 до 200 кДа и конъюгируют с белком-носителем. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл.

Молекула, содержащая spr0096 и spr2021 // 2636350

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к носителям для вакцин, и может быть использовано в медицине для индукции иммунного ответа против бактериального капсульного сахарида. Предложен конъюгат, содержащий бактериальный капсульный сахарид, например капсульный сахарид из N. meningitidis серогруппы А, С, W135 или Y, ковалентно связанный с молекулой носителя, где молекула носителя содержит единую полипептидную цепь, состоящую из одного антигена spr0096 и одного антигена spr2021. Изобретение обеспечивает усиление иммунного ответа на сахарид по сравнению с белком-носителем CRM197. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 18 ил., 5 табл.

Молекула, содержащая spr0096 и spr2021 // 2636350

Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную днк пробиотического штамма enterococcus faecium l3 для экспрессии в пилях // 2640250

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу создания живой вакцины на основе биологически активного штамма Еnterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей антигена клинически актуального патогенного микроорганизма. Настоящий способ предусматривает получение слитого гена entF-bac, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика E. faecium L3 и фрагмента гена bac и имеющего нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 7а, его клонирование и выявление бактериальных клонов, экспрессирущих нужный белок в пилях. Изобретение также относится к рекомбинантной плазмидной ДНК pentF-bac. Настоящая ДНК pentF-bac предназначена для создания живой вакцины на основе биологически активного штамма Е. faecium L3. Указанная ДНК pentF-bac представляет собой суицидную плазмиду pT7ERMB, по сайтам BamHI и KpnI которой вставлена последовательность ДНК слитого гена entF-bac. Настоящее изобретение также относится к вакцинному препарату E. faecium L3 Вас+. Указанный вакцинный препарат получают путем электропорации E. faecium L3 плазмидной ДНК pentF-bac. Настоящее изобретение позволяет получать живую вакцину на основе биологически активного штамма Е. faecium L3. 3 н.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 5 пр.

Множественная вакцинация, включающая менингококки серогруппы с // 2641969

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения набора для иммунизации против S. pneumonia и N. meningitidis серогруппы С. Набор содержит компонент, представляющий собой конъюгат сахарида менингококка, компонент, представляющий собой конъюгат сахарида пневмококка, и дополнительный иммуногенный компонент, для введения в разные места в по существу одно и то же время. Где: (а) компонент, представляющий собой конъюгат сахарида менингококка, содержит по меньшей мере капсульный сахарид Neisseria meningitidis серогруппы С, конъюгированный с первым белком-носителем, но не содержит адъювант фосфат алюминия; (b) компонент, представляющий собой конъюгат сахарида пневмококка, содержит по меньшей мере один капсульный сахарид Streptococcus pneumoniae, конъюгированный со вторым белком-носителем; и (с) дополнительный иммуногенный компонент содержит бесклеточный(е) антиген(ы) В. pertussis и инактивированный полиовирусный антиген (IPV), и один или более антигенов, выбранных из дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, HBsAg и конъюгированного сахарида Hib, причем белок-носитель по меньшей мере одного конъюгата сахарида менингококка и белок-носитель по меньшей мере одного конъюгата сахарида пневмококка являются одинаковыми. Использование данного набора позволяет безопасно вводить конъюгаты сахарида менингококка и конъюгаты сахарида пневмококка одновременно, но по отдельности (в различные места), с дополнительным компонентом, содержащим бесклеточные антигены В. pertussis и инактивированный полиовирусный антиген. 14 з.п. ф-лы.

Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота // 2642316

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма Brucella melitensis Rev-1. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота предусматривает посев и выращивание штамма Brucella melitensis Rev-1 на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина глубокой степени расщепления, экстракта дрожжей, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и агар-агар в заданном соотношении компонентов в течение 72 часов при 37°C. Выросшую вакцинную культуру смывают с поверхности агара средой высушивания и доводят до концентрации 80-140 млрд м.к. в 1 мл. Проверяют на чистоту и диссоциацию, расфасовывают в ампулы и подвергают лиофильной сушке. Изобретение позволяет увеличить выход штамма Brucella melitensis Rev-1 в S-форме. 1 табл., 1 пр.

Вакцины для менингококка серогруппы х // 2644340

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение иммуногенной композиции для иммунизации индивидуума против менингококка серогруппы X. Указанная иммуногенная композиция содержит по 50 мкг каждого из антигенов: антигена с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (белок, связывающий фактор Н, fHbp), антигена с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 (белок, связывающий гепарин, NHBA) и антигена с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10 (адгезин А, NadA), адсорбированных на 1,5 мг гидроксида алюминия и 25 мкг везикул наружной мембраны из штамма NZ98/254 N. Meningitide. Описанная иммуногенная композиция является эффективной для иммунизации индивидуума против менингококка серогруппы X и может быть использована в медицине при вакцинации против менингококка серогруппы X. 2 з.п. ф-лы., 2 табл.

Предотвращение, разрушение и обработка биопленки лизином бактериофага // 2646102

Группа изобретений относится к способам и композициям для предотвращения, контроля и разрушения бактериальных биопленок с использованием лизина, имеющего способность к лизису стафилококковых и стрептококковых бактерий, включая резистентные к лекарственным средствам. Способы включают контактирование биопленки, включающей одну или несколько из бактерий Staphylococcus или Streptococcus, с композицией, содержащей эффективное количество полипептида лизина, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее варианты, имеющие по меньшей мере 80% идентичности с полипептидом с SEQ ID NO: 1, и являющегося эффективным для лизиса стафилококковых и стрептококковых бактерий в биопленке, причем биопленку эффективно диспергируют или обрабатывают. Изобретения позволяют устранять не только зрелые биопленки, но и предотвращать образование биопленок de novo, при этом применяемый полипептид лизина демонстрирует высокую активность при более низких концентрациях (1X МПК) в сравнении с отсутствием активности антибиотиков, применяемых при высоких концентрациях (1000Х МПК). 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 21 ил., 7 табл., 14 пр.