Экстракт бромелаина с протеолитической активностью для лечения заболеваний соединительных тканей

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения заболеваний соединительной ткани. Для этого применяют фармацевтическую композицию, содержащую протеолитический экстракт, полученный из бромелаина. При этом бромелаин получен из стебля ананаса. Протеолитический экстракт содержит бромелаин стебля, ананаин и джакалин-подобный лектин. Заболевание соединительной ткани связано с избыточным отложением коллагена, такое как болезнь Дюпюитрена и болезнь Пейрони. Изобретение обеспечивает эффективность и селективность действия в отношении деградации коллагена типа III в тяжах Дюпюитрена и не повреждает здоровую соединительную ткань. 15 з.п. ф-лы, 13 ил., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к полученному из бромелаина экстракту с протеолитической активностью (протеолитический экстракт) для лечения заболеваний соединительной ткани. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полученный из бромелаина протеолитический экстракт, для лечения заболеваний, таких как болезнь Дюпюитрена и болезнь Пейрони.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Коллаген - один из основных компонентов соединительной ткани, который содержится в основном в фиброзных тканях, таких как сухожилие, связка и кожа. С избыточным отложением коллагена связаны многочисленные заболевания и состояния, наиболее распространенными из которых являются болезнь Дюпюитрена и болезнь Пейрони.

Болезнь Дюпюитрена (БД) представляет собой нарушение соединительной ткани, связанное с аномальным продуцированием и отложением коллагена в руках, которое обычно характеризуется контрактурой пястно-фаланговых суставов (ПФС) и проксимальных межфаланговых суставов (ПМФС) на безымянном пальце и мизинце. Пролиферация и дифференцировка фибробластов в миофибробласты, сопровождаемая избыточным отложением коллагена в ладонной фасции приводит к образованию узлов и фиброзных тяжей на ладони и/или пальцах. Фиброзные тяжи или узлы могут различаться по толщине: от 1 миллиметра в диаметре для фиброзных тяжей до почти 10 миллиметров в диаметре для фиброзных узлов. По мере прогрессирования заболевания тяжи начинают сокращаться, приводя к флексионным деформациям (сгибательным контрактурам).

Частота встречаемости БД увеличивается с возрастом и чаще встречается у мужчин. Предполагается, что общими факторами риска развития БД являются генетическая предрасположенность, курение, потребление алкоголя, сахарный диабет, эпилепсия и работа, связанная с периодически повторяющимися движениями рук. Тяжесть и прогрессирование БД можно классифицировать по степени поражения флексионных деформаций пальцев.

В настоящее время для лечения БД наиболее широко используется хирургический метод, фасциэктомия, которая гарантирует положительные, хотя и временные, результаты для большинства пациентов. Однако хирургическая фасциэктомия обычно связана с часто встречающимися хирургическими осложнениями (например, инфекцией, гематомой, потерей ткани), а также специфическими осложнениями, такими как поражение пальцевых нервов, потеря пальцев, отторжение кожного трансплантата, проблемы, связанные с заживлением ран, и послеоперационная скованность. Кроме того, фасциэктомия предполагает длительный период восстановления и не гарантирует окончательного восстановления, поскольку для БД характерна очень высокая частота рецидивов. Были сделаны попытки внедрения минимально инвазивных процедур, в которых использовались иглы или тонкие скальпели. Несмотря на меньшее количество осложнений, такие процедуры увеличивают частоту рецидивов. Также были разработаны нехирургические методы вмешательства, включающие радиотерапию, ультразвук, инъекцию витамина А, витамина Е, стероидов и интерферона-γ.

В in vitro исследованиях была показана способность коллагеназы уменьшать модуль упругости при растяжении и силу, необходимую для разрыва ткани тяжей Дюпюитрена, указывая на то, что коллагеназа может быть эффективной при ферментативной фасциэктомии. Недавно проведенные клинические испытания показали, что лечение коллагеназой Clostridium histolyticum расслабляет контрактуры БД и увеличивает амплитуду движений пораженных суставов. Восьмилетнее наблюдение за пациентами с БД, которым вводили инъекцию коллагеназы, показало уменьшение тяжести ПФС контрактуры после рецидива заболевания по сравнению с исходной контрактурой до лечения коллагеназой. Также было продемонстрировано, что коллаген типа III, который обычно отсутствует в нормальных ладонных фасциях у взрослых, широко распространен в тканях больных БД.

Болезнь Пейрони - нарушение соединительной ткани, связанное с ростом богатых коллагеном фиброзных бляшек в мягкой ткани полового члена, которое поражает до 10% мужчин. Более конкретно, фиброзные бляшки формируются в белочной оболочке, толстой оболочке ткани, окружающей пещеристое тело, приводя к аномальному изгибу, который часто связан с болью.

Операция является единственным подходом к лечению болезни Пейрони, который имеет предсказуемо воспроизводимую эффективность. Обычно операцию назначают только в хронических случаях, когда болезнь стабилизировалась, и деформация препятствует половым контактам и/или вызывает очень сильные боли. Однако после операции возможны осложнения, в том числе необратимое укорочение полового члена.

Также имеются нехирургические подходы к лечению болезни Пейрони, хотя все они очень неэффективны. Предпринимались попытки растворять бляшки при помощи инъекций, вводимых непосредственно в очаги поражения. Среди методов, связанных с инъекцией, наиболее подходящей эффективностью обладают инъекции коллагеназы Clostridium, несмотря на то что эффект и продолжительность таких инъекций все еще крайне ограничены. Кроме того, были предприняты попытки применения радиационной терапии и лазерных технологий.

В патентах США 5589171, 6086872 и повторно выданном патенте США RE39941 раскрыты способы лечения субъекта, страдающего болезнью Дюпюитрена, содержащие введение коллагеназы в пораженные фиброзом ладонные фасции.

В патенте США 6022539 раскрыты способы лечения субъекта, страдающего болезнью Пейрони, содержащие введение инъекций коллагеназы в фиброзные бляшки Пейрони на половом члене субъекта.

В патенте США 6353028 раскрыто лекарственное средство для наружного нанесения, которое содержит блокаторы кальциевых каналов и носители, облегчающие чрескожную доставку блокатора кальциевых каналов, для лечения заболеваний соединительной ткани: болезни Пейрони, болезни Дюпюитрена и фиброза Леддерхозе.

В публикации заявки на патент США 2008/0206228 раскрыто лекарственное средство, содержащее гиалуроновую кислоту или ее производные в сочетании с коллагеназой, для лечения различных видов ран, ожогов, пролежней, трофических язв и диабетической язвы стопы, а также для лечения гипертрофических и келоидных рубцов, при этом лечение болезни Дюпюитрена описано в явном виде.

В публикации международной заявки WO 2004/037183 раскрыты способы и композиции для лечения состояний, связанных с фиброзом, среди которых указаны болезнь Пейрони и болезни Дюпюитрена. Композиции, среди прочего, содержат ингибитор фосфодиэстеразы (ФДЭ)-4, ингибитор ФДЭ-5 или соединение, которое увеличивает уровень cGMP.

В публикации международной заявки WO 2005/074913 раскрыто применение ингибиторов клеточного цикла, включающих антимикротубулярные агенты, антиметаболиты, алкилирующие агенты, Винка-алкалоиды, ингибиторы ФДЭ, матричную металлопротеиназу, включая коллагеназы, для лечения контрактуры, такой как контрактура Дюпюитрена или контрактура Пейрони.

Ни в одном из документов уровня техники не предлагается применение протеолитических ферментов из растительных источников для лечения нарушений соединительной ткани, связанных с избыточным отложением коллагена.

Было обнаружено, что экстракты, полученные из ствола ананаса (Ananas comosus), способны селективно удалять нежизнеспособную ткань. Такие экстракты, также называемые бромелаин, содержат различные протеолитические и гидролитические ферменты.

В публикации международной заявки на патент WO 2006/054309 автор настоящей заявки раскрывает полученную из бромелаина очищающую (удаляющую нежизнеспособные ткани) композицию, содержащую в основном присутствующие в бромелаине протеолитические ферменты со средним молекулярным весом 23 кДа. WO 2006/054309 также раскрывает применение указанной очищающей композиции для удаления нежизнеспособных тканей.

Однако сохраняется потребность в улучшенных неинвазивных способах лечения заболеваний соединительной ткани, связанных с избыточным отложением коллагена.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагается полученный из бромелаина протеолитический экстракт для лечения заболеваний соединительной ткани. В частности, в настоящем изобретении предлагается полученный из бромелаина протеолитический экстракт для лечения заболеваний соединительной ткани, связанных с избыточным отложением коллагена, включая болезнь Дюпюитрена и болезнь Пейрони.

В настоящем описании впервые раскрыто, что полученный из бромелаина протеолитический экстракт, содержащий одну или более присутствующих в бромелаине цистеиновых протеаз, например бромелаин стебля или ананаин, способен уменьшать количество природного неденатурированного коллагена. Неожиданно было обнаружено, что инъекция протеолитического экстракта в тяж Дюпюитрена приводит к разрыву тяжа, при этом нормальная здоровая соединительная ткань сохраняется в интактном состоянии.

В настоящем изобретении также показано, что эффективность протеолитического экстракта в отношении разрыва или растворения тяжей Дюпюитрена аналогична или даже превышает эффективность коллагеназы. Однако, несмотря на то что коллагеназа может приводить к повреждению не пораженных заболеванием связок или сухожилий, обусловленному ее сродством к различным типам коллагена, протеолитический экстракт по настоящему изобретению проявляет специфичность к болезненным тяжам. Таким образом, протеолитический экстракт по настоящему изобретению обеспечивает улучшенное и более безопасное лекарственное средство против заболеваний соединительной ткани, вызванных избыточным отложением коллагена, в частности для лечения болезни Дюпюитрена и болезни Пейрони.

Поскольку высокие концентрации протеолитического экстракта могут быть получены в небольших объемах, такие небольшие объемы могут вводиться в виде инъекций в болезненные фиброзные тяжи или бляшки, таким образом предупреждая транссудацию и повреждение окружающих тканей, упрощая проведение клинической процедуры и, следовательно, увеличивая комплаентность у пациента.

Согласно одному из аспектов в настоящем изобретении предлагается способ лечения заболевания соединительной ткани, включающий введение нуждающемуся в таком лечении субъекту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество полученного из бромелаина протеолитического экстракта и фармацевтически приемлемый носитель, где протеолитический экстракт содержит по меньшей мере одну цистеиновую протеазу, выбранную из группы, состоящей из бромелаина стебля и ананаина, и где заболевание соединительной ткани связано с избыточным отложением коллагена.

Согласно дополнительным вариантам осуществления изобретения заболевание соединительной ткани выбирают из группы, состоящей из болезни Дюпюитрена, болезни Пейрони, синдрома “замороженного плеча” и болезни Леддерхозе. Согласно одному из конкретных вариантов осуществления заболевание соединительной ткани представляет собой болезнь Дюпюитрена. Согласно другому варианту осуществления заболевание соединительной ткани представляет собой болезнь Пейрони.

Согласно одному из вариантов осуществления протеолитический экстракт содержит бромелаин стебля или ананаин. Согласно другому варианту осуществления протеолитический экстракт дополнительно содержит предшественник цистеиновой протеазы. Согласно другому варианту осуществления протеолитический экстракт дополнительно содержит фрагмент цистеиновой протеазы. Согласно иллюстративному варианту осуществления протеолитический экстракт содержит бромелаин стебля, ананаин и предшественник цистеиновой протеазы.

Согласно другим вариантам осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит агент, выбираемый из группы, состоящей из анестетика, антибактериального агента и противовоспалительного агента.

Согласно другим вариантам осуществления анестетик выбирают из группы, состоящей из аметокаина (тетракаина), лигнокаина (лидокаина), ксилокаина, бупивакаина, прилокаина, ропивакаина, бензокаина, мепивокаина, кокаина и их комбинации. Каждая из указанных возможностей представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно дополнительным вариантам осуществления антибактериальный агент выбирают из группы, состоящей из: гидрохлорида аманфадина, сульфата аманфадина, амикацина, сульфата амикацина, аминогликозидов, амоксициллина, ампициллина, ансамицинов, бацитрацина, бета-лактамов, кандицидина, капреомицина, карбенициллина, цефалексина, цефалоридина, цефалотина, цефазолина, цефапирина, цефрадина, цефалоглицина, хиломфениколов, хлоргексидина, хлоргексидина глюконата, гидрохлорида хлоргексидина, хлороксина, хлорхинальдола, хлортетрациклина, гидрохлорида хлортетрациклина, ципрофлоксацина, циркулина, клиндамицина, гидрохлорида клиндамицина, клотримазола, клоксациллина, демеклоциклина, диклоксациллина, дийодогидроксиквина, доксициклина, этамбутола, гидрохлорида этамбутола, эритромицина, эстолата эритромицина, стеарата эрмицина, фарнезола, флоксациллина, гентамицина, сульфата гентамицина, грамицидина, гризеофульвина, галопрогина, галоквинола, гексахлорофена, иминоциклина, йодохлоргидроксиквина, канамицина, сульфата канамицина, линкомицина, линеомицина, гидрохлорида линеомицина, макролидов, меклоциклина, метациклина, гидрохлорида метациклина, метенина, метенамина гиппурата, метенамина манделата, метициллина, метонидазола, миконазола, гидрохлорида миконазола, миноциклина, гидрохлорида миноциклина, мупироцина, нафциллина, неомицина, сульфата неомицина, нетимицина, сульфата нетилмицина, нитрофуразона, норфлоксацина, нистатина, октопирокса, олеандомицина, орцефалоспоринов, оксациллина, окситеклина, гидрохлорида окситетрациклина, парахлорметаксиленола, паромомицина, сульфата паромомицина, пенициллинов, пенициллина G, пенициллина V, пентамидина, гидрохлорида пентамидина, фенетициллина, полимиксинов, хинолонов, сульфата стрептомицина, тетрациклина, толнафтата тобрамицина, триклозана, трифампина, рифамицина, ролитетрациклина, солей серебра, спектиномицина, спирамицина, стрептомицина, сульфонамида, тетрациклинов, тетрациклина, тобрамицина, сульфата тобрамицина, триклокарбона, триклозана, триметоприм-сульфаметоксазола, тилозина, ванкомицина и иротрицина. Каждая из указанных возможностей представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно другим вариантам осуществления противовоспалительный агент выбирают из группы, состоящей из нестероидных противовоспалительных агентов и стероидных противовоспалительных агентов.

Согласно другим вариантам осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит компонент, который выбирают из группы, состоящей из стабилизирующего агента, антиокислителя, консерванта, буферного агента, хелатирующего агента и регулирующего тоничность агента.

Согласно другим вариантам осуществления фармацевтическую композицию составляют в виде лекарственной формы, выбираемой из группы, состоящей из твердой лекарственной формы, полутвердой лекарственной формы, жидкой лекарственной формы и пенной лекарственной формы. Согласно одному из конкретных вариантов осуществления твердая лекарственная форма представляет собой порошок. Согласно другому варианту осуществления жидкая лекарственная форма представляет собой раствор для инъекций со значением рН в пределах от 6 до 7.

Согласно иллюстративному варианту осуществления фармацевтическую композицию вводят в виде инъекции в болезненную фиброзную ткань. Фармацевтическая композиция может быть инъецирована в виде единичной дозы или в виде аликвот в два или несколько участков болезненной фиброзной ткани.

Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая протеолитический экстракт, предназначенный для лечения заболевания соединительной ткани, где протеолитический экстракт содержит по меньшей мере одну цистеиновую протеазу, выбранную из группы, состоящей из бромелаина стебля и ананаина, и где заболевание соединительной ткани связано с избыточным отложением коллагена.

Приведенное ниже описание, содержащее примеры со ссылкой на чертежи, а также формула изобретения позволят лучше понять эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой график, показывающий коллагенолитическую активность двух партий протеолитического экстракта. Протеолитические экстракты двух партий (обозначенных MD2 H-05-27 и MD5 H-10-46), концентрацию которых увеличивали, инкубировали в течение 20 минут в присутствии флуоресцентно меченного коллагена типа IV. В конце инкубации измеряли величину флуоресценции. Результаты представлены в относительных величинах флуоресценции (RFU).

Фиг.2 представляет собой график, показывающий коллагенолитическую активность протеолитического экстракта, в отношении коллагенов типа I и типа IV. Протеолитический экстракт инкубировали в присутствии флуоресцентно меченного коллагена типа I или типа IV через разные промежутки времени. В конце инкубации измеряли величину флуоресценции. Результаты представлены в относительных величинах флуоресценции (RFU).

Фиг.3 представляет собой график, показывающий коллагенолитическую активность протеолитического экстракта, по сравнению с активностью коллагеназы. Коллагеназу Clostridium histoliticum инкубировали либо с флуоресцентно меченным коллагеном типа IV, либо с флуоресцентно меченным желатином, и через 20 мин инкубации измеряли величину флуоресценции. Протеолитический экстракт инкубировали с флуоресцентно меченным коллагеном типа IV в течение 20 мин, а затем измеряли величину флуоресценции.

Фиг.4 представляет собой график, показывающий желатиназную активность протеолитического экстракта. Протеолитический экстракты двух партий (обозначенных J-01-19 и J-14-45), концентрацию которых увеличивали, инкубировали в течение 20 минут в присутствии флуоресцентно меченного желатина, а затем измеряли величину флуоресценции.

Фиг.5А-С представляют собой фотографии, на которых показано хирургическое иссечение - удаление тяжа Дюпюитрена у пациента. Фиг.6А представляет собой фотографию, на которой показана аномальная контрактура безымянного пальца у пациента, страдающего болезнью Дюпюитрена. Фиг.4В представляет собой фотографию, на которой показано хирургическое удаление патологического тяжа. Фиг.4С представляет собой фотографию, на которой показан тяж после удаления отложения на ладони.

Фиг.6 представляет собой фотографию, на которой показано рассечение тяжа Дюпюитрена на два фрагмента.

Фиг.7 представляет собой фотографию, на которой показано закрепление тяжа.

Фиг.8 представляет собой фотографию, на которой показана стадия инъецирования раствора в тяж Дюпюитрена.

Фиг.9 представляет собой фотографию, на которой показано устройство для измерения растягивающего усилия.

Фиг.10А-В представляют собой фотографии, на которых показан тяж до и после приложения растягивающего усилия. Фиг.10А представляет собой фотографию, на которой показан тяж до приложения растягивающего усилия. Фиг.10В представляет собой фотографию, на которой показан тяж после приложения растягивающего усилия, но до разрыва тяжа.

На Фиг.11 показано действие солевого раствора на удлинение тяжа Дюпюитрена как функция прилагаемого растягивающего усилия. В тяж Дюпюитрена инъецировали солевой раствор, а затем его инкубировали в солевом растворе в течение 24 часов. Затем к тяжу прикладывали растягивающее усилие и оценивали тяж в отношении его удлинения и разрыва.

На Фиг.12 показано действие протеолитического экстракта на удлинение тяжа Дюпюитрена как функция прилагаемого растягивающего усилия. В тяж Дюпюитрена инъецировали протеолитический экстракт, а затем его инкубировали в протеолитическом экстракте в течение 24 часов. Затем к тяжу прикладывали растягивающее усилие и оценивали тяж в отношении его удлинения и разрыва.

На Фиг.13 показано действие единичной инъекции протеолитического экстракта на удлинение тяжа Дюпюитрена в виде функции прилагаемого растягивающего усилия. В тяж Дюпюитрена инъецировали протеолитический экстракт, а затем его инкубировали в протеолитическом экстракте в течение 24 часов. Затем к тяжу прикладывали растягивающее усилие и оценивали тяж в отношении его удлинения и разрыва.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагаются способы лечения заболеваний соединительной ткани, связанных с избыточным отложением коллагена, включающие введение нуждающемуся в таком лечении субъекту полученного из бромелаина протеолитического экстракта.

Очищающая композиция, полученная из бромелаина (также именуемая Debrase®) впервые была раскрыта авторами настоящего изобретения в заявке WO 2006/054309, которая включена в настоящее описание во всей своей полноте в виде ссылки. Раскрытая в WO 2006/054309 очищающая композиция содержит цистеиновую протеазу, такую как бромелаин стебля и ананаин. В WO 2006/054309 также сказано, что очищающая композиция удаляет обожженную кожу, т.е. нежизнеспособную ткань, более эффективно чем бромелаин. Однако было обнаружено, что очищающая композиция неактивна в отношении удаления здоровой или живой кожи или дермиса (см., например, Singer et al., 2010, J. Burn Care Res. 31: 304-309). Следовательно, было показано, что очищающая композиция является активной в отношении нежизнеспособных тканей, но не в отношении жизнеспособных тканей.

Неожиданным согласно раскрытию настоящего изобретения является то, что полученный из бромелаина протеолитический экстракт проявляет коллагенолитическую активность in vitro и способен растворять фиброзные тяжи на ладони у субъектов, страдающих болезнью Дюпюитрена. Поскольку протеолитический экстракт согласно настоящему изобретению не разрушает здоровую соединительную ткань, настоящее изобретение предоставляет безопасное и эффективное лекарственное средство для растворения богатой коллагеном фиброзной ткани, в частности у субъектов, страдающих болезнью Дюпюитрена или болезнью Пейрони.

Термины "полученный из бромелаина протеолитический экстракт" и "протеолитический экстракт" в описании и формуле изобретения являются взаимозаменяемыми и относятся к ферментативному препарату частично очищенному от бромелаина.

Термин "бромелаин" относится к любому из порошкообразных препаратов бромелаина, коммерчески доступных в настоящий момент. Примеры производителей бромелаина включают, без ограничения, Sigma and Challenge Bioproducts Co. Ltd., Taiwan. Бромелаин получают из стебля ананаса. Обычный способ получения бромелаина является следующим: сначала рН сока, полученного из стебля ананаса, доводят фосфорной кислотой до 3 или 4, затем для защиты сульфгидрильных групп от окисления добавляют гидроксид натрия или сульфгидрид натрия. Инертный материал выпадает в осадок в присутствии примерно 30% ацетона, и после фильтрации очищенную жидкость осаждают 70% ацетоном. Этот осадок собирают центрифугированием и либо снова растворяют в воде, содержащей гидроксид натрия или сульфогидрид натрия, подкисленный фосфорной кислотой, и повторно осаждают, либо сразу сушат в печи при пониженном давлении. Если материал повторно осаждают, то используют 70% ацетон. Высушенный материал, полученный любым из двух способов, подходит для использования в качестве исходного материала для получения очищающей композиции по настоящему изобретению.

Протеолитический экстракт по настоящему изобретению может содержать одну или несколько цистеиновых протеаз, присутствующих в бромелаине. Согласно иллюстративному варианту осуществления протеолитический экстракт (также именуемый как Debrase® или Nexobrid®) содержит цистеиновые протеазы из стебля бромелаина (EC 3.4.22.32) и ананаина (EC 3.4.22.31). Протеолитический экстракт также может содержать один или несколько предшественников цистеиновых протеаз бромелаина, таких как, например, предшественник ананаина (EC 3.4.22.31), предшественник содержащегося во фруктах бромелаина (EC 3.4.22.33) и предшественник бромелаина стебля (EC 3.4.22.31). Протеолитический экстракт также может содержать фрагменты цистеиновых протеаз (см., например, WO 2006/054309), джакалин-подобный лектин (см., например, Raval et al., Glycobiology, 2004, 14(12): 1247-1263) и/или ингибиторы бромелаина.

Протеолитический экстракт может быть получен способом, содержащим следующие этапы:

(a) суспендирование бромелаина кислым раствором, необязательно содержащим антиоксидант, при этом значение рН кислого раствора находится в пределах от примерно 2,4 до примерно 4;

(b) доведение рН суспензии, полученной на этапе (a), до значения от примерно 2,4 до примерно 4;

(c) добавление вспомогательной фильтрующей присадки в суспензию, полученную на этапе (b);

(d) фильтрование суспензии, полученной на этапе (c), для удаления нерастворимых компонентов;

(e) добавление в отфильтрованный раствор, полученный на этапе (d), сульфата аммония до степени насыщения раствора сульфатом аммония от примерно 40% до примерно 50%;

(f) доведение рН суспензии, полученной на этапе (e), до значения от примерно 2,5 до примерно 4;

(g) инкубацию суспензии, полученной на этапе (f), при 3°C-10°C;

(h) центрифугирование суспензии, полученной на этапе (g), для получения осадка сульфата аммония;

(i) растворение осадка сульфата аммония в кислом растворе, необязательно содержащем антиоксидант и имеющем значение рН в пределах от примерно 2,4 до примерно 4;

(j) фильтрование раствора, полученного на этапе (i), через 10 кДа ультрафильтр; и

(k) лиофилизацию оставшегося раствора, полученного на этапе (j).

Согласно некоторым вариантам осуществления суспендирование бромелаина можно осуществлять любым кислым раствором, рН которого находится в пределах от примерно 2,4 до 4. Примеры кислых растворов или буферов, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, уксусную кислоту в воде, ацетатный буфер и ацетатный буфер, содержащий 1% тиогликолевую кислоту, рН которых находится в пределах от 2,4 до 4. Согласно некоторым вариантам осуществления кислый раствор выбирают из буферов и растворов, раскрытых в патентах США 5830739 и 4197291, которые включены в настоящее описание во всей свой полноте в качестве ссылки.

Кислый раствор необязательно может содержать антиоксидант. Примеры антиоксидантов включают, без ограничения, аскорбиновую кислоту, дигидрохинон, бутилированный гидрокситолуол и дитиотреитол. Антиоксидант можно добавлять в концентрации от примерно 0,5% до 2%, предпочтительно 1%.

Кислый раствор также может содержать смачивающий агент. Примеры смачивающих агентов включают, без ограничения, н-октанол.

Значение рН кислого раствора, необязательно содержащего антиоксидант, может находиться в пределах от примерно 2,4 до примерно 4. Согласно конкретному варианту осуществления рН кислого раствора, необязательно содержащего антиоксидант, находится в пределах от примерно 2,4 до примерно 2,6.

Согласно дополнительным вариантам осуществления вспомогательную фильтрующую присадку добавляют в суспензию, полученную на этапе (а). Согласно одному из вариантов осуществления вспомогательная фильтрующая присадка содержит оксид кремния. Предпочтительно, вспомогательная фильтрующая присадка представляет собой природный диатомит, который кальцинируют для достижения более высоких скоростей потока.

Осаждение нужных белков можно выполнять путем добавления сульфата аммония в отфильтрованный раствор, полученный на этапе (b). Сульфат аммония можно добавлять до степени насыщения от примерно 40% до примерно 50%. Предпочтительно, сульфат аммония можно добавлять до 40% насыщения.

Затем суспензию, полученную на этапе (f), инкубируют при температуре от 3°С до 10°С. Предпочтительно, суспензию, полученную на этапе (f), инкубируют в течение по меньшей мере 10 часов при температуре от 3°С до 10°С. Более предпочтительно, суспензию, полученную на этапе (f), инкубируют в течение по меньшей мере 12-24 часов при 4°С.

В конце этапа инкубации суспензию, полученную на этапе (g), центрифугируют для осаждения нужных белков, т.е. протеолитических ферментов. Затем осадок растворяют в кислом растворе, необязательно содержащем антиоксидант. Согласно иллюстративному варианту осуществления суспензию инкубируют в течение по меньшей мере 10 часов при 4°С.

Раствор, полученный на этапе (i), фильтруют на этапе фильтрования для получения в остатке протеолитических ферментов с молекулярной массой более 10 кДа. Согласно предпочтительному варианту осуществления раствор, полученный на этапе (i), фильтруют через мембранный фильтр для отделения веществ с молекулярным весом примерно 10 кДа.

После фильтрования протеолитический экстракт может быть лиофилизирован, может быть промыт дистиллированной водой и затем лиофилизирован или может быть отфильтрован и затем лиофилизирован. Согласно предпочтительному варианту осуществления протеолитический экстракт фильтруют через мембранный фильтр с размером пор по меньшей мере 0,5 мкм для получения стерильного раствора, который затем лиофилизируют и хранят. Протеолитический экстракт предпочтительно хранят в виде лиофилизированного порошка, поскольку он является более стабильным в условиях отсутствия влаги. Перед использованием протеолитический экстракт растворяют в растворе с тем, чтобы получить раствор со значением рН от примерно 6 до примерно 7.

Согласно иллюстративному варианту осуществления протеолитический экстракт может быть получен способом, содержащим следующие этапы:

(а) суспендирование бромелаина 0,3М раствором уксусной кислоты, содержащим 1% аскорбиновой кислоты и н-октанол, рН которого находится в пределах от примерно 2,4 до примерно 2,6;

(b) доведение рН суспензии, полученной на этапе (a), до значения от примерно 2,5 до примерно 3,5;

(с) добавление в суспензию, полученную на этапе (b), вспомогательной фильтрующей присадки, содержащей оксид кремния;

(d) фильтрование суспензии, полученной на этапе (с), через фильтр-пресс для удаления нерастворимых компонентов;

(е) добавление в отфильтрованный раствор, полученный на этапе (d), сульфата аммония (285 г/л) до степени насыщения 40%;

(f) доведение рН суспензии, полученной на этапе (e), до значения от примерно 2,5 до примерно 3,5;

(g) инкубацию суспензии, полученной на этапе (f), в течение примерно 12-24 часов при 4°C;

(h) центрифугирование суспензии, полученной на этапе (g), для получения осадка сульфата аммония;

(i) растворение осадка сульфата аммония в 0,3 M растворе уксусной кислоты, содержащем 1% аскорбиновую кислоту, имеющем рН в пределах от примерно 2,4 до примерно 2,6;

(j) фильтрование раствора, полученного на этапе (i), через 10 кДа ультрафильтр;

(k) фильтрование оставшегося раствора, полученного на этапе (j), для получения стерильного раствора; и

(l) лиофилизацию отфильтрованного раствора, полученного на этапе (k).

Термины "болезнь Дюпюитрена" и "БД" являются взаимозаменяемыми и относятся к заболеванию, при котором пальцы не могут полностью разогнуться, и обычно согнуты в направлении ладони руки. В частности, болезнь Дюпюитрена начинается с образования фиброматозных узлов в ладонной фасции, обычно с локтевой стороны. Узлы прогрессируют и формируют фиброзную связку или тяж, тянущийся от ладони до пальцев, приводя в итоге к постоянной контрактуре-флексии пальцев. Наиболее часто поражается безымянный палец, а затем мизинец.

Термины "тяж Дюпюитрена" и "болезненный тяж" являются взаимозаменяемыми и относятся к связкам из фасциальных волокон, которые тянутся под кожей на ладони в продольном направлении. Эти связки приводят к контрактурам наружного слоя кожи и дистальных фаланг пальцев, которые прикреплены к связкам, и в конечном счете к постоянной контрактуре-флексии пораженных пальцев. Обычно тяж Дюпюитрена содержит большое количество фибробластов, увеличенное отложение белков внеклеточного матрикса (ВКМ), в частности коллагена, и миофибробластов.

Следует иметь в виду, что протеолитический экстракт по изобретению можно использовать для лечения субъектов, страдающих другими болезнями, связанными с избыточным отложением коллагена. Другие нарушения фиброзной ткани и нарушения, которые связаны с отложением коллагена, включают болезнь Пейрони, фиброз Леддерхозе и фиброз суставных капсул, влагалищ сухожилий и связок. Таким образом, протеолитический экстракт можно использовать для лечения синдрома “замороженного плеча” (адгезивный капсулит). Эти заболевания соединительной ткани, связанные с избыточным отложением коллагена или нарушениями фиброзной ткани, не связаны с ранами и ожогами.

Термины "лечащий" и "лечение" в настоящем описании относятся к облегчению или исчезновению одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием соединительной ткани. Например, симптомы, связанные с болезнью Дюпюитрена, включают, помимо прочего, контрактуру суставов, уменьшение подвижности суставов. Симптомы болезни Пейрони включают, например, боль, аномальное искривление и эректильную дисфункцию.

Термин "терапевтически эффективное количество" протеолитического экстракта представляет собой такое количество протеолитического экстракта, которое является достаточным для получения терапевтического эффекта у субъекта, которому введена композиция.

Предполагается, что термин "примерно", если он относится к значению рН раствора или суспензии, указывает на то, что значения, превышающие и находящиеся ниже на 0,5 единиц указанного значения рН, находится в объеме настоящего изобретения.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит протеолитический экстракт и фармацевтически приемлемый носитель.

Термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренное регулирующим органом федеральной или государственной власти или регулирующим органом, указанным в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее, для применения на животных, а более конкретно на людях.

Термин "носитель" относится к разбавителю, наполнителю или среде, с которой вводят протеолитический экстракт. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода или масла, включая масла, полученные из нефти, масла животного или растительного происхождения или синтетические масла, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п., полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители. В качестве жидких носителей, в частности растворов для инъекций, можно использовать солевые растворы, водный раствор NaCl/CaCl₂, водный раствор декстрозы, растворы глицерина и растворы альбумина. В качестве носителя также можно использовать воду, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно.

Фармацевтическая композиция также может содержать стабилизирующие агенты, такие как лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, силикат кальция, поливинилпирролидон и целлюлоза. Композиция может дополнительно включать лубриканты, такие как стеарат магния и минеральное масло; смачивающие агенты; эмульгаторы и суспендирующие агенты; консерванты, такие как тримерозал, бензиловый спирт, парабены, метил- или пропилгидроксибензоаты; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, дигидрохинон, бутилированный гидрокситолуол и дитиотреитол; и буферные агенты, такие как одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, бензоат натрия, бензоат калия, цитрат натрия, ацетат натрия и тартрат натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; и регулирующие тоничность агенты, такие как хлорид натрия или декстроза.

Фармацевтическая композиция также может содержать анестетик.

Анестетики включают, без ограничения, аметокаин (тетракаин), лигнокаин (лидокаин), ксилокаин, бупивакаин, прилокаин, ропивакаин, бензокаин, мепивокаин, кокаин и их комбинации.

Фармацевтическая композиция также может содержать антибактериальный агент.

Антибактериальные агенты включают, но не ограничивают, гидрохлорид аманфадина, сульфат аманфадина, амикацин, сульфат амикацина, аминогликозиды, амоксициллин, ампициллин, ансамицины, бацитрацин, бета-лактамы, кандицидин, капреомицин, карбенициллин, цефалексин, цефалоридин, цефалотин, цефазолин, цефапирин, цефрадин, цефалоглицин, хиломфениколы, хлоргексидин, глюконат хлоргексидина, гидрохлорид хлоргексидина, хлороксин, хлорхинальдол, хлортетрациклин, гидрохлорид хлортетрациклина, ципрофлоксацин, циркулин, клиндамицин, гидрохлорид клиндамицина, клотримазол, клоксациллин, демеклоциклин, диклоксациллин, дийодогидроксиквин, доксициклин, этамбутол, гидрохлорид этамбутола, эритромицин, эстолат эритромицина, стеарат эрмицина, фарнезол, флоксациллин, гентамицин, сульфат гентамицина, грамицидин, гризеофульвин, галопрогин, галоквинол, гексахлорофен, иминоциклин, йодохлоргидроксиквин, канамицин, сульфат канамицина, линкомицин, линеомицин, гидрохлорид линеомицина, макролиды, меклоциклин, метациклин, гидрохлорид метациклина, метенин, гиппурат метенамина, манделат метенамина, метициллин, метонидазол, миконазол, гидрохлорид миконазола, миноциклин, гидрохлорид миноциклина, мупироцин, нафциллин, неомицин, сульфат неомицина, нетимицин, сульфат нетилмицина, нитрофуразон, норфлоксацин, нистатин, октопирокс, олеандомицин, орцефалоспорины, оксациллин, окситеклин, гидрохлорид окситетрациклина, парахлорметаксиленол, паромомицин, сульфат паромомицина, пенициллины, пенициллин G, пенициллин V, пентамидин, гидрохлорид пентамидин, фенетициллин, полимиксины, хинолоны, сульфат стрептомицина, тетрациклин, толнафтат тобрамицина, триклозан, трифампин, рифамицин, ролитетрациклин, соли серебра, спектиномицин, спирамицин, стрептомицин, сульфонамид, тетрациклины, тетрациклин, тобрамицин, сульфат тобрамицина, триклокарбон, триклозан, триметоприм-сульфаметоксазол, тилозин, ванкомицин и иротрицин.

Согласно другому варианту осуществления фармацевтическая композиция также может содержать противовоспалительный агент.

Противовоспалительный агент может быть нестероидным, стероидным или их комбинацией. Неограничивающие примеры нестероидных противовоспалительных агентов включают оксикамы, такие как пироксикам, изоксикам, теноксикам, судоксикам; салицилаты, такие как аспирин, дисальцид, бенорилат, трилизат, сафаприн, солприн, дифлунизал и фендозал; производные уксусной кислоты, такие как диклофенак, фенклофенак, индометацин, сулиндак, толметин, изоксепак, фурофенак, тиопинак, зидометацин, ацематацин, фентиазак, зомепирак, клинданак, оксепинак, фелбинак и кеторолак; фенаматы, такие как мефенаминовая, меклофенаминовая, флуфенаминовая, нифлуминовая и толфенаминовая кислоты; производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, беноксапрофен, флурбипрофен, кетопрофен, фенопрофен, фенбуфен, индопрофен, пирпрофен, карпрофен, оксапрозин, пранопрофен, миропрофен, тиоксапрофен, супрофен, алминопрофен и тиапрофеник; пиразолы, такие как фенилбутазон, оксифенбутазон, фепразон, азапропазон и триметазон. Также можно использовать экстракты этих нестероидных противовоспалительных агентов.

Неограничивающие примеры стероидных противовоспалительных лекарственных веществ включают кортикостероиды, такие как гидрокортизон, гидроксил-триамцинолон, альфа-метилдексаметазон, дексаметазонфосфат, дипропионаты бекламетазона, валераты клобетазола, дезонид, дезоксиметазон, дезоксикортикостерона ацетат, дексаметазон, дихлоризон, диацетат дифлоразона, дифлукортолона валерат, флуадренолон, ацетонид флуклоролона, флудрокортизон, пивалат флуметазона, ацетонид флуозинолона, флуоцинонид, сложные бутиловые эфиры флукортина, флуокортолон, ацетат флупреднидена (флупреднилидена), флурандренолон, гальцинонид, гидрокортизона ацетат, гидрокортизона бутират, метилпреднизолон, триамцинолона ацетонид, кортизон, кортодоксон, флуцетонид, флудрокоризон, диацетат дифлурозона, фурадренолон, флудрокортизон, дифлурозона диацетат, флурадренолона ацетонид, медризон, амцинафел, амцинафид, бетаметазон и баланс их эфиров, хлорпреднизон, хлорпреднизона ацетат, клокортелон, клесцинолон, дихлоризон, дифлурпреднат, флуклоронид, флунизолид, фторметалон, флуперолон, флупреднизолон, гидрокортизона валерат, гидрокортизона циклопентилпропионат, гидрокортамат, мепреднизон, параметазон, преднизолон, преднизон, беклометазона дипропионат, триамцинолон и их экстракты.

Фармацевтическая композиция может быть составлена в виде сухой или лиофилизированной лекарственной формы, полутвердой лекарственной формы, жидкой лекарственной формы или пенной лекарственной формы. Таким образом, фармацевтическая композиция может быть составлена в виде порошка, раствора, суспензии, эмульсии, геля, спрея или пластыря.

Фармацевтическую композицию можно наносить на пораженное место, вводить подкожно, интрадермально или внутримышечно.

Согласно одному из конкретных вариантов осуществления фармацевтическую композицию вводят в виде инъекции. Согласно иллюстративному варианту осуществления фармацевтическую композицию инъецируют непосредственно в болезненные фиброзные узлы или тяж или в фиброзную бляшку. В качестве альтернативы, фармацевтическую композицию имплантируют в хирургический надрез. Стерильные инъецируемые препараты могут быть составлены в виде водных растворов или масляных суспензий, известных в данной области техники.

Для местного нанесения на кожу фармацевтическая композиция может быть составлена в виде мази, крема, лосьона, пасты, спрея или аэрозоля. Примеры подходящих сред включают, без ограничения, вазелин, аквафор, Необас, пропиленгликоль, глицерин и т.п. Также могут использоваться комбинации двух или более этих сред.

Фармацевтическая композиция может быть составлена в виде лекарственной формы с контролируемым или замедленным высвобождением, обеспечивающей пролонгированное высвобождение активных компонентов в течение заданного периода времени. В одном из конкретных вариантов осуществления фармацевтическую композицию вводят в комбинации с биоразлагаемым, биосовместимым полимерным имплантом, который высвобождает протеолитический экстракт в выбранный участок в течение контролируемого периода времени. Примеры полимерных материалов включают полиангидриды, полиортоэстеры, полигликолевую кислоту, полиэтиленвинилацетат, их сополимеры и смеси (см., Medical applications of controlled release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Fla.). В качестве альтернативы, фармацевтическую композицию наносят местно в виде геля. Примеры полимерных материалов, которые можно использовать, представляют собой полисахариды, в частности производные целлюлозы, такие как, например, гидроксипропилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и гидроксиэтилцеллюлоза, хитин, хитозан и альгинаты. Гелевые лекарственные формы обеспечивают пролонгированное высвобождение активных компонентов в течение заданного периода времени.

Фармацевтическая композиция может быть составлена в виде пены. Для изготовления и введения вспениваемых композиций в виде пены используются газовые пропелленты. Примеры подходящих газовых пропеллентов включают летучие углеводороды, такие как бутан, пропан, изобутан или их смеси и фторуглеродные газы. Композиция может быть водной, эмульсией масло-в-воде или эмульсией вода-в-масле, дополнительно содержащей стабилизирующий агент. Стабилизирующий агент увеличивает вязкость композиции, может повышать стабильность композиции и/или уменьшать скорость оседания пены. Примеры стабилизирующих агентов включают, без ограничения, встречающиеся в природе полимерные материалы (например, альгинат, альбумин, каррагинан, ксантановую камедь, крахмал), полусинтетические полимерные материалы, такие как сложные эфиры целлюлозы (например, гидроксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза) и синтетические полимерные материалы (например, поливиниловый спирт, карбоксивиниловые полимеры и поливинилпирролидон).

Способы составления лекарственных форм и введения лекарственных веществ можно найти в руководстве "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, последнее издание, которое включено в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки.

Фармацевтическая композиция может быть инъецирована в виде единичной дозы или в виде аликвот в два или несколько участков пораженной фиброзной ткани. Вводимое количество протеолитического экстракта представляет собой эффективное количество, которое размягчает и/или разрушает бляшки. Эффективное количество протеолитического экстракта может находиться в пределах от примерно 0,2 мг/сутки до примерно 40 мг/сутки. В одном из конкретных вариантов осуществления фармацевтическую композицию вводят в виде двух или более аликвот, каждая из которых содержит примерно 0,5-1,5 мг, необязательно в 0,2-0,5 мл раствора или суспензии.

В одном из конкретных вариантов осуществления фармацевтическую композицию, содержащую протеолитический экстракт, вводят в течение нескольких часов, например от 2 до 12 часов.

Каждый возможный вариант, раскрытый в настоящем описании, представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Для более полного понимания изобретения ниже приводятся примеры. Конкретные способы, условия, материалы, пропорции и данные, приведенные для иллюстрации принципов изобретения, являются иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.

ПРИМЕР 1

Коллагенолитическая активность протеолитического экстракта

Протеолитический экстракт получали из бромелаина, согласно описанию, приведенному в WO 2006/054309.

Сначала определяли способность двух партий Debrase разрушать коллаген типа IV. Анализ проводили, используя желатиназу EnzChek®/набор для анализа коллагеназы (Invitrogen), содержащий в качестве субстрата коллаген DQ типа IV™, меченный флуоресцеином. Известно, что этот субстрат эффективно расщепляется коллагеназой до получения сильно флуоресцирующих пептидов. Усиление флуоресценции пропорционально протеолитической активности.

В каждую лунку добавляли реакционный буфер Debrase (0,15 М трис-HCl и 10 мМ ЭДТА, рН 7,6) до получения конечного объема 10 мкл. Затем в лунки добавляли по 10 мкл 0,5 мкг/мкл раствора Debrase коллагена типа IV™. После этого в буфер Debrase в лунках добавляли разные объемы (10-80 мкл) свежеприготовленного Debrase с концентрацией 0,225-1 нг/мкл до достижения концентрации 1,5-20 нг/лунку. Буфер Debrase использовали в качестве отрицательного контроля. Реакционный планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Для остановки реакции добавляли 20 мкл раствора для остановки реакции (0,324 мМ иодуксусной кислоты в буфере Debrase). Интенсивность флуоресценции измеряли микропланшетным ридером флуоресценции (Analyst AD, LJL), оборудованным стандартными флуоресцентными фильтрами. Вычитали фоновую флуоресценцию, полученную из лунок, инкубированных в отсутствии фермента.

На Фиг.1 показана коллагенолитическая активность двух партий Debrase. Как видно на Фиг.1, две партии Debrase демонстрируют аналогичную коллагенолитическую активность, что указывает на то, что используемая в эксперименте процедура для получения протеолитического экстракта по настоящему изобретению приводит к получению сопоставимых препаратов.

Затем определяли способность протеолитического экстракта разрушать коллаген типа I и IV. В итоге, в качестве субстрата использовали коллаген DQ типа IV™ и коллаген DQ типа I™, меченные флуоресцеином. Анализ выполняли согласно тому, как описано выше, при этом анализ продолжался в течение временных интервалов, указанных на Фиг.2. Реакцию останавливали добавлением 20 мкл раствора для остановки реакции (0,324 мМ иодуксусной кислоты в буфере Debrase) и измеряли интенсивность флуоресценции согласно тому, как описано выше.

Коллагеназа, очищенная из Clostridium histolyticum, служила в качестве положительного контроля с заданной активностью (одну единицу определяли как количество фермента, требуемое для высвобождения 1 мкМ эквивалентов Е-лейцина из коллагена через 5 часов при 37°C, pH 7,5).

Для анализа при помощи коллагеназы Clostridium histolyticum в каждую лунку добавляли реакционный буфер для коллагеназы (0,05 M трис-HCl, 0,15 M NaCl, 5 мМ CaCl₂, 0,2 мМ азид натрия, pH 7,6) до достижения конечного объема 100 мкл. Затем в лунки, служащие в качестве стандарта, добавляли разные объемы (10-80 мкл) 0,4-1 мЕд./мкл коллагеназы Clostridium в буфере для коллагеназы Clostridium до получения концентраций в пределах от 5 до 80 мЕд./лунку. Для остановки реакции коллагеназы Clostridium добавляли 20 мкл 2 мг/мл 1,10-фенантотролина в коллагеназном буфере.

Данные по коллагеназе Clostridium использовали в качестве стандартного значения на мЕдиницу. Данные для образцов протеолитического экстракта (также называемого Debrase) получали путем деления на стандартное значение, определяя таким образом мЕд./нг Debrase.

На Фиг.2 показано, что протеолитический экстракт разрушал коллаген типа I и IV со значением удельной активности 1,58 и 1,27 мЕд./нг соответственно.

Затем активность протеолитического экстракта по отношению к коллагену сравнивали с активностью коллагеназы Clostridium histolyticum. Также измеряли протеолитическую активность коллагеназы в отношении желатина, используя желатиназу EnzChek®/набор для определения активности коллагеназы (Invitrogen) и DQ желатин™ (Invitrogen) в качестве субстрата.

На Фиг.3 показано, что протеолитический экстракт продемонстрировал коллагенолитическую активность в отношении коллагена IV, активность которого была выше активности, полученной для коммерчески доступной коллагеназы в отношении коллагена.

На Фиг.4 показано, что протеолитический экстракт продемонстрировал желатиназную активность. Как видно на Фиг.4, желатиназная активность протеолитического экстракта имеет линейную зависимость в диапазоне концентрации от 2 до 8 нг/лунку.

ПРИМЕР 2

Протеолитический экстракт облегчает разрыв тяжа Дюпюитрена.

Тяжи Дюпюитрена были получены от пациентов после фасциэктомии. Перед проведением хирургической операции все пациенты подписали форму установленного образца о своем согласии, а само исследование было одобрено Хельсинкским комитетом. В этом эксперименте изучали способность протеолитического экстракта облегчать фасциэктомию тяжа.

Подготовка ткани

Тяжи, полученные от пациентов, делили на две или три части в зависимости от их длины (Фиг.6). Тяжи соединяли методом Кракова с устройством для механического тестирования нитью пролен-1 (Ethicon, Somerville, NJ) (Фиг. 7). В один или два тяжа инъецировали протеолитический экстракт (0,3-0,5 мл протеолитического экстракта в зависимости от размера тяжа), а во второй контрольный тяж инъецировали солевой раствор (Фиг.8). Тяжи из группы протеолитического экстракта погружали в раствор, содержащий протеолитический экстракт, а тяжи из контрольной группы погружали в солевой раствор. Обе группы инкубировали при 37°С в течение 24 часов.

Механическое тестирование

После 24 часовой инкубации все тяжи соединяли с устройством тестирования на растяжение (Zwick 1445 testing system, Zwick Co., Germany). К каждому тяжу прикладывали увеличивающуюся нагрузку до тех пор, пока не разрывался тяж или нить. С помощью устройства измеряли прилагаемое растягивающее усилие до момента разрыва.

Гистологический анализ

Для гистологического анализа и для определения стадии заболевания получали образец каждого типа.

Статистический анализ

Сравнение эффективности контрольной группы с эффективностью исследуемой группы тестировали, используя критерий Фишера.

Результаты

Все тяжи (n=10), обработанные протеолитическим экстрактом, при растяжении разрывались (Фиг. 10A и 10B). Некоторые тяжи, обработанные протеолитическим экстрактом, были почти полностью разорваны, в частности, растворялись до механического испытания. Ни один из контрольных тяжей (n=9) не разорвался после приложения растягивающего усилия. Как показано на Фиг.11 все контрольные тяжи имели аналогичный паттерн удлинения под нагрузкой с характерным предельным удлинением при увеличении нагрузки на тяж до тех пор, пока он не разрывался при приложении очень высокой нагрузки. Все тяжи, обработанные протеолитическим экстрактом, наоборот не обладали никаким сопротивлением при приложении растягивающего усилия тяжа и разрывались при очень низких нагрузках (Фиг.12). Эти результаты показали, что низкие дозы, т.е. 0,8 мг/мл, протеолитического экстракта способны разрывать тяжи, пораженных болезнью Дюпюитрена, при этом этот эффект был также продемонстрирован для высоких доз протеолитического экстракта, т.е. до 150 мг/мл.

Для оценки действия единичной инъекции протеолитического экстракта при удлинении тяжа Дюпюитрена в тяжи инъецировали протеолитический экстракт в три разных места вдоль тяжа, а затем инкубировали в солевом растворе в отсутствие протеолитического экстракта в течение 24 часов при 37°С.

На Фиг.13 показано, что инъекции протеолитического экстракта, введенные в три участка тяжей Дюпюитрена, приводят к уменьшению сопротивления тяжа к растягивающему усилию в 4-5 (см. Фиг. 13, тест 1a и 2, показывающие разрыв тяжа при приложении усилия 18 Н и 15 Н соответственно). Один тяж (Фиг.13, тест 1b) разорвался при приложении нагрузки 0,4 Н. Эти результаты свидетельствуют об эффективности протеолитического экстракта в отношении растворения тяжей Дюпюитрена и ясно свидетельствуют о том, что протеолитический экстракт по настоящему изобретению является высоко эффективным ферментативным лекарственным средством для лечения болезни Дюпюитрена, а также других болезней соединительной ткани, связанных с избыточным отложением коллагена.

Для специалиста в данной области очевидно, что настоящее изобретение не ограничено приведенными выше сведениями, предназначенными для его иллюстрации и описания. Объем изобретения определяется приведенной ниже формулой изобретения.

1. Фармацевтическая композиция, содержащая протеолитический экстракт, полученный из бромелаина, для применения в лечении заболевания соединительной ткани, где бромелаин получен из стебля ананаса, где протеолитический экстракт содержит бромелаин стебля, ананаин и джакалин-подобный лектин и где заболевание соединительной ткани связано с избыточным отложением коллагена.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где заболевание соединительной ткани выбрано из группы, состоящей из болезни Дюпюитрена, болезни Пейрони, синдрома "замороженного плеча" и болезни Леддерхозе.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, где заболевание соединительной ткани представляет собой болезнь Дюпюитрена.

4. Фармацевтическая композиция по п. 1, где заболевание соединительной ткани представляет собой болезнь Пейрони.

5. Фармацевтическая композиция по п. 1, где протеолитический экстракт дополнительно содержит по меньшей мере один предшественник цистеиновой протеазы.

6. Фармацевтическая композиция по п. 1, дополнительно содержащая агент, выбранный из группы, состоящей из анестетика, антибактериального агента и противовоспалительного агента.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6, где анестетик выбран из группы, состоящей из аметокаина (тетракаина), лигнокаина (лидокаина), ксилокаина, бупивакаина, прилокаина, ропивакаина, бензокаина, мепивокаина, кокаина и их комбинаций.

8. Фармацевтическая композиция по п. 6, где антибактериальный агент выбран из группы, состоящей из гидрохлорида амантадина, сульфата амантадина, амикацина, сульфата амикацина, аминогликозидов, амоксициллина, ампициллина, ансамицинов, бацитрацина, бета-лактамов, кандицидина, капреомицина, карбенициллина, цефалексина, цефалоридина, цефалотина, цефазолина, цефапирина, цефрадина, цефалоглицина, хиломфениколов, хлоргексидина, хлоргексидина глюконата, гидрохлорида хлоргексидина, хлороксина, хлорхинальдола, хлортетрациклина, гидрохлорида хлортетрациклина, ципрофлоксацина, циркулина, клиндамицина, гидрохлорида клиндамицина, клотримазола, клоксациллина, демеклоциклина, диклоксациллина, дийодогидроксиквина, доксициклина, этамбутола, гидрохлорида этамбутола, эритромицина, эстолата эритромицина, стеарата эрмицина, фарнезола, флоксациллина, гентамицина, сульфата гентамицина, грамицидина, гризеофульвина, галопрогина, галоквинола, гексахлорофена, иминоциклина, йодохлоргидроксиквина, канамицина, сульфата канамицина, линкомицина, линеомицина, гидрохлорида линеомицина, макролидов, меклоциклина, метациклина, гидрохлорида метациклина, метенина, метенамина гиппурата, метенамина манделата, метициллина, метронидазола, миконазола, гидрохлорида миконазола, миноциклина, гидрохлорида миноциклина, мупироцина, нафциллина, неомицина, сульфата неомицина, нетилмицина, сульфата нетилмицина, нитрофуразона, норфлоксацина, нистатина, октопирокса, олеандомицина, орцефалоспоринов, оксациллина, окситетрациклина, гидрохлорида окситетрациклина, парахлорметаксиленола, паромомицина, сульфата паромомицина, пенициллинов, пенициллина G, пенициллина V, пентамидина, гидрохлорида пентамидина, фенетициллина, полимиксинов, хинолонов, сульфата стрептомицина, тетрациклина, тобрамицина, толнафтата, триклозана, трифампина, рифамицина, ролитетрациклина, солей серебра, спектиномицина, спирамицина, стрептомицина, сульфонамида, тетрациклинов, тетрациклина, тобрамицина, сульфата тобрамицина, триклокарбона, триклозана, триметоприм-сульфаметоксазола, тилозина, ванкомицина и ротрицина.

9. Фармацевтическая композиция по п. 6, где противовоспалительный агент выбран из группы, состоящей из нестероидных противовоспалительных агентов и стероидных противовоспалительных агентов.

10. Фармацевтическая композиция по п. 1, дополнительно содержащая компонент, который выбран из группы, состоящей из стабилизирующего агента, антиокислителя, консерванта, буферного агента, хелатирующего агента и регулирующего тоничность агента.

11. Фармацевтическая композиция по п. 1, составленная в виде лекарственной формы, выбранной из группы, состоящей из твердой лекарственной формы, полутвердой лекарственной формы, жидкой лекарственной формы и пенной лекарственной формы.

12. Фармацевтическая композиция по п. 11, где твердая лекарственная форма представляет собой порошок.

13. Фармацевтическая композиция по п. 11, где жидкая лекарственная форма представляет собой раствор для инъекций, рН которого находится в пределах от 6 до 7.

14. Фармацевтическая композиция по п. 1, которую вводят путем инъекции в болезненную фиброзную ткань.

15. Фармацевтическая композиция по п. 14, которую вводят в виде одной дозированной инъекции.

16. Фармацевтическая композиция по п. 14, которую инъецируют в виде аликвот в два или более участков болезненной фиброзной ткани.