Способ пробоподготовки крови к количественному определению фтора

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике для определения ионов фтора в крови человека и животных. Для этого проводят отбор проб крови для анализа с последующей обработкой 10%-ным спиртовым раствором гидроксида натрия в соотношении 1:2 к пробе крови. Пробы перемешивают встряхиванием в течение 2 мин или обрабатывают в течение 2 мин ультразвуком. Затем пробы центрифугируют, отделяют полученный раствор и определяют содержание фторид-иона потенциометрическим методом с помощью фторид-селективного электрода. Изобретение обеспечивает способ количественного определения фтора в крови при воздействии фтористых соединений (органических и неорганических) на человека и животных. 1 з.п. ф-лы, 2 пр.

 

Изобретение относится к химии, токсикологии, медицине, в частности к лабораторной диагностике, и может найти применение для определения ионов фтора в крови человека и животных.

Фтор является самым активным неметаллом (галогеном) и образует соединения со всеми другими элементами. Фтор широко распространен в природе: в земной коре в виде минералов: плавикового шпата (флюорита), апатита, криолита, в воде поверхностных и подземных источников. Соединения фтора широко используются в промышленности.

Фтор является постоянной составной частью тканей растений, животных, обязательным микроэлементом для организма человека. Установлено, что фтор стимулирует ряд физиологических процессов: обмен фосфора и кальция, стимулирует рост и укрепление костей, волос, ногтей. При избыточном поступлении фтора в организм наблюдаются острые и хронические интоксикации. Соединения фтора более токсичны в воде ввиду быстрой и более полной всасываемости в виде водных растворов. Резорбтивное действие фтора объясняется по-разному. Ряд авторов считает, что фтор соединяется в организме с кальцием и образует трудно растворимый фтористый кальций, что в конечном итоге приводит к тромбозам сосудов, повышению возбудимости нервной системы.

Фтористые соединения, попадая в желудок, распадаются под влиянием желудочного сока и соляной кислоты, образуя фтористый водород. Фтористый водород, попадая в кровь, оказывает общетоксическое действие, вызывая нарушения ферментных систем: холинэстераз, фосфатаз, аденозинтрифосфатаз, дезоксирибонуклеаз, энтерокиназ.

Основной путь поступления фтора в организм животных и человека - через желудочно-кишечный тракт. Всасывается фтор в тонком кишечнике, в крови связывается с ионизированным кальцием, накапливается преимущественно в костях, зубах, в меньшем количестве - в печени, почках, селезенке, щитовидной железе в виде неорганических соединений.

Резорбция фтора в пищеварительном тракте зависит от 1) типа фторсодержащего соединения (неорганическое, органическое и др.), его агрегатного состояния, растворимости и диссоциации; 2) количества поступающего фтора; 3) вида и количества сопровождающих (с водой или пищей) соединений; 4) особенностей питания; 5) физиологического состояния организма, возраста. В зависимости от описанного выше максимальный подъем уровня фтора в крови наблюдается через 1-3 ч после введения per os [Николаев Н.С., Суворова С.Н., Гурович Е.И. Аналитическая химия фтора // М.: Наука, 1970. - 196 с.]. Большинство авторов считают, что в основе механизма всасывания фтора лежат обычные процессы диффузии (через мембраны желудочной и кишечной стенок), скорость которой определяется градиентом концентрации фтора: пищеварительный тракт - кровь. Неорганические соединения всасываются в основном не измененными, а часть органических - лишь после расщепления в пищеварительном тракте. Из пищеварительного тракта фтор поступает в кровь: часть фтора (по разным данным, от 15 до 50%) находится в ионизированном состоянии, а другая часть связана с альбуминами и кальцием.

Большинство современных исследователей полагают, что концентрация фтора в крови людей колеблется в пределах 0,025-0,06 мг/дм³. Имеется мнение, что биологически значимые нарушения активности ферментов в организме человека начинаются лишь после того, как концентрация фтора в крови достигает 0,3 мг/дм³ (критическая величина. В основном фтор выводится из организма с мочой (80%) и калом (20%)) [Габович Р.Д., Минх А.А. Гигиенические проблемы фторирования питьевой воды. / М.: Медицина, 1979 г.].

Качественное определение фтора в любом материале (зерно, трава, комбикорм, вода и т.д.), в т.ч. биоматериале (органы животных, моча) основывается на специфическом действии этого элемента «разъедать стекло». Для качественного определения предложены многочисленные реакции (например, с цирконализариновым лаком, который в присутствии фтора обесцвечивается). Для быстрого обнаружения фтора в содержимом желудка, а также для исследования костей и зубов применяют серную кислоту по А.В. Николаеву [Николаев Н.С., Суворова С.Н., Гурович Е.И. Аналитическая химия фтора // М.: Наука, 1970. - 196 с.].

Количественное определение фтора в пищевой продукции, биологических объектах основано на его способности вытеснять галогены и кислород из галогенидов и окислов, а также реагировать со свободными элементами.

Известен способ определения ионов фтора в крови [Габович Р.Д., Овруцкий Г.Д. Фтор в профилактике кариеса зубов / Учебное пособие. // Казань. - КГМИ. - 1962. - 243 с.], включающий забор крови для анализа, добавление к ней ацетатно-цитратного буфера, известкового молока, содержащего 0,5 г окиси кальция, выпаривание на водяной бане, высушивание и озоление, отгонку фтора и определение его в дистилляте спектрофотометрическим торий-ализариновым методом.

К недостаткам способа следует отнести использование большого количества реактивов, воздействие температуры в процессе озоления, что приводит к загрязнению исследуемого материала, а также потери ионов фтора в процессе озоления, многостадийность и значительная длительность анализа, что влияет на точность его количественного определения.

В качестве ближайшего аналога можно рассматривать запатентованный способ определения ионов фтора в крови [Патент №2176797], заключающийся в обработке пробы путем многократного замораживания-размораживания, последующего центрифугирования, отделения полученного раствора, в котором содержание ионов фтора определяют фторид-селективным электродом ЭХ-F-01 на иономере IM-115. Причем однократное замораживание не позволяет максимально определить элемент в крови, а дальнейшее увеличение числа стадий замораживания - размораживания не приводит к положительному эффекту. Кроме того, альбуминат фтора, кальций фтористый, магний фтористый являются нерастворимыми соединениями фтора и остаются в осадке после операции центрифугирования.

Поэтому на основании изложенного задачей изобретения является разработка способа определения иона фтора в крови путем подготовки крови без использования воздействия высоких температур (в процессе озоления), большого количества реактивов, редких реактивов (нитрат тория, ализарин-комплексон), большого объема пробы (до 50 см³), многостадийности и длительности процесса - всего, что значительно влияет на точность и воспроизводимость количественного анализа. Технический результат - упрощение процедуры, повышение точности и воспроизводимости количественного определения фтора.

Заявляется способ определения иона фтора в крови, включающий забор пробы крови для анализа, обработку пробы и количественное определение в растворе, отличающийся тем, что обработку пробы проводят 10%-ным спиртовым раствором гидроксида натрия в соотношении 1:2 к пробе крови, проводят встряхивание в течение 2 минут, центрифугируют, отделяют полученный раствор для измерения потенциометрическим методом с помощью фторид-селективного электрода.

Встряхивание может проводиться с использованием ультразвука.

Способ осуществляется следующим образом: отбирают 2-10 см³ крови из вены в зависимости от предполагаемого содержания фтора в центрифужную пробирку объемом 20 см³ с крышкой, добавляют 10%-ный спиртовый раствор гидроксида натрия из расчета 1:2 к пробе крови, встряхивают в течение 2 минут или обрабатывают в течение 2 минут в ультразвуковой установке УЗ-0,25 (с частотой 60-65 кГц), центрифугируют до 10 минут, отделяя раствор от осадка, в раствор добавляют ацетатно-цитратный буферный раствор и определяют содержание иона фтора потенциометрическим методом с помощью фторид-селективного электрода (ЭХ-F-01) на иономере. Содержание фтора в анализируемом объеме определяют по предварительно построенной градуировочной характеристике [МУК 4.1.773-99. Количественное определение ионов фтора в моче с использованием ионселективного электрода]. Общее время анализа составляет 30 минут.

Пример 1.

Были проведены исследования цельной крови человека из группы с экспозицией фтора в профессиональной деятельности и употребляющего воду централизованного источника водоснабжения с содержанием фтора 0,20 мг/см³.

Пробу крови берут из вены, натощак, в количестве 15 см³ в центрифужную пробирку с крышкой, проба делится на 3 равные части по 5 см³ каждая.

Первую часть (5 см³) обрабатывают 2,5 см³ 10%-го спиртового раствора гидроксида натрия, встряхивают в течение 2 минут, центрифугируют 10 минут со скоростью 1200 об/мин, декантируют раствор над осадком в стаканчик, добавляют 7,5 см³ ацетатно-цитратного буферного раствора и определяют содержание иона фтора в растворе фторид-селективным электродом ЭХ-F-01 на иономере АНИОН-140 по методике [5].

Содержание иона фтора в крови составляет 0,40±0,04 мг/дм³.

2-ю часть пробы (5 см³) двукратно замораживают - размораживают, центрифугируют 10 минут со скоростью 1200 об/мин, декантируют раствор над осадком в стаканчик, добавляют 7,5 см³ ацетатно-цитратного буферного раствора и определяют содержание иона фтора в растворе фторид-селективным электродом ЭХ-F-01 на иономере АНИОН-140 по методике [5].

Содержание иона фтора в крови составляет 0,310±0,015 мг/дм³.

В 3-ю часть пробы (5 см³) добавляют ацетатно-цитратный буфер до объема 50 см³. К цитратной крови добавляют известковое молоко, содержащее 0,5 г окиси кальция. Выпаривают на водяной бане, высушивают и озоляют. Отгоняют фтор и определяют его количество в дистилляте фторид-селективным электродом ЭХ-F-01 на иономере АНИОН-140 по методике [5].

Содержание иона фтора в крови составляет 0,20±0,04 мг/дм³.

Наибольшее содержание фтора получено в результате пробоподготовки предлагаемым способом.

Пример 2.

Были проведены исследования цельной крови человека из группы с экспозицией фтора в профессиональной деятельности и употребляющего воду централизованного источника водоснабжения с содержанием фтора 0,30 мг/см³.

Пробу крови берут из вены, натощак, в количестве 10 см³ в центрифужную пробирку с крышкой, проба делится на 2 равные части по 5 см³ каждая.

1-ю часть (5 см³) обрабатывают 2,5 см³ 10%-го спиртового раствора гидроксида натрия, встряхивают в течение 2 минут, центрифугируют 10 минут со скоростью 1200 об/мин, декантируют раствор над осадком в стаканчик, добавляют 7,5 см³ ацетатного буферного раствора и определяют содержание иона фтора в растворе фторид-селективным электродом ЭХ-F-01 на иономере АНИОН-140 по методике, описанной в МУК 4.1.773-99. Количественное определение ионов фтора в моче с использованием ионселективного электрода.

Содержание иона фтора в крови составляет 0,102±0,010 мг/дм³.

Вторую часть (5 см³) обрабатывают 2,5 см³ 10%-го спиртового раствора гидроксида натрия, обрабатывают в течение 2 минут в ультразвуковой установке УЗ-0,25 (с частотой 65 кГц), центрифугируют 10 минут со скоростью 1200 об/мин, декантируют раствор над осадком в стаканчик, добавляют 7,5 см³ ацетатного буферного раствора и определяют содержание иона фтора в растворе фторид-селективным электродом ЭХ-F-01 на иономере АНИОН-140 по известной методике.

Содержание иона фтора в крови составляет 0,098±0,010 мг/дм³.

Различие в определяемом содержании иона фтора незначительно (в пределах ошибки измерения).

Таким образом, предложенный способ количественного определения иона фтора в крови прост в применении, исключает использование химических реагентов и процесса озоления, обладает высокой точностью, наряду с сокращением времени пробоподготовки.

ЛИТЕРАТУРА

1. Николаев Н.С., Суворова С.Н., Гурович Е.И. Аналитическая химия фтора // М.: Наука, 1970. - 196 с.

2. Габович Р.Д., Минх А.А. Гигиенические проблемы фторирования питьевой воды. / М.: Медицина, 1979.

3. Габович Р.Д., Овруцкий Г.Д. Фтор в профилактике кариеса зубов / Учебное пособие. // Казань. - КГМИ. - 1962. - 243 с.

4. Патент №2176797

5. МУК 4.1.773-99. Количественное определение ионов фтора в моче с использованием ионселективного электрода.

1. Способ определения ионов фтора в крови, включающий забор пробы крови для анализа, обработку пробы и количественное определение в растворе, отличающийся тем, что обработку пробы проводят 10%-ным спиртовым раствором гидроксида натрия в соотношении 1:2 к пробе крови, проводят встряхивание в течение 2 минут, центрифугируют, отделяют полученный раствор для измерения потенциометрическим методом с помощью фторид-селективного электрода.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что встряхивание проводят с использованием ультразвука.