Способ получения ботулотоксина

Настоящее изобретение относится к медицине. Предложен способ получения ботулотоксина. Способ включает обработку культуры штамма - продуцента ботулотоксина кислотой при рН 3,0-4,5, добавление буфера к осажденному ботулотоксину и обработку ингибитором протеазы и нуклеазы. Затем экстрагированный ботулотоксин осаждают серной или соляной кислотой при рН 2,5-4,5, растворяют в буфере и очищают анионообменной хроматографией. Изобретение обеспечивает получение ботулотоксина с чистотой 98% и выше. 12 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 5 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу производства ботулотоксина и более конкретно к способу получения ботулотоксина, включающему стадии: (а) обработки культуры штамма-продуцента ботулотоксина кислотой для осаждения ботулотоксина; (б) добавление буфера к осажденному ботулотоксину с последующей обработкой ингибитором протеазы и нуклеазой для экстракции таким образом ботулотоксина; (в) обработки экстрагированного ботулотоксина кислотой, чтобы осадить ботулотоксин, и растворения осадка в буфере; и (г) очистки ботулотоксина анионообменной хроматографией.

Уровень техники

Группа штаммов Clostridium Sp., которые выделяют нейротоксины, была обнаружена в 1890-х годах и токсины, которые секретируются этими штаммами, были охарактеризованы в течение последних 70 лет (Schant, E.J. et al., Microbiol. Rev., 56:80, 1992).

Нейротоксины, полученные из штаммов Clostridium sp., то есть ботулотоксины, подразделяются на семь типов (типы А-G) в зависимости от их серологических свойств. Каждый из токсинов содержит белок токсина, имеющий размер около 150 кДа и в природе также содержит комплекс нескольких нетоксичных белков. Средний комплекс (300 кДа) состоит из белка токсина и нетоксичного негемагглютининового белка, а большой комплекс (450 кДа) и очень большой комплекс (900 кДа) состоят из среднего комплекса, связанного с гемагглютинином (Sugiyama, Н., Microbiol Rev., 44:419, 1980). Такие нетоксичные гемагглютининовые белки, как известно, защищают токсин от низкого рН и различных протеаз в кишечнике.

Токсин синтезируется в клетках в виде единого полипептида, имеющего молекулярную массу около 150 кДа, который затем расщепляется в положении 1/3 от N-конца под действием внутриклеточной протеазы или при обработке искусственным ферментом, таким как трипсин, на две части: легкая цепь (L молекулярная масса: 50 кДа) и тяжелая цепь (Н; молекулярная масса: 100 кДа). Расщепленный токсин имеет значительно более высокую токсичность по сравнению с единым полипептидом. Две части связаны друг с другом дисульфидной связью и имеют различные функции. Тяжелая цепь связывается с рецептором клетки-мишени (Park, М.K. et al., FEMS Microbiol Lett, 72:243, 1990) и взаимодействует с биомембраной при низком рН (рН 4) с образованием канала (Mantecucco, С. et al., TIBS, 18:.. 324, 1993), а легкая цепь имеет фармакологическую активность придает проницаемость клеткам с использованием детергента или мешает секреции нейротрансмиттера при введении в клетки, например, электропорацией (Poulain, В. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 4090, 1988).

Токсин ингибирует экзоцитоз ацетилхолина в холинергическом пресинапсе в нервно-мышечном соединении, что вызывает астению. Был сделан вывод о том, что применение очень небольшого количества токсина характеризуется токсичностью, что свидетельствует о наличии некоторой ферментной активности у токсина (Simpson, LL et al., Ann Rev. Pharmaeol Toxicol., 26:427, 1986).

Согласно недавнему докладу, токсин имеет металлопептидазную активность и его субстрат состоит из синаптобревина, синтаксина, синаптосомального связанного белка 25 кДа (SNAP-25) и т.п., которые являются белковыми блоками экзоцитозного комплекса. Каждый тип токсина использует один из трех вышеописанных белков в качестве субстрата, и известно, что токсины типа В, D, F и G расщепляют синаптобревин в определенном участке, токсины типа А и Е расщепляют SNAP-25 в определенном участке и тип С расщепляет синтаксин в определенном участке (Binz, Т. et al., J. Biol Chem, 265: 9153, 1994).

В частности, ботулотоксин типа А, как известно, растворим в разбавленном водном растворе при рН 4,0-6,8. Известно, что стабильный нетоксичный белок отделяется от нейротоксина при рН около 7 или выше, и в результате, токсичность постепенно утрачивается. В частности, известно, что токсичность уменьшается с повышением рН и температуры.

Ботулотоксин смертелен для человеческого организма даже в небольших количествах, и легко производится в больших количествах. Таким образом, он относится к четырем основным видам био-террористического оружия вместе с Bacillus anthracis, Yersinia pestis и вирусом оспы. Однако было установлено, что, когда ботулотоксин типа А вводится в дозе, которая не оказывает системный эффект на человеческий организм, он может парализовать отдельную мышцу в точке инъекции. На основании этой характеристики, ботулотоксин типа А может быть использован по множеству назначений, включая средства для удаления морщин, средства для лечения спастической гемиплегии и церебрального паралича и т.д. Таким образом, спрос на токсин типа А увеличился и активно ведутся исследования способов получения ботулотоксина, так, чтобы удовлетворить спрос.

Одним широко распространенным современным коммерческим продуктом является BOTOX® (очищенный нейротоксинный комплекс ботулотоксина типа А), коммерчески поставляемый Allergan, Inc., USA. Флакон 100-единиц BOTOX® состоит из около 5 нг очищенного нейротоксинного комплекса ботулотоксина типа А, 0,5 мг человеческого сывороточного альбумина и 0,9 мг хлорида натрия и разводится с использованием стерильного физиологического раствора без консерванта (инъекция 0,9% хлорида натрия). Другие коммерческие продукты включают Dysport® (комплекс ботулотоксина Clostridium типа А и гемагглютинина, который содержит лактозу и человеческий сывороточный альбумин в фармацевтической композиции, содержащей ботулотоксин, и разбавляется с использованием 0,9% хлорида натрия перед использованием), который поставляется Ipsen Ltd., UK, Myobloc™ (инъекционный раствор (рН около 5,6), содержащий ботулотоксин типа В, человеческий сывороточный альбумин, сукцинат натрия и хлорид натрия), который поставляется Solstice Neurosciences Inc. Обычные способы, используемые для производства ботулотоксинов, включают метод кислотного осаждения, метод осаждения солью и хроматографический метод.

Например, в JP №1994-192296 раскрыт способ получения кристаллического ботулотоксина типа А культивированием бактерий Clostridium botulinum с последующим осаждением кислотой, экстракцией, добавлением нуклеазы и кристаллизацией. Кроме того, в US 5696077 раскрыт способ получения кристаллического ботулотоксина типа В культивированием бактерий Clostridium botulinum с последующим осаждением кислотой, экстракцией, ионообменной хроматографией, гель-фильтрационной хроматографией и кристаллизацией.

Simpson et al. получал ботулотоксин типа А очисткой ботулинического нейротоксина хроматографией по методу «Gravity flow" с последующей ВЭЖХ, сорбцией с использованием аффинной смолы, эксклюзионной хроматографией и (анионной и катионной) ионообменной хроматографией, включающей использование двух различных ионообменных колонок (Method in Enzymology, 165: 76, 1988). Wang et al. использовал осаждение и ионообменную хроматографию для очистки ботулотоксина типа A (Dermatol Las Faci Cosm Surg, 2002: 58., 2002).

Кроме того, US 6818409 раскрывает использование ионного обмена и лактозы в колонках для очистки ботулотоксина и US 7452697 раскрывает получение ботулотоксина типа А с помощью ионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии. Корейская патентная выложенная публикация №2009-0091501 раскрывает способ очистки ботулотоксина с помощью кислотного осаждения и анионообменной хроматографии, и US 2013-0156756 раскрывает способ очистки ботулотоксина с помощью анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии.

Однако обычные способы имеют недостатки, заключающиеся в том, что использование анионообменной хроматографии отрицательно влияет на паттерны полос ботулотоксинов в геле (US 7452697) и в том, что эти обычные методы трудно коммерциализировать из-за длительного времени очистки. Кроме того, поскольку Clostridium botulinum, штамм-продуцент ботулотоксина, является анаэробной бактерией, существует проблема связанная с тем, что ферментация бактерий должна быть выполнена в анаэробной системе, и, следовательно, трудно получить ботулотоксины в больших количествах. Кроме того, имеется проблема и в том, что активный ингредиент ботулотоксина, очищенный вышеописанным способом очистки, четко не отделен и идентифицирован, и, таким образом, содержит примеси. Кроме того, проблема обычных способов получения токсинов ботулизма в том, что обязательно выполняется процесс фильтрации или диализа для получения ботулотоксина высокой чистоты, что говорит о том, что процесс очистки является сложным и трудным.

Соответственно, авторы настоящего изобретения затратили значительные усилия для решения вышеописанных проблем, имеющих место в известном уровне техники, и в результате установили, что, когда культуру штамма-продуцента ботулотоксина обрабатывают кислотой для формирования осадка ботулотоксина и образовавшийся осадок очищают с помощью анионообменной хроматографии, стадии фильтрации, диализа и осаждения этанолом могут быть опущены, и процесс получения ботулотоксина будет очень простым и с помощью этого способа получения может производиться ботулотоксин, имеющий чистоту 98% или выше,, завершив тем самым настоящее изобретение.

Краткое изложение сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является создание способа получения ботулотоксина высокой чистоты с помощью простого процесса.

Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение предлагает способ получения ботулотоксина, включающий стадии: (а) обработки культуры штамма-продуцента ботулотоксина кислотой для осаждения ботулотоксина; (б) добавления буфера к осажденному ботулотоксину с последующей обработкой ингибитором протеазы и нуклеазой экстрагируя, таким образом, ботулотоксин; (в) обработки экстрагированного ботулотоксина кислотой для осаждения ботулотоксина и растворения в буфере; и (г) очистки ботулотоксина анионообменной хроматографией.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет схематический вид процесса получения ботулотоксина в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 2 представляет результаты определения чистоты ботулотоксина после выполнения очистки основной анионообменной хроматографией.

Фиг. 3 представляет результаты определения чистоты ботулотоксина после выполнения очистки дополнительной анионообменной хроматографией.

Фиг. 4 представляет результаты измерения увеличения или уменьшения амплитуды составного потенциала действия мышцы, вызванные обработкой ботулотоксином, полученным способом настоящего изобретения и BOTOX^® (Allergan). N: без инъекции; S: физиологический раствор для инъекций; В2: ВТХ-А-1, две единицы; D2: ВТХ-А-2, две единицы; В4: ВТХ-А-1, четыре единицы; D4: ВТХ-А-2, четыре единицы; В8: ВТХ-А-1, восемь единиц; и D8: ВТХ-А-2, восемь единиц.

Фиг. 5 представляет результаты измерения скорости проводимости, вызванной обработкой ботулотоксином, полученным способом настоящего изобретения и BOTOX^® (Allergan). N: без инъекций; S: физиологический раствор для инъекций; В2: ВТХ-А-1, две единицы; D2: ВТХ-А-2, две единицы; В4: ВТХ-А-1, четыре единицы; D4: ВТХ-А-2, четыре единицы; В8: ВТХ-А-1, восемь единиц; и D8: ВТХ-А-2, восемь единиц.

Подробное описание изобретения и предпочтительных вариантов осуществления

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в описании, имеют то же значение, которое обычно понимается рядовым специалистом в данной области техники, к которой относится изобретение. Как правило, номенклатура, используемая в описании, и экспериментальные методы являются хорошо известными и обычно используемыми в данной области техники.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу производства ботулотоксина, включающему стадии: (а) обработки культуры штамма-продуцента ботулотоксина кислотой для осаждения ботулотоксина; (б) добавления буфера к осажденному ботулотоксину с последующей обработкой ингибитором протеазы и нуклеазой, экстрагируя таким образом ботулотоксин; (в) обработки экстрагированного ботулотоксина кислотой, чтобы осадить ботулотоксин, и растворения в буфере; и (г) очистки ботулотоксина анионообменной хроматографией (фиг. 1).

Конечный ботулотоксин, полученный способом настоящего изобретения, может храниться различными способами, в том числе хранением в замороженном и лиофилизированном состоянии.

Способ настоящего изобретения может дополнительно включать после стадии (г), следующие стадии: (д) обработку полученной анионообменной хроматографией фракции, содержащей ботулотоксин, сульфатом аммония для формирования осадка и растворения в буфере; и (е) очистки ботулотоксина анионообменной хроматографией.

В настоящем изобретении штамм-продуцент ботулотоксина предпочтительно является Clostridium botulinum, но не ограничивается им, и специалистам в данной области техники очевидно, что любой штамм, способный продуцировать ботулотоксин, может быть использован в настоящем изобретении.

В соответствии с использованием в описании термин "ботулотоксин" включает не только нейротоксин, продуцируемый штаммом Clostridium botulinum, но также модифицированный, рекомбинантный, гибридный и химерный ботулотоксин. Рекомбинантный ботулотоксин может иметь легкую цепь и/или тяжелую цепь, продуцированную видом, отличным от Clostridium в рекомбинантной форме. Кроме того, термин "ботулотоксин", используемый в описании, означает включение серотипов ботулотоксина А, В, С, D, Е, F и G, комплексы ботулотоксина (т.е. комплексы 300, 600 и 900 кДа), а также чистый ботулотоксин (т.е. молекулу нейротоксина 150 кДа), которые все пригодны для осуществления настоящего изобретения.

В соответствии с использованием в описании термин "полученный ботулотоксин" означает чистый ботулотоксин или комплекс ботулотоксина, который отделен или по существу отделен от других белков или примесей, которые могут сопутствовать ботулотоксину, когда ботулотоксин выделяют из культуры или в процессе ферментации. Таким образом, полученный ботулотоксин имеет чистоту, по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 98%. В частности, полученный в настоящем изобретении ботулотоксин, может быть белком ботулотоксина типа А, имеющим чистоту по меньшей мере 98%).

Культивирование штамма Clostridium botulinum для получения ботулотоксина может быть выполнено с использованием обычного способа, известного в данной области техники, и для культивирования может быть использована обычная среда.

В качестве неограничивающего примера культуральная среда для штамма Clostridium botulinum может включать гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу и т.п., и культивирование выполняется при температуре 25-40°C в течение 90-180 часов, и предпочтительно 100-150 часов.

Стадия осаждения кислотой (а) может быть осуществлена добавлением кислоты, предпочтительно серной кислоты или соляной кислоты, в культуру штамма, так чтобы культура достигала рН 3,0-4,5, предпочтительно 3,3-4,0 и наиболее предпочтительно 3,4-3,6 при измерении рН-метром.

Стадия осаждения кислотой (а) основана на принципе, в соответствии с которым добавление кислоты к культуре, содержащей много видов белков снижает рН среды, убивая ботулинические бактерии, оставшиеся после культивирования, так что белки достигают изоэлектрической точки для осаждения. Она включает кристаллизацию в широком смысле, и метод осаждения представляет собой метод грубого отделения искомого материала в смешанном состоянии, в отличие от кристаллизации, направленной на очистку искомого материала до высокой чистоты. В методе осаждения примеси, имеющие структуру, аналогичную искомому материалу, также выпадают в осадок. При этом рН доводят до около 3,0-4,5. Степень извлечения ботулотоксина возрастает с уменьшением рН. Если рН 3,0 или ниже, то будет разрушаться сам ботулотоксин, и если рН составляет 4,5 или выше, степень извлечения ботулотоксина будет уменьшаться. По этим причинам рН предпочтительно находится в пределах вышеуказанного диапазона.

В частности, наиболее предпочтительное значение рН составляет 3,4-3,6, так как степень извлечения ботулотоксина наиболее высокая в этом диапазоне рН. Когда рН культуры ботулинического штамма достигает подходящего диапазона после добавления кислоты, кислоту добавляют к культуре до прекращения изменения рН и затем культуру выдерживают при комнатной температуре в течение 15-30 часов с последующим удалением маточника.

Стадия (б) экстракции ботулотоксина включает стадию растворения токсина, полученного на стадии (а) в фосфатном буфере, предпочтительно натрий-фосфатном буфере, и удаления осадка. При этом рН фосфатного буфера, предпочтительно составляет около 4,0-7,0. Конечное значение рН можно довести до 4,5-6,5, предпочтительно 5,0-6,0 добавлением основания, предпочтительно гидроксида натрия и экстракция токсина может быть выполнена в вышеуказанном диапазоне рН.

Кроме того, нуклеаза, которую используют на стадии (б), может быть ДНКазой и РНКазой и ингибитор протеазы, который используют на стадии (б), предпочтительно является бензамидин-HCl (гидрохлорид бензамидина), но не ограничивается им, и любой материал, способный ингибировать активность протеазы, известный в данной области техники, может быть использован в настоящем изобретении. Путем обработки нуклеазой на стадии экстракции ботулотоксина (б) примеси, которые содержаться в осадке, сформированном кислотой на стадии (а), например ДНК и РНК, могут быть разложены. Если стадию обработки ферментом осуществляют в течение 1,5 ч или менее, разрушение ДНК и РНК может быть недостаточным. По этой причине стадию обработки ферментом проводят в течение 1,5-7 часов, предпочтительно 3-6 часов и ДНКазу и РНКазу предпочтительно добавляют с концентрацией 0,05-1,0 г/л, предпочтительно 0,1-0,5 г/л.

Поскольку экстракт, полученный ферментативной обработкой, содержит ботулотоксин и белок, обладающий полярностью, подобной полярности ботулотоксина, должна быть выполнена стадия осаждения белка соляной кислотой. В частности, стадию (с) осаждения соляной кислотой предпочтительно осуществляют путем центрифугирования экстракта обработанного ферментом, доведением рН супернатанта до 2,5-4,5, предпочтительно 3,0-4,0 добавлением соляной кислоты (HCl), и последующим осаждением белка из супернатанта соляной кислотой в холодильнике при 4°C. В частности, значение рН на стадии осаждения соляной кислотой наиболее предпочтительно доводят до 3,3-3,8 с целью поддержания высокого уровня активности и степени извлечения токсина. Если стадию осаждения соляной кислотой осуществляют в вышеописанном диапазоне рН, титр ботулотоксина будет достигать 90% или более, и коагуляция белка значительно снизится. Затем осадок с помощью соляной кислоты может быть растворен в буфере и может быть выполнена последующая стадия.

Стадию (в), которая является наиболее важной стадией, выполняют с использованием хроматографии с анионообменной смолой после завершения стадии осаждения соляной кислотой с целью удаления большинства основных примесей, отличных от ботулотоксина типа А. Анионообменная смола, которую используют на стадии (D), может быть смолой, замещенной группами диэтиламиноэтила (DEAE) или четвертичного аммония(Q), но не ограничивается ими. Например, анионообменная смола может быть DEAE-Sephadex, как описано в US 5,696,077, WO 96/05222 и US 5,846,929. Предпочтительно она является любой анионообменной смолой, имеющей сильноосновную группу четвертичного аммония или слабоосновную группу диэтиламиноэтила (DEAE).

Примеры сильноосновной анионообменной группы, которая может быть использована в настоящем изобретении, могут включать Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20) или TSKgel SuperQ-5PW, но не ограничиваются ими и могут быть использованы анионообменные смолы, известные в данной области техники.

Колоночный буфер, используемый на стадии (в) может быть натрий-фосфатным буфером или цитратным буфером. Предпочтительно используют натрий-фосфатный буфер. Концентрация колоночного буфера контролируется в диапазоне 30-70 мМ, предпочтительно около 40-60 мМ. рН колонки контролируется в диапазоне около 3,5-7,5 и скорость потока подвижной фазы контролируется в диапазоне 0,5-5,0 мл/мин, предпочтительно 1,0-3,0 мл/мин. Кроме того, проводимость буфера доводят до 3-30 мСм/см, и образец впрыскивают после завершения уравновешивания колонки. Токсин элюируют в потоке а большинство крупных примесей адсорбируется. В частности, на стадии (г) очистки анионообменной хроматографией ботулотоксин типа А не адсорбируется на анионообменной смоле, и большинство крупных примесей удаляются путем адсорбции.

В настоящем изобретении анионообменную хроматографию на стадии (в) предпочтительно проводят при рН 3,5-7,5, предпочтительно 4,5-7,0 и проводимости 3-30 мСм/см, предпочтительно 5-20 мСм/см.

Для того чтобы полностью удалить остающиеся примеси после анионообменной хроматографии стадии (г) способ получения ботулотоксина в соответствии с настоящим изобретением может, если необходимо, дополнительно включать стадии: (в) обработки содержащей ботулотоксин фракции, полученной анионообменной хроматографией, ботуло сульфатом аммония ((NH₄)₂SO₄) для образования осадка и растворения в буфере; и (е) очистки ботулотоксина дополнительной анионообменной хроматографией.

На стадии (е) содержащую ботулотоксин фракцию, полученную анионообменной хроматографией, обрабатывают сульфатом аммония для формирования осадка и образовавшийся осадок растворяют в буфере. Стадия осаждения сульфатом аммония соответствует процессу высаливания, в котором соль (сульфат аммония и т.д.), которая легко растворяется в воде, добавляют к смеси белков для повышения ионной силы, чтобы тем самым сформировать осадок белка. Если искомый белок выпадает в осадок при насыщении выше 30% (вес/объем) по сульфату аммония, искомый белок может быть осажден путем осаждения белков, отличных от искомого белка, при концентрации насыщения аммония сульфатом 30% (вес/объем) или ниже, а затем добавления сульфата аммония до концентрации насыщения 30% (вес/объем) и может быть выделен путем центрифугирования. Операцию высаливания часто используют в качестве первоначального способа. Концентрация раствора сульфата аммония, который используется на стадии (е), может составлять 10-50% (вес/объем), предпочтительно 20-40%) (вес/объем).

Затем на стадии (д) ботулотоксин может быть очищен с помощью анионообменной хроматографии. Очистка ботулотоксина высокой чистоты в соответствии с настоящим изобретением, в основном осуществляемая с помощью анионообменной хроматографии (основная анионообменная хроматография) стадии (г), и анионообменной хроматографии (дополнительная анионообменная хроматография) на стадии (д), выполняется для удаления оставшихся примесей и может быть проведена таким же образом, что и анионообменная хроматография стадии (г).

Полученная фракция, содержащая белок ботулизма типа А, полученная вышеописанным способом очистки, может быть стерилизована и отфильтрована для получения жидкого препарата. Приготовленный жидкий препарат может быть заморожен и храниться до использования.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к ботулотоксину, полученному способом настоящего изобретения. Чистоту ботулотоксина, очищенного ВЭЖХ, анализируют и в результате можно видеть, что чистота ботулотоксина после основной анионообменной хроматографии составляет 98,38% (фиг. 2), которая выше, чем чистота (около 95%) BOTOX®, коммерчески поставляемого Allergan Inc., что подтверждает, что большинство примесей были удалены на стадии основной анионообменной хроматографии. Кроме того, было показано, что чистота ботулотоксина после дополнительной анионообменной хроматографии составляет 98,99%) (фиг. 3).

Кроме того, способ получения ботулотоксина в соответствии с настоящим изобретением имеет преимущество в том, что стадии фильтрации, диализа и осаждения этанолом могут быть опущены, и таким образом процесс изготовления ботулотоксина является легким и простым. В частности, способ по настоящему изобретению имеет преимущество в том, что стадии фильтрации и осаждения этанолом в способе изготовления BOTOX^® Allergan Inc. (US 2012-0156756; метод, отличный от APF) могут быть опущены, и, таким образом число стадий очистки может быть снижено (от пяти стадий до трех стадий), чтобы сократить период производства жидкого препарата ботулотоксина (от 4 недель до 2 недель).

В другом примере осуществления настоящего изобретения был выполнен эксперимент по сравнению безопасности BOTOX^® (Allergan, Inc.), чтобы подтвердить безопасность белка ботулотоксина типа A (DWP450), полученного способом по настоящему изобретению. В результате было показано, что ботулотоксин (DWP450), полученный способом по настоящему изобретению, дает значение NOAEL 60 ЕД/кг у самок, который в два раза безопаснее, чем BOTOX^® (Allergan, Inc.), дающий значение NOAEL 30 ЕД/кг. В два раза более высокая безопасность ботулотоксина, полученного способом настоящего изобретения, вызвана тем, что ботулотоксин по настоящему изобретению имеет высокую чистоту и, таким образом имеет повышенную способность действовать в локальной области так, что циркуляция ботулотоксина в кровотоке, которая может привести к побочным эффектам, уменьшается.

Ботулотоксин, полученный способом по настоящему изобретению, используется в качестве активного ингредиента в фармацевтической композиции. Ботулотоксин может быть использован для лечения нервно-мышечных нарушений, характеризующихся сверхактивными скелетными мышцами. Кроме того, он может быть использован для различных состояний, включающих головную боль, мигрень, тензионную головную боль, синусовую головную боль, цервикогенную головную боль, расстройства потоотделения, подмышечную потливость, ладонной гипергидроз, подошвенный гипергидроз, синдром Фрея, гиперкинетические морщины кожи, лицевые морщины, межбровные морщины, «гусиные лапки», морщин марионетки, носогубные складки, заболевания кожи, ахалазию, косоглазие, хронические анальные трещины, блефароспазм, костно-мышечные боли, фибромиалгии, панкреатит, тахикардию, увеличения предстательной железы, простатит, задержку мочи, недержание мочи, гиперактивный мочевой пузырь, гемифациальный спазм, тремор, миоклонус, желудочно-кишечные расстройства, сахарный диабет, слюнотечение, сфинктерно-детрузорную диссинергию, спастичность после инсульта, заживление ран, ювенильный церебральный паралич, спазм гладких мышц, рестеноз, фокусную дистонию, эпилепсию, сервикальную дистонию, заболевания щитовидной железы, гиперкальциемию, обсессивно-компульсивные расстройства, боли при артрите, синдром Рейно, стрии, перитонеальные спайки, спазм сосудов, насморк, мышечные контрактуры, поврежденные мышцы, ларингеальную дистонию, судороги и графоспаза и туннельный синдром.

В соответствии с использованием в описании термин "фармацевтическая композиция" означает композицию, включающую ботулотоксин в качестве активного ингредиента, и рецептура может включать, по меньшей мере, один дополнительный ингредиент (наполнитель) в фармацевтической композиции в дополнение к ботулиническому нейротоксину активного ингредиента. Дополнительное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из альбумина, человеческого сывороточного альбумина, человеческого рекомбинантного сывороточного альбумина, желатина, сахарозы, трегалозы, гидроксиэтилкрахмала, коллагена, лактозы, сахарозы, хлорида натрия, полисахарида, каприлата, поливинилпирролидона и натрия, но этим не ограничено. Также способ получения фармацевтической композиции, включающей ботулотоксин в качестве активного ингредиента, включает стадию объединения ботулотоксина с дополнительным ингредиентом (наполнителем) и стадия объединения может быть выбрана из группы процессов, состоящих из сублимационной сушки, лиофилизации и вакуумной сушки.

Таким образом, фармацевтическая композиция представляет собой композицию, которая пригодна для диагностических, терапевтических или косметических назначений (например, внутримышечной или подкожной инъекции, внедрение вещества замедленного действия или имплантата) субъекту, такому как больной человек. Фармацевтическая композиция может находиться: в лиофилизированном или высушенном с помощью вакуума состоянии, в виде раствора, полученного после разведения лиофилизированной или высушенной в вакууме фармацевтической композиции физиологическим раствором или водой, или; в виде раствора, который не требует разбавления. Активный ингредиент может быть одним из серотипов ботулотоксина А, В, Cl, D, Е, F или G или ботулотоксина, все виды которого могут быть получены с помощью бактерий Clostridial. Как указано выше, фармацевтическая композиция может быть жидкой или твердой, например, высушенной в вакууме. Примеры способов введения ботулотоксина в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции раскрыты в US 2003-0118598, опубликованной 5 ноября 2002 года.

В другом примере осуществления настоящего изобретения для подтверждения эффективности белка ботулотоксина типа A (DWP450), полученного способом по настоящему изобретению, измеряют амплитуду составного потенциала действия мышцы (СМАР) и скорость проводимости (tC). В эксперименте, два разных белка ботулооксина типа А, ВТХ-А-1 (BOTOX^®, Allergan Inc., California, USA) и BTX-A-2 (DWP450), приготовленные в примере 2 настоящего изобретения, используют в четырех разделенных группах. В группе 1, 0,08 мл хлорида натрия (NaCl) вводят в одну ТА мышцу и другую мышцу не обрабатывают. В группе 2, 0,02 мл ВТХ-А-1 (две единицы) вводят в одну ТА мышцу и 0,02 мл ВТХ-А-2 (две единицы) вводят в другую ТА мышцу. В группе 3, 0,04 мл ВТХ-А-1 (четыре единицы) вводят в одну ТА мышцу и 0,04 мл ВТХ-А-2 (четыре единицы) вводят в другую ТА мышцу. В группе 4 0,08 мл ВТХ-А-1 (восемь единиц) вводят в одну ТА мышцу и 0,08 мл ВТХ-А-2 (восемь единиц) вводят в другую мышцу.

Одна единица ботулотоксина определяется как LD 50 при внутрибрюшинной инъекции в самку мыши Swiss Webster весом около 18-20 грамм каждая. Одна единица ботулотоксина является количеством ботулотоксина, который убивает 50% группы самок мышей Swiss Webster.

Измеряют амплитуду составного потенциала действия мышцы (СМАР), вызванного введением ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 и в результате, с медленной скоростью раздражения 2 Гц, группы с введенными ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 показывают паралитическое действие на ТА мышцы (dY) черз 3 дня, 1 неделю, 2 недели, 3 недели и 4 недели после введения (фиг. 4А), и с высокой скоростью раздражения 20 Гц, группы с введенными ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 показывают паралитическое действие на ТА мышцы (dY) через 3 дня, 1 неделю, 2 недели, 3 недели и 4 недели после введения (фиг. 4В). Отсутствует существенное различие (р<0,05) между ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 с медленной скоростью раздражения 2 Гц и быстрой скоростью раздражения 20 Гц, и паралитическое действие на ТА мышцы (dY) в группах с введенными ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 представлена в зависимости от дозы вводимого ботулотоксина.

Измерены скорость проводимости (tC), вызванной введением ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 и в результате было показано, что группы с введенными ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 не вызывают задержку в скорости проводимости с низкой скоростью раздражения 2 Гц и высокой скоростью раздражения 20 Гц (рис. 5).

В частности, ботулотоксин, полученный способом по настоящему изобретению, дает эффект, подобный коммерчески поставляемому BOTOX^® (Allergan, Inc.), и в два раза более безопасен, так как он имеет более высокую чистоту, что ведет к уменьшению циркуляции ботулотоксина в кровотоке. Таким образом, он может быть использован для различных целей, включая лечение нервно-мышечных нарушений, удаление морщин и лечение спастической гемиплегии и церебрального паралича.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Специалисту в данной области техники очевидно, что эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем притязаний настоящего изобретения.

Пример 1: Культура штамма Clostridium botulinum

1-1: Состав среды используемой для культивирования

среда, имеющая состав, включающий 2% гидролизата казеина, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы и 0,5% тиогликолята используют для посевной культуры и основной культуры штамма Clostridium botulinum для получения ботулотоксина.

1-2: Посевная культура штамма Clostridium botulinum

20 мкл Clostridium botulinum (получен от Объединение корейских центров по контролю и профилактике заболеваний NO.: 4-029-CBB-IS-001), вносят в пробирку, содержащую 10 мл стерильной среды, имеющей состав, описанный в примере 1-1 и проводят первичный посев культуры (стационарная культура) при 35°C в течение 22-30 часов в анаэробных условиях. При подтверждении роста штамма первичного посева культуры 8 мл первичного посева культуры инокулируют в 1 л культуральный сосуд, содержащий 800 мл стерильной среды, имеющей тот же состав среды, и проводят вторичный посев культуры (стационарная культура) при 35°C в течение 8-15 часов в анаэробных условиях.

1-3: Основная культура штамма Clostridium botulinum

Для получения ботулотоксина культивированием штамма Clostridium botulinum, выполняют культивирование основной культуры штамма. В частности, готовят 9,3 л среды, имеющей состав, описанный в примере 1-1, и помещают в 10 л инкубатор с последующей стерилизацией среды. Азот подают для создания анаэробных условий и выращивание штамма проводят при температуре 35°C и скорости перемешивания 50 об/мин.

Штамм в 1 л культуральном сосуде, полученный после вторичного посева культуры согласно примеру 1-2, инокулируют в 10 л инкубатор через трубку для инокуляции, подключенный к инокуляционному вводу 10 л инкубатора. Штамм Clostridium botulinum в 10 л инкубаторе культивируют в условиях 35°C и 50 об/мин и заданные условия культивирования поддерживают, проверяют и регистрируют. Когда штамм культивируют в течение 100 часов или более, основное культивирование завершается.

Пример 2: Получение ботулотоксина

2-1: Стадия осаждения серной кислотой

Стадия осаждения серной кислоты представляет собой процесс разделения белков, в котором серную кислоту добавляют к культуре, содержащей много видов белков, для снижения рН культуры с одновременной инактивацией ботулинических бактерий, оставшихся после культивирования, так чтобы белки достигали изоэлектрической точки для осаждения. Основное культивирование проводят, как описано в примере 1-3, и после завершения основного культивирования к культуре добавляют 5N серную кислоту с помощью автоматического насоса так, чтобы достичь рН 3,4-3,6 при измерении рН-метром в 10 л инкубаторе, и затем культуру переносят в 20 л контейнер (AS ONE, Cat. No AS5.372,06) по коллекторной трубке инкубатора, и 20 л контейнер, содержащий осадок с серной кислотой, переносят в бокс биологической безопасности (BSC). Затем осаждение серной кислотой проводят в BSC.

2-2: Ферментативная обработка и экстракция токсина

После удаления супернатанта с осадка с серной кислотой к осадку добавляют 700 мл 1 М натрий-фосфатного буфера (рН 5,3). Затем рН раствор доводят до 5,0-6,0 добавлением 5N гидроксида натрия (NaOH). Для удаления ДНК и РНК из осадка добавляют 60 мл 0,4М HCl⋅бензамидина, 1 г ДНКазы и 1 г РНКазы и проводят реакцию с раствором в течение около 5 часов, чтобы экстрагировать ботулотоксин.

2-3: Осаждение соляной кислотой и растворение токсина

Культуру, включающую экстракт токсина, центрифугируют при 4°C при 12000×g в течение 15 минут, чтобы разделить его на гранулы и супернатант и отделенный супернатнант переносят в свежий 10 л сосуд (AS ONE, Cat. No AS5.372,04) и затем рН доводят до 3,4-3,6 добавлением 1N соляной кислоты (HCl) и подвергают осаждению соляной кислотой в холодильнике при 4°C. Осадок, полученный под действием соляной кислоты, центрифугируют при 4°C при 12000×g в течение 15 минут, и удаляют суперантнант, после чего добавляют 50 мл натрий-фосфатного буфера (рН 6,5) к гранулам токсина для растворения токсина.

2-4: Основная анионообменная хроматография

После завершения процесса осаждения, чтобы удалить большинство основных примесей, отличных от ботулотоксина типа А, выполняют хроматографию с помощью ионообменной смолы. В частности, анионообменную смолу (Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience, P/N 17228) загружают в колонку, после чего образец, который осаждают в примере 2-3, вводят в колонку и токсин элюируют буфером, 50 мМ фосфат натрия. На стадии основной очистки белок ботулотоксина типа А не адсорбируется на анионообменной смоле, а большинство основных примесей удаляются путем адсорбции. Для получения ботулотоксина высокой чистоты, образец сохраняют при рН 4,5-7,0 и проводимости 5-20 мСм/см.

2-5: Осаждение сульфатом аммония

Собирают фракции, содержащие белок ботулотоксина типа А, очищенный анионообменной хроматографией, и добавляют сульфат аммония до концентрации 20-40% (вес/объем), чтобы снова осадить белок ботулотоксина типа А. Осажденный белок ботулотоксина снова растворяют в 50 мМ фосфате натрия (рН 6,5).

2-6: Дополнительная анионообменная хроматография

После завершения процесса осаждения сульфатом аммония для удаления незначительного количества примесей, отличных от ботулотоксина типа А, хроматографию выполняют еще раз с использованием ионообменной смолы. В частности, анионообменную смолу (Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience, P/N 17228) загружают в колонку, после чего осадок, полученный действием сульфата аммония, растворенный в примере 2-5, вводят в колонку и токсин элюируют буфером, 50 мМ фосфат натрия. При этом белок ботулотоксина типа А не адсорбируется и незначительное количество примесей удаляют адсорбцией.

Очистка ботулотоксина высокой чистоты в основном достигается на стадии основной анионообменной хроматографии стадии и стадию очистки дополнительной анионообменной хроматографии выполняют для удаления оставшихся примесей. Для получения ботулотоксина высокой чистоты осадок, полученный действием сульфата аммония, выдерживают при рН 4,5-7,0 и проводимости 5-20 мСм/см.

2-7: Получение жидкого препарата

Собирают фракции, содержащие белок ботулотоксина типа А, очищенного с помощью анионообменной хроматографии в примере 2-6, стерилизуют и фильтруют через фильтр 0,2 мкм для получения жидкого препарата. Полученный жидкий препарат хранят при температуре ниже -70°C. Полученный белок ботулотоксина обозначается "DWP450".

Пример 3: Анализ чистоты очищенного ботулотоксина

ВЭЖХ (е2695, Waters) выполняют в виде SEC (эксклюзионная хроматография). В качестве подвижной фазы используют буфер, 100 мМ фосфата натрия, (рН 6,5) и TSKgel G4000SWXL (Tosoh Bioscience, 08542 P/N) колонка соединена с защитной колонкой (Tosoh Bioscience, P/N 08543) для P/N 08542, и 20 мкг белка ботулотоксина типа А загружают в колонку и пропускают со скоростью 1 мл/мин в течение 30 минут. В результате было показано, что чистота ботулотоксина после основной анионообменной хроматографии составляет 98,38% (фиг. 2) и чистота ботулотоксина после дополнительной анионообменной хроматографии составляет 98,99% (фиг. 3).

Пример 4: Оценка безопасности очищенного ботулотоксина

Для подтверждения безопасности белка ботулотоксина типа A (DWP450), очищенного в примере 2, проводят эксперимент по сравнению с безопасностью BOTOX^® (Allergan, Inc.).

SD (Спрег-Доули) самцы* белых крыс разделяют на следующие пять групп, каждая из которых состоит из 10 самцов и 10 самок: группа с введением 30 ЕД/кг испытуемого материала (DWP450); группа с введением 60 ЕД/кг испытуемого материала; группа с введением 30 ЕД/кг материала сравнения (BOTOX^®, поставляемый Allergan, Inc.); группа с введением 60 ЕД/кг материала сравнения; и контрольная группа (физиологический раствор). Каждый из исследуемого материала, материала сравнения и физиологического раствора вводят внутримышечно в общей сложности пять раз в неделю в течение 5 недель.

В группы, в которых вводили 60 ЕД/кг испытуемого материала и 60 ЕД/кг материала сравнения (BOTOX^®), дополнительно добавляют пять самок и пять самцов и испытание сравнения токсичности проводят в течение восстановительного периода 12 недель с целью оценки обратимости токсичности (Таблица 1).

В результате было показано, что ботулотоксин (DWP450), полученный способом по настоящему изобретению дает значение NOAEL 60 ЕД/кг у самок, который в два раза безопаснее, чем BOTOX^® (Allergan, Inc.), дающий значение NOAEL 30 ЕД/кг. Вдвое более высокая безопасность ботулотоксина по настоящему изобретению, как полагают вызвана тем, что ботулотоксин по настоящему изобретению имеет высокую чистоту, и, таким образом, имеет повышенную способность действовать в локальном участке, так что снижается циркуляция ботулотоксина в кровотоке, которое может привести к побочным эффектам.

Пример 5: Исследование эффективности очищенного ботулотоксина

Для оценки эффективности белка ботулотоксина типа A (DWP450), очищенного в примере 2, измеряют амплитуду составного потенциала действия мышцы (СМАР) и скорости проводимости (tC).

В частности, 24 SD (Спрег-Доули) белых крысы были случайным образом разделены на четыре группы, каждая из которых состоит из шести крыс. Используют два разных белка ботулотоксина типа А, ВТХ-А-1 (BOTOX^®, Allergan Inc., California, USA) и BTX-A-2 (DWP450) очищенных в примере 2. Две рецептуры имеют практически одинаковые характеристики, как показано в таблице 2 ниже, и ботулотоксин, разбавленный 0,9% физиологическим раствором, используют во всех процедурах. Крыс анестезируют внутрибрюшинной инъекцией 10 мг/кг гидрохлорида кетамина и затем ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 вводят в переднюю большеберцовую (ТА) мышцу крыс.

В группе 1, 0,08 мл хлорида натрия (NaCl) вводят в одну ТА мышцу и другую ТА мышцу не обрабатывают. В группе 2, 0,02 мл ВТХ-А-1 (две единицы) вводят в одну ТА мышцу и 0,02 мл ВТХ-А-2 (две единицы) вводят в другую ТА мышцу. В группе 3, 0,04 мл ВТХ-А-1 (четыре единицы) вводят в одну ТА мышцу и 0,04 мл ВТХ-А-2 (четыре единицы) вводят в другую ТА мышцу. В группе 4 0,08 мл ВТХ-А-1 (восемь единиц) вводят в одну ТА мышцу и 0,08 мл ВТХ-А-2 (восемь единиц) вводят в другую мышцу.

Измеряют уровень задержки в CMAPs и скорости проводимости с помощью CyberAmp380 и Digidata1320 (Axon Instruments. Inc, USA). Используемые электроды прикрепляют к коже с помощью зажима типа крокодил. Отрицательный электрод прикрепляют к подколенной мышце, а положительный электрод прикрепляют к позадилонному пространству и большому вертелу бедренной кости. Регистрирующий электрод прикрепляют к мышце живота передней мышцы болынеберцовой кости и регистрирующий электрод сравнения прикрепляют к левому заднему ахилловому сухожилию и подошве стопы.

Электрическую стимуляцию 1-5 мА применяют с медленной скоростью раздражения 2 Гц и высокой скоростью раздражения 20 Гц. Паралитическое действие на ТА мышцы определяют измерением размаха колебаний CMAPs (dY) и задержку скорости проводимости определяют измерением временного интервала между раздражением и отрицательным пиком.

Анализ с помощью электрической стимуляции проводят перед введением ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 и через 3 дня, 1 неделю, 2 недели, 3 недели и 4 недели после введения и изменения CMAPs и скорости проводимости, вызванные введением ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 анализируют с использованием ANOVA с помощью SAS (версии 9.2, SAS Institute Inc., US).

В результате было установлено, что при медленной скорости раздражения 2 Гц, группы, в которых вводят ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2, показывают паралитическое действие на ТА мышцы (dY) в течение 3 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель и 4 недель после введения (фиг. 4А) и при высокой скорости раздражения 20 Гц группы, в которых вводят ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2, показывают паралитическое действие на ТА мышцы (dY) в течение 3 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель и 4 недель после введения (фиг. 4В).

Отсутствует существенное различие (р<0,05) между ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 при медленной скорости раздражения 2Hz и быстрой скорости раздражения 20 Гц, и паралитическое действие на ТА мышцы (dY) в группах, в которых вводят ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 зависит от дозы вводимого ботулотоксина.

Измеряют скорость проводимости (tC), вызванную введением ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 и в результате видно, что в группах, в которых вводят ВТХ-А-1 и ВТХ-А-2 не индуцируется задержка скорости проводимости при низкой скорости раздражения 2 Гц и высокой скоростью раздражения 20 Гц.

В частности, было установлено, что ботулотоксин, полученный способом по настоящему изобретению, дает эффект, подобный эффекту коммерчески поставляемого BOTOX^® (Allergan, Inc.).

Промышленная применимость

Применение способа по настоящему изобретению для изготовления ботулотоксина позволяет производить ботулотоксин высокой чистоты с помощью простого процесса, из чего следует, что способ изобретения является очень экономичным и эффективным. Ботулотоксин, полученный способом по настоящему изобретению, имеет высокую чистоту по сравнению с ботулотоксинами, получаемыми традиционными способами, и таким образом имеет повышенную способность действовать в локальной области. Таким образом, циркуляция ботулотоксина в кровотоке, которая может привести к побочным эффектам, снижается, что в свою очередь повышает безопасность. Соответственно, ботулотоксин по настоящему изобретению может быть использован в различных целях, включая лечение нервно-мышечных нарушений, удаление морщин и лечение спастической гемиплегии и церебрального паралича.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на существенные признаки, специалистам в данной области техники очевидно, что это описание только предпочтительного осуществления и не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения. Таким образом, объем притязаний настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

1. Способ получения ботулотоксина, включающий стадии:

(а) обработки культуры штамма-продуцента ботулотоксина кислотой до достижения рН культуры значения 3,0-4,5, чтобы осадить ботулотоксин;

(б) добавления буфера к осажденному ботулотоксину с последующей обработкой ингибитором протеазы и нуклеазой, тем самым экстрагируя ботулотоксин;

(в) обработки экстрагированного ботулотоксина серной кислотой или соляной кислотой до достижения рН экстрагированного ботулотоксина значения 2,5-4,5, чтобы осадить ботулотоксин, и растворения осадка в буфере; и

(г) очистки ботулотоксина анионообменной хроматографией.

2. Способ по п. 1, в котором штаммом-продуцентом ботулотоксина является Clostridium botulinum.

3. Способ по п. 1, в котором очищенный ботулотоксин является белком ботулотоксина типа А, имеющим чистоту по меньшей мере 98%.

4. Способ по п. 1, в котором стадию осаждения кислотой (а) осуществляют добавлением серной кислоты или соляной кислоты в культуру штамма.

5. Способ по п. 1, в котором ингибитор протеазы на стадии (б) является бензамидин⋅HCl.

6. Способ по п. 1, в котором нуклеаза на стадии (б) является ДНКазой и РНКазой.

7. Способ по п. 1, в котором экстракцию ботулотоксина на стадии (б) осуществляют при рН 4,5-6,5.

8. Способ по п. 1, в котором буфер на стадии (в) является натрий-фосфатным буфером.

9. Способ по п. 1, в котором анионообменную хроматографию на стадии (г) проводят при рН 3,5-7,5 и проводимости 3-30 мСм/см.

10. Способ по пп. 1-9, дополнительно включающий после стадии (г) следующие стадии:

(д) обработки полученной анионообменной хроматографией фракции, содержащей ботулотоксин, сульфатом аммония для формирования осадка и растворения осадка в буфере; и

(е) очистки ботулотоксина анионообменной хроматографией.

11. Способ по п. 10, в котором сульфат аммония на стадии (д) добавляют до концентрации 10-50% (вес/объем).

12. Способ по п. 10, в котором буфер на стадии (д) является натрий-фосфатным буфером.

13. Способ по п. 10, в котором анионообменную хроматографию на стадии (д) осуществляют при рН 3,5-7,5 и проводимости 3-30 мСм/см.