Получение иммуноглобулинов с пониженным содержанием тромбогенных агентов и иммуноглобулиновая композиция

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к получению иммуноглобулиновой композиции со сниженным уровнем тромбогенных агентов. Способы включают фракционирование плазмы крови по Кону и/или по Кистлеру-Ничманну с получением содержащего иммуноглобулин раствора. Затем осуществляют контактирование иммуноглобулинового раствора с катионообменником, уравновешенным при pH от 3,8 до 5,3, для связывания фактора XI, фактора XIa и калликреина, и с анионообменником, уравновешенным при pH от 7 до 8,2, для связывания прекалликреин. Затем собирают несвязанные фракции, содержащие иммуноглобулины. Полученная иммуноглобулиновая композиция содержит 4-10% общего белка и пригодна для лечения пациента с иммунодефицитом, воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием или острой инфекцией. Изобретение позволяет максимально удалить тромбогенные агенты, такие как фактор XI, фактор XIa, калликреин и прекалликреин, из содержащего иммуноглобулин раствора путем применения катионообменника в очень узком диапазоне значений pH с одновременным поддержанием неизменного уровня иммуноглобулина в растворе. 3 н. и 46 з.п. ф-лы, 16 табл., 14 пр.

 

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится к препарату иммуноглобулина, содержащему низкий уровень тромбогенных агентов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Препараты иммуноглобулина для внутривенного введения (IVIG) часто используют в лечении различных состояний иммунологической недостаточности, а также аутоиммунных расстройств, включая болезнь Вагнера, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, болезнь Кавасаки и синдром Гийена-Барре. Некоторые тромбоэмболические нежелательные явления связывают с использованием препаратов IVIG (Brannagan et al. Complications of intravenous immune globulin treatment in neurologic disease. Neurology 1996 г.; 47:674–677; Rosenbaum JT. Myocardial infarction as a complication of immunoglobulin therapy. Arthritis Rheum 1997 г.; 40:1732–1733; и Dalakas MC. High-dose intravenous immunoglobulin and serum viscosity: risk of precipitating thromboembolic events. Neurology 1994 г.; 44:223–226).

Эти явления, которые включают в себя глубокий венозный тромбоз и инфаркт миокарда, в основном наблюдают у пациентов, получающих высокие дозы IVIG, и связывают их с повышением уровня вязкости крови (Dalakas MC. 1994 г.; и Reinhart WH, Berchtold PE. Effect of high-dose intravenous immunoglobulin therapy on blood rheology. Lancet 1992 г.; 339:662–664).

Ранее компоненты контактной системы свертывания крови были определены в препаратах иммуноглобулина человека (Alving et al. Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulin preparations with coagulant and vasoactive properties. J Lab Clin Med 1980 г.; 96:334–346). В коммерческих препаратах сывороточного иммуноглобулина было отмечено содержание различных уровней активатора прекалликреина (PKA) и активности калликреина. Эти виды активности представляли интерес ввиду своей способности производить биоактивные пептиды, которые могут повышать проницаемость сосудов. Ранее полагали, что присутствие вазоактивных фрагментов этих белков связано с редкими нежелательными явлениями во время приема препаратов иммуноглобулина. Также эти авторы обнаружили фактор XI (FXI) в препаратах иммуноглобулина (Alving et al. 1980 г.).

В статье Alving et al. (1980 г.) проанализированы двадцать пять наборов коммерческого сывороточного иммуноглобулина (ISG) на наличие PKA и калликреина, компонентов контактной системы активации, которые могли содействовать этим реакциям путем формирования кининов в реципиентах. Активность калликреина находилась в пределах от необнаруживаемых уровней до >60% общей потенциальной активности калликреина в нормальной плазме. Уровень PKA находился в пределах от 5% до 3950% от активности в контрольных белковых фракциях плазмы, что вызывало гипотензию. Кроме пяти наборов, все остальные наборы повысили проницаемость сосудов морской свинки. Пять наборов, не вызвавших повышения проницаемости сосудов, также продемонстрировали самый низкий уровень PKA и активности калликреина. Во время проведения гель-хроматографии препарата иммуноглобулина с целью отделения ферментных контаминантов от иммуноглобулина G только части, содержащие PKA и/или калликреин, повышали проницаемость сосудов. Несколько наборов IVIG сокращали неактивированное парциальное тромбопластиновое время нормальной плазмы с 236 секунд до 38–55 секунд. Во время гель-хроматографии активность коагулянта элюировали в положении, соответствующем молекулярной массе 150 000, ингибированной антителами к фактору XI человека. Эти данные свидетельствуют о том, что фактор XIa отвечает за наблюдаемую активность прокоагулянта, и что PKA и/или калликреин являются потенциальными посредниками вазоактивных реакций на препарат IVIG.

Было также обнаружено, что иммуноглобулины загрязняют препараты фактора XI. Фактор XI и иммуноглобулины совместно очищают на последовательных ионообменных колонках, что требует присоединения специальной колонки для аффинной хроматографии с конкавалином A для устранения следов загрязнения иммуноглобулином из фактора XI (Bonno BN, Griffin JH. Human blood coagulation factor XI: purification, properties, and mechanism of activation by activated factor XII. J Biol Chem 1977 г.; 252:6432–6437).

Wolberg et al. (Coagulation Factor XI Is a Contaminant in Intravenous Immunoglobulin Preparations. Am J Hem 2000 г.; 65:30–34) продемонстрировали наличие прокоагулянта, известного под названием активированный фактор XI, в препаратах иммуноглобулина (IgG). В настоящем исследовании двадцать девять образцов иммуноглобулина для внутривенного введения (IVIG) от восьмерых различных производителей были проанализированы на наличие активности прокоагулянта. Двадцать шесть из этих образцов сократили время свертывания дефицитной по фактору XI плазмы. Из них в четырнадцати образцах была отмечена активность фактора XI на уровне более 0,001 ЕД/мл выше показателей нормальной объединенной плазмы. Остальные образцы имели менее 0,001 ЕД/мл активности нормальной плазмы. Активность прокоагулянта в этих образцах могла быть ингибирована поликлональным анти-фактор XI антителом, в предположении, что активность прокоагулянта принадлежала фактору XI. После хранения при температуре 4°C на протяжении 4 недель активность прокоагулянта повысилась в двух образцах, что может быть результатом самоактивации фактора XIa. Кроме того, активность в некоторых образцах IVIG могла непосредственно активировать фактор IX, что означает присутствие активированного фактора XI в этих образцах.

За последние три столетия было разработано множество способов очистки иммуноглобулинов для внутривенного введения, чтобы удовлетворить возросший спрос на IVIG. Большинство производственных процессов включает в себя различные технологии поглощения иммуноглобулина на специальной, обычно ионообменной смоле (Jerry Siegel. The Product: All Intravenous Immunoglobulins Are Not Equivalent. The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy. Том 25, выпуск 11, часть 2, ноябрь 2005 г.). Поглощение иммуноглобулина на смоле требует очень много средств и времени, поскольку используется большое количество смолы. В среднем один литр ионообменной смолы поглощает приблизительно 30–50 г иммуноглобулина. Таким образом, использование обычной большой колонки емкостью приблизительно 100 л смолы позволяет получить 3–5 кг иммуноглобулина. Поглощение агентов, присутствующих в растворе иммуноглобулина, с помощью небольшой колонки является экономически выгодным.

В патенте США 5252217 раскрывается приготовление концентрата человеческого фактора XI путем нанесения криопреципитатной надосадочной жидкости на этапе фильтрования-адсорбции и одного этапа хроматографии на катионообменной смоле. Полученный концентрат идеально подходит для терапевтических целей во время заместительной терапии в случае дефицита фактора XI. Катионообменную смолу уравновешивают буферным раствором с pH от 5,5 до 6,5, предпочтительно pH 6.

В патенте США 4272521 раскрывается способ удаления активатора прекалликреина (PKA) и активируемого калликреином предшественника PKA (фактора XII) из раствора сывороточного иммуноглобулина (ISG) с помощью ионообменного вещества при pH ≥ 7,2.

В патенте США 5164487 раскрывается способ производства препарата переносимого иммуноглобулина-G для внутривенного введения, свободного от скоплений, вазоактивных веществ и протеолитических ферментов. Исходный материал обрабатывают с помощью 0,4–1,5% от объема октановой кислоты с последующей хроматографией, особенно на ионо- или катионообменной установке или на гидрофобной матрице.

В заявке на патент США 2010/0311952 раскрывается способ очистки иммуноглобулина, включающий этапы, на которых наносят водный буферный раствор, содержащий иммуноглобулин в мономерной и агрегированной форме, на катионообменный материал при условии, что иммуноглобулин не связывается с катионообменным материалом, а также восстанавливают иммуноглобулин в мономерной форме из раствора после контакта с катионообменным материалом.

В заявке на международный патент PCT №WO 2010/072381 раскрывается способ очистки иммуноглобулина, включающий этапы, на которых наносят водный буферный раствор, содержащий иммуноглобулин в мономерной, агрегированной и фрагментированной форме, на материал для анионообменной хроматографии при условии, что иммуноглобулин в мономерной форме не связывается с анионообменным материалом, а также восстанавливают иммуноглобулин в мономерной форме в элюате материала для анионообменной хроматографии, где pH водного буферного раствора принимает значения в диапазоне от 8,0 до 8,5. В одном варианте осуществления изобретения материалом для анионообменной хроматографии является мембранный материал для анионообменной хроматографии.

Jose et al. (2010 г.) описали, что пастеризация в процессе производства иммуноглобулина для внутривенного введения инактивирует некоторые тромбогенные агенты, например коагулирующие фрагменты. Однако в этом способе не предусмотрена избирательная инактивация, что может изменить активность раствора иммуноглобулина.

Таким образом, необходимо разработать способ избирательного удаления тромбогенного агента из раствора иммуноглобулина без оказания какого-либо влияния на иммуноглобулин.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу для специфического удаления PKA, калликреина и/или FXI(a) из препарата иммуноглобулина. В одном варианте осуществления настоящего изобретения препарат иммуноглобулина получают из крови или фракции крови.

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ удаления тромбогенного агента из содержащего иммуноглобулин раствора, включающий следующие этапы, на которых получают содержащий иммуноглобулин раствор с pH в диапазоне от выше 3,8 до значений, равных или ниже 5,3; получают подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы; приводят в контакт раствор с подложкой; а также собирают несвязанную фракцию I.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,0.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,7.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора составляет приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,3.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения несвязанная фракция I далее приходит в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы с таким же значением pH, а несвязанная фракция II собирается.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения подложка представлена в форме хроматографического материала или хроматографической мембраны.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения материал подложки или мембраны является гидрофильным и выбран из группы, состоящей из агарозы, сефарозы, акриловых гранул, целлюлозы, стекла с контролируемым размером пор, силикагеля и декстранов; или гидрофобным и выбран из группы, состоящей из смол или органических синтетических полимеров, выбранных из группы, состоящей из материалов или мембран на основании полиакриламидов или полистиролов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения отрицательно заряженные группы иммобилизованы на подложке посредством линкера между подложкой и отрицательно заряженными группами.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения линкер выбран из группы, состоящей из белков, аминокислот и пептидов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложка химически модифицирована.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложкой служит слабый или сильный катионообменник.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные отрицательно заряженные группы выбирают из группы, состоящей из производных сульфоновой кислоты и других серосодержащих кислот, фосфорной и других фосфорсодержащих кислот, нитратов и других азотсодержащих кислот и их комбинаций.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные отрицательно заряженные группы представляют собой серосодержащие кислоты, например сульфопропил.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные отрицательно заряженные группы представляют собой карбоновые кислоты, например карбоксиметил.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этапы, на которых регулируют несвязанную фракцию I или несвязанную фракцию II до значений pH в диапазоне от 7 до 8,2; приводят несвязанную фракцию I или несвязанную фракцию II в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные положительно заряженные группы со значениями pH в диапазоне от 7 до 8,2; и собирают несвязанную фракцию.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этапы, на которых регулируют и приводят в контакт раствор и подложку, содержащую иммобилизованные положительно заряженные группы со значениями в диапазоне от 7 до 8,2, до приведения раствора в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы; и собирают несвязанную фракцию.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные положительно заряженные группы выбирают из группы, состоящей из аммония, алкиламмония, диалкиламмония, триалкиламмония, четвертичного аммония, алкильных групп, H⁺, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, http://en.wikipedia.org/wiki/Amine, функциональной аминогруппы и их комбинации.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизованные положительно заряженные группы представляют собой четвертичный аммоний. Четвертичным аммонием может быть диэтиламиноэтил (DEAE).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ включает в себя этапы, на которых приводят в контакт раствор и подложку, содержащую иммобилизованные положительно заряженные группы со значениями pH в диапазоне от 7 до 8,2; собирают несвязанную фракцию; регулируют pH несвязанной фракции до значений в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3; приводят в контакт несвязанную фракцию и подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы со значениями pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3; и собирают несвязанную фракцию I.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,0.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,7.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения регулирование и приведение в контакт несвязанной фракции и подложки, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения приведение в контакт раствора и подложки, содержащей положительно заряженные группы, проводят при линейной скорости в диапазоне от 1 до 2 мл/мин/см², при этом температура содержащего иммуноглобулин раствора находится в диапазоне от 8 до 37°C.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этапы, на которых приводят в контакт раствор и хроматографический материал, содержащий трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер, до приведения в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы; и собирают несвязанную фракцию III.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этапы, на которых приводят в контакт несвязанную фракцию, несвязанную фракцию I или несвязанную фракцию II с хроматографическим материалом, содержащим трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер; и собирают несвязанную фракцию III.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложка, содержащая иммобилизованные положительно заряженные группы, представляет собой слабый или сильный анионообменник.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения иммуноглобулиновой композиции, который включает в себя этапы, на которых содержащий иммуноглобулин раствор подвергают по меньшей мере двум этапам отрицательной хроматографии: анионообменной хроматографии при значениях pH в диапазоне от 7 до 8,2 с последующей катионообменной хроматографией при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят дважды. В одном варианте осуществления изобретения две катионообменные хроматографии проводят последовательно.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,0.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,7.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,3.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

Еще в одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает в себя этап проведения отрицательной хроматографии с помощью хроматографического материала, содержащего трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменник представлен в форме мембраны.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катионообменник содержит функциональную сульфоновую группу.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуноглобулиновой композиции, полученной из крови или фракций крови, содержащих 4%–10% белка, которую можно получить в соответствии со способом настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также предоставляет контейнер, содержащий иммуноглобулиновую композицию в соответствии с настоящим изобретением.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения субъекта с иммунодефицитом, воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием или острой инфекцией, согласно которому требуется введение субъекту эффективного количества иммуноглобулиновой композиции в соответствии с настоящим изобретением.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу удаления тромбогенных агентов из препарата иммуноглобулина. В одном варианте осуществления настоящего изобретения препарат иммуноглобулина получен из крови или фракций крови. В другом варианте осуществления настоящего изобретения кровь или фракции крови получены от более чем одного донора или от множества доноров.

Настоящее изобретение продемонстрировало, что FXI и/или его активную форму, FXIa, можно эффективно удалить из содержащего иммуноглобулин раствора путем обработки раствора иммуноглобулина катионообменной хроматографией при уровне pH не менее 6. Оптимальные результаты были получены в диапазоне значений pH от выше 3,8 до равных или ниже 5,3. Этот диапазон значений pH продемонстрировал способность эффективного удаления FXIa с одновременным по существу сохранением уровней иммуноглобулина (IgG).

Эти результаты были неожиданными, поскольку иммуноглобулин (с изоэлектрической точкой 6–8, патенты США №№ 6592905 и 4296027) имеет положительный чистый электрический заряд при значениях pH ниже 6, поэтому ожидалось его связывание также и с катионообменником с последующим получением низкого уровня иммуноглобулина в растворе (патент США № 6592905).

Поскольку отсутствует механизм связывания, оказывается, что при значениях pH ниже 6 FXIa и иммуноглобулин конкурируют за отрицательно заряженные группы на катионообменнике, и связывание FXIa является более предпочтительным.

Также неожиданно было обнаружено, что в соответствии с настоящим изобретением можно достичь более высокой эффективности удаления FXIa из содержащего иммуноглобулин раствора путем обработки раствора иммуноглобулина на катионообменнике при значениях pH в диапазоне от 4,0 до 4,3. Эти результаты также неожиданны ввиду того, что FXIa имеет положительный чистый заряд в широком диапазоне значений pH, включая значения до приблизительно 9 (его изоэлектрическая точка - 8,9-9,1; каталог реагентов для исследований компании Haematologic Technologies Inc.). Неожиданно было обнаружено, что эти результаты были получены с помощью либо слабого катионообменника, либо сильного катионообменника.

Согласно настоящему изобретению было также обнаружено, что калликреин (с изоэлектрической точкой 8,6-9,5) может быть эффективно удален из содержащего иммуноглобулин раствора путем катионообменной хроматографии при уровне значений pH 4,1-4,3 с одновременным по существу сохранением уровней IgG. Эти результаты неожиданны в свете того, что иммуноглобулин имеет положительный чистый электрический заряд в этом диапазоне значений pH, поэтому от него также ожидается связывание с катионообменником, что приводит к низкому уровню иммуноглобулина в растворе.

Результаты демонстрируют максимальное удаление тромбогенного агента из содержащего иммуноглобулин раствора путем применения к раствору катионообменника в очень узком диапазоне значений pH с одновременным поддержанием неизменного уровня иммуноглобулина в растворе.

Эти результаты проложили путь разработкам способа удаления тромбогенного агента из содержащего иммуноглобулин раствора с одновременным сохранением большей части иммуноглобулина в растворе и/или без изменения распределения иммуноглобулинов на подклассы (например, IgG1 - приблизительно 65%, IgG2 -приблизительно 30%, IgG3 - приблизительно 6% и IgG4 - приблизительно 1%). Термин «сохранение большей части иммуноглобулина в растворе» означает, что способ предусматривает восстановление 75% и более иммуноглобулина от исходного содержания иммуноглобулина до приведения раствора в контакт с подложкой в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ предусматривает восстановление 80%, 85%, 90%, 95% и 99% иммуноглобулина от исходного содержания иммуноглобулина до приведения раствора в контакт с подложкой в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение предоставляет способ удаления тромбогенного агента из содержащего иммуноглобулин раствора, включающий в себя этапы, на которых получают раствор иммуноглобулина с pH в диапазоне значений от выше 3,8 до равных или ниже 5,3; получают подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы; приводят в контакт раствор и подложку; а также собирают несвязанную фракцию. В одном варианте осуществления настоящего изобретения pH раствора принимает значения в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,0. В другом варианте осуществления настоящего изобретения диапазон значений соответствует от или выше 4,0 до равных или ниже 5,0. В другом варианте осуществления диапазон охватывает значения от выше 3,8 до равных или ниже 4,7, например, pH 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7. В дополнительном варианте осуществления диапазон охватывает значения от выше 3,8 до равных или ниже 4,3. В дополнительном варианте осуществления диапазон охватывает значения от выше 4,0 до равных или ниже 5,3. В другом дополнительном варианте осуществления диапазон является очень узким, от значений, равных или выше 4,0, до значений, равных или ниже 4,3 или от приблизительно 4,1 до приблизительно 4,3 и позволяет специально удалять FXIa и калликреин.

Термин «тромбогенный агент» относится к агенту, обладающему способностью стимулировать образование фибриновых сгустков. В настоящем документе термин «тромбогенный агент» взаимозаменяем терминами «гемостатический агент», «тромбозный агент» и «прокоагулирующий агент». Например, тромбогенным агентом может являться калликреин, FXI, FXIa, фактор XII, тромбин и PKA. Термин «тромбогенный агент» включает в себя тромбогенные индуцированные агенты и «агенты, вызывающие тромбоз», в частности агенты, активирующие тромбогенные факторы в коагулирующей системе.

В настоящем документе термин «подложка» включает в себя носитель или какую-либо матрицу, используемую для присоединения, иммобилизации, перемещения или стабилизации отрицательно заряженных групп. Подложки хорошо известны в области применения, как описано в работе Hermanson et al. Immobilized Affinity Ligand Techniques (Academic Press Inc. 1992 г.). Подложка для выполнения способа настоящего изобретения может быть изготовлена из любого материала, способного связывать молекулу, содержащую отрицательно заряженные группы. Твердые подложки включают в себя, без ограничений, матрицы, колонки, покровные стекла, хроматографические материалы, фильтры, предметные стекла, пробирки, ампулы, бутылки, подложки для ELISA, стеклянные или пластиковые поверхности, хроматографические мембраны, листы, частицы, гранулы, включая магнитные микроносители, гели, порошки, волокна и т.п.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложка представлена в форме хроматографического материала. В другом варианте осуществления настоящего изобретения подложка представлена в форме хроматографической мембраны. Подложка может содержать гидрофильный материал, например агарозу, сефарозу, акриловые гранулы, целлюлозу, стекло с контролируемым размером пор, силикагель, декстраны; гидрофобный материал, например смолы; или органический искусственный/синтетический полимер, например материалы на основе полиакриламидов или полистиролов. Типичные материалы/полимеры доступны в продаже под торговыми названиями Sephacryl® (Pharmacia, Швеция), Ultragel® (Biosepara, Франция), TSK-Gel Toyopearl® (Toso Corp., Япония), ГЭМА (Alltech Ass. (Диэрфилд, штат Иллинойс, США), Eupergit® (Rohm Pharma, г. Дармштадт, Германия). Доступны также материалы на основе азлактонов (3M, г. Сент-Пол, штат Миннесота, США). В особенности предпочтительными являются Agarose® или Sepharose®. Эти материалы доступны в продаже, например, у компании Sigma, г. Сент-Луис. Хроматографический материал может быть суспендирован в соответствующей среде, и полученную суспензию можно использовать, например, в хроматографической колонке. Однако способ настоящего изобретения может также выполняться по партиям, например, с помощью пробирки или реактора периодического действия. В одном варианте осуществления настоящего изобретения подложка представляет собой полимерную матрицу FRACTOGEL® EMD, TOYOPEARL® или TSK-GEL®.

Хроматография на колонке известна в области применения (Practical Protein Chromatography, под редакцией Kenney и Fowell, том 11, Humana Press, 1992 г.) и по существу этот термин относится к технологии, согласно которой раствор (подвижная фаза) может опускаться вниз по колонке, а индивидуальный компонент адсорбируют в неподвижной фазе, например, с помощью хроматографического материала. Термин «отрицательно заряженные группы» относится к молекуле, содержащей химические группы, несущие отрицательный заряд, например, производные сульфоновой кислоты или другие серосодержащие кислоты (например, SO₄^2- и SO₃^-), муравьиная кислота и другие карбоновые кислоты (например, COO^-), а также фосфорная и другие фосфорсодержащие кислоты (например, PO₄^3-), нитраты и другие азотсодержащие кислоты (например, NO²) и их комбинации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения отрицательно заряженные группы представляют собой серосодержащие кислоты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения отрицательно заряженные группы представляют собой сульфопропил (SP). В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения заряженные группы представляют собой карбоновые кислоты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения отрицательно заряженные группы представляют собой карбоксиметил (CM).

Подложка может иметь гидрофобную или гидрофильную поверхность, связывающую часть отрицательно заряженных групп с помощью гидрофобного/гидрофильного ковалентного взаимодействия. Гидрофобной/гидрофильной поверхностью подложки может также служить полимер, такой как пластик или какой-либо другой полимер, в котором гидрофобные/гидрофильные группы связаны с полиэтиленом, полистиролом или поливинилом. Альтернативно отрицательно заряженные группы могут иметь ковалентную связь с подложкой посредством линкера, служащего мостом между подложкой и отрицательно заряженными группами. Используемый выше термин «линкер» относится к спейсерной группе или цепи, молекулярная масса которой составляет от десятков до миллионов дальтонов, используемой в качестве промежуточного соединителя между подложкой и отрицательно заряженными группами. Например, линкер может представлять собой белок, пептид и/или аминокислоту. Если подложка непосредственно связывает молекулу, содержащую отрицательно заряженные группы (без линкера), может использоваться реакционноспособная группа внутри молекулы, содержащей отрицательно заряженные группы, например, гидроксильную группу, эфир, аминогруппу или карбоксильную группу для присоединения к реакционноспособной группе, присутствующей на подложке, с целью создания ковалентной связи. Подложка также может иметь заряженную поверхность или может быть модифицирована для переноса заряженной группы, взаимодействующей с отрицательно заряженными группами. Подложка также может содержать другие реакционно-способные группы, которые могут быть химически активированы с целью присоединения отрицательно заряженных групп, например матриц, активируемых бромидом цианогена, эпоксиактивируемых матриц и т.п. Также подложка может содержать такой неорганический носитель, как оксид кремния, например силикагель, с которым могут ковалентно связываться заряженные группы. В другом варианте осуществления заряженные группы присоединены к поверхности мембраны или встроены в мембрану. Возможно присоединение заряженных групп к мембране вышеописанным способом.

Катионообменник, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может быть представлен в форме мембраны или в форме хроматографического материала согласно приведенному выше описанию.

Обычно подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы, называют катионообменником. Катионообменники получили свое название за способность привлекать или связывать катионы или положительно заряженные частицы. Обычно система подложки имеет отрицательный заряд и молекула присоединяется при значении pH, которое соотносится с положительным чистым зарядом молекулы. Примерами доступных в продаже катионообменников в форме мембраны служат мембрана Mustang® S и капсула Mustang® S, содержащие функциональную сульфоновую группу.

В случае использования мембраны в качестве подложки (например мембраны Mustang® S, капсулы Mustang® S), возможно приведение раствора иммуноглобулина в контакт с мембраной при скорости потока текучей среды в диапазоне от 2 до 4,3 объема мембраны (MV)/мин. Термин «скорость потока текучей среды» обычно относится к потоку раствора сквозь подложку.

Термин «изоэлектрическая точка» относится к значению pH, при котором молекула не несет чистого заряда. Ниже значения изоэлектрической точки молекула несет чистый положительный заряд, а выше этого значения - чистый отрицательный заряд.

Подложка, содержащая отрицательно заряженные группы, может быть слабым (например, карбоксиметиловая (CM) колонка) или сильным катионообменником (например мембрана Mustang® S). Под слабым катионообменником обычно подразумевают обменник, образованный из слабой кислоты, постепенно теряющей свой заряд со снижением pH, в то время как под сильным катионообменником обычно подразумевают обменник, образованный из сильной кислоты, способной удерживать свой заряд в широком диапазоне pH.

Термин «приведение в контакт» относится к любому виду комбинированных действий, посредством которых раствор или фракцию приводят в достаточно близкий контакт с подложкой таким образом, что между заряженными группами и каким-либо партнером по связыванию, например, тромбогенным агентом, присутствующим в растворе/фракции, происходит связывающее взаимодействие. Возможно проведение инкубации раствора/фракции с подложкой на протяжении достаточного периода времени, который позволяет связывание между заряженными группами и тромбогенным агентом. Во время взаимодействия с подложкой температура раствора/фракции может находиться в диапазоне от 7°C до 37°C.

Благодаря настоящему изобретению было обнаружено, что проведение этапа второй катионообменной хроматографии приводит к повышенному удалению FXIa из содержащего иммуноглобулин раствора по сравнению с одним этапом катионообменной хроматографии. Этот второй этап катионообменной хроматографии проводился с по существу сохранением уровней иммуноглобулина. Таким образом, раствор может взаимодействовать с подложкой несколько раз. Альтернативно, если подложка представляет собой фильтр, возможно сочетание нескольких фильтров в одном функциональном блоке. В одном варианте осуществления настоящего изобретения этап первичного фильтрования приводит к получению несвязанной фракции I, которую приводят в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, в таком же диапазоне pH, как указано выше, и собирают вторую несвязанную фракцию II.

Возможно уравновешивание подложки до приведения в контакт раствора/фракции с буфером, например, путем мойки подложки с помощью буфера содержащего иммуноглобулин раствора.

Термин «уравновешивать» обычно относится к возможности достижения колонкой или подложкой специального состояния буфера, например, специального уровня pH и/или ионной силы.

Термин «несвязанная фракция» обычно относится к фильтрату, полученному или собранному после приведения в контакт содержащего иммуноглобулин раствора и подложки, содержащей заряженные группы, или фильтрат, полученный или собранный после приведения в контакт содержащего иммуноглобулин раствора/фракции и подложку для хроматографии.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения заряженные группы имеют отрицательный заряд. В другом варианте осуществления настоящего изобретения полученный фильтрат называют «несвязанная фракция I». В другом варианте осуществления настоящего изобретения «несвязанную фракцию I» подвергают взаимодействию с подложкой, содержащей отрицательно заряженные группы, и фильтрат называют «несвязанная фракция II».

Возможно приготовление колонки для хроматографии путем наполнения колонки сухим хроматографическим или заранее набухшим материалом. Сухой хроматографический материал можно предварительно подготавливать путем смешивания его в 2 объемах 0,5 N HCl (для получения подложки, содержащей отрицательно заряженные группы) или в 0,5 N NaOH (для получения подложки, содержащей положительно заряженные группы). Затем необходимо оставить материал приблизительно на 30 мин для осаждения. Надосадочную жидкость можно сцедить и промыть материал с помощью H₂O до значений pH 4 или 8 соответственно. Затем можно суспендировать материал в двух объемах 0,5 N NaOH (для подложки, содержащей отрицательно заряженные группы) или в 0,5 N HCl (для подложки, содержащей положительно заряженные группы), а надосадочную жидкость сцедить, например, через 30 мин. Этап второго суспендирования можно повторить, затем вымыть колонку с помощью H₂O до нейтрализации фильтрата.

Набухший ранее материал (и сухой материал, обработанный согласно приведенному выше описанию) можно подвергать предварительной обработке путем смешивания материала в течение, например, 5 мин, с буфером, используемым для введения содержащего иммуноглобулин раствора в объеме 6 мл буфера/грамм набухшего ранее материала (или 30 мл буфера/грамм сухого материала). Затем можно отрегулировать pH до значений, соответствующих настоящему изобретению, и оставить материал для осаждения, например, приблизительно на 30 мин, затем надосадочную жидкость сцеживают. Далее суспензию повторно диспергируют в буфере для уравновешивания (согласно вышеуказанной пропорции). Колонку наполняют, а затем оставляют материал для осаждения.

Альтернативно возможно применение доступных в продаже предварительно наполненных готовых для использования колонок без предварительной обработки.

После этого колонку (подготовленную с помощью сухого материала, набухшего ранее материала или предварительно наполненную готовую для использования колонку) наполняют и уравновешивают до желаемых условий pH (например, путем использования буфера для уравновешивания).

После уравновешивания колонки раствор иммуноглобулина с желаемым значением pH используют для наполнения и колонку промывают пятью объемами слоя буфера для уравновешивания с целью смывания всего несвязанного материала. Колонку можно очистить для повторного использования.

В данной области широко используются подготовка и предварительная подготовка хроматографического материала, наполнение колонки, уравновешивание колонки, наполнение содержащим иммуноглобулин раствором, сбор несвязанного материала и очистка колонки для последующего использования, см., например, публикацию Protein liquid chromatography, под редакцией Michael Kastner, Elsevier science B.V. 2000 г., стр. 45–49.

До хроматографии содержащий иммуноглобулин раствор может быть подвержен этапу фильтрования с целью уменьшения агрегатов в растворе. Фильтрование может проводиться с использованием, например, 1,2 мкм глубинного фильтра или 0,2 мкм фильтра. В одном варианте осуществления настоящего изобретения до проведения анионообменной хроматографии раствор подвергают фильтрованию на 0,2 мкм положительно заряженном глубинном фильтре. Преимущественно используется положительно заряженный глубинный фильтр для удаления отрицательно заряженных материалов, например, фосфолипидов, липидов и т.п. Анионообменную хроматографию можно проводить, используя 7,5 л смолы, например диэтиламиноэтиловой (DEAE) смолы, в колонке диаметром 35 см и с высотой слоя в 15 см. Наполненную колонку можно уравновешивать с помощью по меньшей мере 48 объемов колонки дистиллированной водой (PuW) или водой для инъекций (WFI) при скорости потока текучей среды 100–120 л/час, например при скорости потока текучей среды в 110 л/час. После уравновешивания можно добавить в колонку 18 объемов колонки содержащего иммуноглобулин раствора. Добавление содержащего иммуноглобулин раствора можно проводить при скорости потока текучей среды 50–70 л/час, например при скорости потока текучей среды 60 л/час. Раствор может находиться при температуре 2–10°C, например при 8–10°C. Возможно проведение хроматографии при комнатной температуре (22±2°C).

Катионообменную хроматографию можно проводить с помощью катионообменной фильтрующей мембраны при объеме мембраны в 1560 мл. Можно использовать различные комбинации размеров мембраны с целью получения окончательного объема мембраны в 1560 мл, например, две фильтрующие мембраны объемом 780 мл можно последовательно соединить для образования общего объема мембраны в 1560 мл.

Условия катионообменника можно предварительно задать с помощью по меньшей мере 38 объемов мембраны 1 N NaOH с последующим добавлением по меньшей мере 64 объемов мембраны 1 N NaCl при скорости потока текучей среды 1,6–2,3 л/мин. Термин «предварительно задавать условия» по существу относится к мойке подложки или мембраны до использования с целью удаления нежелательных веществ, которые могут присутствовать на поверхности подложки или мембраны. После этого фильтрующую мембрану можно уравновешивать с помощью по меньшей мере 64 объемов мембраны 20 мМ ацетата натрия (приведенного к желаемому pH) при скорости потока текучей среды в 1,6–2,3 л/мин до достижения желаемого значения pH. После уравновешивания сквозь фильтрующую мембрану можно профильтровать по меньшей мере 50–140 объемов мембраны содержащего иммуноглобулин раствора. Хроматографию можно проводить при комнатной температуре (22±2°C) при скорости потока текучей среды 1,6–2,3 л/мин. Температура раствора для наполнения может составлять 6–10°C.

Концентрация белка в содержащем иммуноглобулин растворе может принимать значения в диапазоне от 40 до 75 мг/мл во время добавления катионо- или анионообменников, например, концентрация белка может составлять 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 мг/мл.

В случае хроматографии на колонке возможно получение несвязанной фракции после мойки наполненной колонки тем же буфером, который используется для уравновешивания, и/или буфером, используемым для наполнения (часто называемого «буфером для связывания») колонки содержащим иммуноглобулин раствором.

В соответствии с настоящим изобретением было также обнаружено, что аффинная хроматография бензамидин-сефарозы (аффинность которой связывает такие серин-протеазы, как FXIa) не подходит для удаления FXIa из содержащего иммуноглобулин раствора. Однако неожиданно было обнаружено, что FXIa можно эффективно удалять из раствора иммуноглобулина, подвергая его гепарин-аффинной хроматографии при низких уровнях pH (например при pH 5,3).

Оказалось, что в случае отсутствия связывания посредством этого механизма при низких уровнях pH гепарин-аффинная хроматография действует в качестве катионообменника (с такими кислотообразующими группами, как COOH и H₂SO₄); таким образом ее можно преимущественно использовать для эффективного удаления FXIa из содержащего иммуноглобулин раствора в соответствии с настоящим изобретением.

По существу «аффинная хроматография» обычно основывается на высокоспецифическом биологическом взаимодействии, например, между антигеном и антителом, ферментом и субстратом или рецептором и лигандом.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения эффективным считают удаление более чем 75% FXIa, например 80%, 85%, 90%, 95% и 99%, из содержащего иммуноглобулин раствора или фракции по сравнению с начальным содержанием FXIa (до приведения в контакт раствор или фракцию с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы в соответствии с настоящим изобретением).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения эффективным считают удаление калликреина более чем на 75%, например, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% и 99% из иммуноглобулин-содержащего раствора или фракции по сравнению с начальным содержанием калликреина (до приведения в контакт раствора или фракции с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы в соответствии с настоящим изобретением).

PKA имеет нулевой чистый электрический заряд при значениях pH в диапазоне 7-8,2 (изоэлектрическая точка PKA составляет приблизительно 8; http://www.expasy.org), поэтому от него не ожидают связывания положительно заряженных групп. Несмотря на это, в соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что обработка раствора иммуноглобулина со значением pH в диапазоне 7-8,2 на анионообменнике привела к эффективному удалению PKA. Также результаты показали, что использование диапазона уровней pH 7-8,2 в анионообменной хроматографии также привело к высокому уровню восстановления IgG в несвязанной фракции. Уровень pH 7-8,2 - это уровень, при котором IgG имеет нулевой или отрицательный чистый заряд, поэтому ожидаются некоторые его потери из-за связывания с анионообменником. Неожиданно было обнаружено, что обработка содержащего иммуноглобулин раствора на анионообменнике при значениях pH в диапазоне 7-8,2 привела к максимальному удалению PKA практически без какой-либо потери IgG.

Соответственно, чтобы удалить PKA и в то же время получить высокие результаты восстановления иммуноглобулина, способ, соответствующий настоящему изобретению, может дополнительно включать в себя этап приведения в контакт содержащего иммуноглобулин раствора/фракции с подложкой, содержащей иммобилизованные положительно заряженные группы, при значениях pH в диапазоне от 7 до 8,2, и сбор несвязанной фракции. Таким образом, содержащий иммуноглобулин раствор подвергают обработке на анионообменнике при значениях pH в диапазоне от 7 до 8,2.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает в себя сначала этап использования анионообменника, а потом этап использования катионообменника в соответствии с настоящим изобретением. В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ включает в себя сначала этап использования катионообменника, а потом этап использования анионообменника.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения значение pH содержащего иммуноглобулин раствора регулируют с помощью кислотного или щелочного раствора до значения pH в диапазоне от 7 до 8,2 и приводят раствор в контакт с положительно заряженными группами, предварительно уравновешенными буфером или PuW с таким же значением pH, как значение pH раствора и собранной несвязанной фракции. Значение pH собранной фракции можно регулировать с помощью кислотного раствора до значения pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3, и фракцию можно приводить в контакт с отрицательно заряженными группами, предварительно уравновешенными буфером с таким же значением pH, как значение pH фракции и собранной несвязанной фракции.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения значение pH содержащего иммуноглобулин раствора регулируют с помощью кислотного или щелочного раствора до значения pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3 и приводят в контакт с отрицательно заряженными группами, предварительно уравновешенными буфером с таким же значением pH, как значение pH раствора и собранной несвязанной фракции. Значение pH собранной фракции можно регулировать с помощью щелочного раствора до значения pH в диапазоне от 7 до 8,2 и приводить в контакт с положительно заряженными группами, предварительно уравновешенными буфером или PuW с таким же значением pH, как значение pH фракции и собранной несвязанной фракции.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения этапы использования анионо- и катионообменника следуют непосредственно одна за другой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения существуют дополнительные этапы между этапами использования анионо- и катионообменника настоящего изобретения.

Для повышения степени очистки можно проводить этапы использования анионо- или катионообменника несколько раз.

В настоящем документе термин «положительно заряженные группы» относится к молекуле, содержащей химические группы, несущие положительный заряд, например, аммонию, алкиламмонию, диалкиламмонию, триалкиламмонию, четвертичному аммонию [например, диэтиламиноэтил (DEAE), диметиламиноэтил или триметиламиноэтил], алкиловым группам, H⁺, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, http://en.wikipedia.org/wiki/Amine, функциональным аминогруппам (например, NR₂H⁺) и их комбинациям.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения положительно заряженные группы представляют собой четвертичный аммоний (Q). В другом варианте осуществления настоящего изобретения положительно заряженные группы представляют собой диэтиламиноэтил (DEAE).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения содержащий иммуноглобулин раствор сначала приводят в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные положительно заряженные группы, при значении pH в диапазоне от 7 до 8,2 и собирают несвязанную фракцию; затем несвязанную фракцию приводят в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, и собирают несвязанную фракцию I. Альтернативно, содержащий иммуноглобулин раствор можно сначала привести в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, и собрать несвязанную фракцию I; затем привести несвязанную фракцию I в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные положительно заряженные группы, и собрать несвязанную фракцию.

Подложка, содержащая положительно заряженные группы, может состоять из любого материала, способного связывать молекулу, содержащую химические группы, несущие положительный заряд, как описано выше.

Подложку, содержащую иммобилизованные положительно заряженные группы, обычно называют анионообменником. Анионообменники получили свое название за способность привлекать или связывать анионы или отрицательно заряженные частицы. В данной области анионообменники хорошо известны (Practical Protein Chromatography под редакцией Kenney и Fowell, том 11, Humana Press, 1992 г.). Система подложки анионообменников имеет положительный заряд и молекула примет участие в связывании, если значение pH буфера выше уникальной изоэлектрической точки белка.

Подложка, содержащая иммобилизованные положительно заряженные группы, может быть слабым или сильным анионообменником. Обычно слабым анионообменником считают обменник, образованный из слабой кислоты, которая постепенно теряет свой заряд со снижением pH, в то время как сильным анионообменником обычно считают обменник, образованный из сильной кислоты, способной поддерживать свой заряд в широком диапазоне значений pH.

Во время контакта с подложкой температура раствора/фракции может составлять от 8 до 37°C.

Содержащий иммуноглобулин раствор/фракцию можно приводить в контакт с подложкой несколько раз и/или использовать еще два или более фильтров, объединенных в единый функциональный блок.

Подложку можно уравновесить до приведения в контакт раствора/фракции и подложки, например, путем мойки подложки с помощью буфера содержащего иммуноглобулин раствора/фракции.

В частности, после приведения в контакт раствора и подложки, содержащей иммобилизованные положительно заряженные группы, собирают несвязанную фракцию (фильтрат, полученный после приведения в контакт раствора иммуноглобулина и подложки). В случае хроматографии на колонке возможно получение несвязанной фракции после мойки наполненной колонки тем же буфером, который используется для уравновешивания, и/или буфером, используемым для наполнения колонки содержащим иммуноглобулин раствором/фракцией.

Выше описаны альтернативные возможности иммобилизации подложки и положительно заряженных групп для получения возможностей иммобилизации подложки и отрицательно заряженных групп.

В случае использования колонки в качестве подложки, содержащей положительно заряженные группы, содержащий иммуноглобулин раствор может быть приведен в контакт с колонкой при линейной скорости от 1 до 2 мл/мин/см². Термин «линейная скорость фильтрования» относится к скорости прохождения раствора через колонку.

Также настоящее изобретение предоставляет способ удаления тромбогенного агента из содержащего иммуноглобулин раствора, включающий в себя этапы, на которых предоставляют содержащий иммуноглобулин раствор при значении pH в диапазоне от 7 до 8,2, предоставляют подложку, содержащую иммобилизованные положительно заряженные группы, и предоставляют подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы; приводят в контакт раствор и подложку, содержащую иммобилизованные положительно заряженные группы; собирают несвязанную фракцию; регулируют значения pH фракции до значения pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3; приводят в контакт несвязанную фракцию и подложку, содержащую иммобилизованные отрицательно заряженные группы; а также собирают несвязанную фракцию I.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения обнаруживаемые количества тромбообразующих агентов (например, PKA, калликреин и/или FXIa) удаляют из содержащего иммуноглобулин раствора.

Термин «обнаруживаемый» относится, например, к уровню, обнаруживаемому с помощью аналитического способа, описанного ниже в разделе «Материалы и способы».

В одном варианте осуществления настоящего изобретения эффективным считают удаление более чем 80% PKA, например, 83%, 85%, 90%, 95% и 99%, из содержащего иммуноглобулин раствора или фракции по сравнению с начальным содержанием PKA (до приведения в контакт раствора или фракции с подложкой, содержащей иммобилизованные положительно заряженные группы в соответствии с настоящим изобретением). Результаты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, также указывают на то, что использование изготовленной из трехмерного поперечносшитого гидрофобного акрилового полимера SDR-колонки позволяет удалять остаточные количества FXIa. SDR-колонка представляет собой технологию хроматографии, в которой образец взаимодействует с гидрофобной неподвижной фазой при относительно высокой концентрации соли в подвижной фазе.

Таким же образом возможно приведение в контакт содержащего иммуноглобулин раствора с хроматографическим материалом, содержащим трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер, с последующим сбором несвязанной фракции (например, «несвязанной фракции III»). Альтернативно, приведение в контакт с хроматографическим материалом, содержащим трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер, возможно после приведения в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы, или после приведения в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные положительно заряженные группы, т.е. «несвязанную фракцию», «несвязанную фракцию I» или «несвязанную фракцию II» приводят в контакт с хроматографическим материалом, содержащим трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер, с последующим сбором несвязанной фракции III. Примером таких трехмерных поперечносшитых гидрофобных акриловых полимеров является смола HyperD, производимая компанией Biosepra. Хроматография с использованием HyperD включает в себя смешанный режим адсорбции гидрофобного взаимодействия и молекулярной эксклюзии [Guerrier L et al. «Specific sorbent to remove solvent-detergent mixtures from virus-inactivated biological fluids». J Chromatogr B Biomed Appl. 3 февраля 1995 г.; 664(1):119–125].

Было обнаружено (с помощью физиологической модели животного, разработанной и описанной в публикации Wessler et al. Biologic assay of a thrombosis-inducing activity in human serum. J Appl Physiol. 1959 г.; 14:943–946), что иммуноглобулиновая композиция, из которой удалили калликреин, PKA и/или FXIa в соответствии с настоящим изобретением, демонстрирует сниженную активность стимуляции тромбоза.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ очистки содержащего иммуноглобулин раствора от тромбогенных агентов, включающий в себя этапы, на которых раствор подвергают по меньшей мере двум этапам отрицательной ионной хроматографии: анионообменной хроматографии при значениях pH в диапазоне от 7 до 8,2, с последующей катионообменной хроматографией при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3. Дополнительно способ может включать в себя этап обработки раствора отрицательной гидрофобной хроматографией с использованием хроматографического материала, содержащего трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер.

Также настоящее изобретение предоставляет способ получения иммуноглобулиновой композиции, включающий в себя этапы, на которых содержащий иммуноглобулин раствор подвергают по меньшей мере двум этапам отрицательной ионной хроматографии: анионообменной хроматографии при значениях pH в диапазоне от 7 до 8,2, с последующей катионообменной хроматографией при значениях pH от выше 3,8 до равных или ниже 5,3.

Возможно проведение катионообменной хроматографии в диапазоне значений pH от выше 3,8 до равных или ниже 5,0, в диапазоне значений pH от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0, в диапазоне значений pH от выше 3,8 до равных или ниже 4,7, в диапазоне значений pH от выше 3,8 до равных или ниже 4,3 или в диапазоне значений pH от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

Дополнительно способ настоящего изобретения может включать в себя отрицательную гидрофобную хроматографию с использованием хроматографического материала, содержащего трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фильтрат из катионообменника в соответствии с настоящим изобретением называют несвязанной фракцией I; фильтрат из анионообменника в соответствии с настоящим изобретением называют несвязанной фракцией; фильтрат, полученный во время второго этапа использования катионообменника в соответствии с настоящим изобретением, называют несвязанной фракцией II; и фильтрат хроматографического материала, содержащий трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер в соответствии с настоящим изобретением, называют несвязанной фракцией III. Каждую из этих фракций можно использовать для наполнения на одной или более хроматографических этапах и при условиях в соответствии с настоящим изобретением в разном порядке с целью удаления тромбогенных агентов и сбора фракции содержащего иммуноглобулин фильтрата.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения содержащим иммуноглобулин раствором наполняют трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер согласно описанию в патенте США № 6468733. Проводят сбор полученной несвязанной фракции III, pH несвязанной фракции III уравновешивают до 7–8,2, а фракцию III подвергают обработке на анионообменнике в аналогичных pH условиях. Несвязанную фракцию собирают и уравновешивают ее pH в соответствии с настоящим изобретением до наполнения катионообменника в соответствии с настоящим изобретением; и собирают несвязанную фракцию I. Последний этап можно повторить.

Термин «отрицательная хроматография» означает выбранные условия, в которых только относительно небольшая доля (например менее 25%) очищенного белка (т.е. иммуноглобулина) связывается с подложкой хроматографии или никакая его часть не связывается с ней, таким образом проходя сквозь подложку в хроматографическом разделении. Таким образом, основная часть белка присутствует в фильтрате.

Термин «положительная хроматография» относится к выбранным условиям, в которых большая часть очищенного белка (т.е. иммуноглобулина) связывается с подложкой хроматографии, поэтому необходим этап элюирования в неизократических условиях для восстановления белка.

Результаты демонстрируют эффективное удаление тромбогенных агентов также в процессе масштабирования катионо- и анионообменной хроматографии.

Настоящее изобретение также предоставляет иммуноглобулиновую композицию, содержащую низкий уровень тромбогенного агента. Иммуноглобулин может быть представлен в жидком или твердом виде, например в виде лиофилизированного порошка.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения сначала содержащий иммуноглобулин раствор приводят в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные положительно заряженные группы (анионообменник); полученную несвязанную фракцию собирают и приводят в контакт с подложкой, содержащей иммобилизованные отрицательно заряженные группы (катионообменник), и собирают полученную несвязанную фракцию I, содержащую иммуноглобулиновую композицию с низким уровнем тромбогенных агентов. В одном варианте осуществления настоящего изобретения содержащий иммуноглобулин раствор также приводят в контакт с хроматографическим материалом, содержащим трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер (хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)).

Иммуноглобулиновой композицией с низким уровнем тромбогенных агентов называют, например, композицию, имеющую менее 6 МЕ/мл PKA; композицию, образование тромбина в которой обнаружено на уровне менее 100 нМ во время определения возможности образования тромбина в иммуноглобулиновой композиции, например, в ходе проведения анализа тромбинообразования, как описано ниже; менее 0,8 нг/мл FXIa; и/или менее 200 нг/мл калликреина (например, менее 126 нг/мл). Уровни PKA, калликреина и FXIa можно определить путем проведения анализа, описанного в разделе «Материалы и способы».

В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуноглобулиновой композиции, которую можно получить в соответствии со способом настоящего изобретения. Иммуноглобулиновая композиция может быть предоставлена в контейнере. Флакон или предварительно наполненный шприц может содержать различные объемы композиции, например, композиция может иметь объем 0,5 мл, 2 мл, 10 мл, 30 мл, 50 мл, 100 мл, 200 мл, 500 мл, 1 л, 2 л и 3 л.

Термин «контейнер» означает любой контейнер, созданный для хранения иммуноглобулиновой композиции.

Иммуноглобулиновая композиция может содержать белок, диапазон концентрации которого составляет от 2 до 20% вес/об. или 5–10%. В одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация белка в композиции находилась в диапазоне 4,5–5,5% вес/об. В другом варианте осуществления настоящего изобретения концентрация белка в композиции составила приблизительно 5% вес/об. В другом варианте осуществления настоящего изобретения концентрация белка в композиции составила приблизительно 10% вес/об. В одном варианте осуществления концентрация белка составила приблизительно 50 мг/мл. Процентное отношение иммуноглобулина в общем содержании белка может составлять более 90%. В одном варианте осуществления настоящего изобретения процентное отношение иммуноглобулина в общем содержании белка составляет 95%.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулиновая композиция содержит низкое процентное отношение агрегатов белка, например, менее 3% агрегатов белка.

Термин «агрегаты» относится к агломератам материала, содержащим такие твердые вещества, как агрегаты белка. Агрегаты можно измерять с помощью ВЭЖХ.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композицию предоставляют в объеме 50 мл, содержание белка при этом составляет 2,5 г. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композицию предоставляют в объеме 100 мл, содержание белка при этом составляет 5,0 г. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композицию предоставляют в объеме 200 мл, содержание белка при этом составляет 10,0 г.

Флаконы, содержащие композицию, можно хранить при температуре ниже 25°C, например, при температуре 0°C или от 2°C до 8°C, и вдали от света до момента использования.

Иммуноглобулиновая композиция также может содержать эксципиенты. В настоящем контексте термин «эксципиент» означает инертное вещество, добавляемое к фармацевтической композиции. Добавление эксципиентов в композицию возможно, например, с целью обеспечения химической стабильности и биологической активности активного ингредиента во время хранения, облегчения производственного процесса и/или эстетических причин, например для окрашивания. В частности, к эксципиентам относятся, без ограничений, различные сахара, например, мальтоза или D-сорбитол; глицин; полимерные эксципиенты, например, полиэтиленгликоль или сывороточные белки, например, альбумин.

Иммуноглобулиновая композиция может содержать по меньшей мере 95% нормального иммуноглобулина человека G в качестве активного ингредиента, 10% мальтозы и воду для инъекций. Содержание иммуноглобулина A (IgA) может быть равным или менее ≤ 0,15 мг/мл.

Еще одна цель настоящего изобретения достигнута предоставлением способа лечения субъекта от иммунодефицита, например, первичного и вторичного иммунодефицита, воспаления, аутоиммунного заболевания или острой инфекции, включая введение субъекту эффективного количества иммуноглобулиновой композиции в соответствии с настоящим изобретением.

Термин «субъект» включает в себя животных, относящихся к классу млекопитающих, включая человека. В одном варианте осуществления субъектом является пациент.

Термин «эффективное количество» означает дозировку, необходимую для предотвращения или лечения (ослабления симптома или всех симптомов) заболевания, расстройства или состояния. Эффективное количество можно измерять на основании каких-либо изменений в течении болезни в ответ на введение композиции. Эффективную дозу можно изменять в зависимости от возраста и веса субъекта, заболевания и его тяжести (например, раннего или позднего этапа) и других факторов, которые могут быть выявлены специалистами в данной области.

Возможно использование иммуноглобулиновой композиции в заместительной терапии, например, первичного иммунодефицита (пациентов с первичным недостаточным образованием антител, например, агаммаглобулинемией или гипогаммаглобулинемией); хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) с тяжелой степенью вторичной гипогаммаглобулинемии и рецидивирующими инфекциями, которые не показали положительных результатов после профилактической антибиотикотерапии; миеломы в фазе плато с гипогаммаглобулинемией и рецидивирующими бактериальными инфекциями, которые не показали реакции на вакцинацию против пневмококковой инфекции; гипогаммаглобулинемии I у пациентов после трансплантации аллогенных кроветворных стволовых клеток (HSCT); детей с врожденным СПИДом и рецидивирующими инфекциями; для трансплантации аллогенного костного мозга; и для иммуномодуляции, например, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (ХВДП); идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ИТП); синдрома Гийена-Барре; и болезни Кавасаки.

Дозировка и режим введения зависят от целевого назначения. В заместительной терапии возможна индивидуализация дозировки для отдельных пациентов в зависимости от фармакокинетических и клинических целей.

Иммуноглобулиновую композицию, полученную в соответствии с настоящим изобретением и содержащую низкий уровень тромбогенных агентов, можно вводить способами, обеспечивающими системную адсорбцию. Многочисленные примеры способов введения, в частности, включают в себя внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный и внутримышечный способы. Преимущественно пациенты могут принимать высокую дозу раствора иммуноглобулина, полученного в соответствии с настоящим изобретением, содержащего низкий уровень тромбогенных агентов. Введение можно проводить, начиная с более высокой начальной дозы, например 0,4–0,8 г/кг, с последующими такими же или более низкими дозами через определенные промежутки времени. Более высокие дозы могут быть предназначены для стремительного повышения концентрации иммуноглобулина пациента до эффективной целевой концентрации.

Термин «внутривенный» относится к введению композиции в вену субъекта. Введение можно проводить путем периодического или непрерывного капания. Термин «периодический» синонимичен термину «внутривенное струйное введение» или «внутривенно струйно».

Термин «подкожный» означает введение композиции путем инъекции под кожу субъекта. Введение инъекции можно осуществлять путем образования кармашка, например, щипком или натягиванием кожи вверх и в сторону от подкожной ткани. Необязательно, возможно проведение инфузии с помощью подкожной имплантации диспенсера для введения лекарственных средств под кожу субъекта. Диспенсер может вводить предварительно заданное количество иммуноглобулина с предварительно заданной скоростью в течение предварительно заданного промежутка времени.

Термин «внутримышечный» означает введение иммуноглобулиновой композиции прямо в мышцу. Введение инъекций можно осуществлять в любую мышцу, включая, в частности, дельтовидную мышцу, латеральную широкую мышцу бедра, вентро-ягодичную и спинно-ягодичную область. Введение можно осуществлять в множество мест. Термин «внутрибрюшинный» означает инъекцию иммуноглобулина в брюшную полость.

Возможно получение иммуноглобулиновой композиции из крови или фракций крови, предоставленных здоровыми донорами. Возможно получение иммуноглобулина из смешанной крови или фракций крови, полученных от 1000 и более доноров. Возможно получение иммуноглобулина от доноров, прошедших скрининг, имеющих высокие титры антител. Примеры таких методик раскрыты в международном патенте WO-2007/017859, содержание которого включено в настоящий документ путем ссылки. Термин «фракция крови» относится к фракции цельной крови, содержащей такие иммуноглобулины, как плазма или сыворотка. Возможно получение иммуноглобулиновой композиции путем повторного суспендирования пасты II после фракционирования плазмы, например, в соответствии с методиками фракционирования по Кону и/или Кистлеру-Ничманну (KN).

Обычно иммуноглобулиновые композиции, полученные из компонентов крови, очищают от инфекционных частиц. Вирусную инактивацию можно проводить путем фильтрования, нанофильтрации, обработки растворителем/моющим средством, тепловой обработки, в частности, пастеризации, облучения гамма или ультрафиолетовыми лучами спектра С (<280 нм) или любым другим способом, известным в данной области.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулиновую композицию очищают путем обработки растворителем/моющим средством с помощью TnBP/Triton-X-100 и нанофильтрации при pH 4.

Термин «инфекционная частица» относится к такой микроскопической частице как, без ограничений, микроорганизм или прион, который может инфицировать клетки или размножаться в клетках биологического организма. Инфекционные частицы могут быть вирусными.

Процедуру инактивации инфекционных частиц можно проводить путем добавления инактивирующей молекулы в композицию до и/или во время процедуры очистки. Можно удалить введенные молекулы и их продукты путем гравитации, хроматографии на колонке или любым другим способом, известным в данной области. Возможно удаление инфекционных частиц путем нанофильтрации или методик селективной адсорбции, например, аффинной, ионообменной или гидрофобной хроматографии. Возможно проведение многоэтапной процедуры вирусной инактивации. Например, можно подвергнуть содержащий иммуноглобулин раствор обработке растворителем/моющим средством, тепловой обработке, селективной хроматографии и нанофильтрации.

Термин «вирусная инактивация» относится как к ситуации, в которой вирусы сохраняются в растворе, но считаются нежизнеспособными (например, путем растворения их липидной оболочки), так и/или к ситуации, в которой вирусы физически удалены из раствора (например, с помощью методик удаления по размеру).

Термин «обработка растворителем/моющим средством» обычно означает процесс, инактивирующий оболочечные вирусы путем разрушения их липидной оболочки. Возможно проведение обработки путем добавления моющих средств (например, Triton X-45, Triton X-100 или Tween 80) и растворителей [например, три(н-бутил) фосфат (TnBP), ди- или триалкилфосфатов]. Комбинация растворителей и моющих средств, используемая для деактивации вирусов с липидной оболочкой, может представлять собой любую комбинацию, известную в данной области, например TnBP и Triton X-100; Tween 80 и холат натрия и т.п. Концентрация растворителя/моющего средства может соответствовать обычно используемым в данной области, например, >0,1% TnBP и >0,1% Triton X-100. Обычно условия инактивации вирусов растворителем/моющим средством требуют введения 10–100 мг/мл растворителя/моющего средства при значении pH в диапазоне от 5 до 8 и температуре в диапазоне от 2 до 37°C в течение от 30 мин до 24 ч. Однако другие комбинации растворителей/моющих средств и подходящих условий будут очевидны любому специалисту в данной области. Большую часть растворителя/моющего средства, используемого в обработке растворителем/моющим средством, можно удалить с помощью, например, хроматографии на колонке, включая хроматографию гидрофобного взаимодействия (ХГВ), например, материал носителя из кремнезема C-18 и SDR (удаление растворителя/моющего средства) HyperD; матрицы адсорбции белка, например, ионообменные матрицы; матрицы аффинности; и/или эксклюзионные матрицы. Удаление растворителя/моющего средства может включать в себя дополнительный этап экстрагирования масла.

Термин «нанофильтрация» обычно относится к процессу, в котором вирусы с липидной оболочкой и необолочечные вирусы удаляют из раствора, например, с помощью специальных наноразмерных фильтров, например Planova^TM 20N, 35N и 75N; Viresolve/70^TM, Viresolve/180^TM. Размер пор на фильтрах может быть менее 70 нм, предпочтительно от 15 до 50 нм. Однако в нанофильтрации можно использовать любую мембрану с размером отверстий, достаточным для уменьшения количества или исключения вирусов из раствора. Вирусы, удаляемые путем нанофильтрации, могут быть оболочечными [например, ВИЧ, вирус гепатита B, вирус гепатита C, вирус лихорадки Западного Нила, цитомегаловирус (ЦМВ), вирус Эпштейна-Барра (ВЭБ), вирус простого герпеса], и необолочечными (например, вирус гепатита A, паравирус B19, вирус полиомиелита).

Примеры методик очистки иммуноглобулина раскрыты в патенте США № 6468733, патенте EP № 1161958 и международной публикации PCT международного патента WO 99/18130, включенных в настоящий документ путем ссылки. Например, способ очистки иммуноглобулинов из такого исходного раствора, как фракция II по Кону, может включать в себя этапы, на которых: (a) предварительно обрабатывают катионообменную смолу кислотным раствором со значением pH 4,0–4,5; (b) приводят в контакт исходный раствор и катионообменную смолу; и (c) элюируют иммуноглобулины, связанные с катионообменной смолой. До приведения в контакт с катионообменной смолой можно обработать исходный раствор органическим растворителем и моющим средством.

Другой способ очистки иммуноглобулинов может включать в себя этапы, на которых: (a) обрабатывают раствор комбинацией растворителя и моющего средства в концентрации и условиях, достаточных для инактивации вирусов в липидной оболочке; (b) удаляют комбинацию растворителя и моющего средства из раствора путем прогона полученного раствора (a) на хроматографическом носителе, содержащем гранулы кремнезема, поровое пространство которых заполнено трехмерным поперечносшитым гидрофобным акриловым полимером; и (c) прогона раствора после этапа (b) сквозь фильтр с размером пор от приблизительно 15 нм до приблизительно 70 нм как описано в патенте США № 6468733.

Иммуноглобулиновая композиция может быть сконцентрирована путем ультрафильтрации. После ультрафильтрации можно провести диафильтрацию для обмена буфера. Концентрирование и диализ путем ультрафильтрации и диафильтрации, соответственно, можно проводить на одном этапе или на двух отдельных этапах. Проведение диафильтрации возможно с любым раствором, подходящим для введения людям. Неограничивающие примеры таких растворов включают в себя, без ограничений, 0,3% NaCl и от приблизительно 1,6 до приблизительно 2,6% глицина, например 2,25%.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

Раствор иммуноглобулина.

a) Ресуспендирование пасты II

Пасту II (45 кг), полученную из плазмы способом фракционирования по Кону (Cohn, E.J. The history of plasma fractionation. In Advances in Military Medicine, Andrus et al. под редакцией Little, Brown & Co, 1948 г.), перенесли в резервуар крешера с добавлением холодной (4°C) воды для инъекций (WFI) (весом, превышающим вес пасты II в три раза) для достижения окончательного веса 180 кг. Сначала ресуспендированную пасту перемешивали в течение 5 часов при 4–6°C, затем сцеживали при 4–6°C, не перемешивая в течение 37 ч, для осаждения основных белковых соединений. После осаждения надосадочную жидкость отделили от осадка и использовали для следующего этапа.

b) Фильтрование CUNO

Надосадочную жидкость, полученную на предыдущем этапе, профильтровали на параллельной паре CUNO 0,2 мкм положительно заряженных глубинных фильтров (Cuno Zeta Plus, Cuno Incorporation Inc., штат Коннектикут, США) для удаления агрегатов. На этапе фильтрования давление в фильтре не превышало 0,1 МПа (1,0 бар). Скорость потока текучей среды во время фильтрования составила 60 л/ч при температуре 7,2°C.

c) Анионообменная хроматография - колонка с диэтиламиноэтилцеллюлозой (DEAE)

На следующем этапе раствор, полученный на этапе b), подвергли анионообменной хроматографии (см. примеры 7–11).

Если не было указано иное, колонку DEAE уравновешивали 7 объемами колонки (CV; т.е. 77 мл) дистиллированной воды (или WFI) при скорости потока текучей среды 2,8 мл/мин. После уравновешивания колонку наполнили раствором иммуноглобулина, полученным на этапе b). Давление в колонке не превышало 0,1 МПа (1,0 бар).

В случае дополнительной обработки, если не было указано иное, этап c) проводили в следующих условиях (условия масштабирования): колонку DEAE (Toyopearl DEAE-650M; TOSOHAAS) использовали в качестве анионообменника [7,5 л смолы. Диаметр колонки составил 35 см с высотой слоя 15 см]. Колонку промывали 360 л WFI при скорости потока текучей среды 110 л/ч. Наполнение проводили в качестве продолжения фильтрования CUNO со скоростью потока текучей среды 60 л/ч при 8–10°C (температура материала). Объем наполнения раствором иммуноглобулина составлял 18 объемов колонки при pH обрабатываемого раствора 7–7,6. Хроматографию проводили при комнатной температуре (22±2°C).

d) Регулирование pH

Значение pH раствора регулировали до 4,59 путем добавления 0,5 M HCl при непрерывном смешивании. Температуру поддерживали на уровне 8±2°C. Для удаления агрегатов проводили фильтрование раствора сквозь фильтр 0,45–0,65 мкм (Sartobran) в чистый сосуд.

e) Концентрация до 90 г/л и диафильтрация

Раствор, полученный на этапе d), подвергали ультрафильтрации с помощью кассеты для ультрафильтрации, содержащей мембрану с эксклюзионным пределом в 30000 Д (Filtron Maxisette; 30 КД). Кассету подготавливали путем мойки с 500 кг WFI. Во время ультрафильтрации раствор белка (200 кг) концентрировали до 90 г/л (конечный вес 141 кг). Далее проводили этап диафильтрации с помощью 705 кг WFI при постоянном объеме с целью удаления остаточного этанола и снижения осмоляльности до <30 мОсм/кг. Затем концентрацию белка регулировали до 73 г/л с помощью WFI до достижения конечного объема в 173 кг. На этом этапе температуру поддерживали на уровне 8±2°C.

Катионообменную хроматографию проводили [с использованием мембраны Mustang® S, капсулы Mustang® S, SP-колонки или CM-колонки (см. примеры 2–4, пример 5, пример 1 и пример 1, соответственно, относительно специальных условий)] после этапа c) с использованием SP-колонки или после этапа e) с использованием мембраны Mustang® S или капсулы Mustang® S.

В случае проведения катионообменной хроматографии после этапа c) хроматографии подвергали приблизительно 50–60 мг/мл белка. В случае проведения хроматографии после этапа e) хроматографии подвергали приблизительно 70 мг/мл белка.

Для снижения содержания агрегатов до обработки раствора иммуноглобулина катионообменной хроматографией раствор фильтровали через фильтр [1,2 мкм глубинный фильтр, полученный от Sartorius sartopure (до SP-колонки) или 0,2 мкм CA-фильтр, полученный от Corning (до мембраны Mustang® S или капсулы Mustang®)].

В случае SP-колонки до наполнения раствором иммуноглобулина колонку уравновешивали с помощью 20 мМ ацетатного буфера в объеме 20 мл с уровнем pH, совместимым с уровнем раствора иммуноглобулина для наполнения.

В случае мембраны Mustang® S до наполнения раствором иммуноглобулина фильтрующую мембрану уравновешивали с помощью 20 мМ ацетатного буфера в объеме 20 мл с уровнем pH, совместимым с уровнем раствора иммуноглобулина для наполнения.

В случае капсулы Mustang® S до уравновешивания капсулу предварительно обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя. Если не было указано иное, на следующем этапе капсулу уравновешивали с помощью 600 мл 20 мМ ацетатного буфера с уровнем pH 4,2.

Обработка растворителем/моющим средством (Р/МС).

Раствор иммуноглобулина уравновешивали до pH 5,3 и подвергали обработке Р/МС (для инактивации вирусов в липидной оболочке) следующим образом: 1% Triton X-100 и 0,3% три(н-бутил)фосфат (TnBP) (объем/объем) смешивали вместе с последующим медленным добавлением в раствор при быстром помешивании (20 Гц) раствора. Затем раствор инкубировали в течение приблизительно 4,5 ч при 6,9°C при непрерывном осторожном помешивании. В конце периода инкубации температуру повышали до 23°C на 1–1,5 ч в условиях сильного перемешивания (со скоростью 20 Гц). На следующем этапе раствор, обработанный растворителем и моющим средством, последовательно профильтровали через глубинный фильтр 3мкм (Sartorius), а затем через мембранный фильтр 0,45–0,65 мкм (Sartorius) (с целью удаления крупных частиц до следующего этапа удаления растворителя/моющего средства).

Удаление растворителя/моющего средства на SDR-колонке.

Удаление растворителя/моющего средства проводили на специальной колонке с использованием смолы для хроматографии, предназначенной для удаления растворителя/моющего средства (SDR-HyperD, компания Biosepra), HyperD. До наполнения раствором иммуноглобулина, обработанным растворителем/моющим средством, колонку подготовили с помощью 450 кг WFI (при максимальном давлении 0,08 МПа (0,8 бар)) и со скоростью потока 80 л/ч. Длина колонки составляла 54 см, диаметр - 28 см, объем смолы - 30–32 л. Скорость потока составляла 78 л/ч, было использовано 37 кг WFI для промывания колонки после наполнения образцом для достижения базовой линии. Общий собранный объем фильтрата составил 176,7 кг.

Измерение уровней активатора прекалликреина

Активатор прекалликреина (PKA), первый зимоген природной системы коагуляции, активирует прекалликреин в калликреин. В настоящем исследовании прекалликреин (добавленный к проверяемому образцу) активируется до калликреина с помощью PKA, обнаруживаемого в проверяемом образце. Затем образованный калликреин расщепляет хромогенный субстрат (H-D-But-CHA-Arg-pNA) до окрашенного п-нитроанилина (pNA) с постоянной скоростью (см. реакцию ниже). Реакцию можно измерять с помощью спектрофотометра при 405 нм.

Полученный цвет пропорционально соответствует количеству PKA, присутствующего в проверяемом образце.

Все необходимые реагенты входили в набор для анализа активатора прекалликреина (Pathway Diagnostics; код продукта: PW30100). Анализ проводили при 37°C.

Более подробное описание анализа представлено ниже:

i) Этап A для подготовки контрольных проб: 25 мкл всех стандартных разведений PKA (0, 3,125, 6,25, 12,5 и 18,75 МЕ/мл. Из раствора PKA, разбавленного буферным набором, были получены различные концентрации PKA); положительный контроль [международный стандарт Управления по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) в отношении PKA, содержащий 10 МЕ/мл PKA]; или разбавленные тестовые образцы (разведение 1:2 с помощью буферного набора) отмеряли пипеткой в 96-луночный микропланшет.

ii) Этапы стандартов PKA, положительного контроля и тестовых образцов: 25 мкл всех стандартных тестовых образцов PKA, разбавленных или разведенных (разведение согласно способу, описанному выше) отмеряли пипеткой в пробирки компании Eppendorf. Затем добавляли 50 мкл раствора прекалликреина человека в каждую пробирку Eppendorf. Пробирку закрыли колпачком, смешали и перенесли 25 мкл из каждой пробирки компании Eppendorf (с дубликатами) в лунки микропланшета.

iii) На следующем этапе планшет инкубировали на протяжении 30 мин при 37°C.

iv) Этап B подготовки контрольных проб: после 30-минутной инкубации 50 мкл предварительно нагретого (37°C) раствора прекалликреина человека добавили во все контрольные пробы (см. подготовку этапа i), а содержимое лунки смешали с помощью пипетки. Затем 25 мкл содержимого всех этих лунок немедленно перенесли (с дубликатами) в соответствующие лунки микропланшета. Микропланшет дополнительно инкубировали при 37°C на протяжении 15 мин (общий период инкубации составил 45 мин).

v) Этапы для всех подготовительных работ: 100 мкл предварительно нагретого (при 37°C) рабочего раствора субстрата калликреина (раствора, содержащего хромогенный субстрат) были добавлены во все лунки (лунки, упомянутые в этапах ii и iv).

vi) Микропланшет был помещен в считыватель ELISA (при 37°C); оптическую плотность (OD) измеряли при 405 нм через 2 мин (OD_{2 мин}) и еще раз через 12–17 минут инкубации (OD_{X мин}).

Полученные для контрольных проб значения OD вычли из значений OD, полученных для соответствующих тестовых образцов.

Содержимое PKA рассчитали с помощью ΔOD_(x–2) (после вычета контрольной пробы из каждого значения), как интерполировано из стандартной калибровочной кривой с учетом соответствующего фактора разведения. Результаты представлены в международных единицах/мл.

Анализ тромбинообразования для оценки удаления FXI/FXIa

Анализ тромбинообразования (TGA) представляет собой общий гемостатический способ измерения количества образованного и пониженного со временем тромбина. Этот анализ позволяет оценить способность (или потенциал) какого-либо заданного образца образовывать тромбин в случае запуска системы коагуляции (с помощью внутреннего или внешнего агента). Мониторинг тромбинообразования осуществляется путем конвертирования флуорогенного субстрата тромбина и калибрации тромбинообразования образца путем сравнения с определенным стандартом активности тромбина.

Анализ проводили в прозрачных круглодонных (U-подобных) 96-луночных планшетах с помощью флуорометра Thermo Electron Fluorometer (Fluoroskan FL), оснащенного набором фильтров 390/460 для измерений на наноразмерном уровне и диспенсером.

Для измерения уровня FXI/FXIa использовали плазму с недостатком FXI (полученную от Stago; номер по каталогу 00723) и запустили систему коагуляции с помощью 1 пМ тканевого фактора (что вызывает активацию внешнего пути коагуляции) и 4 мкМ фосфолипидов (что вызывает активацию внутреннего пути коагуляции) (тканевый фактор и фосфолипиды смешаны и предоставлены в одном реагенте - PPP-Reagent low; Stago; номер по каталогу TS 31.00).

Измерения проводили в соответствии с инструкцией The Thrombogram Guide (Thrombinoscope BV): outline of the method to measure thrombin generation using the Calibrated Automated Thrombogram со следующими изменениями:

Для целей измерений 20 мкл проверяемого образца (служащего потенциальным источником FXIa) смешивали в лунке с 60 мкл плазмы с недостаточным количеством FXI и 20 мкл PPP-Reagent.

Каждый отдельный проверяемый образец требует соответствующего образца калибратора (содержащего известное количество тромбина) и проверяемого образца. Для измерения образца калибратора тромбина смешивали 20 мкл проверяемого образца, 60 мкл плазмы с недостаточным количеством FXI и 20 мкл калибратора тромбина (Stago; номер по каталогу TS 20.00).

Реакция тромбинообразования (при 37°C) начиналась после добавления 20 мкл вещества, содержащего флуоресцентный субстрат и Ca²⁺ [флуоресцентный субстрат и Ca²⁺ предоставлены в наборе Fluca (Stago; номер по каталогу TS 50,00) и смешаны в соответствии с инструкциями производителя]. Добавление флуоресцентного субстрата и Ca²⁺ проводят автоматически с помощью Fluoroskan FL.

Затем количество образованного тромбина (в нМ) рассчитывают с помощью инструментального программного обеспечения Thrombinoscope BV (предоставляемого вместе с Fluoroskan FL). Конечное количество тромбина в проверяемом образце рассчитывали путем уменьшения фонового значения в значении проверяемого образца и значении калибратора тромбина и экстраполяции количества тромбина в образце из значения калибратора тромбина. Фоновое значение было получено с помощью 60 мкл плазмы с недостаточным количеством FXI, дополненной 20 мкл буфера, содержащего 20 мМ ацетатного буфера.

Измерения уровней фактора XIa (FXIa) (флуорогенный способ).

Уровни фактора XIa измеряли с помощью флуорогенного способа. Согласно этому способу FXIa расщепляет определенный флуорогенный субстрат в присутствии кальция. Во время реакции расщепления субстрат (образованный из флуоресцентной репортерной группы 6-амино-1-нафталин-сульфонамида (ANSN), присоединенной к трипептидной последовательности) гидролизируют между трипептидной последовательностью и группой ANSN. После расщепления из фрагмента пептида группа ANSN показывает приблизительно 1000-кратное увеличение относительной флуоресцентности. Эта активность непосредственно связана с количеством фактора XIa в образце. Полученную флуоресцентность измеряют с помощью считывателя ELISA в следующих значениях длины волны: возбуждение при 350 нм и эмиссия при 470 нм. Более подробное описание измерения представлено ниже:

Первый этап (1-я подготовка 96-луночного планшета): проверяемые образцы проверяли либо в неразбавленном состоянии (если образец проверяли после обработки раствора иммуноглобулина катионообменной хроматографией), либо в разбавленном состоянии (1:10, если образец проверяли до обработки раствора иммуноглобулина катионообменной хроматографией). Разведение проводили в буфере B [40 мМ Hepes, 300 мМ NaCl, 4 мМ CaCl₂, 0,2% раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с 20 K]. 50 мкл из упомянутых выше образцов добавили в лунку 96-луночного планшета (Costar; номер по каталогу 3797) в четырех экземплярах.

Стандартная кривая была подготовлена с помощью FXIa (Hematological Technologies Inc.; номер по каталогу HCXIA-0160), разбавленного буфером A [20 мМ Hepes; 150 мМ раствора NaCl; 0,1% (вес/об.) BSA] до получения следующих концентраций: 140, 100, 70, 50 и 25 нг/мл. 50 мкл каждой концентрации добавили в лунки в четырех экземплярах. Положительный контроль (препарат иммуноглобулина, содержащий приблизительно 120 нг/мл FXIa) и образцы контрольных проб (буфер A) добавили в каждую лунку в четырех экземплярах (50 мкл всех положительных образцов и образцов контрольных проб).

Второй этап (2-я подготовка 96-луночного планшета): второй 96-луночный планшет был подготовлен для кинетической реакции (Costar; номер по каталогу 3695) путем добавления 25 мкл раствора субстрата FXIa (Hematological Technologies Inc., номер по каталогу SN-13a) в разбавлении 1:100 буфером B) в каждую лунку 96-луночного планшета. Далее 25 мкл всех образцов, приготовленных на 1-м 96-луночном планшете (проверяемые образцы, образцы для подготовки стандартной кривой, положительные контрольные образцы и образцы контрольных проб) перенесли в параллельные лунки второго планшета и немедленно перенесли второй планшет в считыватель ELISA (SpectraMax). Для считывания использовали следующие параметры: записи на протяжении 15 минут каждые 30 секунд; возбуждение: 350 нм; эмиссия: 470 нм; граница: 455 нм; температура: 37°C. Шейкер активировали за 15 секунд до первого считывания; и скорость V_max [относительная единица флуоресценции (ОЕФ)/мин] измеряли за 0–900 секунд.

Значение V_max кинетической реакции является результатом вычисления реакции с помощью подбора линейной кривой. Медленно изменяющуюся итерацию проводили, используя точки V_max, а крутизну наивысшего сегмента кривой обозначали как скорость V_max в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ).

С помощью программного обеспечения концентрацию FXIa (нг/мл) в проверяемом образце экстраполировали из стандартной кривой, созданной с помощью FXIa (см. описание выше), с учетом разведения образца (за автоматическим вычетом контрольной пробы).

Содержание белка измеряли биуретовым способом с помощью реагента для определения общего белка (Sigma Diagnostic INC., номер по каталогу 541-2) в соответствии с инструкциями производителя.

Распределение подклассов IgG измеряли с помощью набора BIND A RID для подклассов IgG человека, набор Combi (The Binding Site Ltd.; номер по каталогу RK021) в соответствии с инструкциями производителя.

Титр антидифтерийных антител измеряли с помощью набора Diphtheria (VITROTECH) в соответствии с инструкциями производителя.

Антитела поверхностного антигена гепатита B (против HBsAg) измеряли с помощью набора, полученного от Abbott Laboratories; номер по каталогу: LBXHBS.

Измерения уровней калликреина (хромогенный способ)

Уровни калликреина измеряли хромогенным способом. Согласно этому способу калликреин расщепляет определенный хромогенный субстрат. Во время реакции расщепления субстрат калликреина (содержащий хромогенную репортерную группу пара-нитроанилина (pNa), присоединенную к олигопептидной последовательности субстрата калликреина) гидролизируют между олигопептидной последовательностью и группой pNa. После расщепления от фрагмента пептида pNa показывает высокий уровень расщепления при 405 нм. Эта активность непосредственно связана с количеством калликреина в образце. Наблюдаемое поглощение измеряли с помощью считывателя ELISA при 405 нм. Более подробное описание проводимого измерения представлено ниже:

Первый этап (1-я подготовка 96-луночного планшета): проверяемые образцы проверяли либо в разбавленном состоянии в соотношении 1:5 (если образец проверяли после обработки раствора иммуноглобулина катионообменной хроматографией), либо в разбавленном состоянии в соотношении 1:30 (если образец проверяли до обработки раствора иммуноглобулина катионообменной хроматографией). Разведение проводили в буфере A [20 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 0,1% вес/об. BSA]. 50 мкл из упомянутых выше образцов добавили в лунку 96-луночного планшета (Costar; номер по каталогу 3797) в четырех экземплярах.

Стандартную кривую подготавливали, используя калликреин (Enzyme Research Laboratories; номер по каталогу HPKa-1303), разведенный в буфере A для получения следующих концентраций: 400, 200, 100, 50, 25 и 12,5 нг/мл. 50 мкл каждой концентрации добавили в лунки в четырех экземплярах. Два положительных контроля (препараты иммуноглобулина, содержащие приблизительно 70 и 15 нг/мл калликреина) и контрольные пробы (буфер A) добавили на каждый планшет в четырех экземплярах (50 мкл всех положительных образцов и контрольных проб).

Второй этап (2-я подготовка 96-луночного планшета): для проведения кинетической реакции готовили второй 96-луночный планшет (Costar; номер по каталогу 3695) путем добавления 25 мкл раствора субстрата калликреина {Biophen SC31(02) (HYPHEN BioMed, номер по каталогу 229031) - повторно растворенного в 5 мл дистиллированной воды, а затем разбавленного в соотношении 1:7 буфером A} в каждую лунку 96-луночного планшета. Далее 25 мкл всех образцов, приготовленных на 1-м 96-луночном планшете (проверяемые образцы, образцы для подготовки стандартной кривой, положительные контрольные образцы и образцы контрольных проб) перенесли в параллельные лунки второго планшета и немедленно перенесли второй планшет в считыватель ELISA (SpectraMax). Для считывания использовали следующие параметры: записи на протяжении 15 минут каждые 34 секунды; поглощение: 405 нм; температура: 37°C. Шейкер активировали за 15 секунд до первого считывания; и скорость V_max [OD/мин] измеряли за 0–900 сек.

Значение V_max кинетической реакции является результатом вычисления реакции с помощью подбора линейной кривой. Медленно изменяющуюся итерацию проводили, используя точки V_max, а крутизну наивысшего сегмента кривой обозначали как скорость V_max в единицах поглощения/мин.

С помощью программного обеспечения концентрацию калликреина (нг/мл) в проверяемом образце экстраполировали из стандартной кривой, созданной с помощью калликреина (см. описание выше), с учетом разведения образца (за автоматическим вычетом контрольной пробы).

Пример 1. Влияние уровня pH раствора иммуноглобулина на эффективность катионообменной хроматографии в удалении FXIa из раствора

Целью следующего эксперимента являлось определение влияния уровня pH раствора иммуноглобулина на удаление FXIa из раствора с помощью катионообменника.

Изоэлектрическая точка FXIa равна приблизительно 9 (Bonno BN, Griffin JH. Human blood coagulation factor XI: purification, properties, and mechanism of activation by activated factor XII. J Biol Chem 1977 г.; 252:6432–6437). Применение катионообменника позволяет использовать уровень pH ниже изоэлектрической точки (где FXIa имеет чистый положительный заряд). В настоящем эксперименте оценивали влияние диапазона уровней pH 4–7.

Согласно этой цели раствор иммуноглобулина подготовили в соответствии с этапами a–c, описанными в разделе «Материалы и способы». На следующем этапе значение pH раствора регулировали с помощью 0,5 N NaCl или 0,1 N NaOH до желаемого проверяемого значения pH (диапазон значений pH 4–7; уровень pH раствора измеряли с помощью устройства для электронного мониторинга pH) и 100 мл всех полученных растворов иммуноглобулина обрабатывали на катионообменной колонке.

В качестве катионообменника использовали сульфопропильную колонку (SP-колонку). Подготовка колонки: 4 мл сульфопропильной смолы (TOSOHAAS; номер по каталогу Toyopearl, SP-650M) помещали внутрь колонки диаметром 1 см (Bio-Rad), что позволяло достичь слоя высотой 6 см. Хроматографию проводили при комнатной температуре (22±2°C) со скоростью потока 2 мл/мин. Температура раствора для наполнения составляла 22±2°C.

Для оценки эффективности удаления FXIa его уровень измеряли в материале для наполнения («Наполнение») и после сбора раствора из колонки («Несвязанная фракция»). Измерения проводили с помощью анализа тромбинообразования (TGA) согласно описанию, представленному в разделе «Материалы и способы». В настоящем эксперименте значения тромбинообразования в материале для наполнения находились в диапазоне 246–271 нМ.

Для оценки восстановления IgG в несвязанной фракции измеряли общее восстановление белка (%) (IgG состоит из приблизительно 95% общего белка). Результаты представлены ниже в таблице 1.

Изоэлектрическая точка IgG равна 6–8. Таким образом, при уровне pH ниже 6 IgG (с положительным чистым зарядом) может также связываться с катионообменником (помимо FXIa), что приводит к низкому уровню восстановления IgG.

Таблица 1
Влияние уровня pH раствора иммуноглобулина на эффективность катионообменника для удаления FXIa из раствора и на общее восстановление белка
Уровень pH материала для наполнения	Образец	Тромбин (нМ)	Общее восстановление белка (%)*
4	Несвязанная фракция	40,5	97,2
4,6	Несвязанная фракция	42	92,6
5,3	Несвязанная фракция	48,7	91,1
5,7	Несвязанная фракция	68,9	92,1
6,1	Несвязанная фракция	71	92,8
6,5	Несвязанная фракция	102,6	98,1
7	Несвязанная фракция	110,8	94
*Оценку проводили путем сравнения содержания белка (используя биуретовый способ) до («Наполнение») и после («Несвязанная фракция») обработки раствора на колонке.

Результаты показывают, что уровень pH выше 6 приводил к более низким показателям удаления FXIa (высокие значения тромбинообразования), а уровни pH ниже 6 приводили к высоким показателям удаления FXIa (низкие значения тромбинообразования) из раствора иммуноглобулина с одновременными высокими показателями восстановления IgG (измеренных по общему восстановлению белка). Эти результаты оказались неожиданными, поскольку при уровне pH ниже 6 IgG (изоэлектрическая точка которого находится в диапазоне 6-8) имеет положительный чистый электрический заряд, поэтому ожидалось его связывание с отрицательно заряженными группами катионообменной колонки и более низкие показатели восстановления IgG.

Другую серию экспериментов проводили с помощью карбоксиметильной (CM)-колонки (слабого катионообменника компании TOSOHAAS; номер по каталогу Toyopearl, CM-650M). Эксперимент проводили в таких же условиях, как условия в SP-колонке. В случае CM-колонки проверяли только диапазон низких значений pH 4–5,5. Результаты были сопоставлены с результатами, полученными с помощью SP-колонки. Сравнение показало, что для проверяемого диапазона значений pH (4–5,5) были получены высокие показатели удаления FXIa и высокие показатели восстановления IgG. Объем смолы составлял 8 мл; диаметр колонки был равен 1 см, а высота слоя - 10 см.

Пример 2. Влияние уровня pH раствора иммуноглобулина на эффективность мембраны Mustang® S (катионообменника) в удалении FXIa из раствора

Целью следующего эксперимента являлось изучение влияния низких уровней pH на раствор для внутривенного введения после удаления FXIa из раствора с помощью катионообменной мембраны Mustang® S [фильтры индикаторов конвергенции; объем слоя мембраны (MV) = 0,35 мл; Pall; номер по каталогу NP8MSTGSP1]. В настоящем эксперименте оценивали влияние диапазона значений pH 3,8–5,3 раствора иммуноглобулина на эффективность удаления FXIa.

Для осуществления этой цели раствор иммуноглобулина готовили в соответствии с этапами (a)–(e), описанными выше в разделе «Материалы и способы». На следующем этапе значение pH раствора после диафильтрации регулировали с помощью 0,5 N NaCl или 0,1 N NaOH до желаемого проверяемого значения pH (диапазон значений pH 3,8–5,3); 30 мл каждого полученного раствора иммуноглобулина наносили на мембрану Mustang® S. Хроматографию проводили при комнатной температуре (22±2°C) со скоростью потока 1,5 мл/мин. Температура раствора для наполнения составляла 22±2°C.

Уровень FXIa измеряли в растворе иммуноглобулина до («Наполнение») и после («Несвязанная фракция») обработки растворов на катионообменнике. Оценку проводили флуорогенным способом согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы», пункт «Измерения уровней FXIa». Результаты представлены ниже в таблице 2.

Таблица 2
Влияние уровня pH раствора иммуноглобулина на эффективность катионообменника при удалении FXIa
Уровень pH материала для наполнения	FXIa (нг/мл) Использование флуорогенного способа	Удаление FXIa (%)*
Наполнение	Несвязанная фракция
3,8	270,5	129,2	52,24
4	302,2	34,5	88,58
4,3	422,4	50,1	88,09
4,5	360,2	67,8	81,18
4,7	312,7	53,9	82,76
5	367,8	76,6	79,17
5,3	340,9	81,4	76,12
* Рассчитано путем сопоставления уровней FXIa до («наполнение») и после («несвязанная фракция») обработки раствора на колонке.

Полученные результаты показывают, что уровни pH выше 3,8 приводят к эффективному удалению FXIa из раствора иммуноглобулина, при этом оптимальный уровень pH находится в диапазоне от 4,0 до 5,0 (значения pH, при которых наблюдали наивысшее процентное отношение удаления FXIa).

В другой серии экспериментов оценивали влияние более высокого уровня pH (до 7,4). Эксперимент проводили таким же способом, как в предыдущем эксперименте, за исключением того, что 20 мл раствора иммуноглобулина добавляли в катионообменник (мембрану Mustang® S) и проводили фильтрование с более высокой скоростью потока 2,5 мл/мин.

Уровень FXIa измеряли в материале для наполнения («Наполнение») и в несвязанной фракции 10 (собрали 10 фракций по 2 мл и проводили измерения на фракции 10). Измерения проводили, как описано выше, с помощью флуорогенного способа. Результаты представлены ниже в таблице 3.

Таблица 3
Влияние уровня pH раствора иммуноглобулина на эффективность мембраны Mustang® S при удалении FXIa
Уровень pH материала для наполнения	FXIa (нг/мл) Использование флуорогенного способа	Удаление FXIa (%)*
Наполнение	Несвязанная фракция 10
5	116,7	28,3	75,75
6	115,6	68,5	40,74
7,4	112,1	144,5	-
* Рассчитано путем сопоставления уровней FXIa до («наполнение») и после («несвязанная фракция») обработки раствора на колонке.

Полученные результаты неожиданно продемонстрировали, что, хотя FXIa имеет положительный чистый заряд при уровне pH ниже приблизительно 9 (его изоэлектрическая точка равна 8,9-9,1), при значениях pH 6 и выше было получено недостаточное удаление FXIa.

Пример 3. Влияние скорости потока текучей среды на удаление FXIa из раствора иммуноглобулина путем катионообменной хроматографии

Целью следующего эксперимента являлось изучение влияния скорости потока текучей среды на удаление FXIa из раствора иммуноглобулина с помощью катионообменной хроматографии. Оценивали следующие показатели скорости потока: 0,7, 1, 1,5, 2,5 мл/мин. Начальный раствор иммуноглобулина был таким же раствором, который использовали в примере 2, а в качестве катионообменника использовали такую же мембрану Mustang® S.

Принимая во внимание предыдущие примеры, значение pH раствора иммуноглобулина регулировали до 4,2 (для раствора иммуноглобулина, наполняемого со скоростью потока 0,7, 1 и 2,5 мл/мин) или 4,3 (для раствора иммуноглобулина, наполняемого со скоростью потока 1,5 мл/мин) до наполнения катионообменника раствором иммуноглобулина. Хроматографию проводили при комнатной температуре (22±2°C), температура раствора для наполнения катионообменника составляла 22±2°C; 30 мл раствора иммуноглобулина добавили в катионообменник.

Уровень FXIa измеряли в растворе иммуноглобулина до («Наполнение») и после («Несвязанная фракция») наполнения катионообменника раствором. Измерения проводили непосредственно флуорогенным способом и косвенно, с помощью анализа тромбинообразования, описанного выше в разделе «Материалы и способы». В настоящем эксперименте значения тромбинообразования в материале для наполнения находились в диапазоне 179–290 нМ.

Результаты представлены ниже в таблице 4.

Таблица 4
Влияние скорости потока текучей среды на удаление FXIa из раствора иммуноглобулина с помощью катионообменной хроматографии
Скорость потока материала для наполнения (мл/мин)	FXIa (нг/мл) Использование флуорогенного способа	Удаление FXIa (%)***	Тромбин (нМ) Использование анализа тромбинообразования
Наполнение	Несвязанная фракция*	Несвязанная фракция*
0,7	342,6	40,8	88,09	43,0
1,0	283,5	45,1	84,09	25,2
1,5	422,4	50,1	88,14	0,0
2,5	304,0	80,7	73,45	63,3
* Для скорости потока 0,7, 1 и 2,5 мл/мин собирали 15 фракций (по 2 мл каждая); для оценки уровня FXIa использовали смесь несвязанных фракций: 2, 5, 7, 10 и 13. Для скорости потока 1,5 мл/мин для оценки использовали всю несвязанную фракцию. ** Поскольку объем слоя мембраны Mustang (MV) составляет 0,35 мл–0,7 мл/мин = 2 MV/мин; 1 мл/мин = 2,9 MV/мин; 1,5 мл/мин = 4,3 MV/мин; и 2,5 мл/мин = 7,1 MV/мин. *** Рассчитано путем сопоставления уровней FXIa до («наполнение») и после («несвязанная фракция») обработки раствора на колонке.

В процессе использования флуорогенного способа было отмечено, что оптимальная скорость потока для удаления FXIa из раствора иммуноглобулина находилась в диапазоне 0,7–1,5 мл/мин (в этом же диапазоне наблюдали и наивысшее процентное отношение удаления FXIa). Анализ тромбинообразования показал, что оптимальная скорость потока для удаления FXIa из раствора иммуноглобулина (самый низкий полученный уровень тромбина в несвязанной фракции по сравнению с другими проверяемыми показателями скорости потока) составила 1,5 мл/мин.

Эти результаты указывают на то, что для дополнительного повышения эффективности удаления FXIa из раствора иммуноглобулина можно использовать скорость потока ниже 2,5 мл/мин, например скорость потока в диапазоне от 0,7 до 1,5 мл/мин (2–4,3 MV/мин), во время обработки раствора на катионообменной мембране.

Пример 4. Влияние уровня температуры раствора иммуноглобулина на эффективность удаления FXIa путем катионообменной хроматографии

Целью следующего эксперимента являлось изучение влияния уровня температуры раствора иммуноглобулина на удаление FXIa путем катионообменной хроматографии. С этой целью раствор иммуноглобулина уравновесили до следующих значений температуры: 7°C, комнатная температура (22±2) и 37°C. Начальный раствор иммуноглобулина был таким же раствором, который использовали в примере 2, а в качестве катионообменника использовали такую же мембрану Mustang® S.

Согласно результатам, полученным в примерах 2 и 3, до наполнения катионообменника раствором иммуноглобулина его pH регулировали до значения 4,2, затем наполнили катионообменник раствором иммуноглобулина со скоростью потока 1–1,5 мл/мин. Собственно хроматографию проводили при комнатной температуре (22 ± 2°C), 30 мл раствора иммуноглобулина, уравновешенного до разных значений температуры, добавляли в катионообменник.

Уровень FXIa измеряли в растворе иммуноглобулина до («Наполнение») и после («Несвязанная фракция») обработки растворов на катионообменнике. Как и в примере 3, оценку проводили с помощью флуорогенного способа и анализа тромбинообразования согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы». Результаты представлены ниже в таблице 5. В настоящем эксперименте значения тромбинообразования в материале для наполнения находились в диапазоне 251–292 нМ.

Таблица 5
Влияние уровня температуры раствора иммуноглобулина на эффективность катионообменника при удалении FXIa
Уровень температуры материала для наполнения (°C)	FXIa (нг/мл) Использование флуорогенного способа	Удаление FXIa (%)*	Тромбин (нМ) Использование анализа тромбинообразования
Наполнение	Несвязанная фракция	Несвязанная фракция
7	283,9	39,0	86,26	24,9
22 ± 2	283,5	45,1	84,09	25,2
37	274,2	49,2	82,05	59,7
* Рассчитано путем сопоставления уровней FXIa до («наполнение») и после («несвязанная фракция») обработки раствора на колонке.

Полученные результаты показывают, что все проверяемые уровни температуры привели к удалению FXIa из раствора иммуноглобулина (по сравнению с материалом для наполнения), при этом оптимальные значения температуры составляют от комнатной температуры (22 ± 2°C) до 7°C.

Пример 5. Влияние проведения второго этапа катионообменной хроматографии на удаление FXIa из раствора иммуноглобулина

Целью следующего эксперимента являлось изучение влияния проведения второго этапа катионообменной хроматографии на дополнительное повышение уровня удаления FXIa из раствора иммуноглобулина.

Начальный раствор иммуноглобулина был таким же, как и раствор в примере 2. В следующем эксперименте 2600 мл раствора перенесли в капсулу Mustang® S с MV в 10 мл (Pall; номер по каталогу CLM05MSTGSP1); значение pH раствора для наполнения регулировали до 4,2; фильтрование проводили при комнатной температуре (22±2°C) со скоростью потока 30 мл/мин (= 3 MV/мин). Температура раствора для наполнения составляла 22±2°C.

Собрали шесть фракций фильтрата (400 мл на фракцию) и измеряли уровень FXIa с помощью анализа тромбинообразования согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы». На следующем этапе собрали все шесть фракций фильтрата, свели в общий пул и провели второй этап фильтрования сквозь новую капсулу Mustang® S (MV=10 мл). Снова собрали шесть фракций фильтрата (400 мл на фракцию) и измеряли уровень FXIa с помощью анализа тромбинообразования. Результаты материала для наполнения и всех фракций фильтрата (1–6) на каждом этапе фильтрования представлены в таблице 6. Кроме того, чтобы оценить восстановление IgG, общее восстановление белка измеряли после второго этапа катионообменной хроматографии.

Таблица 6
Влияние проведения второго этапа катионообменной хроматографии на удаление FXIa из раствора иммуноглобулина
Фильтрование первой капсулой
Образец	Тромбин (нМ) Использование анализа тромбинообразования
Материал для наполнения	248,6
Несвязанная (UB) фракция 1	0,0
UB фракция 2	15,2
UB фракция 3	40,0
UB фракция 4	62,5
UB фракция 5	84,8
UB фракция 6	121,5
Фильтрование второй капсулой
Материал для наполнения	74,9
UB фракция 1	0,3
UB фракция 2	0,0
UB фракция 3	0,0
UB фракция 4	2,1
UB фракция 5	0,0
UB фракция 6	0,0

Было отмечено, что проведение второго этапа фильтрования привело к повышенному удалению FXIa из раствора иммуноглобулина по сравнению с проведением одного этапа фильтрования. Также было продемонстрировано, что второе фильтрование не изменило высокие показатели восстановления IgG (общее восстановление белка в размере 91,6% было достигнуто после второго этапа фильтрования).

Эти результаты показывают, что для достижения максимального удаления FXIa из раствора иммуноглобулина с одновременным существенным сохранением уровней IgG можно подвергать раствор катионообменной хроматографии более одного раза.

Пример 6. Эффективность колоночной аффинной хроматографии в процессе удаления FXIa из раствора иммуноглобулина

В примерах 1–5 было показано, что катионообменная хроматография была эффективным этапом в удалении FXIa из раствора иммуноглобулина в диапазоне pH от 3,8 до ниже 6. В следующем примере изучали эффективность колоночной аффинной хроматографии при удалении FXIa. В качестве колонки для аффинной хроматографии использовали колонку с бензамидин-сефарозой (бензамидин сефароза связывает серин-протеазы, в частности, FXIa).

Для этой цели раствор иммуноглобулина подготовили в соответствии с этапами a-c, описанными в разделе «Материалы и способы». На следующем этапе колонку для аффинной хроматографии наполнили раствором. Для аффинной хроматографии были использованы следующие условия: 120 мл раствора налили в колонку; процесс проводили при комнатной температуре (22±2ºC); значение pH раствора иммуноглобулина составляло 7,4; использовали скорость потока текучей среды 1,3 мл/мин; температура обрабатываемого раствора составляла 22±2°C. Колонку подготовили в соответствии с инструкциями производителя - 5 мл бензамидин-сефарозы (GE healthcare; номер по каталогу 17-5123-01) поместили внутрь колонки диаметром 1 см (Bio-Rad). До использования колонку промыли 5 объемами колонки дистиллированной воды и уравновесили 5 объемами колонки буфера (50 мМ цитрата и 0,2 M NaCl), pH 7,4.

Собрали три образца фильтрата (40 мл на фракцию) и измеряли уровень FXIa в материале для наполнения и образце фильтрата с помощью флуорогенного способа согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы». Результаты представлены ниже в таблице 7.

Таблица 7
Влияние колоночной аффинной хроматографии с использованием парааминобензамидина на удаление FXIa из раствора иммуноглобулина
Образец	FXIa (нг/мл) Использование флуорогенного способа
Материал для наполнения	363,9
Несвязанная (UB) фракция 1	90,6
UB фракция 2	267,1
UB фракция 3	290,5

В первой несвязанной (UB) фракции была отмечена способность колонки эффективно связывать FXIa. Однако во второй и третьей несвязанных фракциях в растворе иммуноглобулина был обнаружен FXIa в высоких количествах.

Эти результаты показывают, что в используемых условиях аффинная хроматография с использованием бензамидин-сефарозы не подходит для эффективного удаления FXIa из раствора иммуноглобулина.

В вышеописанном эксперименте было обнаружено, что в проверяемых условиях аффинная колонка с бензамидин-сефарозой является неэффективной для удаления FXIa. В следующей серии экспериментов проверяли гепарин-аффинную хроматографию (проверяли способность гепарина связывать FXI и FXIa). В настоящем эксперименте оценивали влияние различных уровней pH (в диапазоне 5,3–8) раствора иммуноглобулина.

Для осуществления этой цели раствор иммуноглобулина готовили в соответствии с этапами (a)–(c), описанными выше в разделе «Материалы и способы». На следующем этапе значение pH раствора регулировали с помощью 0,5 N NaCl или 0,1 N NaOH до получения желаемого проверяемого значения pH; 150 мл каждого раствора иммуноглобулина с разными значениями pH подвергли гепарин-аффинной хроматографии.

Подготовка колонки: 8 мл гепариновой смолы Capto (GE Healthcare) поместили внутрь колонки диаметром 1 см (Bio-Rad), что позволило достичь слоя высотой 10 см. Хроматографию проводили при комнатной температуре (22±2°C) со скоростью потока 2 мл/мин. Температура раствора для наполнения составляла 22±2°C. Колонку уравновесили до наполнения раствором иммуноглобулина с помощью 40 мл 50 мМ цитратного буфера с уровнем pH, соответствующим уровню pH раствора иммуноглобулина для наполнения (т.е. уровень pH 5,3, 6,5, 7,4 и 8).

Собрали четыре фракции фильтрата (40 мл на фракцию) и оценивали уровень FXIa в материале для наполнения и в фракциях фильтрата с помощью описанного выше флуорогенного способа. Результаты представлены ниже в таблице 8.

Таблица 8
Влияние гепарин-аффинной хроматографии, проводимой при различных уровнях pH раствора иммуноглобулина, на эффективность удаления FXIa из раствора
Уровень pH материала для наполнения	Образец	FXIa (нг/мл) Использование флуорогенного способа
5,3*	Наполнение	192,87
	Несвязанная (UB) фракция 1	25,51
	UB фракция 2	28,92
	UB фракция 3	40,85
UB фракция 4	201,48
6,5	Наполнение	201,8
	Несвязанная (UB) фракция 1	38,7
	UB фракция 2	47,9
	UB фракция 3	55,2
UB фракция 4	190,4
7,4	Наполнение	214,2
	UB фракция 1	51,0
	UB фракция 2	64,6
	UB фракция 3	107,0
UB фракция 4	159,6
8	Наполнение	209,9
	UB фракция 1	65,4
	UB фракция 2	78,7
	UB фракция 3	112,7
UB фракция 4	167,0
* При значении pH 5,3 использовали следующие условия (вместо условий, определенных для всех других уровней pH): использовали 8 мл гепарина Hyper DM (GE Healthcare Life Sciences); объем наполнения составил 125 мл. До наполнения провели уравновешивание с помощью 40 мл буфера (содержащего 50 мМ цитрата и 0,2 M NaCl при pH 7,4) со скоростью потока текучей среды 2 мл/мин.

В целом было отмечено, что связывание FXIa с гепариновой смолой было улучшено путем снижения значения pH раствора иммуноглобулина. Лучшие результаты были получены по первым трем несвязанным фракциям самого низкого значения pH (5,3). Однако после приблизительно 15-го объема колонки FXIa собирается в фильтрате (было обнаружено относительно большое количество FXIa в несвязанных фракциях 4, pH 5,3).

Пример 7. Влияние уровня pH раствора иммуноглобулина на эффективность анионообменной хроматографии для удаления PKA из раствора

Целью следующего эксперимента являлось определение влияния уровня pH раствора иммуноглобулина на удаление PKA из раствора с помощью анионообменника.

В настоящем эксперименте оценивали влияние диапазона уровней pH 6,4–8,2. Уровень pH раствора измеряли с помощью устройства для электронного мониторинга pH.

Колонку-DEAE (Toyopearl DEAE-650M; TOSOHAAS) использовали в качестве анионообменника. Использовали 11 мл смолы. Диаметр колонки составлял 1 см, а высота слоя была 14 см.

В настоящем эксперименте раствор иммуноглобулина приготовили из пасты II и подвергли его фильтрованию способом CUNO, описанным выше в разделе «Материалы и способы» (использовали раствор иммуноглобулина после этапа b). На следующем этапе уровень pH раствора регулировали с помощью 0,5 N HCl или 0,5 N NaOH до получения желаемого проверяемого уровня pH (диапазона pH 6,4–8,2); 200 мл каждого полученного раствора иммуноглобулина подвергли анионообменной хроматографии (этап c) подготовки раствора иммуноглобулина, описанной в разделе «Материалы и способы») (во всех экспериментах анионообменной хроматографией обрабатывали 200 мл вещества с содержанием белка приблизительно 70 мг/мл). Этап хроматографии проводили при 8°C; температура раствора иммуноглобулина для наполнения составляла 8°C; использовали линейную скорость потока текучей среды 1,65 мл/мин/см².

В примерах 7–11 такой же раствор иммуноглобулина использовали в качестве материала для наполнения («Наполнение»), т.е. уровень PKA материала для наполнения был идентичен во всех экспериментах.

Уровень PKA и другие характеристики раствора иммуноглобулина, в частности, общее восстановление белка, распределение подклассов IgG, уровни титров антител против HBsAg и против дифтерии оценивали в «несвязанной» фракции (= после обработки растворов на анионообменнике). Оценку проводили согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы». Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9
Влияние уровня pH раствора иммуноглобулина на эффективность DEAE-колонки в удалении PKA
Уровень pH материала для наполнения
	Восстановление общего белка** (%)	Против HBsAg (мМЕ/мл)	PKA (МЕ/мл)	Распределение подклассов IgG (%)	Антитела против дифтерии (МЕ/мл)
IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
6,4	97	4762	14,4	НО	НО	НО	НО	НО
7,0	97	4884	< ПКО	62,9	29,5	6,7	0,9	6,1
7,6	95	3450	< ПКО	63,6	28,8	6,6	1,0	5,8
8,2	97	2481	< ПКО	64,7	28,7	5,7	0,9	5,3
* НО - не определяется; ПКО - предел количественного определения - <6. ** Общее восстановление белка (%) рассчитывали путем сопоставления содержания белка (биуретовым способом) до и после обработки раствора на колонке.

Результаты показали, что низкий уровень pH 6,4 приводил к повышенному содержанию PKA в восстановленном растворе IgG по сравнению с более высокими уровнями pH. Также результаты показали, что уровень pH в диапазоне 7–8,2 (диапазон, в котором PKA имеет нулевой чистый электрический заряд, поэтому от него ожидают связывания с положительно заряженными группами) приводил к повышенной способности анионообменника удалять PKA (уровень PKA был ниже предела количественного определения). Кроме того, результаты показали, что диапазон значений pH 7–8,2 также приводил к более высоким показателям восстановления белка в несвязанной фракции (уровень pH, при котором IgG имеет чистый нулевой или отрицательный заряд, поэтому ожидали, что какая-либо его часть будет связываться с анионообменником) (восстановление белка было достигнуто в диапазоне 95-100%), в неизмененных характеристиках распределения подклассов IgG [типичное распределение подклассов IgG (IgG1 - приблизительно 65%, IgG2 - приблизительно 30%, IgG3 - приблизительно 6% и IgG4 - приблизительно 1%), и типичные титры антител против HBsAg (в диапазоне 2000–5000 мМЕ/мл) и против дифтерии (приблизительно 6 МЕ/мл)].

Эти результаты показывают, что для эффективного удаления PKA из раствора во время обработки на анионообменнике уровень pH раствора иммуноглобулина должен составлять от 7 до 8,2.

Пример 8. Влияние уровня температуры на удаление PKA из раствора иммуноглобулина с помощью анионообменной хроматографии

Целью следующего эксперимента являлось определение влияния уровня температуры раствора иммуноглобулина на удаление PKA из раствора с помощью анионообменника. Оценивали растворы иммуноглобулина, уравновешенные до следующих температур: 2, 8, 14 и 20°C. Использованный начальный раствор иммуноглобулина (материал для наполнения) и DEAE-колонка были такими же, как в примере 7. Собственно этап хроматографии проводили при 8°C; использовали линейную скорость потока текучей среды 1,65 мл/мин/см² и уровень pH 7,5; объем для наполнения составлял 200 мл.

Уровень PKA и другие характеристики раствора иммуноглобулина (такие же параметры, как указано выше) оценивали в несвязанной фракции. Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10
Влияние температуры раствора иммуноглобулина на эффективность DEAE-колонки в удалении PKA
Уровень температуры материала для наполнения (°C)
	Восстановление общего белка (%)	PKA (МЕ/мл)	Против HBsAg (мМЕ/мл)	Распределение подклассов IgG (%)	Антитела против дифтерии (МЕ/мл)
IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
2	100	7,7	4616	НО	НО	НО	НО	НО
8	96	< ПКО	3222	65,4	27,0	6,5	1,1	6,4
14	97	< ПКО	3620	65,0	27,8	6,3	1,0	6,4
20	100	< ПКО	4970	64,1	27,8	7,0	1,1	6,4
* НО - не определяется; ПКО - предел количественного определения - <6.

Результаты показали, что наполнение раствором IgG низкой температуры 2°C приводило к повышенному содержанию PKA в восстановленной несвязанной фракции. Температура в диапазоне от 8 до 20°C приводила к оптимальному удалению PKA (уровень PKA был ниже предела количественного определения), с одновременным неизмененным содержанием IgG и характеристиками распределения подклассов IgG после этапа хроматографии с использованием DEAE, и типичными титрами антител против HBsAg и против дифтерии (см. типичные значения выше).

Пример 9. Влияние объема для наполнения раствора иммуноглобулина на эффективность анионообменной хроматографии в удалении PKA

Целью следующего эксперимента являлось определение влияния объема для наполнения раствора иммуноглобулина на удаление PKA из раствора с помощью анионообменника. Колонку наполнили следующими объемами: 12 объемов колонки (CV), 20 CV и 25 CV (объем смолы и подготовка колонки соответствуют использованным в примере 7). Фраза «12 объемов колонки» означает 12-кратный объем смолы (который был равен 11 мл).

Используемый начальный раствор иммуноглобулина (материала для наполнения) соответствовал использованному в примере 7; DEAE-колонку использовали в качестве анионообменника. Этап хроматографии проводили при 8°C; в соответствии с предыдущими примерами температура раствора иммуноглобулина для наполнения составляла 8°C при pH 7,5; линейная скорость потока текучей среды была равна 1,65 мл/мин/см².

Уровень PKA и другие характеристики раствора иммуноглобулина (такие же параметры, как указано выше) оценивали в несвязанной фракции. Результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11
Влияние увеличения объема для наполнения раствора иммуноглобулина на эффективность DEAE-колонки в удалении PKA
Объем для напол-нения (CV)
	Восстановление общего белка (%)	PKA (МЕ/мл)	Против HBsAg (мМЕ/мл)	Распределение подклассов IgG (%)	Против дифтерии (МЕ/мл)
IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
12	100	< ПКО	5107	63,2	29,2	6,6	1,0	6,5
20	93	< ПКО	3727	64,8	27,9	6,4	0,9	6,4
25	99	< ПКО	5329	66,6	26,0	6,4	1,1	6,1
* ПКО - предел количественного определения - <6.

Результаты показали, что во всех проверяемых объемах наполнения DEAE-колонка эффективно удалила PKA по существу без ущерба для восстановления белка (было достигнуто общее восстановление белка в диапазоне 93–100%), характеристик IgG (все значения сопоставимы с типичными значениями или титрами против дифтерии и против HBsAg (см. типичные значения в примере 7).

Пример 10. Влияние линейной скорости потока раствора иммуноглобулина во время его обработки анионообменной хроматографией на эффективность хроматографии в удалении PKA

В настоящем примере рассмотрено влияние линейной скорости раствора во время наполнения на эффективность анионообменной хроматографии в удалении PKA. Оценивали следующие линейные скорости: 1, 2, 3 и 4 см/мин/мл.

Использованный материал для наполнения и DEAE-колонка были такими же, как в примере 7. Этап хроматографии проводили при 8°C; температура раствора иммуноглобулина для наполнения составляла 8°C; pH был равен 7,5; объем для наполнения составлял 200 мл.

Уровень PKA и другие характеристики раствора иммуноглобулина (такие же параметры, как указано выше) оценивали в несвязанном материале. Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12
Влияние линейной скорости потока раствора иммуноглобулина на эффективность DEAE-колонки в удалении PKA
Линейная скорость материала для наполнения (см/мин/мл)
	Восстановление общего белка (%)	Против HBsA (мМЕ/мл)	PKA (МЕ/мл)	Распределение подклассов IgG (%)	Антитела Против Дифтерии (МЕ/мл)
IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
1	97	3870	< ПКО	65,5	27,4	6,1	1,0	5,3
2	96	3844	< ПКО	65,5	27,0	6,4	1,1	5,2
3	98	3739	11,2	НО	НО	НО	НО	НО
4	101	3751	8,6	НО	НО	НО	НО	НО
* НО - не определяется; ПКО - предел количественного определения - <6.

Результаты показали, что линейная скорость от 1 до 2 см/мин/мл была эффективной для удаления PKA из раствора иммуноглобулина без ущерба для восстановления белка и характеристик IgG. Более высокие значения линейной скорости (например, 3–4 см/мин/мл) приводили к более низким показателям удаления PKA.

Пример 11. Удаление тромбогенных агентов из раствора иммуноглобулина с помощью последовательной ионообменной хроматографии

Раствор иммуноглобулина приготовили из пасты II и подвергли его фильтрованию способом CUNO, описанным выше в разделе «Материалы и способы» (использовали раствор иммуноглобулина после этапа b). На следующем этапе раствор обработали на DEAE-колонке [(Toyopearl DEAE-650M; TOSOHAAS) (использовали 11 мл смолы; диаметр колонки составлял 1 см, высота слоя - 14 см)] в следующих условиях: этап хроматографии проводили при 8°C; температура раствора иммуноглобулина для наполнения была равна 8°C; линейная скорость потока текучей среды составила 1,65 мл/мин/см²; а уровень pH раствора иммуноглобулина для наполнения уравновесили до 7,5. Объем раствора для наполнения составлял 200 мл. Колонку уравновесили до наполнения раствором согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы».

Уровень PKA и другие характеристики раствора иммуноглобулина (см. выше) оценивали в «несвязанной» фракции (= после обработки растворов на анионообменнике). Измерения проводили согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы». Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13
Удаление PKA из раствора иммуноглобулина с помощью анионообменника
PKA (МЕ/мл)	Восстановление общего белка (%)	Против HBsAg (мМЕ/мл)	Подклассы IgG (%)	Против дифтерии (МЕ/мл)*
IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
< ПКО	100	4332	63,6	28,9	6,6	0,9	6,7
ПКО - предел количественного определения - <6.

Результаты показали, что в заданных условиях DEAE-колонка эффективно удалила PKA по существу без ущерба для восстановления белка (было достигнуто общее восстановление белка на 100), характеристик IgG (все значения сопоставимы с типичными значениями), титров против дифтерии и против HBsAg (см. типичные значения в примере 7).

После приведения в контакт раствора иммуноглобулина с анионообменником собранную несвязанную фракцию обработали согласно этапам d)–e) подготовки иммуноглобулина в соответствии с описанием, приведенным в разделе «Материалы и способы». На следующем этапе раствор подвергли обработке на катионообменнике в следующих условиях: уровень pH в диапазоне от 3,8 до 6; скорость потока ниже 2,5 мл/мин [например, скорость потока в диапазоне от 0,7 до 1,5 мл/мин (2–4,3 MV/мин)]; температура иммуноглобулиновой композиции для наполнения находилась в диапазоне от комнатной температуры (22±2°C) до 7°C.

Удаление FXIa оценивали в материале для наполнения («Наполнение») и после сбора раствора из колонки («Несвязанная фракция»). Измерения проводили с помощью анализа тромбинообразования и/или флуорогенного способа согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы».

Пример 12. Влияние SDR-колонки на удаление FXIa из раствора иммуноглобулина

Целью следующего эксперимента являлось определение способности SDR-колонки удалять FXIa из раствора иммуноглобулина.

Для этой цели раствор иммуноглобулина приготовили из пасты II в соответствии с этапами a)–e) способом, описанным в разделе «Материалы и способы». На следующем этапе раствор подвергли катионообменной хроматографии с помощью капсулы Mustang® S следующим образом (условия масштабирования):

До обработки раствора иммуноглобулина на катионообменнике раствор профильтровали сквозь 0,2 мкм СА-фильтр компании Corning (для уменьшения агрегатов). Фильтрование Mustang® проводили с помощью двух последовательно соединенных фильтров Mustang® S. До фильтрования Mustang® два фильтра отдельно промыли с помощью 30 кг 1 Н NaOH при скорости потока 2,1 л/мин (для обоих фильтров). В качестве второго промывания оба фильтра отдельно промыли с помощью 50 кг 1 Н NaCl при скорости потока 1,8 л/мин (для первого фильтра) или при скорости потока 2,1 л/мин (для второго фильтра). В заключение фильтры отдельно промыли с помощью 50 кг 20 мМ ацетата натрия (при pH 4,2) со скоростью потока 1,8 л/мин (для первого фильтра) или со скоростью потока 1,9 л/мин (для второго фильтра). Вышеуказанные промывания проводили с целью получения уровня pH 4,2. Все промывания проводили при давлении 0.

Фильтрование Mustang®: раствор иммуноглобулина фильтровали сквозь два промытых фильтра Mustang® S при скорости потока 1,6 л/мин. Собранный раствор иммуноглобулина (несвязанная фракция) составил 160 кг. Температура раствора для наполнения была равна 7°C, фильтр был комнатной температуры. Значение pH раствора иммуноглобулина для наполнения составило 4,2–4,3.

На следующем этапе фильтрат (несвязанную фракцию) подвергли обработке растворителем/моющим средством (Р/МС) и на SDR-колонке согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы».

Уровень FXIa измеряли в растворе до фильтрования раствора сквозь мембрану Mustang S (т.е. раствор иммуноглобулина, приготовленный согласно этапам a-e в соответствии с описанием, приведенным в разделе «Материалы и способы»), после фильтрования раствора сквозь мембрану Mustang S и после обработки растворов Р/МС + SDR-колонка.

Оценку проводили с помощью флуорогенного способа согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы». Результаты представлены ниже в таблице 14.

Таблица 14
Удаление FXIa из раствора иммуноглобулина с помощью SDR-колонки
FXIa (нг/мл) Использование флуорогенного способа	Проверяемый образец
529,4	До фильтрования Mustang S
37,6	После фильтрования Mustang S
3,9 (<LOD)	После обработки Р/МС + SDR-колонкой
* LOD - предел обнаружения.

Как показано в таблице 14, добавление обработки Р/МС и удаление Р/МС с помощью SDR-колонки приводит к удалению остаточных количеств FXIa.

Пример 13. Удаление калликреина из раствора иммуноглобулина с помощью капсулы Mustang® S (катионообменника)

Целью следующего эксперимента являлось определение способности капсулы Mustang® удалять калликреин из раствора иммуноглобулина.

С этой целью раствор иммуноглобулина приготовили из пасты II в соответствии с этапами a)–e) способом, описанным в разделе «Материалы и способы». На следующем этапе раствор обработали с помощью капсулы Mustang® S следующим образом (условия масштабирования):

До фильтрования Mustang® каждый фильтр предварительно отдельно промыли с помощью по меньшей мере 30 кг 1 Н NaOH со скоростью потока 1,6–2,3 л/мин. В качестве второго промывания каждый фильтр отдельно промыли с помощью по меньшей мере 50 кг 1 Н NaCl со скоростью потока 1,6–2,3 л/мин. В завершение каждый фильтр отдельно уравновесили с помощью 50 кг 20 мМ ацетата натрия (при pH 4,2) со скоростью потока 1,6–2,3 л/мин. Вышеуказанные промывания проводили с целью получения уровня pH 4,2. Все промывания проводили при давлении ≤0,1 МПа (1 бар.)

До обработки раствора иммуноглобулина на катионообменнике раствор профильтровали сквозь 0,2 мкм фильтр Durapore (Milipore) (для уменьшения агрегатов). Полученный раствор иммуноглобулина профильтровали сквозь две последовательно соединенные капсулы Mustang® S (предварительно промытые и уравновешенные согласно описанию выше).

Фильтрование Mustang®: раствор иммуноглобулина профильтровали сквозь две капсулы со скоростью потока 1,6–2,3 л/мин [было использовано приблизительно 160 кг (приблизительно 160 л) раствора иммуноглобулина; и приблизительно 70 мг/мл белка]. В общем было собрано приблизительно 160 кг раствора иммуноглобулина (приблизительно 160 л) (несвязанная фракция).

Температура раствора для наполнения составила приблизительно 7°C, фильтр был комнатной температуры; фильтрование проводили при комнатной температуре; значение pH раствора иммуноглобулина находилось в диапазоне 4,1–4,3.

Уровень удаления калликреина измеряли в растворе иммуноглобулина до («До фильтрования») и после фильтрования («После фильтрования») сквозь капсулу Mustang® S, и вычисляли процентное отношение удаления калликреина. Оценку проводили с помощью хромогенного способа согласно описанию, приведенному в разделе «Материалы и способы».

Для оценки восстановления IgG после фильтрования измеряли общее восстановление белка (%).

Полученное значение удаления калликреина представлено в таблице 15 ниже, полученное значение общего восстановления белка (%) представлено в таблице 16.

Таблица 15
Удаление калликреина с помощью фильтров Mustang® S
Образец	Vmax*	Калликреин (нг/мл)	Удаление (%)
До фильтрования	478,2	3760,6
После фильтрования	20,6	126,1	97%

Таблица 16
Восстановление белка после фильтрования Mustang® S
Образец	Общий белок (мг/мл)	Восстановление белка (%)
До фильтрования	65,4
После фильтрования	63,4	97%

Результаты показали, что в указанных условиях наполнение катионообменника раствором иммуноглобулина приводило к удалению калликреина на 97% с восстановлением 97% белка (IgG).

Пример 14. Испытание активности стимуляции тромбоза раствора иммуноглобулина, приготовленного в соответствии с настоящим изобретением, in vivo

Целью следующего эксперимента являлось изучение того, показывает ли раствор иммуноглобулина, из которого удалили калликреин, PKA и/или FXIa согласно предыдущим примерам, сниженную активность стимуляции тромбоза. Оценку проводили с помощью модели in vivo в соответствии с описанием, представленным в публикации Wessler et al. (Biologic assay of a thrombosis-inducing activity in human serum. J Appl Physiol. 1959 г.; 14:943–946).

Использование животной модели Весслера показало, что раствор иммуноглобулина после удаления PKA и/или FXIa в соответствии с настоящим изобретением демонстрирует снижение активности стимуляции тромбоза.

1. Способ удаления фактора XI, фактора XIa, калликреина и активатора прекалликреина (PKA) из содержащего иммуноглобулин раствора, включающий стадии: контактирования содержащего иммуноглобулин раствора, полученного в результате фракционирования по Кону и/или фракционирования по Кистлеру-Ничманну плазмы крови, содержащего фактор XI, фактор XIa, калликреин и PKA, с катионообменником, уравновешенным при pH в диапазоне от значений выше 3,8 до равных или ниже 5,3, для связывания фактора XI, фактора XIa и калликреина; и с анионообменником, уравновешенным при pH в диапазоне от 7 до 8,2, для связывания PKA с анионообменником; и сбора несвязанных фракций, содержащих иммуноглобулины.

2. Способ по п. 1, включающий доведение раствора до pH в диапазоне значений от выше 3,8 до равных или ниже 5,0.

3. Способ по п. 1, включающий доведение раствора до pH в диапазоне значений от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0.

4. Способ по п. 1, включающий доведение раствора до pH в диапазоне значений от выше 3,8 до равных или ниже 4,7.

5. Способ по п. 1, включающий доведение раствора до pH приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7.

6. Способ по п. 1, включающий доведение раствора до pH в диапазоне значений от выше 3,8 до равных или ниже 4,3.

7. Способ по п. 1, включающий доведение раствора до pH в диапазоне значений от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

8. Способ по п. 1, включающий доведение раствора до pH в диапазоне значений от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3.

9. Способ по п. 1, в котором раствор приводят в контакт с катионообменником; собирают несвязанную фракцию I; несвязанную фракцию I дополнительно приводят в контакт с катионообменником с таким же значением pH; и собирают несвязанную фракцию II.

10. Способ по п. 1, в котором катионообменник представлен в форме хроматографического материала или хроматографической мембраны.

11. Способ по п. 10, в котором материал катионообменника или мембраны является гидрофильным и выбран из группы, состоящей из агарозы, сефарозы, акриловых гранул, целлюлозы, стекла с контролируемым размером пор, силикагеля и декстранов; или гидрофобным и выбран из группы, состоящей из смол или органических синтетических полимеров, выбранных из группы, состоящей из материалов или мембран на основе полиакриламидов или полистиролов.

12. Способ по п. 1, в котором отрицательно заряженные группы иммобилизованы на катионообменнике посредством линкера, присутствующего между катионообменником и отрицательно заряженными группами.

13. Способ по п. 12, в котором линкер выбран из группы, состоящей из белка, аминокислоты и пептида.

14. Способ по п. 1, в котором катионообменник химически модифицирован.

15. Способ по п. 1, в котором катионообменник представляет собой слабый или сильный катионообменник.

16. Способ по п. 1, в котором на катионообменнике иммобилизованы отрицательно заряженные группы, выбранные из группы, состоящей из производных сульфоновой кислоты и других серосодержащих кислот, муравьиной кислоты и других карбоновых кислот, фосфорной и других фосфорсодержащих кислот, нитратов и других азотсодержащих кислот и их комбинаций.

17. Способ по п. 16, в котором иммобилизованные отрицательно заряженные группы представляют собой серосодержащие кислоты.

18. Способ по п. 17, в котором серосодержащие кислоты представлены сульфопропилом.

19. Способ по п. 16, в котором иммобилизованные отрицательно заряженные группы представляют собой карбоновые кислоты.

20. Способ по п. 19, в котором карбоновые кислоты представлены карбоксиметилом.

21. Способ по п. 9, дополнительно включающий стадии регулирования pH несвязанной фракции I или несвязанной фракции II до значений pH в диапазоне от 7 до 8,2; приведения в контакт несвязанной фракции I или несвязанной фракции II с анионообменником со значениями pH в диапазоне от 7 до 8,2.

22. Способ по любому из пп. 1-21, в котором на анионообменнике иммобилизованы положительно заряженные группы, выбранные из группы, состоящей из аммония, алкиламмония, диалкиламмония, триалкиламмония, четвертичного аммония, алкильных групп, H⁺, Na⁺, K⁺, Са²⁺, Mg²⁺, функциональной аминогруппы и их комбинаций.

23. Способ по п. 22, в котором иммобилизованные положительно заряженные группы представлены четвертичным аммонием.

24. Способ по п. 23, в котором четвертичный аммоний представляет собой диэтиламиноэтил (DEAE).

25. Способ по п. 1, включающий приведение в контакт раствора, содержащего иммуноглобулин, сначала с анионобменником, уравновешенным при pH в диапазоне от 7 до 8,2; сбор несвязанной фракции I', содержащей иммуноглобулины; регулирование pH несвязанной фракции I' до значений в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3; и приведение в контакт несвязанной фракции I' с катионообменником, уравновешенным при pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,3, и сбор несвязанной фракции I'', содержащей иммуноглобулины.

26. Способ по п. 25, в котором pH несвязанной фракции I' доводят до значений от выше 3,8 до равных или ниже 5,0, а катионообменник уравновешивают при pH в диапазоне значений от выше 3,8 до равных или ниже 5,0.

27. Способ по п. 25, в котором pH несвязанной фракции I' доводят до значений от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0, а катионообменник уравновешивают при pH в диапазоне значений от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0.

28. Способ по п. 25, в котором pH несвязанной фракции I' доводят до значений от выше 3,8 до равных или ниже 4,7, а катионообменник уравновешивают при pH в диапазоне значений от выше 3,8 до равных или ниже 4,7.

29. Способ по п. 25, в котором pH несвязанной фракции I' доводят до значений приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7, а катионообменник уравновешивают при pH приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7.

30. Способ по п. 25, в котором pH несвязанной фракции I' доводят до значений от выше 3,8 до равных или ниже 4,3, а катионообменник уравновешивают при pH в диапазоне значений от выше 3,8 до равных или ниже 4,3.

31. Способ по п. 25, в котором pH несвязанной фракции I' доводят до значений от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3, а катионообменник уравновешивают при pH в диапазоне значений от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

32. Способ по п. 25, в котором pH несвязанной фракции I' доводят до значений от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3, а катионообменник уравновешивают при pH в диапазоне значений от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3.

33. Способ по любому из пп. 1-21, в котором анионообменник представляет собой колонку, и приведение в контакт раствора с анионообменником проводят при линейной скорости в диапазоне от 1 до 2 мл/мин/см², при этом температура содержащего иммуноглобулин раствора находится в диапазоне от 2 до 22°C.

34. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадии приведения в контакт раствора и хроматографического материала, содержащего трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер, до приведения в контакт с катионообменником; и сбора несвязанной фракции III.

35. Способ по п. 1 или 21, дополнительно включающий стадии приведения в контакт несвязанной фракции I', несвязанной фракции I или несвязанной фракции II, с хроматографическим материалом, содержащим трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер; и сбора несвязанной фракции III.

36. Способ по любому из пп. 1-21, в котором анионообменник представляет собой слабый или сильный анионообменник.

37. Способ получения иммуноглобулиновой композиции, который включает стадии: а) контактирования содержащего иммуноглобулин раствора, полученного в результате фракционирования по Кону и/или фракционирования по Кистлеру-Ничманну плазмы крови, содержащего фактор XI, фактор XIa, калликреин и PKA, с анионообменником, уравновешенным при значениях pH в диапазоне от 7 до 8,2, и катионообменником, уравновешенным при значениях pH от выше 3,8 до равных или ниже 5,3, чтобы обеспечить возможность активатору прекалликреина (PKA) связаться с анионообменником, а фактору XI, фактору XIa и калликреину связаться с катионообменником; и b) сбор не связавшихся фракций, включающих иммуноглобулин.

38. Способ по п. 37, в котором катионообменную хроматографию проводят дважды.

39. Способ по п. 37 или 38, в котором катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 5,0.

40. Способ по п. 37 или 38, в котором катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 5,0.

41. Способ по п. 37 или 38, в котором катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,7.

42. Способ по п. 37 или 38, в котором катионообменную хроматографию проводят при значениях pH приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6 или 4,7.

43. Способ по п. 37 или 38, в котором катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от выше 3,8 до равных или ниже 4,3.

44. Способ по п. 37 или 38, в котором катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,0 до равных или ниже 4,3.

45. Способ по п. 37 или 38, в котором катионообменную хроматографию проводят при значениях pH в диапазоне от равных или выше 4,1 до равных или ниже 4,3.

46. Способ по п. 37 или 38, дополнительно включающий отрицательную хроматографию с использованием хроматографического материала, содержащего трехмерный поперечносшитый гидрофобный акриловый полимер, которую осуществляют до, после или между анион- или катионобменной хроматографией и сбором несвязанной фракции.

47. Способ по п. 37 или 38, в котором катионообменник представлен в форме мембраны.

48. Способ по п. 37 или 38, в котором катионообменник содержит функциональную сульфоновую группу.

49. Иммуноглобулиновая композиция для лечения пациента с иммунодефицитом, воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием или острой инфекцией, полученная из крови или фракций крови, содержащая 4-10% общего белка, полученная в результате удаления фактора XI, фактора XIa и калликреина и активатора прекалликреина (PKA) из содержащего иммуноглобулин раствора и сбора несвязанных фракций, содержащих иммуноглобулины, в соответствии со способом по любому из пп. 37-48.