Терапевтические собачьи иммуноглобулины и способы их применения

Изобретение относится к области биохимии. Представлены антитело и слитый белок для применения в терапевтическом лечении собаки, содержащие специфичные изотипы тяжелой цепи. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи минимизирует активацию эффекторных функций иммунной системы при связывании антитела или слитого белка с целевым антигеном. Также предложены способы очистки указанного антитела и указанного слитого белка. Изобретение может быть использовано для лечения патологических состояний, таких как боль, воспалительные состояния и раковые состояния у собаки. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 пр.

 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к собачьим или собачьего происхождения антителам, которые имеют специфичные константные участки тяжелых цепей, для применения в качестве антагонистов растворимых внеклеточных медиаторов и/или рецепторов клеточной поверхности. Настоящее изобретение относится к терапевтическому применению антител или их фрагментов в способах селективного лечения состояний, таких как воспаление, боль, злокачественное заболевание или инфекция у собаки.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Рекомбинантные иммуноглобулины и слитые белки, сконструированные с использованием фрагментов константных доменов иммуноглобулинов, применяют для лечения многих заболеваний человека, в том числе воспалительных заболеваний (например, ревматоидного артрита, псориаза, воспалительного заболевания кишечника), аллергий (например, астмы), злокачественных заболеваний (например, лимфомы, рака молочной железы, колоректального рака), инфекционных заболеваний (например, инфекции RSV), боли (например, боли при остеоартрите, боли при злокачественном заболевании, боли в пояснице) и глазного заболевания (например, возрастной дегенерации желтого пятна).

Молекулярные цели для терапии предусматривают цитокины и хемокины (например, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-5 (IL-5), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), факторы роста (например, фактор роста нервов (NGF), фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF), фактор некроза опухолей (TNF)), рецепторы клеточной поверхности (например, HER-2, VEGFR, EGFR, CD20), связанные с клеточной поверхностью факторы роста (например, непроцессированный фактор некроза опухоли), вирусы (например, RSV) и компоненты каскада комплемента (например, С5). Известны многие другие цели, для которых доказано участие в процессах заболевания (например, описанные в версии 1.3.1 базы данных IMGT/MAb-DB от 14 декабря 2011 г. (URL: www.imgt.org/mAb-DB/query), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки).

Нативные иммуноглобулины продуцируются в виде различных основных подтипов, включающих иммуноглобулин G (IgG), иммуноглобулин A (IgA), иммуноглобулин М (IgM) или иммуноглобулин Е (IgE), и в ответ на инфекцию эти иммуноглобулины выполняют различные роли в узнавании патогена посредством связывания с целевыми антигенами, нейтрализации, разрушения и удаления. Иммуноглобулин G вырабатывается в виде нескольких различных изотипов (также известных как изоформы), таких как (у людей) IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Эти изотипы антител варьируют по структуре, в особенности, в отношении различий в аминокислотных последовательностях константного участка, особенно, вокруг шарнирного участка константного домена (Fc) между доменами С1 и С2.

Различные изотипы антител также отличаются по отношению к последующим эффекторным функциям, которые антитело опосредует. Например, последовательность константного участка антитела может опосредовать сильное влияние на характеристики, такие как эффекторные функции (ADCC, фиксирование и активацию комплемента), фармакокинетические показатели и физические свойства антитела. Антитела, характеризующиеся различными изотипами, также отличаются по их способности связываться с рецепторами Fc IgG на иммунных клетках. У людей IgG1 и IgG3 являются активными в вовлечении комплемента в обеспечение разрушения цели с помощью каскада ферментов комплемента в крови (CDC: зависимая от комплемента цитотоксичность), и, аналогичным образом, IgG1 и IgG3 связывают рецепторы Fc на иммунных клетках, которые нацеливают на связанный антиген для разрушения путем опосредованной антителом клеточной цитотоксичности (ADCC). Напротив, IgG2 и IgG4 не вовлекают комплемент или не активируют опосредованную ADCC атаку, а просто связываются с целевым антигеном с высокой аффинностью для того, чтобы ингибировать или нейтрализовать его активность.

Рекомбинантные иммуноглобулины и слитые белки, созданные из таковых, разработаны с учетом активности изотипа Fc, если целью является лечение заболевания. Например, при рассмотрении терапевтического подхода, который направлен на применение антител для целевого уничтожения раковых клеток человека, предпочтительным является конструирование рекомбинантного иммуноглобулина из доменов Fc изотипов IgG1 или IgG3, поскольку применение этих изотипов будет стимулировать иммуноопосредованные разрушительные механизмы, такие как CDC и ADCC. Напротив, при нацеливании растворимых медиаторов в контексте чувствительных тканей человека домен Fc либо упускают (например, при лечении человеческой возрастной дегенерации желтого пятна фрагменты Fab, нацеливающиеся на VEGF, являются предпочтительными), или конструируют с использованием доменов Fc IgG2 или IgG4 (например, нацеливание на фактор роста нервов в контексте невропатической или воспалительной боли, или на С5 комплемента при нефрите, псориазе или ревматоидном артрите). Эти принципы также применяют к иммуноглобулиновым слитым белкам, таким как растворимые слитые белки рецептора Fc TNF, при лечении состояний, таких как ревматоидный артрит, которое базируется на терапевтических средствах на основе Fc IgG1 человека.

У собак и других видов, таких как мыши и лошади, также существуют изоформы иммуноглобулина, но они характеризуются недостаточной гомологией между собой для определения a priori того, какая последовательность будет активной или неактивной в индуцировании последующих эффекторных функций, таких как CDC или ADCC. Более того, многочисленные иммуноглобулины у видов варьируют (например, у собаки имеется четыре иммуноглобулина IgG, которые определяют как caIgG-A, caIgG-B, caIgG-C и caIgG-D (Tang et al., 2001)). У лошадей имеется семь изотипов IgG (Wagner, 2006).

Только лишь анализом последовательности или гомологии последовательностей невозможно определить, будет ли конкретный изотип иммуноглобулина отличных от человека видов активным или неактивным в отношении опосредования связывания рецептора Fc и последующей эффекторной функции. Тем не менее, если это известно, эта информация будет иметь существенное значение, поскольку выбор изотипа константных участков для образования антитела может быть важным для обеспечения терапевтической эффективности антитела или терапевтических средств на основе антитела, таких как, связывающий фрагмент антитела или слитый белок.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

В результате глубокой экспериментальной работы автором настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что у изотипов собачьего иммуноглобулина IgG имеются общие характеристики с человеческими антителами IgG, такие, что некоторые изотипы антител IgG активны по отношению к активизации иммунных эффекторных функций, тогда как другие изотипы антител IgG не активируют иммунные эффекторные функции и являются, соответственно, неактивными. Более того, по отношению к четырем известным тяжелым цепям собачьих иммуноглобулинов (известным как НСА (caIgG-A), HCB (caIgG-B), HCC (caIgG-C) и HCD (caIgG-D)) автор настоящего изобретения неожиданно установил, что константные домены тяжелых цепей двух (caIgG-B и caIgG-C) из четырех тяжелых цепей собачьих иммуноглобулинов при конструировании в виде различных рекомбинантных форм, нацеливающихся на различные терапевтические цели, связывают комплемент, в то время как другие два (caIgG-A и caIgG-D) нет.

Соответственным образом, настоящее изобретение относится к определенным рекомбинантным собачим иммуноглобулинам или слитым белкам, созданным из них, которые могут быть использованы в терапии собак, если желательно разрушение цели (например, при лечении злокачественного или инфекционного заболевания), и к некоторым другим изоформам, которые могут быть предпочтительны для видов терапевтического лечения собак, если желательна скорее нейтрализация цели, а не уничтожение цели (например, при лечении боли).

Настоящее изобретение, таким образом, относится к рекомбинантным собачьим иммуноглобулинам, которые могут различаться по их способности или отсутствию способности связываться с первым компонентом каскада комплемента на основе изотипа их константного домена тяжелой цепи. В результате и впервые рекомбинантные собачьи иммуноглобулины могут быть отобраны по их предполагаемому применению в лечении заболевания у собак для задач, при которых предполагаемую цель отбирают для иммуноопосредованного разрушения через опосредованную комплементом цитотоксичность (CDC; например, для применения в уничтожении собачьих опухолей in vivo), или при которых цель отбирают просто для нейтрализации при отсутствии нежелательного иммуноопосредованного разрушения (например, в непосредственной близости от нервов или в глазу).

Первый аспект настоящего изобретения относится к антителу, слитому белку или их связывающему фрагменту для применения в терапевтическом лечении собаки, при этом указанное антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, при этом аминокислотная последовательность тяжелой цепи минимизирует активацию последующих эффекторных функций иммунной системы при связывании антитела, слитого белка или связывающего фрагмента с их целевым антигеном.

Согласно некоторым вариантам осуществления терапевтическое лечение собаки относится к лечению боли или воспаления, или ассоциированного с таковыми состояния, такого как артрит или артритическое состояние.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента, содержащих константный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, при этом аминокислотная последовательность тяжелой цепи минимизирует активацию последующих эффекторных функций иммунной системы, если антитело, слитый белок или связывающий фрагмент связываются с их целевым антигеном, в получении лекарственного препарата для применения в лечении боли или воспаления у собаки или ассоциированного с таковыми состояния, такого как артрит или артритическое состояние.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу лечения, подавления или облегчения боли или воспаления, или ассоциированного с таковыми состояния, такого как артрит или артритическое состояние, у собаки, нуждающейся в этом, предусматривающему стадии

- получения антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента, которые специфично связываются с целевым антигеном, которые обладают специфичной функцией в лечении или предотвращении боли или воспаления, при этом антитело, слитый белок или их связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, и при этом антитело, слитый белок или их связывающий фрагмент не активируют последующие эффекторные функции иммунной системы, и

- введения терапевтически эффективного количества антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента собаке.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к антителу собачьего происхождения, слитому белку или их связывающему фрагменту, которые имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, для применения в получении лекарственного препарата для лечения, подавления или облегчения боли или воспаления у собаки.

Согласно некоторым вариантам осуществления боль представляет собой невропатическую боль. В частности, боль может быть периоперационной, послеоперационной или болью после хирургического вмешательства. Послеоперационная боль может возникать после любой операционной процедуры, которая у собак может предусматривать без ограничения ортопедическое хирургическое вмешательство, хирургическое вмешательство на мягких тканях, овариогистерэктомические процедуры, кастрационные процедуры и т.п. Согласно определенным вариантам осуществления боль представляет собой хроническую боль, ассоциированную со злокачественным заболеванием или злокачественным состоянием (онкологическую боль). Согласно определенным вариантам осуществления боль ассоциируется с ревматоидным артритом, остеоартритом, воспалением или пруритом или возникает из-за таковых.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения артрита или артритического состояния у собаки, предусматривающему стадии

- получения антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента, которые специфично связываются с целевым антигеном, которые обладают специфичной функцией в лечении или предотвращении боли или воспаления, при этом антитело, слитый белок или их связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, и при этом антитело, слитый белок или их связывающий фрагмент не активируют последующих эффекторных функций иммунной системы, и

- введения терапевтически эффективного количества антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента собаке, нуждающейся в таком лечении.

Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутый способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, предусматривает стадию совместного введения по меньшей мере одного дополнительного средства, которое может усиливать и/или дополнять эффективность антитела в соответствии с настоящим изобретением. Например, антитело или его связывающий антиген фрагмент могут вводиться совместно с по меньшей мере одним анальгетическим средством, NSAID, опиоидным средством, кортикостероидом или стероидом. Примеры приемлемых анальгетиков включают без ограничения буторфанол, 10 бупренорфин, фентанил, флуниксин меглумин, мерпидин, морфин, налбуфин и их производные. Приемлемые NSAID включают без ограничения ацетаминофен, ацетилсалициловую кислоту, карпрофен, этодолак, кетопрофен, мелоксикам, фирококсиб, робенакоксиб, деракоксиб и т.п.

Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутые способы могут сопровождаться введением по меньшей мере одного дополнительного средства. Указанное средство может быть терапевтически активным средством, которым может быть одно или несколько из группы, выбранной из антибиотических, противогрибковых, антипротозойных, противовирусных или подобных терапевтических средств. Более того, по меньшей мере одно дополнительное средство может быть ингибитором медиатора(ов) воспаления, таким как антагонист PGE-рецептора, иммуносупрессивным средством, таким как циклоспорин, противовоспалительным глюкокортикоидом. В следующих определенных аспектах по меньшей мере одно дополнительное средство может быть средством, которое используется для лечения когнитивной дисфункции или расстройства, такого как потеря памяти, или родственных состояний, которые могут стать более распространенными у старых собак. Более того, по меньшей мере одно дополнительное средство может быть противогипертоническим или другим соединением, используемым для лечения сердечнососудистой дисфункции, например, для лечения гипертонии, ишемии миокарда, застойной сердечной недостаточности и т.п. Более того, по меньшей мере одно дополнительное средство может быть диуретиком, сосудорасширяющим средством, антагонистом бета-адренергического рецептора, ингибитором ангиотензин-II-превращающего фермента, блокатором кальциевых каналов и ингибитором редуктазы HMG-CoA.

Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых аспектов настоящего изобретения последующие эффекторные функции иммунной системы выбирают из группы, состоящей из зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC), зависимой от антитела опосредованной клеткой цитотоксичности (ADCC) и зависимого от антитела клеточного патогенеза (ADCP). Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислотная последовательность константного домена тяжелой цепи ингибирует связывание тяжелой цепи с C1q, которое предотвращает индукцию каскада комплемента и зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC).

Согласно некоторым вариантам осуществления целевой антиген является растворимым медиатором. Согласно некоторым вариантам осуществления целевой антиген является фактором роста нервов (NGF). Согласно некоторым вариантам осуществления антитело специфично связывается с рецептором и антагонизирует рецептор, который опосредует боль или воспаление. Согласно некоторым вариантам осуществления целевой антиген может быть выбран из группы, состоящей без ограничения из цитокинов или хемокинов (например, интерлейкина-1 и родственных интерлейкинов IL-2 - IL-35, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, эритропоэтина, тромбопоэтина, ингибирующего лейкоз фактора, цилиарного нейротрофического фактора, онкостатина М, факторов роста (например, фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофина-3, нейротрофина-4, сосудистого эндотелиального фактора роста клеток (VEGF), фактора некроза опухолей (TNF), рецепторов клеточной поверхности (например, HER-2, VEGFR, EGFR, CD20), связанных с клеточной поверхностью факторов роста (например, непроцессированного фактора некроза опухоли), вирусов (например, RSV) и компонентов каскада комплемента (например, С5, С5а).

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к антителу, слитому белку или их связывающему фрагменту для применения в терапевтическом лечении собаки, при этом указанное антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:14, при этом аминокислотная последовательность тяжелой цепи опосредует активацию последующих эффекторных функций иммунной системы при связывании антитела, слитого белка или связывающего фрагмента с целевым антигеном.

Согласно некоторым вариантам осуществления терапевтическое лечение собаки относится к лечению ракового или злокачественного состояния.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента, содержащих константный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:14, при этом аминокислотная последовательность тяжелой цепи опосредует активацию последующих эффекторных функций иммунной системы при связывании антитела, слитого белка или связывающего фрагмента с целевым антигеном, в получении медицинского препарата для применения в лечении ракового или злокачественного состояний у собаки.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения ракового или злокачественного состояния у собаки, предусматривающему стадии

- получения антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента, которые специфично связываются с целевым антигеном, которые обладают специфичной функцией в лечении ракового или злокачественного состояния, при этом антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:14, и при этом антитело, слитый белок или связывающий фрагмент активируют последующие эффекторные функции иммунной системы, и

- введения терапевтически эффективного количества антитела, слитого белка или связывающего фрагмента собаке, нуждающейся в таком лечении.

Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутый способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, предусматривает стадию совместного введения по меньшей мере одного дополнительного средства, которое может усиливать и/или дополнять эффективность антитела в соответствии с настоящим изобретением.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антитела собачьего происхождения, слитого белка или их связывающего фрагмента, которые имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:14, в получении медицинского препарата для лечения ракового или злокачественного состояний у собаки.

Согласно некоторым вариантам осуществления в вышеупомянутых аспектах настоящего изобретения последующие эффекторные функции иммунной системы выбирают из группы, содержащей зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC), зависимую от антитела опосредованную клеткой цитотоксичность (ADCC) и зависимый от антитела клеточный патогенез (ADCP). Согласно определенным вариантам осуществления аминокислотная последовательность константного домена тяжелой цепи обеспечивает связывание тяжелой цепи с C1q, что предотвращает индукцию каскада комплемента и зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC). Согласно некоторым вариантам осуществления константный домен тяжелой цепи обеспечивает связывание с рецепторами Fc, которые могут в свою очередь опосредовать ADCP и/или ADCC иммунные ответы.

Согласно некоторым вариантам осуществления целевой антиген представляет собой раковый специфичный антиген. Согласно следующим определенным вариантам осуществления настоящего изобретения целевой антиген может быть выбран из группы связанных с мембраной белков, экспрессированных на клетках опухоли собаки. Согласно следующим вариантам осуществления настоящего изобретения связанные с мембраной белки опухоли собаки могут быть выбраны из группы белков, включающих в себя CD2, CD4, CD8, CD20, EGFR, VEGFR, HER2 и т.п. Согласно следующим определенным вариантам осуществления целевой антиген может быть выбран из группы, состоящей без ограничения из цитокинов и хемокинов (например, интерлейкина-1 (IL-1), IL-2, IL-3 и интерлейкинов в числовом значении до IL-35, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, эритропоэтина, тромбопоэтина, ингибирующего лейкоз фактора, цилиарного нейротрофического фактора, онкостатина М), факторов роста (например, фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофина-3, нейротрофина-4, сосудистого эндотелиального фактора роста клеток (VEGF), фактора некроза опухолей (TNF)), рецепторов клеточной поверхности (например, HER-2, VEGFR, EGFR, CD20), связанных с поверхностью клеток факторов роста (например, непроцессированного фактора некроза опухоли), вирусов (например, RSV) и компонентов каскада комплемента (например, С5, С5а).

Еще один аспект настоящего изобретения относится к антителу, слитому белку или их связывающему фрагменту для применения в лечении состояния у собаки, при этом антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, который не связывается с C1q при связывании антитела, слитого белка или связывающего фрагмента с их целевым антигеном, и при этом антитело, слитый белок или связывающий фрагмент могут быть очищены с использованием хроматографии на основе белка А.

Согласно некоторым вариантам осуществления указанное антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам осуществления указанные антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:15.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антитела, слитого белка или связывающего фрагмента, которые содержат константный домен тяжелой цепи, который не связывается с C1q при связывании антитела, слитого белка или связывающего фрагмента со своим целевым антигеном, и при этом антитело, слитый белок или связывающий фрагмент могут быть очищены с использованием хроматографии на основе белка А, в получении медицинского препарата для лечения состояния, ассоциированного с болью и/или воспалением, у собаки.

Согласно некоторым вариантам осуществления указанные антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам осуществления указанные антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:15.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения, подавления или облегчения боли или воспаления, или ассоциированного с таковыми, состояния, такого как артрит или артритическое состояние, у собаки, нуждающейся в этом, предусматривающему стадии

- получения антитела, слитого белка или связывающего фрагмента, которые содержат константный домен тяжелой цепи, который не связывается с C1q при связывании антитела с его целевым антигеном, и при этом антитело может быть очищено с использованием хроматографии на основе белка А, и

- введения терапевтически эффективного количества антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента собаке.

Согласно некоторым вариантам осуществления указанное антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13. Согласно некоторым вариантам осуществления указанное антитело, слитый белок или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:15.

Различные другие аспекты настоящего изобретения относятся к (i) нуклеиновым кислотам, которые кодируют любые из вышеупомянутых антител, слитых белков или фрагментов антител в соответствии с настоящим изобретением, (ii) векторам, которые несут указанные нуклеиновые кислоты, (iii) клеткам-хозяевам, несущим указанные векторы. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения антител и слитых белков, определенных в вышеупомянутых формулировках настоящего изобретения. Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, которые содержат антитела или слитые белки в соответствии с настоящим изобретением вместе по меньшей мере с одним носителем, разбавителем или наполнителем.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантному антителу, слитому белку или их связывающему фрагменту, которые могут быть терапевтически введены собаке для специфичного связывания с целевым антигеном и которые, кроме того, опосредуют иммунный ответ, характеризующийся связыванием C1q комплемента с указанным антителом, слитым белком или их связывающим фрагментом и ассоциированный с зависимой от комплемента цитотоксичностью, при этом тяжелая цепь антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента содержит изотип В константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (НСВ, caIgG-В), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, изотип С константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (НСС, caIgG-C), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или изотип С тяжелой цепи агликозилированной формы собачьего иммуноглобулина (НСС, caIgG-C), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента, которые содержат изотип В константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (НСВ, caIgG-B), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, изотип С константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (НСС, caIgG-C), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или изотип С тяжелой цепи агликозилированной формы собачьего иммуноглобулина (НСС, caIgG-C), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, в получении медицинского препарата для применения в лечении состояния, при котором требуется специфичное связывание с целевым антигеном, и при котором желателен иммунный ответ, характеризующийся связыванием C1q комплемента с указанным антителом, слитым белком или их связывающим фрагментом и ассоциированный с зависимой от комплемента цитотоксичностью.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения ракового состояния у собаки, предусматривающему стадии

- получения иммуноглобулина, слитого белка или их связывающего фрагмента, которые обладают специфичностью связывания с опухолевым специфичным антигеном и которые, кроме того, содержат изотип В константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (НСВ, caIgG-B), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, изотип С константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (НСС, caIgG-C), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или изотип С тяжелой цепи агликозилированной формы собачьего иммуноглобулина (НСС, caIgG-C), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и

- введения терапевтически эффективного количества иммуноглобулина, слитого белка или связывающего фрагмента собаке, нуждающейся в этом.

Различные следующие аспекты настоящего изобретения относятся к антителам или слитым белкам, которые связываются с желаемым целевым антигеном и которые содержат константные домены тяжелых цепей, не связывающиеся с C1q, и которые, следовательно, не опосредуют иммунный ответ с вовлечением зависимой от комплемента цитотоксичности.

Соответственным образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантному антителу, слитому белку или их связывающему фрагменту, которые могут быть терапевтически введены собаке для специфичного связывания с целевым антигеном, при этом константный домен антитела или слитого белка не связывается с C1q комплемента, и при этом тяжелая цепь константного домена содержит изотип А константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (НСА, caIgG-A), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, изотип D константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (HCD, caIgG-D), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, или изотип В константного домена тяжелой цепи агликозилированной формы собачьего иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 (НСВ*, caIgG-B).

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антитела, слитого белка или их связывающего фрагмента, которые содержат изотип А константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (НСА, caIgG-A), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, изотип D константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (HCD, caIgG-D), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, или изотип В константного домена тяжелой цепи агликозилированной формы собачьего иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 (НСВ*, caIgG-B), в получении медицинского препарата для применения в лечении состояния, при котором требуется специфичное связывание с целевым антигеном, и при котором не желателен иммунный ответ, характеризующийся связыванием C1q комплемента с указанными антителом, слитым белком или их связывающим фрагментом и ассоциированный с зависимой от комплемента цитотоксичностью.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения состояния у собаки, предусматривающему стадии

- получения иммуноглобулина, слитого белка или их связывающего фрагмента, которые характеризуются специфичностью связывания с опухолевым специфичным антигеном и которые, кроме того, содержат изотип А константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (НСА, caIgG-А), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, изотип D константного домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина (HCD, caIgG-D), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, или изотип В константного домена тяжелой цепи агликозилированной формы собачьего иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 (HCB*, caIgG-B), и

- введения терапевтически эффективного количества иммуноглобулина, слитого белка или связывающего фрагмента собаке, нуждающейся в этом.

Согласно некоторым вариантам осуществления агликозилированная форма константного домена, разработанная для конструирования антитела с отсутствующей CDC активностью, является аланин-замещенной агликозилированной формой тяжелой цепи НСВ, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 (обозначенной НСВ*). В различных других аспектах настоящего изобретения антитела, включающие тяжелые цепи НСА, HCD, или не обладающие активностью CDC агликозилированные формы НСА, НСВ или HCD (НСА*, НСВ* или HCD*: SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:15), направлены на собачьи факторы роста, гормоны, цитокины, хемокины или другие растворимые медиаторы, такие как компоненты каскада комплемента. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела, содержащие тяжелые цепи НСА, HCD или НСВ*, направлены на собачий фактор роста нервов (NGF) с целью нейтрализации биологической активности собачьего NGF у собак без индуцирования CDC.

Согласно конкретным вариантам осуществления вышеупомянутые аспекты настоящего изобретения относятся к антителу, являющемуся моноклональным антителом. Согласно следующим вариантам осуществления антитело является химерным антителом. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело является канинизированным антителом, то есть антителом, которое содержит аминокислотную последовательность, которая была деиммунизирована таким образом, что нейтрализующиеся антитела не будут продуцироваться снова при введении собаке. Как правило, константные домены тяжелых цепей антитела отбирают или модифицируют путем замещения или делеции аминокислот так, что константные домены не опосредуют последующие эффекторные функции. Согласно конкретным вариантам осуществления антитело может быть конъюгировано по меньшей мере с одной репортерной молекулой.

Согласно следующим конкретным вариантам осуществления по меньшей мере один остаток в константном домене антител или слитых белков в соответствии с вышеупомянутыми аспектами настоящего изобретения может быть замещен или подвергнут делеции для предотвращения гликозилирования остатка. Следующий аспект настоящего изобретения относится к константному домену тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина, который может быть слит полностью или частично с внеклеточным доменом рецептора цитокина или хемокина или другого трансмембранного белка (например, рецептора TNF), в соответствии с чем целый константный домен тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина или его фрагмент отбирают из группы НСА, HCD или НСВ*, если желательно, чтобы слитый белок собачьего внеклеточного домена и тяжелой цепи иммуноглобулина не активировал CDC (например, если слитые белки TNF и рецептора Fc разработаны для нейтрализации растворимого TNF), или константный домен тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина отбирают из группы НСВ, НСС или НСС*, если наоборот желательно, чтобы слитый белок собачьего внеклеточного домена и тяжелой цепи иммуноглобулина активировал CDC (например, если слитые белки TNF и рецептора Fc разработаны для уничтожения клеток воспаления, несущих ассоциированный с мембраной TNF).

Следующие аспекты настоящего изобретения относятся к слитым белкам собачьего рецептора Fc, которые могут быть выбраны из группы внеклеточных доменов связанных с мембраной рецепторов, обнаруженных на собачьих клетках, слитых с участками Fc домена тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина. Другой аспект настоящего изобретения относится к содержащим тяжелые цепи НСВ, НСС или НСС* антителам, направленным против CD20 для индуцирования CDC в собачьих экспрессирующих CD20 клетках, таких как клетки собачьей лимфомы, посредством связывания этих антител с CD20 на их поверхности.

Кроме того, предпочтительно чтобы канинизированные антитела не были перекрестно-реактивными к каким-либо другим эпигонам, присутствующим у собак, а также, чтобы не образовывались нейтрализующие антитела против антител в соответствии с настоящим изобретением при введении их собаке.

Согласно следующим конкретным вариантам осуществления в антителах или слитых белках в соответствии с настоящим изобретением могут быть выполнены модификации аминокислотной последовательности константных областей тяжелой цепи. Указанная модификация может предусматривать добавление, замещение или делецию одного или нескольких аминокислотных остатков. Указанные аминокислотные изменения, как правило, осуществляют, чтобы модифицировать функциональные характеристики антитела. Например, аминокислотная модификация может быть выполнена для предотвращения последующих эффекторных функций, опосредованных константными доменами антитела, например, путем предотвращения способности антитела связываться с рецепторами Fc, активировать комплемент или индуцировать ADCC. Кроме того, модификации могут быть выполнены на аминокислотных остатках шарнирной области константного домена тяжелой цепи для модификации периода полувыведения антитела из кровотока при введении его собаке.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к мультиспецифичным или мультивалентным антителам, содержащим антитело или связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением, соединенные или конъюгированные с другими антителами с различными специфичностями связывания, для применения в комбинированной терапии. Мультиспецифичное антитело содержит по меньшей мере одно антитело или связывающий фрагмент, специфичные к первому эпитопу, и по меньшей мере один связывающий участок, специфичный к другому эпитопу, присутствующему на антигене, или к другому антигену. Мультивалентное антитело содержит антитела или связывающие фрагменты антител, которые обладают специфичностью связывания к тому же эпитопу. Соответствующим образом, согласно конкретным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к слитому белку антитела, содержащему четыре или более Fv-участков или Fab-участков антител в соответствии с настоящим изобретением. Согласно следующим конкретным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к биспецифичному антителу, в котором антитело или его связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением связываются со вторым антителом или его связывающим фрагментом, которые обладают специфичностью связывания по отношению ко второй цели, при этом указанная цель не является первым антигеном. Такие мультивалентные, биспецифичные или мультиспецифичные антитела могут быть получены с помощью различных рекомбинантных способов, хорошо известных специалисту в данной области.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело, слитый белок или связывающий антиген фрагмент вводят собаке как часть вышеупомянутых способов с дозой от приблизительно 0,01 мг/кг массы тела до приблизительно 10 мг/кг массы тела, в частности, от 0,03 мг/кг массы тела до приблизительно 3 мг/кг массы тела.

Различные другие аспекты настоящего изобретения относятся к композиции, содержащей антитело, слитый белок или их связывающий фрагмент в соответствии с каким-либо вышеупомянутым аспектом настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция, кроме того, содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Согласно конкретным вариантам осуществления композиция также может содержать по меньшей мере одно анальгетическое средство, NSAID, опиоидное средство, кортикостероид или стероид.

Различные другие аспекты настоящего изобретения относятся к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует антитело, слитый белок или связывающие фрагменты антитела в соответствии с настоящим изобретением. Соответствующим образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует антитело, слитый белок или связывающий антиген фрагмент в соответствии с каким-либо из вышеупомянутых аспектов настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенная нуклеиновая кислота, кроме того, кодирует одну или несколько функционально связанных с ней регуляторных последовательностей.

Следующий аспект относится к вектору экспрессии, содержащему полинуклеотид, кодирующий вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи или константный домен тяжелой и/или легкой цепи в соответствии с настоящим изобретением. Согласно некоторым вариантам осуществления вектор экспрессии, кроме того, содержит одну или несколько регуляторных последовательностей. Согласно некоторым вариантам осуществления вектор представляет собой плазмиду или ретровирусный вектор. Еще один аспект относится к клетке-хозяину, включающей в себя вектор экспрессии в соответствии с вышеупомянутым аспектом настоящего изобретения. Следующий аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, которая продуцирует антитело в соответствии с каким-либо из вышеупомянутых аспектов настоящего изобретения.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу получения антитела или слитого белка в соответствии с настоящим изобретением, предусматривающему стадию культивирования клетки-хозяина в соответствии с вышеупомянутым аспектом настоящего изобретения для обеспечения экспрессии клеткой антитела. Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу получения антитела или слитого белка в соответствии с настоящим изобретением, предусматривающему стадии экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов/нуклеиновых кислот или векторов в соответствии с вышеупомянутыми аспектами настоящего изобретения, которые экспрессируют легкие и/или тяжелые цепи антител в соответствии с настоящим изобретением в приемлемой клетке-хозяине, извлечения экспрессированных полипептидов, которые могут быть экспрессированы в клетке-хозяине вместе или по отдельности в различных клетках-хозяевах, и выделения антител. Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу лечения, облегчения или подавления боли у собаки, предусматривающему стадию введения собаке эффективного количества полинуклеотида, который кодирует антитело или слитый белок с константным доменом тяжелой цепи, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 - SEQ ID NO:11.

Очистка собачьего антитела

В случае тех собачьих антител, с которыми желательной является нейтрализация цели при отсутствии нежелательной иммунной эффекторной активности, автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил, что нативные изоформы собачьих тяжелых цепей, у которых отсутствует активность CDC, также очень слабо связывают, если вообще связывают, белок A Staphylococcus, и, следовательно, этот общепринятый способ очистки антител не может быть использован в производстве. Автор настоящего изобретения описывает три пути преодоления данного ограничения - посредством применения альтернативных стратегий очистки и посредством мутации тяжелой цепи для предотвращения гликозилирования в ходе продуцирования. Автором настоящего изобретения согласно этим способам были получены очищенные антитела, и было продемонстрировано, что они обладают желаемыми свойствами, являясь безопасными и эффективными in vivo у собак без нежелательной иммуногенности.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу очистки иммуноглобулина собачьего происхождения или иммуноглобулина, или слитого белка, содержащего собачий константный домен тяжелой цепи изотипа А (НСА, caIgG-A), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, или константный домен тяжелой цепи изотипа D собачьего иммуноглобулина (HCD, caIgG-D), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, из исходной смеси, предусматривающему стадии

(i) получения исходной смеси, содержащей целевые иммуноглобулины или слитые белки,

(ii) подвержения исходной смеси анионообменной хроматографии;

(iii) подвержения исходной смеси хроматографии гидрофобного взаимодействия и

(iv) подвержения исходной смеси эксклюзионной хроматографии.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает стадию замены буфера в фосфатно-буферном солевом растворе. Как правило, способом получают очищенное антитело, которое фракционируется с высокой степенью чистоты и биоактивности.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу получения агликозилированной формы собачьего антитела, которое может быть очищено с помощью хроматографии на основе белка А.

Различные другие аспекты настоящего изобретения относятся к собачьему или собачьего происхождения антителу или слитому белку, полученным в соответствии с каким-либо из способов, определенных в настоящем документе, для применения в терапевтическом лечении собаки. Различные другие аспекты относятся к применению антитела против собачьего NGF в получении медицинского препарата для применения в лечении у собаки иммуноопосредованного состояния или ассоциированного с болью состояния.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу очистки иммуноглобулина собачьего происхождения или иммуноглобулина, или слитого белка, содержащих собачий константный домен тяжелой цепи изотипа А (НСА, caIgG-A), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, или константный домен тяжелой цепи собачьего иммуноглобулина изотипа D (HCD, caIgG-D), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, из исходной смеси, предусматривающему стадии

(i) получения исходной смеси, содержащей целевые иммуноглобулины,

(ii) подвержения исходной смеси аффинной хроматографии Capto adhere и

(iii) подвержения исходной смеси анионообменной хроматографии.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к антителу или слитому белку, полученному способом очистки в соответствии с вышеупомянутым аспектом настоящего изобретения, для применения в лечении собаки.

Краткое описание графических материалов

На фиг.1А и 1В показано эквивалентное связывание антител против NGF (экспрессированных в супернатанте трансфицированных клеток СНО), сконструированных с использованием четырех различных изотипов собачьих тяжелых цепей (НСА, НСВ, НСС, HCD) против мышиного NGF посредством ELISA (фиг.1А), и эквивалентное ингибирование возрастания NGF клеток TF-1 (фиг.1В).

На фиг.2 показано дифференцированное связывание комплемента с NGF-связанными изотипами антитела против собачьего NGF, измеренное посредством ELISA на основе антитела против C1q.

На фиг.3а и 3b показано связывание захваченных NGF гликозилированных и агликозилированных форм канинизированных моноклональных антител против NGF с комплементом, измеренное посредством ELISA на основе антитела против C1q.

На фиг.4 показано связывание захваченных NGF канинизированных моноклональных антител (Mab) против NGF, MAb против собачьего VEGF и химерного MAb против человеческого CD20/собачьего НСВ, с комплементом, измеренное посредством ELISA на основе антитела против C1q. В частности, на фиг.4А, 4В и 4С показано связывание комплемента с антителами, сконструированными с использованием различных изотипов собачьих тяжелых цепей. Канинизированные моноклональные антитела (MAb) были экспрессированы в клетках СНО и тестированы на их способность связывать C1q комплемента. На панели А показано сравнение канинизированных антител против NGF (caN-HCB, caN-HCC) с изотипами гуманизированных антител (huN-G1, huN-G4); на панели В показаны антитела против VEGF, сконструированные с изотипами собачьих НСА (caV-HCA) и НСВ (caV-HCB); на панели С показано сравнение антитела против CD20, сконструированного с использованием изотипа НСВ (mub-HCA), с изотипом мышиного IgG2a (muB-2a).

На фиг.5 показано относительное извлечение изотипов антител против NGF, очищенных с помощью белка А и выявленных с использованием собачьего поликлонального иммуноглобулина против NGF с помощью вестерн-блота. Супернатанты согласно фиг.1 пропускали через колонку с белком А и элюировали специфично связанный материал. Равные объемы элюата подвергали SDS-PAGE. Собачьи изотипы НСА, НСС и HCD слабо связывались с белком А, на что указывало наличие значительного материала при промывании и потоке через фракции. На фиг.А-D показано относительное извлечение собачьих изотипов антител НСА, НСВ, НСС и HCD с помощью белка A: L - загрузка; W - промывание; Р - очистка; F - пропускание потока. В этом эксперименте использовали супернатант с антителом против NGF согласно фиг.1.

На фиг.6А и 6B показана количественная очистка антитела против собачьего NGF (изотипа НСА) с использованием трехстадийного способа (способ I), предусматривающего (1) анионообменную хроматографию, (2) хроматографию гидрофобного взаимодействия и (3) эксклюзионную хроматографию. На фиг.6А показаны результаты фракционирования с помощью эксклюзионной HPLC. На фиг.6B показан восстанавливающий SDS-PAGE фракций после каждой стадии. На фиг.6С и D показана количественная очистка антител против собачьего NGF в соответствии с настоящим изобретением с использованием двухстадийного способа (способ II), предусматривающего хроматографию Capto adhere и анионообменную хроматографию. На фиг.6С показан анализ на основе SDS-PAGE при невосстанавливающих и восстанавливающих условиях. На фиг.6С дорожка 1 представляет MW, дорожка 2 представляет 2 мкг/мл антитела против собачьего NGF и 0 мкл восстанавливающего средства, дорожка 3 представляет 4 мкг/мл антитела против собачьего NGF и 0 мкл восстанавливающего средства, дорожка 4 представляет 6 мкг/мл антитела против собачьего NGF и 0 мкл восстанавливающего средства, дорожка 5 представляет MW, дорожка 6 представляет 2 мкг/мл антитела против собачьего NGF и 3 мкл восстанавливающего средства, дорожка 7 представляет 4 мкг/мл антитела против собачьего NGF и 3 мкл восстанавливающего средства, дорожка 8 представляет 6 мкг/мл антитела против собачьего NGF и 3 мкл восстанавливающего средства, и дорожка 9 представляет MW. На фиг.6D показана эксклюзионная хроматография очищенного антитела против собачьего NGF.

На фиг.7 показано сравнение антитела против собачьего NGF (изотипа НСА), очищенного способам I и II. На фиг.7А показано сравнение с помощью невосстанавливающего и восстанавливающего SDS-PAGE. На фиг.7B показано сравнение с помощью ELISA на основе антитела против NGF.

На фиг.8 показано, что масса (верхняя панель) и температура (нижняя панель) тела являются стабильными после внутривенного введения антител против собачьего NGF (изотипа НСА, очищенного способом I) у собак.

На фиг.9 показан кинетический анализ концентрации в плазме моноклонального антитела против собачьего NGF после внутривенной инъекции собакам. Собаку породы бигль инъецировали внутривенно антителом против NGF при 2 мг/кг, образцы плазмы брали в указанные моменты времени и моноклональное антитело против NGF выявляли с помощью ELISA на основе NGF. Моноклональное антитело против собачьего NGF характеризовалось неожиданно длинной (бета) фазой полувыведения, составляющей приблизительно 9 дней.

На фиг.10 показано, что моноклональные антитела против собачьего NGF (изотипа НСА, очищенные способом I) уменьшают воспалительную боль у собак. Каолин инъецировали в подушечку лапы собак породы бигль в день -1, антитело или контроль-носитель в день 0 и хромоту измеряли визуально с помощью шкалы оценок.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

После углубленной экспериментальной работы автор настоящего изобретения разработал и сконструировал несколько собачьих моноклональных антител с использованием различных изотипов константных доменов тяжелой цепи и неожиданно показал, что полезные свойства могут быть извлечены из их способности (или отсутствия способности) опосредовать последующие эффекторные функции и, в особенности, из их способности связываться с комплементом. Соответствующим образом, автор настоящего изобретения идентифицировал различные биологические эффекты, опосредуемые различными подтипами собачьего иммуноглобулина. Для связывающих комплемент изотипов собачьих антител этим полезным свойством является управление в клетках, связанных с теми же антителами, управляемой комплементом цитотоксичностью (CDC) in vivo. Примером того, когда желательно данное функциональное свойство, является противораковая терапия собаки, при которой антитела, направленные на опухолевые антигены, затем будут направлять систему комплемента на целевые клетки, которые были связанны с антителом, для уничтожения.

Напротив, изотипы антител, которые не связывают комплемент и поэтому не вызывают CDC, являются предпочтительными, если активность комплемента нежелательна, например, вблизи нервов, в глазу или в уже воспаленных тканях, или просто при желании снизить риск непредвиденных побочных проявлений антитела.

Таким образом, очевидно, что возможность предсказывать, какие собачьи изотипы являются приемлемыми для разработки и применения в методах лечения антителом у собак, является весьма желательной и полезной.

Были описаны четыре различных изотипа собачьего иммуноглобулина G (caIgG-А (изотип А собачьего иммуноглобулина G), caIgG-B, caIgG-C и caIgG-D, Tang et al., 2001). Для простоты (и для обеспечения отличия от различных конструкций антитела и от компонентов легкой цепи) константные домены тяжелых цепей называют в настоящем документе НСА (caIgG-A), HCB (caIgG-B), HCC (caIgG-C) и HCD (caIgG-D).

Очистка антител

Следующее неожиданное открытие было сделано автором настоящего изобретения в процессе очистки желаемых изоформ НСА и HCD антител против NGF, которые не связывались с белком А, лигандом, используемым в масштабах промышленного изготовления путем аффинной колоночной хроматографии на основе белка А, для проведения крупномасштабной очистки терапевтических белков. На фиг.5 показано относительное извлечение изоформ НСА, HCB, HCC и HCD антител против NGF с помощью аффинной хроматографии на основе белка А в небольшом масштабе. Следовательно, требовались другие способы для очистки изоформ НСА или HCD, поскольку они не могли быть очищены с использованием аффинной хроматографии на основе белка А. После углубленной экспериментальной работы автор настоящего изобретения неожиданно нашел два альтернативных способа (названных в настоящем документе способом I и способом II), которые могут быть использованы для очистки конструкции антитела caN-HCA-kLC или других собачьих антител, которые содержат изотип тяжелой цепи НСА или HCD.

Первый способ предусматривает объединение анионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия и эксклюзионной хроматографии. Второй способ предусматривает объединение аффинной хроматографии Capto adhere и анионообменной хроматографии. На фиг.6 показана очистка НСА, содержащего антитело против NGF, с помощью каждого из двух способов. Высоко чистый материал получали каждым способом, а с помощью обоих способов получали материал с подобной биоактивностью, измеренной с помощью ELISA на основе NGF (фиг.7). Поскольку изотипы НСА и HCD более похожи друг на друга, чем изотипы НСВ и НСС, способы применяют для обоих изотипов.

При дальнейшем изучении очистки антител автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил, что агликозилированная форма изотипа НСВ* антитела против NGF, подобно изотипу НСВ, все же способна связывать белок А, и поэтому обладает желаемым свойством отсутствия активности CDC и очищается с помощью хроматографии на основе белка А.

Тестирование безопасности для собаки

Для демонстрации того, что антитела в соответствии с настоящим изобретением, которые разрабатывали с учетом отсутствия нежелательной активности CDC, являются безопасными при введении собакам, высоко очищенный изотип НСА антитела против NGF инъецировали трем собакам путем внутривенной инъекции (после предварительного одобрения Комитетом по этике в отношении животных (CRL, Ирландия)). На фиг.8 показано, что помимо отсутствия поведенческих изменений при наблюдении ветеринарами у трех собак не проявлялись изменение массы или пирексия после инъекции изотипа НСА антитела (однократная доза 2 мг/кг).

Кинетические показатели антитела изотипа НСА в плазме у трех собак согласовывалась с двухфазным распределением и механизмом выведения, характеризующимся длинным периодом полувыведения бета, составляющим приблизительно 9 дней (фиг.9). Отсутствие быстрого выведения в течение 14 дневного периода наблюдения согласовывалось с отсутствием ответа с участием антитела против собачьего антитела. Напротив, константные домены тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина являются иммуногенными у собак и быстро выводятся из плазмы через приблизительно 8 или 9 дней после инфузии (Richter 1999, Drug Met. Disp. 27, 21-25).

Собачья модель воспаления

Все эксперименты выполняли после предварительного одобрения Комитетом по этике в отношении животных (CRL, Ирландия). Собакам породы бигль инъецировали (=дней-1) каолин в подушечку одной задней лапы для образования саморазвивающегося воспаления, начинающегося через приблизительно 24 часа и вызывающего временную хромоту у собак. В этой модели, как только первоначальный воспалительный ответ на каолин отступает, собаки все меньше хромают в течение периода приблизительно 1-2 недели, а затем полностью излечиваются.

Группам из 3 собак внутривенно инъецировали либо моноклональные антитела против собачьего NGF при 200 мкг/кг массы тела, либо фосфатно-солевой буферный раствор, в качестве контроля-носителя (=день 0). Собак оценивали на хромоту в течение 7 дней при помощи метода визуальной оценки (оценка 0 - отсутствие хромоты (полная опора на конечность); оценка 1 - небольшая хромота (неполная опора на конечность, но хорошее хождение); оценка 2 - умеренная хромота (слабая опора на конечность и плохое хождение), оценка 3 - тяжелая хромота (отсутствие опоры на конечность)). Наблюдателям не было известно, какие собаки получали какие инъекции.

Результаты представлены на фиг.10. Оценки хромоты снижались у собак, получавших моноклональные антитела против NGF, в день 3 после инъекции по сравнению с получавшими контроль-носитель, что указывает на то, что моноклональные антитела против NGF влияли на снижение боли у собак в большей степени, чем наблюдали только с носителем. Отсроченная активность согласуется с плазменными фармакокинетическими показателями моноклональных антител против собачьего NGF, которые демонстрировали медленную фазу тканевого распределения (альфа), составляющую приблизительно 30 часов, и относительно низкую васкуляризацию области подушечки лапы. Результаты, представленные на фиг.10, показывают, что антитела против собачьего NGF в соответствии с настоящим изобретением снижают воспалительную боль у собак с последующим уменьшением хромоты.

Взятые вместе описанные автором настоящего изобретения результаты показывают, что очищенные собачьи антитела, сконструированные с использованием CDC-неактивного изотипа НСА, безопасны и эффективны у собак и характеризуются желаемым длительным периодом полувыведения.

Все документы, на которые ссылается настоящее описание, включены в настоящий документ посредством ссылки. Для специалистов в данной области будет очевидно, что различные модификации и вариации описанных вариантов осуществления настоящего изобретения не выходят за границы объема настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение описано по отношению к определенным предпочтительным вариантам осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение не должно быть незаконно ограничено такими определенными вариантами осуществления. В действительности, различные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, которые очевидны для специалистов в данной области, должны быть охвачены настоящим изобретением.

Определения

Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины характеризуются значениями, обычно понимаемыми специалистом в области настоящего изобретения. Значение и сфера применения терминов должны быть ясными, однако, в случае какой-либо неясности приведенные в настоящем документе определения создадут прецедент по отношению к какому-либо словарному или не относящемуся к настоящему документу определению.

Во всем описании, если контекст не требует иного, термины «содержать» или «включать в себя» или вариации, такие как «содержит» или «содержащий», «включает в себя» или «включающий в себя», следует понимать как включение указанного целого значения или группы целых значений, но не исключение какого-либо другого целого значения или группы целых значений.

Используемые в настоящем документе термины в единственном числе включают в себя ссылки на единственное число и на множественное число, если в контексте четко не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «активное средство» или на «фармакологически активное средство» предусматривает одно активное средство, а также два или несколько различных активных средств в комбинации, так ссылки на «носитель» предусматривают смеси двух или более носителей, а также один носитель и т.п. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе должны предусматривать множественное число, а термины во множественном числе должны предусматривать единственное число.

Определенный в настоящем документе термин «боль» означает неприятное сенсорное и эмоциональное переживание, ассоциированное с реальным или потенциальным повреждением ткани, или описанное по отношению к такому повреждению.

В отношении операционной или послеоперационной боли в Законе о защите животных США (Animal Welfare Act 2002. AWA regulations, CFR, Title 9 (Animals and Animal Products), Chapter 1 (Animal and Plant Health Inspection Service, Department of Agriculture). Subchapter A (Animal Welfare), Parts 1-4) определяют болезненную процедуру как какую-либо процедуру, которая, как резонно ожидается, может вызвать более чем слабую или кратковременную боль или дистресс у человека, подвергшегося этой процедуре, то есть, боль, превышающую таковую, вызванную инъекциями или другими незначительными процедурами. Поэтому, если собака подвергается болезненной хирургической процедуре, то животное должно получать послеоперационные анальгетические средства.

В другом случае собака может испытывать сильную или хроническую боль как результат ассоциированного клинического состояния, такого как ревматоидный артрит, остеоартрит, воспаление или раковое или злокачественное состояние.

Термин «ноцицепция» относится к восприятию неприятных раздражителей. Определенная в настоящем документе «невропатическая боль» (также известная как «невралгия») представляет собой боль, которая возникает в связи с проблемами с сигналами от нервов. Она может быть последствием поражения или заболевания, поражающего соматосенсорную систему. У невропатической боли существуют причины, и они могут быть ассоциированы с патологическими ощущениями, называемыми дизестезией, которые возникают спонтанно. В качестве альтернативы, они могут быть ассоциированы с аллодинией, возникающей, когда боль появляется или становится сильнее, с прикосновением или раздражителем, который в норме не вызывает боль. Например, слабое касание к лицу может вызвать боль, если имеется невралгия тройничного нерва, или давление постельного белья может вызвать боль при наличии диабетической невропатии. Невропатическая боль может также быть результатом аллодинии, при которой боль появляется или становится сильнее с прикосновением или раздражителем, которые в норме не вызывают боль. Например, слабое касание лица может вызвать боль, если субъект страдает невралгией тройничного нерва. Невропатическая боль, связанная с гипералгезией, означает то, что сильная боль возникает из-за раздражителя или прикосновения, которые в норме вызывают лишь слабый дискомфорт, в то время как парестезия означает, что дискомфортные или болезненные ощущения возникают даже тогда, когда ничего не контактирует с областью, вызывающей боль, например, булавки и иглы. Другие формы невропатической боли включают в себя прурит или зуд, которые могут быть ассоциированы с аллергическими или воспалительными реакциям на коже и с воспалительной болью в результате повреждения тканей и процессов регенерации.

Определенный в настоящем документе термин «нейтрализующее NGF антитело» или подобное описывает антитело, способное нейтрализовать биологическую активацию и передачу сигнала NGF. Нейтрализующее антитело, которое также может упоминаться как антагонистическое антитело или блокирующее антитело, специфично и предпочтительно избирательно связывается с NGF и ингибирует одну или несколько биологических активностей NGF. Например, нейтрализующее антитело может ингибировать связывание NGF с его целевым лигандом, например, связанные с клеточной мембраной рецепторы TrkA или р75.

Используемый в настоящем документе термин «биологическая активность» относится к какому-либо одному или нескольким характерным биологическим свойствам молекулы (будь то встречающиеся в природе как найденные in vivo, или обеспеченные или предоставленные рекомбинантными средствами). Биологические свойства включают без ограничения связывание и/или активацию рецептора, индукцию клеточной передачи сигнала или клеточной пролиферации, ингибирование роста клеток, индукцию продуцирования цитокинов или хемокинов, индукцию апоптоза и ферментативную активность.

Используемый в настоящем документе термин «определяющий комплементарность участок (CDR)» относится к аминокислотным последовательностям, которые вместе определяют аффинность и специфичность связывания природного Fv-участка нативного связывающего иммуноглобулин сайта, как это описано Kabat et al. (Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H., Gottesman, K. and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242). Используемый в настоящем документе термин «каркасный участок (FR)» относится к аминокислотным последовательностям, расположенным между CDR. Эти части антитела служат для удерживания CDR в соответствующей ориентации (что позволяет CDR связывать антиген).

Используемый в настоящем документе термин «константный участок (CR)» относится к части молекулы антитела, которая обеспечивает эффекторные функции. В настоящем изобретении константные участки обычно означают, что собачьи константные участки, то есть константные участки канинизированных антител субъекта происходят от собачьих иммуноглобулинов.

Используемый в настоящем документе термин «химерное антитело» относится к антителу, содержащему последовательности, полученные из двух различных антител, которые обычно принадлежат к разным видам. Наиболее типично, химерные антитела содержат вариабельные домены, происходящие от донора, что определяет специфичность связи с целевым эпитопом, и константные домены, происходящие от антител, полученных от целевых видов, которым антитело должно быть введено.

Используемый в настоящем документе термин «иммуногенность» относится к измерению способности нацеливающего белка или терапевтической составляющей вызывать иммунный ответ (гуморальный и клеточный) при введении реципиенту. Настоящее изобретение относится к иммуногенности канинизированных антител субъекта. Предпочтительно антитела в соответствии с настоящим изобретением не обладают иммуногенностью, то есть против них не будут повышаться нейтрализующие антитела при введении собаке, и, кроме того, эффекторные функций не опосредуются Fc-участками антитела.

Используемый в настоящем документе термин «идентичность» или «идентичность последовательности» означает, что в любом конкретном положении аминокислотного остатка в выровненной последовательности аминокислотный остаток является идентичным у выровненных последовательностей. Используемый в настоящем документе термин «подобие» или «подобие последовательности» означает, что в любом конкретном положении в выровненных последовательностях аминокислотный остаток характеризуется подобным типом у последовательностей. Например, лейцин может быть заменен остатком изолейцина или валина. Это можно назвать консервативной заменой. Предпочтительно, если аминокислотные последовательности в соответствии с настоящим изобретением модифицированы путем консервативной замены любого из аминокислотных остатков, содержащихся в ней, эти изменения не влияют на специфичность связывания или функциональную активность полученного антитела по сравнению с немодифицированным антителом.

Идентичность последовательности применительно к (нативному) полипептиду в соответствии с настоящим изобретением и его функциональной производной относится к процентному отношению аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам соответствующего нативного полипептида, после выравнивания последовательностей и введения гэпов при необходимости для достижения максимального процентного отношения гомологии, и при этом какие-либо консервативные замены не рассматриваются как часть идентичности последовательности. Ни N-, ни C-концевые удлинения, ни вставки не должны расцениваться как снижение идентичности последовательности или гомологии. Методы и компьютерные программы для осуществления выравнивания двух или более аминокислотных последовательностей и определения их идентичности или гомологии последовательности хорошо известны специалисту в данной области. Например, процентное отношение идентичности или подобия 2 аминокислотных последовательностей можно легко рассчитать с использованием алгоритмов, например, BLAST (Altschul et al., 1990), FASTA (Pearson & Lipman, 1988) или алгоритма Smith-Waterman (Smith & Waterman, 1981).

Используемая в настоящем документе ссылка на аминокислотный остаток, обладающий «наивысшей гомологией» по отношению ко второму аминокислотному остатку, относится к аминокислотному остатку, у которого большинство характеристик или свойств являются общими со вторым аминокислотным остатком. При определении того, характеризуется ли аминокислотный остаток наивысшей гомологией по отношению ко второму аминокислотному остатку, оценка, как правило, может быть сделана исходя из таких факторов, как без ограничения заряд, полярность, гидрофобность, масса боковой группы и размер боковой группы.

Используемый в настоящем документе термин «соответствующая позиция» относится к аминокислотному остатку, присутствующему во второй последовательности в положении, соответствующем определенному аминокислотному остатку в первой последовательности, предназначен для указания позиции во второй последовательности, которая находится в том же положении в первой последовательности при выравнивании двух последовательностей с обеспечением максимальной идентичности последовательности у этих двух последовательностей. Аминокислотные остатки в соответствующих положениях имеют ту же нумерацию по Kabat.

Используемый в настоящем документе термин «состоит по сути из» или «состоящий по сути из» означает, что полипептид может обладать дополнительными признаками или элементами, кроме описанных, при условии, что такие дополнительные признаки или элементы не существенно влияют на способность антитела или фрагмента антитела обладать специфичностью связывания с собачьим NGF. То есть антитело или фрагменты антитела, содержащие полипептиды, могут обладать дополнительными признаками или элементами, которые не мешают способности антитела или фрагментов антитела связываться с собачьим NGF и антагонизировать функциональную активность собачьего NGF. Такие модификации могут быть введены в аминокислотную последовательность с целью снижения иммуногенности антитела. Например, полипептид, состоящий по сути из определенной последовательности, может содержать одну, две, три, четыре, пять или более дополнительных, удаленных или замещенных аминокислот на любом конце или на обоих концах последовательности, при условии, что эти аминокислоты не мешают, не подавляют, не блокируют или не прерывают роль антитела или фрагмента в связывании с собачьим NGF и блокировании его биологической функции. Подобным образом, молекула полипептида, которая обеспечивает антагонистические антитела против собачьего NGF в соответствии с настоящим изобретением, может быть химически модифицирована одной или несколькими функциональными группами при условии, что такие функциональные группы не влияют на способность антитела или фрагмента антитела связываться с собачьим NGF и антагонизировать его функцию.

Используемый в настоящем документе термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» означает количество средства, связывающего соединения, малой молекулы, слитого белка или пептидомиметика в соответствии с настоящим изобретением, которое требуется для достижения необходимого терапевтического эффекта.

Используемые в настоящем документе взаимозаменяемые термины «полипептид», «пептид» или «белок» обозначают линейные ряды аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидными связями между альфа-амино- и карбоксигруппами смежных остатков. Аминокислотные остатки, как правило, находятся в естественной изомерной форме «L». Тем не менее, остатки в изомерной форме «D» могут быть замещены любым L-аминокислотным остатком, при условии сохранения полипептидом желаемого функционального свойства.

Определенный в настоящем документе термин «антитело» охватывает связывающие антиген белки, которые специфично связываются с представляющим интерес целевым антигеном, в данном случае с собачьим фактором роста нерва, содержащие один или несколько полипептидов, которые могут быть рекомбинантно получены или которые являются генетически кодируемыми генами иммуноглобулина или фрагментами генов иммуноглобулина. Термин «антитело» охватывает моноклональные и химерные антитела, в частности, канинизированные антитела, и, кроме того охватывает поликлональные антитела или антитела любого класса или подтипа. Термин «антитело», кроме того, распространяется на гибридные антитела, биспецифичные антитела, гетероантитела, а также на их функциональные фрагменты, которые остаются связывающими антиген.

Выражение «специфично связывается с» относится к связыванию антитела со специфичным белком или целью, которые присутствуют в гетерогенной популяции белков. Следовательно, при присутствии в специфичных условиях иммунного анализа антитела связываются с конкретным белком, в данном случае собачьим NGF, но не связываются в значительном количестве с другими белками, присутствующими в образце.

Определенный в настоящем документе термин «собачий» также может относиться к «собаке». Собаки могут быть классифицированы по принадлежности к подвиду с триномиальным названием Canis lupus familiaris (Canis familiaris domesticus) или Canis lupus dingo. Собаки включают в себя любые виды собак и включают в себя как дикие, так и одомашненные разновидности, последние также называются животными-компаньонами.

Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на следующие примеры, которые приведены с целью иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение. Способы и методики в соответствии с настоящим изобретением в основном выполняли в соответствии со стандартными способами, хорошо известными в уровне техники и согласно описанным в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются во всем настоящем описании, если не указано иное.

Примеры

Пример 1: Разработка и получение антител против собачьего NGF, характеризующихся различными собачьими изотипами

Антитела против собачьего NGF (названные антителами caN) разрабатывали и конструировали с использованием идентичных вариабельных тяжелых доменов (VH), присоединенных к константным доменам тяжелой цепи (СН2 и СН3), выбранным из НСА (SEQ ID NO:1), НСВ (SEQ ID NO:2), HCC (SEQ ID NO:3) или HCD (SEQ ID NO:4). Вариабельную легкую цепь (VL) присоединяли к собачьему константному домену каппа (SEQ ID NO:5). Объединенные аминокислотные последовательности превращали в экспрессируемую форму в клетках млекопитающих с помощью оптимального отбора кодонов и полного химического генного синтеза, а также клонирования в вектор экспрессии клетки млекопитающего pcDNA3.1+. В частности, разработанные аминокислотные последовательности конструировали в синтетической cDNA-экспрессируемой форме и клонировали в вектор экспрессии клетки млекопитающего pcDNA3.1(+). Цельные последовательности антител получали путем объединения канинизированных последовательностей вариабельных доменов с C-концевыми собачьими последовательностями константной тяжелой или константной легкой цепи. Канинизированный домен VH aD11 объединяли с каждым из четырех изотипов НСА, НСВ, НСС и HCD тяжелой цепи (SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:4), a канинизированный домен VL aD11 с собачьим константным доменом каппа легкой цепи (SEQ ID NO:5). Объединенные аминокислотные последовательности преобразовывали в экспрессируемую в клетках млекопитающих форму путем оптимального отбора кодонов и полного химического генного синтеза, а также клонирования в вектор экспрессии клетки млекопитающих pcDNA3.1+.

Комбинации канинизированных плазмид cDNA тяжелой и легкой цепи (caN-HCA-kLC с использованием SEQ ID NO:5 с SEQ ID NO:1 (HCA); caN-HCB-kLC с использованием SEQ ID NO:5 с SEQ ID NO:2 (НСВ); caN-HCC-kLC с использованием SEQ ID NO:5 с SEQ ID NO:3 (НСС) и caN-HCD-kLC с использованием SEQ ID NO:5 с SEQ ID NO:4 (HCD)) трансфицировали в клетки СНО, супернатанты собирали и подвергали реакции с NGF в формате ELISA. После стадий инкубации и промывания связанное собачье антитело выявляли по способности реагирования со специфичным поликлональным козьим антителом против собачьего IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) и разработанным с использованием ТМВ. Оптическую плотность полученного продукта измеряли при 450 нм и сравнивали с таковой от модельного трансфицированного пустым вектором супернатанта. Результаты связывания с NGF для 4 изотипов канинизированных антител показаны на фиг.1. Каждое из этих антител имеет одинаковую легкую цепь (caN-kLC), что представляет собой легкую цепь, содержащую собачий константный домен каппа. Каждое антитело содержит разный константный домен тяжелой цепи. Соответственно, специфичный вариабельный домен тяжелой цепи объединяли с одним из 4 различных константных доменов (caN-HCA, caN-HCB, caN-HCC или caN-HCD). Эквивалентное связывание с NGF наблюдали для каждого из собачьих изотипов тяжелых цепей.

Супернатанты антител тестировали на связывание NGF с использованием анализа ELISA (фиг.1А), а также на нейтрализацию NGF с использованием анализа ингибирования пролиферации клеток TF-1 (фиг.1B). Как можно видеть на фиг.1, четыре изотипа обладают эквивалентной активностью в этих анализах, то есть все они специфично связаны с собачьим NGF.

Пример 2: Индуцированная захваченными NGF канинизированными антителами депозиция комплемента

Четыре содержащих антитело супернатанта далее оценивали по их способности связывать комплемент при связывании с NGF с использованием ELISA на C1q комплемента. Планшеты покрывали 5 мкг/мл мышиного NGF по 100 мкл/лунка и блокировали 5% BSA/PBS. Покрытые лунки инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с супернатантами клеточной культуры, содержащими рекомбинантные канинизированные изотипы IgG против NGF, разведенные в PBS/1% BSA (100 мкл/лунка). Планшеты промывали и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с 100 мкл/лунка человеческой сыворотки крови, разведенной 1/100 в вероналовом буферном солевом растворе, содержащем 0,5 мМ MgCl₂, 2 мМ CaCl₂, 0,05% Tween-20, 0,1% желатина и 0,5% BSA. После промывания планшеты инкубировали с 100 мкл разведенного 1/800 конъюгированного с HRP овечьего антитела против C1q (Serotec) в PBS/1% BSA. После промывания планшеты проявляли путем добавления 100 мкл субстрата ТМВ. Связывание всего C1q комплемента выражали в виде А450 за вычетом фонового значения термоинактивированного комплемента. Проявление останавливали добавлением 100 мкл 2 н H₂SO₄ и считывали данные поглощения при 450 нм.

Результаты представлены на фиг.2. Эти результаты демонстрируют связывание C1q с иммобилизованными канинизированными антителами типа НСВ и НСС и отсутствие связывания C1q с канинизированными антителами типа НСА и HCD. При этом результаты неожиданно показали, что различные тяжелые цепи собачьего происхождения проявляют различные связывающие комплемент и, следовательно, активационные характеристики, а также что канинизированные антитела с тяжелыми цепями типа НСА и HCD неожиданно оказались предпочтительными для применения в антагонизировании собачьего NGF. Следовательно, способность продуцировать антитело, которое специфично связывается с собачьим NGF, но все же не опосредует CDC, очень полезна, поскольку антитело, которое специфично связывается с NGF, но которое опосредует иммунный ответ в непосредственной близости к экспрессирующим NGF клеткам было бы крайне нежелательным.

Пример 3: Связывание комплемента захваченными NGF N-гликозилированными и агликозилированными формами моноклональных антител против собачьего NGF с изотипами тяжелой цепи НСВ и НСС

Выполняли сравнение связывания N-гликозилированных и агликозилированных вариантов моноклональных антител против собачьего NGF с NGF и изотипов тяжелой цепи НСВ и НСС. Векторы экспрессии, кодирующие пары легких и тяжелых цепей, описанные в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:2 (НСВ), SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6 (НСВ*), SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:3 (НСС) или SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:7 (НСС*), совместно трансфицировали в клетки СНО и супернатанты сравнивали по связыванию с мышиным NGF с помощью ELISA. Результаты представлены на фиг.3. На левой панели показано выявление с помощью ELISA экспрессии MAb против NGF, сконструированных с тяжелой цепью НСВ (НСВ), агликозилированной формой тяжелой цепи НСВ (НСВ*), тяжелой цепью НСС (НСС) или агликозилированной формой тяжелой цепи НСС (НСС*), белые столбики на диаграмме показывают неразведенный супернатант, заштрихованные столбики - разведенный 1/10 супернатант, а С показывает неразведенный супернатант отрицательного контроля. Наблюдали эквивалентное связывание с NGF.

Подобным образом, антитела, разработанные для удаления N-связанного сайта гликозилирования константного домена НСВ и НСС (названных НСВ* (SEQ ID NO:6) и НСС* (SEQ ID NO:7)), экспрессировали совместно с легкой цепью и оценивали на активность комплемента (фиг.3) в попытке устранить их связывание комплемента. Удивительно, но агликозилированная форма НСВ* не была способна к связыванию комплемента, однако, агликозилированная форма НСС* сохраняла способность к связыванию комплемента. Идентификация гликозилированных и агликозилированных форм тяжелых цепей собачьего происхождения, которые не опосредовали фиксацию комплемента, является особенно полезным открытием, поскольку NGF является растворимым медиатором, участвующим в ноцицепции.

Супернатанты трансфицированных клеток СНО тестировали на их способность вовлекать комплемент с использованием описанного в примере 2 анализа ELISA на C1q. Результаты представлены на фиг.3, правая панель. Результаты на фиг.3 совместно показывают, что способность вовлекать C1q комплемента аннулировали путем удаления N-связанного сайта гликозилирования в тяжелой цепи типа В (НСВ*) и уменьшили подобной мутацией в тяжелой цепи типа С (НСС*).

Таким образом, в настоящем документе совершенно неожиданно показали, что если антитело содержит тяжелую цепь собачьего происхождения подтипов НСА, HCD или агликозилированной формы изотипа НСВ*, связывание антитела с собачьим NGF не приводит к активации комплемента (и, возможно, других последующих эффекторных функций, таких как ADCC и ADCP). Следовательно, указанные антитела для антагонизирования биологической функциональной активности цели, такой как собачий NGF, путем предотвращения связывания собачьего NGF со связанными с клеточной мембраной рецепторами TrkA или р75 ингибируют ассоциированный последующий внутриклеточный сигнальный каскад. Кроме того, поскольку экспрессия NGF часто происходит в непосредственной близости от нервов, такие антагонизирующие или нейтрализующие NGF антитела, которые содержат тяжелую цепь собачьего происхождения подтипов ПСА, HCD либо НСВ*, блокируют биологическую активность собачьего NGF без вовлечения более широкого иммунного ответа. Следовательно, результаты неожиданно показывают, что различные тяжелые цепи собачьего происхождения проявляют различные характеристики связывания и активации комплемента, и что канинизированные антитела с тяжелыми цепями типа НСА и HCD, как неожиданно показали, являются предпочтительными для использования в антагонизировании собачьего NGF. Идентификация тяжелых цепей собачьего происхождения, которые не опосредуют фиксацию комплемента, является особенно полезным открытием, поскольку NGF является растворимым медиатором. Такие функциональные свойства являются одновременно неожиданными и весьма желательными.

Пример 4: Получение антител с собачьими константными доменами тяжелой цепи к другим антигенам, VEGF и CD20, и их связывание с комплементом

Учитывая удивительный результат, заключающийся в том, что различные изотипы собачьих тяжелых цепей характеризуются дифференциальным связыванием с комплементом, антитела против VEGF и CD20 конструировали аналогичным образом с использованием собачьих константных доменов тяжелой цепи, экспрессированных в клетках СНО, с использованием того же метода, что описан в примере 1. Результаты анализа супернатантов этих антител в ELISA по комплементу представлены на фиг.4. Результаты сравнивали с антителами против NGF, описанными выше, по их способности вовлекать последующее связывание комплемента с его родственным антигеном.

Результаты представлены на фиг.4. На панели А показано, что канинизированные MAb против NGF, сконструированные с использованием изотипов В и С собачьей тяжелой цепи, и гуманизированные антитела, сконструированные с использованием изотипов IgG1 и IgG4 человеческой тяжелой цепи, захватывали на покрытые NGF планшеты, инкубировали с человеческой сывороткой крови и выявляли связанный C1q с помощью ELISA с использованием конъюгированных с HRP поликлональных антител против C1q. На панели В показаны результаты связывания C1q комплемента с захваченными VEGF канинизированными MAb против VEGF, сконструированными с использованием изотипов А и В собачей тяжелой цепи (SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9). На панели С показаны результаты связывания C1q комплемента с MAb против CD20, захваченным на пептид внеклеточного домена huCD20 (muB-2a: мышиное Mab против человеческого CD20 и muB-HCB: мышиное Mab против человеческого CD20, выраженное как химерный слитый белок с изотипом В собачей тяжелой цепи (SEQ ID NO:9). Связывание всего C1q комплемента, выражали как А450 за вычетом фонового значения термоинактивированного комплемента.

В совокупности эти данные показывают, что антитела против VEGF, сконструированные с использованием собачьих константных доменов тяжелой цепи НСВ, но не НСА, могут вовлекать комплемент, а антитело против CD20, сконструированное с использованием собачьего НСВ, может связать комплемент, а значит сравнимы с дифференциальным связыванием изотипов антитела против NGF с комплементом, описанным ранее. Таким образом, эти данные подтверждают удивительное наблюдение, что захваченные антигеном антитела, сконструированные с изотипами НСВ и НСС, связывают комплемент, в то время как с НСА и HCD - нет. Установление того факта, что изотипы НСВ и НСС связывают комплемент, является особенно полезным в уничтожении опухолевых клеток, например, экспрессирующих VEGF или экспрессирующих CD20 опухолевых клеток.

Результаты этих экспериментов подтверждают неожиданное заключение согласно примеру 1 о том, что антитела, содержащие изотипы НСА, HCD и агликозилированную форму НСВ (НСВ*) тяжелой цепи собачьего константного домена, дают иммуноглобулины, которые не опосредуют активность CDC. Соответственно, автор настоящего изобретения впервые определил, что такие тяжелые цепи собачьего происхождения находят применение в иммуноглобулинах для использования в терапевтических методах, при которых опосредованный CDC иммунный ответ является нежелательным. Примерами таких применений могут быть ингибирование собачьими иммуноглобулинами цитокинов или хемокинов, факторов роста, гормонов и других внеклеточных медиаторов, в том числе и комплемента как такового, in vivo, или лечение заболеваний, таких как боль, дегенерация желтого пятна или воспаление.

Помимо того, что изотипы НСА, HCD и НСВ* являются наиболее применимыми при разработке CDC неактивных антител, автор настоящего изобретения также неожиданно установил, что собачьи антитела изотипов НСВ (caIgG-B) и НСС (caIgG-C) применимы при разработке CDC активных антител. Такие антитела могут быть использованы при нацеливании на клетки для разрушения, например, в терапии злокачественных заболеваний. Существует множество человеческих опухолевых антигенов, на которые нацеливаются с использованием CDC активных антител, в том числе CD20, HER2 и EGFR, поэтому собачьи антитела, сконструированные с использованием изотипов НСВ и НСС, будут находить параллельное применение у собак.

Пример 5: Очистка моноклональных антител против NGF после экспрессии в клетках СНО

Поскольку собачьи моноклональные антитела против NGF изотипов НСА и HCD характеризуются желаемым отсутствием связывания с комплементом (фиг.2), но слабо связываются с белком A Staphylococcus (фиг.5), разрабатывали альтернативные методы очистки (фиг.6). Моноклональные антитела против собачьего NGF (сконструированные с использованием изотипа НСА тяжелой цепи) экспрессировали в клетках СНО и после глубоких экспериментов неожиданно обнаружили, что антитело против собачьего NGF может быть фракционировано до высокой степени чистоты (>89% мономерного пика IgG, как показано на фиг.6А, 6D) двумя альтернативными способами очистки.

В первом способе моноклональное антитело против собачьего NGF очищали с помощью анионообменной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и эксклюзионной хроматографии (способ I - фиг.6А и B). Во втором способе антитело против NGF могло быть очищено с помощью аффинной хроматографии Capto adhere, за которой следует анионообменная хроматография (способ II - фиг.6С и D).

Основной пик очищенного с помощью любого метода моноклонального антитела против NGF соответствует молекулярной массе приблизительно 150 кДа. Сравнение по SDS-PAGE и ELISA (фиг.7) показывало, что способами I и II получали препараты антител подобной чистоты и биологической активности. Очищенные моноклональные антитела против NGF, полученные этими способами, тестировали в анализе нейтрализации NGF TF-1 (описанном на фиг.1) и показывали наличие высокой активности (IC50 13 рМ антитела против NGF нейтрализовало 37 рМ NGF; не показано).

Пример 6: Моноклональные антитела против собачьего NGF могут безопасно вводиться собакам внутривенно и не вызывать пирексию

Моноклональные антитела против собачьего NGF, полученные с помощью векторов экспрессии, содержащих собачью тяжелую цепь типа НСА, экспрессировали в клетки СНО и очищали с помощью комбинации ионообменной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и эксклюзионной хроматографии (способ I, фиг.6А и В), а буфер заменяли на фосфатно-солевой буферный раствор. Антитела вводили внутривенно собакам породы бигль по 2 мг/кг массы тела и оценивали на наличие признаков токсичности путем визуального осмотра ветеринаром, на изменение массы тела, температуры тела и биохимии плазмы. На фиг.8 показаны измерения массы и температуры тела. Не наблюдали никаких изменений в этих или в каких-либо измеренных аналитах биохимии плазмы (в том числе в натрии, калии, хлориде, кальции, фосфате, мочевине, креатинине, глюкозе, холестерине, билирубине, аланинтрансаминазе, щелочной фосфатазе, амилазе, липазе, общем белке или альбумине, не показано).

Пример 7: Плазменные фармакокинетические показатели моноклональных антител против собачьего NGF (изотипа НСА) in vivo демонстрируют длительный период полувыведения из сыворотки крови и отсутствие иммуногенности

Моноклональные антитела против собачьего NGF, полученные с помощью векторов экспрессии, экспрессирующих тяжелую цепь собачьего типа НСА, экспрессировали в клетках СНО и очищали с помощью комбинации ионообменной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и эксклюзионной хроматографии, а буфер заменяли на фосфатно-солевой буферный раствор (способ 1, фиг.6А и В). Антитела инъецировали внутривенно собакам породы бигль по 2 мг/кг массы тела и образцы плазмы отбирали в различные моменты времени в течение следующих 2 недель. Разведенные образцы плазмы оценивали на концентрацию антител против собачьего NGF с помощью ELISA с использованием NGF в качестве цели и вторичного реагента - конъюгированного с пероксидазой хрена поликлонального антитела против собачьего NGF и обрабатывали в соответствии с фиг.1. Результаты представлены на фиг.9. Измеренные плазменные концентрации согласовывались с двухфазной кинетикой, с фазой тканевого распределения (альфа) с периодом полувыведения приблизительно 33 часа и удивительно длинной фазой элиминации (бета), составляющей приблизительно 9 дней.

Отсутствие резкого снижения в плазме концентрации антитела против собачьего NGF через 100-300 часов показывает отсутствие в крови собаки ранее существовавших нейтрализующих антител к рекомбинантным моноклональным антителам против NGF, а также каких-либо еще нейтрализующих антител, образованных после инфузии. Для сравнения, рекомбинантные человеческие белки на основе иммуноглобулина нейтрализуются антителами в крови собаки через приблизительно 200 часов после инфузии (Richter et al, Drug Metabolism and Disposition 27:21, 1998). Поэтому данные результаты показывают, что антитела против собачьего NGF в соответствии с настоящим изобретение характеризуются длительным периодом полувыведения из сыворотки крови (приблизительно 9 дней) in vivo после внутривенной инъекции, и отсутствуют как ранее существовавшие антитела, так и вновь образованные антитела, которые с течением времени нейтрализуют инъецированные антитела против NGF.

Пример 8: Влияние моноклональных антител против собачьего NGF на снижение воспалительной боли in vivo

Терапия антителами

Моноклональные антитела против собачьего NGF, полученные с помощью векторов экспрессии, содержащих тяжелую цепь собачьего типа НСА, экспрессировали в клетки СНО и очищали с помощью комбинации ионообменной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и эксклюзионной хроматографии (способ I), а буфер заменяли на фосфатно-солевой буферный раствор.

Собачья модель воспаления

Все эксперименты выполняли с предварительного одобрения Комитетом по этике в отношении животных (CRL, Ирландия). Собак породы бигль инъецировали (=день-1) каолином в подушечку одной задней лапы в целях создания самостоятельно развивающегося воспаления, начинающегося через приблизительно 24 часа и вызывающего у собак временную хромоту. В этой модели, как только начальная воспалительная реакция на каолин отступает, через приблизительно 1-2 недели собаки все меньше хромают, а затем полностью восстанавливаются.

Группам из 3 собак внутривенно инъецировали либо моноклональные антитела против собачьего NGF при 200 мкг/кг массы тела, либо фосфатно-солевой буферный раствор, в качестве контроля-носителя (=день 0). Собак оценивали на хромоту в течение 7 дней при помощи метода визуальной оценки (оценка 0 - отсутствие хромоты (полная опора на конечность); оценка 1 - небольшая хромота (неполная опора на конечность, но хорошее хождение); оценка 2 - умеренная хромота (слабая опора на конечность, и плохое хождение), оценка 3 - тяжелая хромота (отсутствие опоры на конечность)). Наблюдателям не было известно, какие собаки получали какие инъекции.

Результаты представлены на фиг.10. Оценки хромоты снижались у собак, получавших моноклональные антитела против NGF, в день 3 после инъекции по сравнению с получавшими контроль-носитель, что указывает на то, что моноклональные антитела против NGF влияли на снижение боли у собак в большей степени, чем наблюдали только с носителем. Отсроченная активность согласуется с плазменными фармакокинетическими показателями моноклональных антител против собачьего NGF, которые демонстрировали медленную фазу тканевого распределения (альфа), составляющую приблизительно 30 часов, и относительно низкую васкуляризацию области подушечки лапы. Результаты, представленные на фиг.10, показывают, что антитела против собачьего NGF в соответствии с настоящим изобретением снижают воспалительную боль у собак с последующим уменьшением хромоты.

Все документы, на которые ссылается настоящее описание, включены в настоящий документ посредством ссылки. Для специалистов в данной области будет очевидно, что различные модификации и вариации описанных вариантов осуществления настоящего изобретения не выходят за границы объема настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение описано по отношению к определенным предпочтительным вариантам осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение не должно быть незаконно ограничено такими определенными вариантами осуществления. В действительности, различные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, которые очевидны для специалистов в данной области, должны быть охвачены настоящим изобретением.

1. Антитело или его связывающий фрагмент для применения в терапевтическом лечении собаки, если желательна нейтрализация мишени при отсутствии нежелательного иммуноопосредованного разрушения, при этом указанное антитело или связывающий фрагмент специфично связываются с целевым антигеном и имеют константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, при этом аминокислотная последовательность тяжелой цепи минимизирует активацию последующих эффекторных функций иммунной системы при связывании антитела или связывающего фрагмента с их целевым антигеном.

2. Антитело или его связывающий фрагмент по п.1, при этом терапевтическое лечение собаки связано с лечением, ингибированием или облегчением боли или воспаления у собаки.

3. Антитело или его связывающий фрагмент по п.2, при этом боль выбрана из группы, состоящей из невропатической боли, онкологической боли, боли, ассоциированной с ревматоидным артритом или возникающей из-за ревматоидного артрита, боли, ассоциированной с остеоартритом или возникающей из-за остеоартрита, боли, ассоциированной с воспалением или возникающей из-за воспаления, или боли, ассоциированной с пруритом или возникающей из-за прурита.

4. Антитело или его связывающий фрагмент по п.3, при этом последующие эффекторные функции выбраны из группы, состоящей из опосредованной комплементом цитотоксичности, опосредованной антителом клеточной цитотоксичности и опосредованным антителом клеточным патогенезисом.

5. Антитело или его связывающий фрагмент по п.4, в котором антитело или связывающий фрагмент имеют константный домен тяжелой цепи, который не связывается с C1q, если антитело или связывающий фрагмент связаны с их целевым антигеном.

6. Антитело или его связывающий фрагмент по п.5, в котором антитело имеет тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 6.

7. Антитело или его связывающий фрагмент по любому из пп.1-6, при этом целевой антиген выбран из группы, состоящей из цитокина, хемокина, фактора роста, рецептора клеточной поверхности, вируса и компонента каскада комплемента.

8. Слитый белок для применения в терапевтическом лечении собаки, если желательна нейтрализация мишени при отсутствии нежелательного иммуноопосредованного разрушения, при этом указанный слитый белок содержит (i) связывающую часть, которая специфично связывается с целевым антигеном, и (ii) константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, при этом связывающая часть слита с константным доменом тяжелой цепи, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи минимизирует активацию последующих эффекторных функций иммунной системы при связывании слитого белка с его целевым антигеном.

9. Слитый белок по п.8, при этом терапевтическое лечение собаки связано с лечением, ингибированием или облегчением боли или воспаления у собаки.

10. Слитый белок по п.9, при этом боль выбрана из группы, состоящей из невропатической боли, онкологической боли, боли, ассоциированной с ревматоидным артритом или возникающей из-за ревматоидного артрита, боли, ассоциированной с остеоартритом или возникающей из-за остеоартрита, боли, ассоциированной с воспалением или возникающей из-за воспаления, или боли, ассоциированной с пруритом или возникающей из-за прурита.

11. Слитый белок по п.10, при этом последующие эффекторные функции выбраны из группы, состоящей из опосредованной комплементом цитотоксичности, опосредованной антителом клеточной цитотоксичности и опосредованным антителом клеточным патогенезисом.

12. Слитый белок по п.11, при этом слитый белок имеет константный домен тяжелой цепи, который не связывается с C1q, если слитый белок фрагмент связан с его целевым антигеном.

13. Слитый белок по п.12, при этом слитый белок имеет тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 6.

14. Слитый белок по любому из пп.8-13, при этом целевой антиген выбран из группы, состоящей из цитокина, хемокина, фактора роста, рецептора клеточной поверхности, вируса и компонента каскада комплемента.

15. Способ очистки антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп.1-7 или слитого белка по любому из пп.8-14 из исходной смеси, в котором антитело, слитый белок или связывающий фрагмент содержат собачий константный домен тяжелой цепи изотипа А, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или константный домен тяжелой цепи изотипа D собачьего иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, включающий стадии:

(i) получения исходной смеси, содержащей целевые антитела, слитые белки или их связывающие фрагменты, иммуноглобулины или слитые белки,

(ii) подвержения исходной смеси хроматографии с гидрофобным взаимодействием и

(iii) подвержения исходной смеси эксклюзионной хроматографии.

16. Способ очистки антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп.1-7 или слитого белка по любому из пп.8-14 из исходной смеси, в котором антитело, слитый белок или их связывающий фрагмент содержат собачий константный домен тяжелой цепи изотипа А, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или константный домен тяжелой цепи изотипа D собачьего иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, из исходной смеси, включающий стадии:

(i) получения исходной смеси, содержащей целевые иммуноглобулины или слитые белки для аффинной хроматографии Capto adhere; и

(ii) подвержения исходной смеси анионообменной хроматографии.