Усовершенствованная работа птицефермы

Изобретения относятся к биотехнологии. Предложены композиция, способ улучшения окружающей среды на птицеферме, способ снижения образования аммиака и ингибирования ферментов уреазы, способ снижения уровня патогенных бактерий, способ уничтожения вредителей в подстилке для птицы, способ предотвращения пододерматита у птиц. Композиция содержит по меньшей мере один штамм Bacillus subtilis в количестве от 1×10⁴ кое/мл до 1×10¹³ кое/мл, биологическое поверхностно-активное вещество (сурфактин или лихенизин, или фенгицин, или итурин, или их смесь) в количестве от 2 мг/л до 7000 мг/л, поверхностно-активное вещество (алкилбензолсульфоновую кислоту или алкилбензолсульфонат). Способы предусматривают нанесение предложенной композиции на подстилку для птицы. Изобретения обеспечивают повышение производительности птицеферм. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 15 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам улучшения окружающей среды на птицеводческом предприятии, включая снижение образования аммиака на птицефабрике, ингибирование уреазных ферментов в подстилке для птицы, снижение уровней патогенных бактерий в подстилке для птицы, повышение производительности птицеферм, снижение или предотвращение пододерматита у птицы, выращиваемой на птицефабриках с крупномасштабным производством, и уничтожение вредителей в подстилке для птицы. Также описаны композиции, подходящие для использования в подобных способах, содержащие по меньшей мере один микроорганизм рода Bacillus и по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество, которое присутствует в количестве от 2 мг/л до 7000 мг/л.

Уровень техники изобретения

Для предоставления пищи для увеличивающегося населения, за последние 50 лет общее производство зерна, мяса, овощей и молочных продуктов увеличилось на 70%. Соответственно, резко увеличился рост промышленного птицеводства. Значение производства в США бройлеров, яиц, индеек и кур в 2010 года составило 34,7 миллиардов долларов США, увеличившись на 10% с 2009 года, в течение каждого года с 2008 по 2010 экспорт птицы из США приближался к 7 миллиардам фунтов по массе. Кроме того, на рынке птицы существует повышенный интерес к деликатесной части ног курицы.

Для поддержания производства птицы и роста производства птицы, в птицеводстве обычными являются крупномасштабные предприятия, которые вмещают от десятков тысяч до миллионов птиц. Однако на данных предприятиях существуют производственные проблемы, которые являются вредными для здоровья птиц и результатом которых является более медленное вскармливание, низкая масса и/или которые являются причиной заболевания в популяции птиц.

Непосредственная близость птицы на крупномасштабных предприятиях означает, что птицы находятся в контакте не только со своим собственным пометом, но также с пометом других птиц. Это приводит к тому, что желудочно-кишечные патогены быстро распространяются по предприятию. Некоторые желудочно-кишечные патогены птицы, такие как Salmonella spp., Clostridium spp., Campylobacter spp. и Escherichia spp., также являются болезнетворными для людей, и их уровни на птицефермах отслеживают.

Уровни патогенных бактерий в популяциях птицы традиционно снижают посредством введения домашней птице антибиотиков. Однако в последние годы некоторые страны, например, Европейские страны, запрещают использование антибиотиков, которые также используются для людей, по причине возникновения устойчивых к антибиотикам патогенных бактерий.

Одним средством подавления патогенных бактерий у птицы было добавление в их корм пробиотических микроорганизмов, и было обнаружено, что это улучшает здоровье птиц, производство мяса и производство яиц (Khalid et al., "Effect of Probiotic на some Physiological Parameters in Broiler Breeders", International Journal of Poultry Science, 2011, 10(8): 626-628).

Пробиотики, даваемые домашней птице, могут содержать неболезнетворные микроорганизмы, такие как Bacillus subtilis (US 4919936, US 7247299 и US 7754469). Однако данные композиции должны быть подходящими для потребления домашней птицей, и любые дополнительные пищевые добавки с антибиотической активностью могут регулироваться промышленными нормативами.

Кроме того, некоторые из патогенных бактерий содержат ферменты уреазы, которые гидролизируют мочевину и мочевую кислоту, обнаруженную в помете птицы, и тем самым вырабатывают аммиак. Высокие уровни аммиака на предприятиях являются вредными для здоровья птиц, и промышленные нормативы требуют поддержания уровней аммиака на птицефабриках с крупномасштабным производством ниже 25 частей на миллион.

Снижение уровней аммиака в настоящее время выполняется в течение первых 8-10 дней производства за счет использования кислого нейтрализующего химического препарата, добавляемого в помет. Обычные кислые нейтрализующие химические препараты содержат соли серной кислоты, кислые сернистокислые соли и органические кислоты, такие как лимонная кислота. Однако данные нейтрализующие химические препараты активны только во время первоначального производства и расходуются приблизительно на 10 день производства. Впоследствии с аммиаком боролись, используя вытяжные вентиляторы. Еще одна трудность с использованием кислых нейтрализующих химических препаратов состоит в том, что они находятся в постоянном контакте с лапами птиц и являются причиной или усугубляют пододерматит, вызываемый инфекцией Staphylococcus и образование пузырей на их лапах.

Композиции, содержащие Bacillus spp., также используются в дезодорирующих композициях благодаря их способности выделять внеклеточные ферменты, которые разлагают выделения (US 8025874). Одна из данных композиций содержит специфичный штамм Bacillus subtilis, NRRL B-50147 и особенно полезна для борьбы с запахом подстилки для животных. Однако данные композиции требуют использования специфичных штаммов B. Subtilis, а также содержат другие адсорбенты, такие как глина. Подобные композиции также указываются как неподходящие для крупномасштабного использования в таких окружающих условиях, как крупномасштабное производство птицефермы.

Существует потребность в эффективной обработке птицефабрик с крупномасштабным производством для уменьшения и/или подавления выработки аммиака, и которая является эффективной для уничтожения и/или уменьшения патогенных бактерий в подстилке для птицы и навозе птицы, тем самым снижая запах, предотвращая инфекцию у птицы и потребителей и улучшая здоровье и продуктивность птицы.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение частично основано на открытии, что композиция, содержащая по меньшей мере один микроорганизм Bacillus и по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество, такое как сурфактин, является полезной для борьбы с патогенными бактериями и выработкой аммиака на птицеводческих предприятиях с крупномасштабным производством.

В одном аспекте изобретения, предоставлен способ улучшения окружающей среды на птицеводческом предприятии, включающий нанесение на подстилку для птицы или на птичий помет на птицеводческом предприятии композиции, содержащей по меньшей мере один микроорганизм рода Bacillus и по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество, которое присутствует в композиции в количестве между приблизительно 2 мг/л и 7000 мг/л.

В некоторых вариантах выполнения, окружающая среда улучшается за счет подавления или снижения выработки аммиака на птицефабрике. В некоторых вариантах выполнения, подавление или уменьшение выработки аммиака по меньшей мере частично обусловлено уничтожением или уменьшением вырабатывающих уреазу бактерий в подстилке для птицы и/или уменьшением или ингибированием ферментов уреазы в подстилке для птицы или в птичьем помете.

В некоторых вариантах выполнения, окружающая среда улучшается за счет уничтожения или уменьшения патогенных бактерий в подстилке для птицы или в птичьем помете.

В некоторых вариантах выполнения, окружающая среда улучшается за счет уничтожения вредителей в подстилке для птицы, таких как жуки и мухи и их соответствующие личинки.

В некоторых вариантах выполнения, улучшение окружающей среды улучшает кормление, кладку яиц, набор массы и другие критерии производительности на птицефабрике.

В еще одном аспекте изобретения предоставлен способ предотвращения или снижения дерматита подушечки стопы (пододерматит) и гангренозного дерматита у птицы на птицефабрике, включающий нанесение на подстилку для птицы на птицеводческом предприятии композиции, содержащей по меньшей мере один микроорганизм рода Bacillus и по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество, которое присутствует в композиции в количестве между приблизительно 2 мг/л и 7000 мг/л.

В некоторых вариантах выполнения, предотвращение или снижение пододерматита приводит к уничтожению или уменьшению микроорганизмов Staphylococcus и/или Pseudomonas в подстилке для птицы. В некоторых вариантах выполнения, пододерматит может быть снижен или предотвращен за счет уменьшения или отсутствия использования нейтрализующих кислых соединений в подстилке для птицы.

В еще одном аспекте изобретения, предоставлена композиция, содержащая по меньшей мере один микроорганизм рода Bacillus и по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество, которое присутствует в композиции в количестве между приблизительно 2 мг/л и 7000 мг/л.

В некоторых вариантах выполнения, композиция содержит 50-7000 мг/л биологического поверхностно-активного вещества. В некоторых вариантах выполнения, композицией является концентрат, который может быть дополнительно разбавлен перед использованием. В данных вариантах выполнения, биологическое поверхностно-активное вещество может присутствовать в количестве от 500 мг/л до 7000 мг/л, конкретно от 800 мг/л до 7000 мг/л или от 850 мг/л до 6000 мг/л. В некоторых вариантах выполнения, композиция находится в разбавленном виде, содержащем биологическое поверхностно-активное вещество в диапазоне, составляющем от 2 мг/л до 850 мг/л, конкретно от 2 мг/л до 800 мг/л или от 2 мг/л до 500 мг/л. В некоторых вариантах выполнения, композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, конкретно анионное поверхностно-активное вещество.

В некоторых вариантах выполнения, композиция содержит виды Bacillus RSA-203.

Подробное Описание Изобретения

1. Определения

Артикли "a" и "an" используются в данном описании для обозначения одного или более чем одного (т.е. по меньшей мере одного) грамматического объекта артикля. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или более чем один элемент.

Как используется в данном описании, термин "приблизительно" относится к количеству, уровню, значению, величине, размеру или сумме, которая варьирует на целых 30%, 25%, 20%, 15% или 10% для обозначения количества, уровня, значения, величины, размера или суммы.

По всему данному описанию и формуле изобретения, которые следуют далее, если контекст не требует иное, слово "содержать", и варианты, такие как "содержит" и "содержащем", следует понимать, подразумевая включение указанного числа или стадии или группы чисел или стадий, но не исключение любого другого числа или стадии или группы чисел или стадий.

Как используется в данном описании, термин "окружающая среда на птицеводческом предприятии" относится к зонам размещения птицы птицефабрики, таким как птичники, в которых выращивают домашнюю птицу и/или где откладываются яйца, и включает пол или ярус птичника, подстилку для птицы, используемую в птичнике, воздух и качество воздуха в птичнике и твердые поверхности внутри птичника.

Как используется в данном описании, термин "домашняя птица" относится к одомашненным птицам, содержащимся людьми с целью получения яиц, мяса и/или перьев. Домашняя птица включает домашнюю птицу, водоплавающих и пернатую дичь. Примеры птицы включают кур, индеек, уток, гусей, перепелов, фазанов, голубей, голубиных, эму, страусов и нанду.

Как используется в данном описании, термин "барда" относится к побочному продукту сахарной промышленности, получаемому при переработке сахарного тростника или сахарной свеклы. Мелассу, образующуюся во время переработки сахара, ферментируют для получения этанола и аскорбиновой кислоты. Остаток, остающийся после данной ферментации, называется барда. Барда представляет собой вязкую жидкость с общим содержанием твердых веществ, составляющим 2-10% м/о, высокой кислотностью pH 4-5 и высокие BOD (30 000-40 000).

2. Способы изобретения

Изобретение относится к способам улучшения окружающей среды на птицефабрике, конкретно на птицефабрике с крупномасштабным производством. Способы, включающие введение в контакт подстилки для птицы или навоза птицы с композицией, содержащей по меньшей мере один микроорганизм рода Bacillus и по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество, которое присутствует в композиции в количестве между приблизительно 2 мг/л и 7000 мг/л. Способы могут использоваться на птицефермах для уничтожения или уменьшения патогенных бактерий, подавления или уменьшения выработки аммиака, лечения или предотвращения пододерматита птицы или снижения или предотвращения заражения паразитами на птицефабриках. Композиция также может улучшать производительность на птицефабриках.

Птицефабрикой может быть предприятие, где домашнюю птицу производят для потребления, или предприятие, где домашнюю птицу содержат для их яиц, перьев или другой продукции птицы.

В некоторых вариантах выполнения, способы предназначены для уничтожения патогенных бактерий в подстилке для птицы или в птичьем помете. Патогенными бактериями может быть патоген желудочно-кишечного тракта птицы. Патогенные бактерии могут являются причиной заболевания у птицы, такого как диарея или пододерматит. Патогенными бактериями также могут быть патогенные бактерии, которые инфицируют людей. В некоторых вариантах выполнения, патогенные бактерии выбирают из Salmonella spp., Clostridium spp., Campylobacter spp., Escherichia spp., Pseudomonas spp. и Staphylococcus spp. Например, патогенные бактерии могут быть выбраны из Salmonella enterica, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Clostridium perfringens. Бактерии могут иметь или не иметь резистентность к стандартным антибиотикам или вакцинам.

В еще одном аспекте изобретения имеется способ лечения или предотвращения пододерматита птицы или гангренозного дерматита. Пододерматит птицы, известный также как дерматит подушечки стопы, и гангренозный дерматит представляют собой состояния, которые воздействуют на ноги домашних птиц, которые живут в окружающей среде, покрытой подстилкой для птицы. В некоторых случаях, пододерматит или гангренозный дерматит усугубляется наличием улучшителей подстилки для птицы, таких как нейтрализующие кислоты, которые используются для подавления выработки аммиака в подстилке для птицы, например, квасцов, кислых сернистокислых солей и других кислот. Пододерматит птицы или гангренозный дерматит может вызываться Staphylococcus aureus или Pseudomonas aeruginosa, который присутствует в фекалиях птицы, которые находятся в подстилке для птицы. Данные состояния приводят к инфекции и волдырям на ногах домашних птиц, аммиачному ожогу и/или серозному отеку.

В некоторых вариантах выполнения, способы предназначены для подавления или уменьшения выработки аммиака на птицефабриках. Есть основания полагать, что аммиак образуется за счет гидролиза мочевины и мочевой кислоты, которая находится в помете птицы в подстилке для птицы или в птичьем помете. Гидролиз мочевины и мочевой кислоты с получением аммиака ускоряется за счет наличия ферментов уреазы, которые присутствуют в помете птицы или выделяются бактериями. Не желая связывать себя теорией, есть основания полагать, что композиция снижает ферментативную активность уреазы в фекальных массах птицы за счет уменьшения или уничтожения содержащих уреазу микробов в фекальной массе. Уреазы катализируют разрушение мочевой кислоты до аммиака в фекальной массе. Вследствие этого, в одном аспекте изобретения предоставлен способ снижения или ингибирования активности ферментов уреазы в подстилке для птицы или в птичьем помете.

В некоторых вариантах выполнения, концентрацию аммиака на птицефабрике доводят до уровня ниже 25 частей на миллион, максимальной концентрации аммиака, допускаемой на птицефабриках. В некоторых вариантах выполнения, концентрацию аммиака поддерживают ниже 20 частей на миллион, 15 частей на миллион или 10 частей на миллион. Предпочтительно, концентрация аммиака может поддерживаться ниже 25 частей на миллион в течение между 2 и 50 дней, например, 5 и 50 дней, 10 и 50 дней, 15 и 50 дней, 20 и 50 дней, конкретно в течение периода времени, достаточного для выращивания птицы от цыплят до взрослых особей. Предпочтительно, поддержание концентрации аммиака ниже 25 частей на миллион снижает или устраняет необходимость использования на предприятиях вытяжных вентиляторов, который являются энергоемкими и дорогими в эксплуатации.

В еще одном аспекте, способ по изобретению обеспечивает уничтожение вредителей в подстилке для птицы. В вариантах выполнения, вредителями являются безпозвоночные вредители, такие как насекомые. В одном варианте выполнения, вредителя выбирают из чернотелки, конкретно личинок чернотелки, и мух, таких как слепни, слепни малые, черные мусорные мухи, комнатные мухи, комнатные мухи малые, жигалка обыкновенная, черноголовые мухи, синие мясные мухи, серые мясные мухи, ильница обыкновенная и другие домашние мухи.

В еще одном аспекте изобретения, способ улучшает продуктивность птицы и птицефабрики. Уменьшение патогенных бактерий и/или уменьшение уровней аммиака улучшает общее здоровье домашних птиц, увеличивая их кормление и рост и обеспечивая здоровые ноги. Повышение продуктивности может проявляться в увеличенной средней массе домашних птиц, в производстве большего количества яиц или более крупных яиц и/или в производстве здоровых товарных куриных окорочков для Азиатского продуктового рынка.

В некоторых вариантах выполнения, композицию или разбавленную композицию распыляют по подстилке для птицы. В некоторых вариантах выполнения, композицию используют неразбавленной. В других вариантах выполнения, композицию разбавляют, например, водой. Однако сохраняют бактерицидную концентрацию биологического поверхностно-активного вещества, составляющую по меньшей мере 2 мг/л, конкретно 50 мг/л. В некоторых вариантах выполнения, композицию разбавляют от 1 часть композиции о/о на 2 части воды до 1 часть композиции о/о на 30 частей воды, например, 1 часть композиции на 2-25 частей воды, 1 часть композиции на 5-20 частей воды, конкретно 1 часть композиции на 10 частей воды, 1 часть композиции на 11 частей воды, 1 часть композиции на 12 частей воды, 1 часть композиции на 13 частей воды, 1 часть композиции на 14 частей воды, 1 часть композиции на 15 частей воды, 1 часть композиции на 16 частей воды, 1 часть композиции на 17 частей воды, 1 часть композиции на 18 частей воды, 1 часть композиции на 19 частей воды или 1 часть композиции на 20 частей воды.

Когда композицию изобретения разбавляют, композиция может содержать приблизительно 1-40% о/о разбавленной композиции, конкретно 1-30% о/о, 1-20% о/о, 1-15% о/о, 1-12% о/о или 1-10% о/о, более конкретно приблизительно 2-8%.

Композиция, либо разбавленная, либо неразбавленная, может быть нанесена на подстилку для птицы в количестве от 1 галлона на 50 квадратных футов до 1 галлона на 150 квадратных футов (от 0,8 л/м² до 0,27 л/м²), конкретно от 1 галлона на 75 квадратных футов до 1 галлона на 125 квадратных футов (от 0,54 л/м² до 0,33 л/м²) или от 1 галлона на 90 квадратных футов до 1 галлона на 120 квадратных футов (от 0,45 л/м² до 0,34 л/м²).

В некоторых вариантах выполнения, подстилка для птицы содержит одно или более из древесных стружек, древесных опилок, соломы, арахисовой шелухи, рисовой шелухи, резаного сахарного тростника и других недорогих сухих, абсорбирующих органических материалов с низкой стоимостью. Тип используемого органического материала может диктоваться местными сельскохозяйственными культурами и их сухими органическими отходами производства.

В некоторых вариантах выполнения, композицию наносят на подстилку для птицы между выводками птицы, и вследствие этого подстилка содержит фекальные массы перед введением следующего выводка цыплят. Композиция изобретения может быть нанесена на подстилку для птицы за 1-10 дней перед введением следующего выводка цыплят, конкретно за 3-7 дней.

В некоторых вариантах выполнения, композицию вносят в птичий помет, например, на предприятиях по производству яиц, таких как предприятия, содержащие заключенных в клетки домашних птиц.

В некоторых вариантах выполнения, подстилка для птицы или птичий помет может подвергаться валкованию перед или после нанесения композиции изобретения. В некоторых вариантах выполнения, композиция, нанесенная на валок, содержит микроорганизмы в виде спор.

3. Композиции изобретения

В одном аспекте настоящего изобретения предоставлена композиция, содержащая по меньшей мере один микроорганизм рода Bacillus и по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество, которое присутствует в композиции в количестве, составляющем приблизительно от 2 мг/л до 7000 мг/л.

В вариантах выполнения, по меньшей мере одним микроорганизмом из рода Bacillus является пробиотический микроорганизм. В некоторых вариантах выполнения, композиция содержит один микроорганизм из рода Bacillus. В других вариантах выполнения, композиция содержит более одного микроорганизма из рода Bacillus, например 2, 3, 4, 5 или 6 микроорганизма. В некоторых вариантах выполнения, по меньшей мере один микроорганизм из рода Bacillus выбирают из Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus popillae, Bacillus circulates и их смесей, конкретно Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis и их смесей, более конкретно Bacillus subtilis.

В некоторых вариантах выполнения, по меньшей мере одним микроорганизмом из рода Bacillus является специфичный штамм Bacillus subtilis, конкретно подвиды Bacillus subtilis subtilis NRRL B-3383 (Министерство сельского хозяйства США, Служба сельскохозяйственных исследований, ARS коллекция культур NRRL), B. subtilis ATCC 21331, B. subtilis ATCC 21332, B. subtilis SD901 (FERM BP,7666) и B. subtilis RSA-203 или их смесь. В некоторых вариантах выполнения, по меньшей мере одним микроорганизмом рода Bacillus является B. subtilis RSA-203. В некоторых вариантах выполнения, по меньшей мере одним микроорганизмом рода Bacillus является комбинация Bacillus subtitis NRRL B-3383 и Bacillus subtilis RSA-203.

RSA-203 представляет собой микроорганизм, которым является штамм Bacillus subtilis. Это палочковидный, аэробный, грамположительный, β-гемолитический микроб, способный образовывать эндоспоры. Анализ последовательности нуклеиновых кислот подтверждает, что это штамм B. subtilis. Образец данного микроорганизма был помещен в депозитарий ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Соединенных штатов of America 9 января 2013 года, и был присвоен № поступления ______.

RSA-203 вырабатывает значительные количества биологического поверхностно-активного вещества сурфактина. Если условия культивирования включают удаление фоамата во время культивирования, сурфактин можно получить в количествах от 250 мг/л до 1000 мг/л в среде для культивирования и от 850 мг/л до 2 г/л в фоамате.

В некоторых вариантах выполнения, микроорганизм находится в вегетативном состоянии. В других вариантах выполнения, микроорганизм находится в состоянии покоя, например, в виде эндоспоры. В других вариантах выполнения, микроорганизм присутствует в смеси вегетативного состояния и состояния покоя.

Композиция может содержать любое подходящее количество микроорганизма рода Bacillus для получения подходящей популяции при нанесении на подстилку для птицы. Не желая связывать себя теорией, есть основания полагать, что микроорганизм в состоянии воспользоваться преимуществом источников пищи в подстилке для птицы более эффективно, чем другие микроорганизмы, такие как патогенные бактерии. Это приводит к тому, что микроорганизмы рода Bacillus опережают другие микроорганизм, так что другие микроорганизмы не развиваются или погибают. Подходящие количества микроорганизма рода Bacillus составляют между 1×10⁴ кое/мл и 1×10¹³ кое/мл.

В некоторых вариантах выполнения, по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество вырабатывается микроорганизмом рода Bacillus, который находится в композиции. В других вариантах выполнения, по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество не образуется микроорганизмом рода Bacillus, который находится в композиции.

В некоторых вариантах выполнения, по меньшей мере одним биологическим поверхностно-активным веществом является антимикробный пептид, конкретно циклическое липопептидное биологическое поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах выполнения, биологическим поверхностно-активным веществом является одно из сурфактина, лихенизина, итурина, фенгицина или их смесей, более конкретно сурфактин, лихенизин или их смеси, наиболее конкретно сурфактин. Каждое из данных биологических поверхностно-активных веществ может содержать смеси соединений, варьирующих по длине цепи фрагмента жирной кислоты липопептида.

Циклические липопептиды, такие как сурфактин, имеют фрагмент циклического пептида и фрагмент, полученный из жирной кислоты. Сурфактин имеет циклический пептид из семи аминокислот, включая как D-, так и L-аминокислоты, Glu-Leu-D-Leu-Val-Asp-D-Leu-Leu, сшитые от N-конца до C-конца с образованием циклического фрагмента с помощью C₁₂-C₁₇ β-гидрокси жирной кислоты, как показано ниже.

Лихенизин имеет аналогичную структуру с аминокислотной последовательностью, отличающейся от сурфактина, Gln-Leu-D-Leu-Val-Asp-D-Leu-Ile, сшитой от N-конца до C-конца с образованием циклического фрагмента с помощью C₁₂-C₁₇ β-гидрокси жирной кислоты.

Фенгицин представляет собой циклический липопептид, имеющий последовательность Glu-D-Orn-Tyr-D-Allo-Thr-Glu-D-Ala-Pro-Glu-D-Tyr-Ile, где пептид циклизирован между тирозин фенокси группой положения 3 и C-концом Ile в положении 10, жирная кислота соединена с пептидом с образованием амида с N-концом.

Итурин относится к группе циклических пептидов с последовательностью Asn-D-Tyr-D-Asn-Gln-Pro-D-Asn-Ser, в которой N-конец и C-конец соединены β-амино жирной кислотой варьирующей длины.

Композиция содержит биологическое поверхностно-активное вещество в количестве от 2 мг/л до 7000 мг/л, например от 50 мг/л до 7000 мг/л. В некоторых вариантах выполнения, композиция находится в виде концентрата, который может быть разбавлен перед использованием. Например, концентрат может содержать биологическое поверхностно-активное вещество в концентрации от 500 мг/л до 7000 мг/л, от 800 мг/л до 7000 мг/л или от 850 мг/л до 6000 мг/л. В некоторых вариантах выполнения, композиция находится в разбавленном виде и содержит биологическое поверхностно-активное вещество в диапазоне, составляющем от 2 мг/л до 850 мг/л, конкретно от 2 мг/л до 800 мг/л или от 2 мг/л до 500 мг/л. В некоторых вариантах выполнения композиция содержит биологическое поверхностно-активное вещество в количестве, составляющем приблизительно от 50 мг/л до 4000 мг/л, от 50 мг/л до 2000 мг/л, от 100 мг/л до 2000 мг/л, от 400 мг/л до 2000 мг/л или приблизительно от 750 мг/л до 1500 мг/л.

Композиция содержит водный носитель, например, воду, буфер или культуральную жидкость. В некоторых вариантах выполнения, водную композицию буферизуют при pH от 3 до 8. Например, для поддержания pH 3-6 может быть использован цитратный буфер или фосфатный буфер, например, для поддержания pH от 4,8 до 8 может использоваться мононатрийфосфат, монокалийфосфат, динатрийфосфат или дикалийфосфат. В некоторых вариантах выполнения, композиция имеет pH от 3 до 6. В других вариантах выполнения, композиция имеет pH от 6 до 8.

В некоторых вариантах выполнения, композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активное вещество может быть анионное, катионное, неионное или цвитерионное. В некоторых вариантах выполнения, поверхностно-активное вещество имеет Гидрофильно-липофильный баланс (HLB), равный 12 или больше, конкретно в диапазоне, составляющем от 12 до 14. Подходящие поверхностно-активные вещества включают вещества, упоминаемые в McCutcheon's Emulsifiers & Detergents, International Edition, 1998 и последующих изданиях, например, вещества, упоминаемые на страницах 223-231 индекса HLB издания 1998 года. Иллюстративные неионные поверхностно-активные вещества содержат алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры поли(этиленоксида), алкиловые и полиалкиловые эфиры поли(этиленоксида), алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры сорбитана, необязательно полиэтоксилированные, алкиловые и полиалкиловые эфиры сорбитана, необязательно полиэтоксилированные, алкиловые и полиалкиловые гликозиды или полигликозиды, в частности алкиловые и полиалкиловые глюкозиды или полиглюкозиды, алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры сахарозы, алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры глицерина, необязательно полиэтоксилированные, алкиловые и полиалкиловые эфиры глицерина, необязательно полиэтоксилированные, и их смеси. Иллюстративные анионные поверхностно-активные вещества включают алкилэфирсульфаты, карбоксилаты, производные аминокислот, сульфонаты, такие как линейные алкилбензенсульфонаты или сульфоновые кислоты, изотионаты, таураты, сульфоцукцинаты, алкилсульфоацетаты, полипептиды, соли металлов C₁₀-C₃₀, в частности C₁₂-C₂₀ жирные кислоты, в частности стеараты металлов и их смеси. В отдельном варианте выполнения, поверхностно-активным веществом является линейные алкилбензенсульфонат или сульфоновая кислота, конкретно додецилбензенсульфоновая кислота.

Подходящие алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры поли(этиленоксида) включают алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры поли(этиленоксида), имеющие ряд этиленоксидных (EO) звеньев в диапазоне от 2 до 200, например, стеарат 40 EO, стеарат 50 EO, стеарат 100 EO, лаурат 20 EO, лаурат 40 EO, дистеарат 150 EO. Подходящие алкиловые и полиалкиловые эфиры поли(этиленоксида) включают алкиловые и полиалкиловые эфиры поли(этиленоксида), имеющие ряд этиленоксидных (EO) звеньев в диапазоне от 2 до 200, например, цетилэфир 23 EO, олеилэфир 50 EO, фитостерол 30 EO, стеарет 40, стеарет 100, бехенет 100. Подходящие алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры сорбитана, необязательно полиэтоксилированные, включают алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры сорбитана, имеющие ряд этиленоксидных (EO) звеньев в диапазоне от 0 до 100, например, сорбитан лаурат 4 или 20 EO, в частности полисорбат 20 (или полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат), такой как продукт Tween 20, продаваемый компанией Uniqema, сорбитан пальмитат 20 EO, сорбитан стеарат 20 EO, сорбитан олеат 20 EO или Cremophor (RH 40, RH 60 и т.д.) от BASF. Подходящие алкиловые и полиалкиловые эфиры сорбитана, необязательно полиэтоксилированные, включают алкиловые и полиалкиловые эфиры сорбитана, имеющие ряд этиленоксидных (EO) звеньев в диапазоне от 0 до 100. Подходящие алкиловые и полиалкиловые глюкозиды или полиглюкозиды, включают алкиловые и полиалкиловые глюкозиды или полиглюкозиды, содержащие алкиловую группу, имеющую от 6 до 30 атомов углерода, а конкретно от 6 до 18, или даже от 8 до 16 атомов углерода, и содержащие глюкозидовую группу, конкретно содержащие от 1 до 5, в частности 1, 2 до 3 глюкозидовых звеньев. алкилполиглюкозиды могут быть выбраны, например, из децилглюкозида (Алкил-Cг/Cn-полиглюкозида (1,4)), такого как продукт, продаваемый под названием Mydol 10® компанией Kao Chemicals, или продукт, продаваемый под названием Plantacare 2000 UP ® компанией Henkel, и продукт, продаваемый под названием ORAMIX NS 10® компанией SEPPIC; каприлил/каприл глюкозида, такого как продукт, продаваемый под названием Plantacare KE 3711® компанией Cognis, или ORAMIX CG 110® компанией SEPPIC; лаурилглюкозида, такого как продукт, продаваемый под названием Plantacare 1200 UP компанией Henkel или Plantaren 1200 N® компанией Henkel; кокоглюкозида, такого как продукт, продаваемый под названием Plantacare 818 UP® компанией Henkel; каприлилглюкозида, такого как продукт, продаваемый под названием Plantacare 810 UP компанией Cognis; и их смесей. Подходящие алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры сахарозы включают, например, Crodesta F 150, сахарозы монолаурат, продаваемый под названием Crodesta SL 40, и продукты, продаваемые как сложный сахарный эфир Ryoto, например, сахарозы пальмит, продаваемый со ссылкой на сложный сахарный эфир Ryoto P 1670, сложный сахарный эфир Ryoto LWA 1695 и сложный сахарный эфир Ryoto 01570. Подходящие алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры глицерина, необязательно полиэтоксилированные, включают алкиловые и полиалкиловые сложные эфиры глицерина, имеющие ряд этиленоксидных (EO) звеньев в диапазоне от 0 до 100 и ряд глицериновых звеньев в диапазоне от 1 до 30, например, гексаглицерилмонолаурат и PEG-30 глицерилстеарат. Подходящие алкиловые и полиалкиловые эфиры глицерина, необязательно полиэтоксилированные, включают алкиловые и полиалкиловые эфиры глицерина, имеющие ряд этиленоксидных (EO) звеньев в диапазоне от 0 до 100 и ряд глицериновых звеньев в диапазоне от 1 до 30. Примеры включают Nikkol батиловый спирт 100, Nikkol химиловый спирт 100. Подходящие алкилэфирсульфаты включают, например, лаурил эфир натрий сульфат (C12-14 70-30) (2,2 EO), продаваемый под названиемs SIPON AOS225 или TEXAPON N702 компанией Henkel, лаурил эфир аммоний сульфат (C12-14 70-30) (3 EO), продаваемый под названием SIPON LEA 370 компанией Henkel, алкил (C12-C14) эфир (9 EO) аммоний сульфат, продаваемый под названием RHODAPEX AB/20 компанией Rhodia Chimie, и смесь лаурил и олеил эфир сульфата натрия и магния, продаваемого под названием EMPICOL BSD 52 компанией Albright & Wilson.

Поверхностно-активное вещество может присутствовать в количестве для содействия смачиванию подстилки для птицы, когда композицию наносят. Подходящие количества содержат 0,01-10% м/м, конкретно от 0,1% до 5% м/м, более конкретно от 0,1 до 1% м/м композиции.

В некоторых вариантах выполнения, композиция дополнительно содержит органическую кислоту. В некоторых вариантах выполнения, органическую кислоту выбирают из лимонной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты, винной кислоты, аскорбиновой кислоты и тому подобного, конкретно лимонную кислоту. Органическую кислоту включают для регулировки pH до между 3 и 6, и она может способствовать нейтрализации свободного аммиака в подстилке для птицы, который присутствует, когда композицию наносят на помет, или который вырабатывается после нанесения композиции на подстилку для птицы.

Другие необязательные компоненты композиции включают ароматизирующие вещества, такие как экстракт цитрусового масла и тому подобное. Подобные ароматизирующие вещества могут быть синтетическими или натуральными, но предпочтительно натуральными; и красители, которые могут быть полезными при идентификации обработанной подстилки для птицы. Подходящие красители включают пищевые красители, такие как FD&C Зеленый #5, FD&C Зеленый #3, FD&C Синий #1, FD&C Синий #2, FD&C красный #40, FD&C красный #3, FD&C Желтый #5, FC&C #6, Зеленый S, Хинолин Желтый, Кармоизин, Пунцовый 4R, патентованый Синий V, аннатто, хлорофилин, кошениль, бетанин, шафрановый, куркума, ликопен, сок бузины, пандан и мотыльковый горошек.

Композиция изобретения может быть получена в микробной культуре. Микроорганизм из рода Bacillus можно получить посредством стандартных технологий культивирования. Например, биореактор заполняют деминерализованной водой, солями и питательными веществами и перемешивают. Затем среду для культивирования засевают культурой требующегося микроорганизма. Затем биомассу насыщают воздухом, взбалтывают и инкубируют при подходящей температуре, например, 35°C, до тех пор, пока не получают требующийся рост микроорганизмов. Требующийся рост микроорганизмов может быть определен по оптической плотности при 600 нм (OD_600нм). В вариантах выполнения, культивирование продолжают до тех пор, пока оптическая плотность не достигает OD_6ooнм>1,5-2,5, конкретно 1,7-2,0.

Иллюстративный способ включает заполнение биореактора деминерализованной водой, монокалийфосфатом, динатрийфосфатом, нитратом амония, экстрактом дрожжей, сульфатом магния, хлоридом кальция, сульфатом железа, сульфатом марганца, натриевой этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA) и глюкозой. После перемешивания, среду для культивирования засевают соответствующей Bacillus sp. Затем культуру насыщают воздухом и взбалтывают при 300 об/мин в течение приблизительно 12 часов при 35°C. Процесс культивирования завершали, когда плотность клеток достигала 1×10¹⁴ колониеобразующих единиц (кое) на мл или OD_6ooнм между 1,7 и 2,0.

При этом в некоторых вариантах выполнения, композиция может содержать среду для культивирования, содержащую микроорганизм и биологическое поверхностно-активное вещество в достаточных количествах, образующихся непосредственно при процессе культивирования. В других вариантах выполнения, биологическое поверхностно-активное вещество добавляют в среду для культивирования или композицию, содержащую микроорганизм в вегетативном состоянии или состоянии эндоспор.

В некоторых вариантах выполнения, процесс культивирования может выполняться с использованием микроорганизмов Bacillus, которые не вырабатывают достаточных количеств биологического поверхностно-активного вещества для использования в изобретении. В некоторых вариантах выполнения, процесс культивирования включает стадию непрерывного удаления биологического поверхностно-активного вещества посредством пеновой дистилляции, поощряя тем самым микроорганизм к выработке более крупных количеств биологического поверхностно-активного вещества посредством расходования биологического поверхностно-активного вещества по мере того, как оно вырабатывается. В других вариантах выполнения, микроорганизм рода Bacillus изолирован, например, в виде эндоспор, а не в среде для культивирования и вследствие этого не содержит биологическое поверхностно-активное вещество. В данных вариантах выполнения, требующееся количество биологического поверхностно-активного вещества может быть добавлено к микроорганизму с образованием композиции изобретения.

Биологическое поверхностно-активное вещество можно получать, как описано выше или с помощью других способов, известных в данной области. Производство биологических поверхностно-активных веществ, таких как сурфактин, описано в литературе, например в US 3687926, JP-A-6-121668, US 3030789, US 7011969, Wei et al. Enz. Microbiol. Technol., 1989, 22:724-728, Sheppard et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 1989, 27:486-489, Mulligan et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., (1989), 31 :486-489, Kim et al. J. Ferment. Bioeng., 1997, 84:41-46 и Cooper et al., Appl. Env железо. Microbiol., 1981, 42:408-412.

В вариантах выполнения, микроорганизмом рода Bacillus в композиции является микроб, вырабатывающий биологическое поверхностно-активное вещество.

Биологическое поверхностно-активное вещество может вырабатываться любым продуцирующим биологическое поверхностно-активное вещество микробом. Однако в вариантах выполнения, по меньшей мере один продуцирующий биологическое поверхностно-активное вещество микроб происходит из рода Bacillus, например, они могут быть выбраны из Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus popilliae, Bacillus circulans и их смесей. В некоторых вариантах выполнения, один продуцирующий биологическое поверхностно-активное вещество микроб присутствует в жидкой среде для культивирования. В других вариантах выполнения, два продуцирующих биологическое поверхностно-активное вещество микроба присутствуют в жидкой среде для культивирования. В еще одном варианте выполнения, три продуцирующих биологическое поверхностно-активное вещество микроба присутствуют в жидкой среде для культивирования. В дополнительных вариантах выполнения, четыре продуцирующих биологическое поверхностно-активное вещество микроба присутствуют в жидкой среде для культивирования. В некоторых вариантах выполнения, по меньшей мере одним продуцирующим биологическое поверхностно-активное вещество микробом является смесь пяти продуцирующих биологическое поверхностно-активное вещество микробов. По меньшей мере одним продуцирующим биологическое поверхностно-активное вещество микробом может быть штамм микроба, о котором известно, что он продуцирует биологические поверхностно-активные вещества с повышенным выходом. Например, многие виды Bacillus вырабатывают биологические поверхностно-активные вещества, однако известно, что Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis продуцируют значительные количества биологических поверхностно-активных веществ. Кроме того, известно, что конкретные штаммы Bacillus subtilis продуцируют биологические поверхностно-активные вещества, такие как B. subtilis ATCC 21331, B. subtilis ATCC 21332, B. subtilis SD901 (FERM BP,7666) с повышенным выходом. Многие штаммы продуцирующих биологические поверхностно-активные вещества микробов являются коммерчески или общедоступными. В вариантах выполнения, по меньшей мере один продуцирующий биологическое поверхностно-активное вещество микроб выбирают из B. subtilis NRRL B-3383 или B. subtilis ATCC 21331, которые оба являются общедоступными. В других вариантах выполнения, вырабатывающим биологическое поверхностно-активное вещество микроорганизмом является B. subtilis RSA-203, новый штамм B. Subtilis, который, как обнаружено, продуцирует биологическое поверхностно-активное вещество, сурфактин, со значительным выходом.

В некоторых вариантах выполнения, по меньшей мере одним продуцирующим биологическое поверхностно-активное вещество микробом является смесь B. subtilis и B. licheniformis. В других вариантах выполнения, по меньшей мере одним продуцирующим биологическое поверхностно-активное вещество микробом является смесь B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus и Bacillus popilliae. В данных вариантах выполнения, соотношение каждого микроба можно регулировать для определения количества различных продуцируемых биологических поверхностно-активные веществ. В некоторых вариантах выполнения, B. subtilis присутствует в смеси продуцирующих биологические поверхностно-активные вещества микробов приблизительно в 50-98% от смеси, конкретно в 60-95%, 70-95%, 80-95%, более конкретно приблизительно в 90%.

В некоторых вариантах выполнения, источником углерода, используемым в жидкой среде для культивирования, является сахар или углеводород. Примеры подходящих источников углерод включают глюкозу, глицерин, крахмал, сахарозу, мелассу и барду или их смеси. В некоторых вариантах выполнения, источником углерода является глюкоза. В других вариантах выполнения, источником углерод является барда.

В некоторых вариантах выполнения, количество источника углерода, такого как глюкоза, меласса и/или барда, в жидкой среде для культивирования составляет 3-20% м/о, конкретно 3-15% м/о, более конкретно 3-12% м/о или 3-10% м/о, наиболее конкретно приблизительно 10% м/о. В некоторых вариантах выполнения, количество источника углерода варьируют для получения требуемой концентрации биологического поверхностно-активного вещества в культуральной жидкости.

Продуцируемым биологическим поверхностно-активным веществом предпочтительно является циклическое липопептидное биологическое поверхностно-активное вещество, такое как сурфактин, лихенизин, итурин, фенгицин и их смеси. Каждое из данных биологических поверхностно-активных веществ может содержать смеси соединений, варьирующих по длине цепи фрагмента жирной кислоты липопептида. Модулирование условий роста и питательных веществ создает возможность получения биологических поверхностно-активных веществ с варьирующими соотношениями длин цепей липидных жирных кислот.

В некоторых вариантах выполнения, продуцируемое биологическое поверхностно-активное вещество выбирают из сурфактина и лихенизина и их смесей. В других вариантах выполнения, продуцируемым биологическим поверхностно-активным веществом является сурфактин.

Температура процесса культивирования составляет от 25°C до 40°C, конкретно от 30°C до 40°C, более конкретно приблизительно от 30°C до 35°C, например, от 32°C до 35°C. Используемая температура может зависеть от идентичности продуцирующего биологическое поверхностно-активное вещество микроба. Квалифицированный специалист в данной области может определить соответствующую температуру для заданной популяции бактерий с помощью рутинных методов исследования.

pH среды для культивирования поддерживают между 4 и 8, конкретно между 6 и 8, или между 6 и 7,5, более конкретно между 6,3 и 7,2, например, от 6,3 до 6,7.

Инокулят по меньшей мере одного продуцирующего биологическое поверхностно-активное вещество микроба добавляют в среду для культивирования в количестве для достижения первоначальной OD_600нм, равной 0,1-0,15. В некоторых вариантах выполнения, инокулятом является культура, имеющая OD_600нм, составляющую от 1,3 до 2,5. В некоторых вариантах выполнения, инокулятом является культура в середине логарифмического роста с OD_600нм, составляющей от 1,3 до 1,6, которую добавляют в новую культуру в количестве для достижения OD_600нм, составляющей 0,1-0,15. Необходимое количество может быть легко вычислено, например, инокуляты с OD_600нм, составляющей 1,5, будут добавлять в соотношении 10% о/о для получения новой среды для культивирования с OD_600нм, составляющей 0,15.

В некоторых вариантах выполнения, жидкая среда для культивирования дополнительно содержит источник катаболизируемого азота. В некоторых вариантах выполнения, источник катаболизируемого азота выбирают из содержащей азот неорганической соли или содержащего азот органического соединения, например, аммонийных солей, нитратных солей, мочевины, пептона, мясного экстракта, дрожжевого экстракта, соевого жмыха, жидкого кукурузного экстракта, пептона или муки, полученной из бобовых, например, сои, фасоли лучистой, гороха, кормовых бобов, нута обыкновенного, чечевицы и волокнистой фасоли или экстрактов из подобной муки или их смесей. В вариантах выполнения, источником катаболизируемого азота является неорганическая соль, такая как аммонийная соль или нитратная соль, конкретно аммония нитрат, аммония хлорид, аммония ацетат, аммония карбонат, аммония бикарбонат, калия нитрат, натрия нитрат, магния нитрат и кальция нитрат или их смеси. В вариантах выполнения, источником катаболизируемого азота является аммония нитрат, натрия нитрат, аммония хлорид или их смеси, например, натрий нитрат, аммония нитрат или их смесь.

Величина источника катаболизируемого азота, имеющегося в жидкой среде для культивирования, будет зависеть от природы источника и доступности азота в источнике. Например, источник азота может присутствовать в количестве, составляющем 1-20 г/л. Когда источником азота является источник неорганического азота, он может присутствовать в количестве, составляющем 1-10 г/л, конкретно от 2 до 7 г/л, более конкретно от 3,5 до 4,5 г/л.

В некоторых вариантах выполнения, жидкая среда для культивирования дополнительно содержит по меньшей мере одну неорганическую соль, такую как сульфаты, фосфаты, хлориды, особенно таких металлов, как марганец, железо, натрий, калий, магний и кальций. В некоторых вариантах выполнения неорганические соли выбирают из сульфатов и фосфатов ионов, например, марганца, магния, натрия, калия и железа или смесей подобных солей. В отдельном варианте выполнения, по меньшей мере одну неорганическую соль выбирают из марганца сульфата, натрия фосфата, кальция хлорида, магния сульфата, железа сульфата и их смесей, особенно из натрия фосфата, марганца сульфата и железа сульфата или их смесей.

Неорганические соли варьируют по количеству в зависимости от используемых солей. Если имеется источник фосфата, он может присутствовать в количестве, составляющем приблизительно 1-10 г/л, конкретно от 2 до 7 г/л, более конкретно от 4 до 7 г/л, наиболее конкретно от 5 до 6 г/л. Когда добавляют неорганические соли для предоставления элементов, присутствующие в следовых количествах, таких как железо, марганец и кальций, количества будут варьировать между 1 мг/л и 5 г/л, например, кальциевые соли можно добавлять в количестве от 0,5 г/л до 1 г/л, соли железа можно добавлять в количестве, составляющем 1-10 мг/л, марганцевые соли можно добавлять в количестве, составляющем 0,5-1 г/л, магниевые соли можно добавлять в количестве, составляющем 0,5 г/л-5 г/л.

В некоторых вариантах выполнения, среда для культивирования дополнительно содержит хелатирующий агент. Конкретные хелатирующие агенты включают аминокарбоновые кислоты и их соли, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), диэтилентриаминовая пентауксусная кислота, гидроксиэтилэтилендиаминовая ацетилацетоуксусная кислота, 1,2-диаминциклогексантетрауксусная кислота, этиленгликольбис([бета]-аминоэтилэфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота (EGTA), диэтиленетриаминпентауксусная кислота (DPTA), триэтилентетраамингексауксусная кислота (TTG), аминоацетоуксусная кислота и гидроксиэтиламиноацетоуксусная кислота. Конкретными хелатирующими агентами являются соли и смешанные соли EDTA, такие как двукалиевые, амонийные, кальциевые, динатриевые, тринатриевые и тетранатриевые соли, наиболее предпочтительно динатриевые или тетранатриевые соли EDTA, особенно динатрий EDTA. Хелатирующий агент присутствует в количестве между 0,1 и 5 мг/л, конкретно от 0,5 до 3 мг/л, более конкретно 1-2,5 мг/л среды для культивирования.

Способ культивирования можно осуществлять в небольших масштабах в лабораторных колбах в инкубаторе или можно осуществлять в более крупных масштабах, например, в промышленном масштабе в биореакторе. Способ осуществляют в аэробных условиях.

Продолжительность процесса культивирования будет зависеть от условий культивирования. В некоторых вариантах выполнения, процесс культивирования имеет продолжительность от 8 до 120 часов, в частности от 8 до 72 часов, от 8 до 48 часов или от 8 до 24 часов, например, от 10 до 14 часов. Продолжительность процесса культивирования для получения сурфактина зависит от достижения плотности клеток более чем OD_600нм 1,3.

В некоторых вариантах выполнения, способ дополнительно включает насыщение кислородом среды для культивирования для предоставления растворенного кислорода. Как правило, это включает барботирование воздуха через среду для культивирования со скоростью между 1 л/минуту и 3 л/минуту, конкретно приблизительно 1,5 л/минуту. Квалифицированный специалист в данной области легко может определить скорость насыщения кислородом. Насыщение кислородом может происходить с начала процесса культивирования или может начинаться после того, как начался процесс культивирования, в частности с начала процесса культивирования. В вариантах выполнения, насыщение кислородом поддерживает концентрацию растворенного кислорода приблизительно от 20 до 40%, конкретно от 25 до 35%. В некоторых вариантах выполнения, концентрацию растворенного кислорода поддерживают приблизительно при 30%.

После того, как началось продуцирование биологического поверхностно-активного вещества, среда для культивирования может пениться по причине присутствия биологического поверхностно-активного вещества. В некоторых вариантах выполнения, образование пены можно регулировать посредством распыления фоамата со смесью спирта, такого как этанол, и растворителя, такого как диметилен хлорид или ацетон. В некоторых вариантах выполнения, биореактор, в котором проводят ферментацию, является взрывобезопасным. В некоторых вариантах выполнения, взрывобезопасным является оборудование для сбора пены. Размер давления, которое должно выдерживать оборудование, определяется давлением насоса и скоростью потока в колонку для пены.

В некоторых вариантах выполнения, стимулируют получение фоамата, и фоамат собирают из сосуда для культивирования. Фоамат содержит продуцируемое биологическое поверхностно-активное вещество. Пену можно собирать через вращающийся клапан в резервуар с небольшим разрежением или в резервуар с распылительной колонной для разрушения пены. Биологическое поверхностно-активное вещество может быть выделено из собираемого фоамата. В некоторых вариантах выполнения, биологическое поверхностно-активное вещество выделяют посредством окисления с последующим экстрагированием жидкости жидкостью, а затем выпаривания жидкостей.

В других вариантах выполнения, биологическое поверхностно-активное вещество выделяют из среды для культивирования после завершения процесса культивирования. Например, для удаления биомассы сырую среду для культивирования можно центрифугировать. Затем супернатант подкисляют до кислого pH, например, pH 2, кислотой, например, HCl. Кислый pH приводит к преципитации биологического поверхностно-активного вещества, подкисленный супернатант можно оставить при 4°C в течение некоторого периода времени для предоставления возможности завершения преципитации. Затем преципитат собирают, например, посредством центрифугирования или фильтрования и ресуспендируют в воде. pH суспензии доводят до щелочного pH, например до pH 8, для солюбилизации преципитата. Полученный в результате водный раствор может быть экстрагирован органическим растворителем, таким как дихлорметан, этилацетат, хлороформ, в частности дихлорметаном, и органическую фазу выпаривали для предоставления биологического поверхностно-активного вещества с кристаллической формой высокой чистоты. В некоторых вариантах выполнения, биологическое поверхностно-активное вещество можно собирать с помощью пеновой дистилляции во время культивирования или после завершения культивирования. Собранное или выделенное биологическое поверхностно-активное вещество можно добавлять к другим культурам или композициям, содержащим микроорганизмы рода Bacillus, особенно когда микроорганизм находится в виде эндоспор. Это позволяет композиции изобретения иметь более высокую концентрацию биологического поверхностно-активного вещества, чем можно было бы получить или допускалось бы микроорганизмом в обычных условиях.

Композиция изобретения может быть получена за счет добавления биологического поверхностно-активного вещества в композицию, содержащую микроорганизм, для предоставления биологического поверхностно-активного вещества в количестве между 2 мг/л и 7000 мг/л. В некоторых вариантах выполнения, микроорганизм находится в среде для культивирования. В других вариантах выполнения, микроорганизм находится в воде, в частности в деионизированной воде. В некоторых вариантах выполнения, микроорганизм находится в культуральной жидкости, и его разбавляют водой, в частности деионизированной водой.

В некоторых вариантах выполнения, где продуцирующим биологическое поверхностно-активное вещество микроорганизмом является микроорганизм из рода Bacillus, культивирование микроорганизма для использования в композиции также вырабатывает биологическое поверхностно-активное вещество. Вследствие этого по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество в микроорганизме и композиции можно получить на единственной стадии. В данном варианте выполнения, композиция может содержать среду для культивирования и биологическое поверхностно-активное вещество. В данном варианте выполнения, если требуется увеличенное количество биологического поверхностно-активного вещества, дополнительно биологическое поверхностно-активное вещество можно добавить.

В некоторых вариантах выполнения, по меньшей мере некоторая часть микроорганизмов рода Bacillus в композиции находится в виде спор. В это время также можно добавить поверхностно-активное вещество, как описано выше.

В некоторых вариантах выполнения, культуральную жидкость в результате одновременного получения микроорганизма рода Bacillus и биологического поверхностно-активного вещества разбавляют, и за счет добавления культуральной жидкости в смесь воды, регулятора pH, такого как натрий гидроксид, монокалий фосфат или лимонная кислота, и поверхностно-активного вещества, образуются эндоспоры.

В некоторых вариантах выполнения, после образования эндоспор, в композицию добавляют дополнительное биологическое поверхностно-активное вещество, например, в количествах от 100 до 1000 мг/л, конкретно приблизительно от 400 до 750 мг/л.

Композиция изобретения содержит микроорганизм в любом подходящем количестве, однако, в некоторых вариантах выполнения, микроорганизм присутствует в количестве, составляющем приблизительно от 1×10⁴ кое/мл до 1×10¹³ кое/мл.

В еще одном аспекте изобретения предоставлен микроб Bacillus subtilis RSA-203.

Далее изобретение будет описано со ссылкой на следующие примеры, которые иллюстрируют некоторые предпочтительные аспекты изобретения. Однако должно быть понятно, что обстоятельность следующего описания изобретения не должна подменить утверждение общего характера предшествующего описания.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 представлен график роста микроорганизмов с течением времени при различных количествах сульфатионов.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Получение биологического поверхностно-активного вещества сурфактина

Штамм Bacillus subtilis NRRL B-3383 (полученный от Министерства сельского хозяйства Соединенных Штатов) из культуры бактерий переносили в 2% объем на объем инокуляте в 4 л встряхиваемые колбы, содержащие 2,5 л 10% MMS бульона на основе барды. MMS бульон на основе барды содержит:

компонент	Количество
барда	100 мл
аммония нитрат	4,1 г

натрия фосфат двухосновный	5,68 г
тетранатрий тетрагидрат EDTA	1,8 мг
марганца сульфат	6,8 мг
автоклавированная деионизированная вода	до 1 л

Колбы помещали на орбитальные встряхиватели (SKC 6100, Jeio Tech) при 150 об/мин во время инкубирования при 30°C (MCO-801C Инкубатор, Sanyo). Спустя 72 часа, колбы изымали с инкубатора, и биомассу извлекали из сырой культуральной жидкости посредством центрифугирования при 8,500 об/мин в течение 20 мин при 4°C (Sorvall Evolution RC).

PH полученного в результате супернатанта доводили до pH, равного 2,0, используя HCl, что приводило к преципитации сурфактина, а супернатант оставляли на ночь при 4°C для предоставления возможности завершения преципитации. Преципитат собирали посредством центрифугирования при 8500 об/мин в течение 20 минут при 4°C. Приблизительно 2,5 г/л сырьевого материала собирали в гранулу. Гранулу суспендировали в деионизированной воде, и pH доводили до 8,0, используя 1M NaOH. Водный раствор экстрагировали с равным объемом дихлорметана. Слой дихлорметана отделяли и обеспечивали возможность испарения для предоставления очищенного кристаллического сурфактина в количестве от 50 мг/л до 750 мг/л.

Образцы кристаллического сурфактина исследовали на чистоту по сравнению со стандартной композицией чистого сурфактина (Sigma Aldrich, чистота 98%). Анализ стандартной композиции с помощью LC-MS показал пики со временем удерживания при 1,03, 1,23, 1,61, 1,74, 2,15 и 2,93 минут. Чистоту рассчитывали на основании на площади пика.

Было обнаружено, что чистота четырех образцов, протестированных на чистоту с использованием способа выше, составляла 80%, 56%, 58% и 61%.

Пример 2: Получение смесей сурфактина и лихенизина

Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis использовали для инокулирования 4 л встряхиваемых колб, содержащих 10% MMS бульона на основе мелассы. MMS бульон на основе мелассы содержал:

компонент	Количество
меласса	100 мл
аммония нитрат	4,1 г
натрия фосфат двухосновный	5,68 г
тетранатрий тетрагидрат EDTA	1,8 мг
марганца сульфат	6,8 мг
автоклавированная деионизированная вода	до 1 л

Колбы помещали на орбитальные встряхиватели (SKC 6100, Jeio Tech) при 150 об/мин во время инкубирования при 30°C (MCO-801C Инкубатор, Sanyo). Спустя 72 часа колбы изымали из инкубатора, и биомассу извлекали из культуральной жидкости посредством центрифугирования при 8500 об/мин в течение 20 мин при 4°C (Sorvall Evolution RC).

Пример 3:

В 1 литровом биореакторе получали буферный раствор, содержащий 800 мл деминерализованной воды, монокалийфосфат (20,4 г), динатрийфосфат (28,4 г) и дрожжевой экстракт (5 г). Буфер перемешивали, и pH доводили до 7. Затем буфер автоклавировали. В 1 литровом биореакторе, 200 мл буферного раствора перемешивали с магния сульфатом (2 мл раствора 12 г/100 мл), кальция хлоридом (1 мл, 0,1M), гептагидратом сульфата железа (1 мл раствора 15,7 г/100 мл), моногидратом сульфата марганца (1 мл раствора 3,8 г/100 мл), натрий EDTA (1 мл раствора 0,18 г/100 мл) и глюкозы (20 мл деионизированной воды, 20 г/80 г) и аммония нитратом (10 мл раствора 82 г/200 мл). Споры видов Bacillus инокулировали в биореактор с 2% масс. Биомассу взбалтывали при 300 об/мин в течение 12 часов при 35°C. Bacillus инкубировали до тех пор, пока плотность клеток не составила 1×10¹⁴ кое на мл, а OD_600нм не составила 2,2.

Пример 4: Совместное получение видов Bacillus и биологического поверхностно-активного вещества

2200 фунтов (998 кг) деминерализованной воды добавляли в реактор из нержавеющей стали на 560 галлон (2200 л) и нагревали до 35°C. Добавляли 8,7 фунтов (3,95 кг) монокалийфосфата и 13,3 фунтов (6 кг) динатрийфосфата, и композицию перемешивали. Магния сульфат (240 г), кальция хлорид (33 г), EDTA (2,2 г) растворяли в 100 мл воды, добавляли железа сульфат (104 г), марганца сульфат (41,7 г), декстрозы моногидрат (10,7 фунтов, 4,85 кг), автоклавированный дрожжевой экстракт (2,14 фунтов, 0,97 кг), аммония хлорид (6,1 фунтов, 2,77 кг) и натрия нитрат (9,6 фунтов, 4,35 кг), и перемешивание продолжали при температуре, равной 35°C. добавляли 23 л Bacillus инокулята, имеющего OD_600нм, равную 2,2, и поверхностное натяжение больше чем 50 дин/см. Смесь перемешивали и сохраняли при 35°C и аэрировали фильтрованным воздухом до уровня растворенного кислорода, составляющего 50%. Культивирование останавливали, когда среда для культивирования достигала оптической плотности от 1,7 до 2,0 оптических единиц.

Пример 5: Композиция

Затем получали композицию для использования в способах изобретения за счет дополнительного разбавления среды для культивирования, полученной в примере 4. В реактор для разбавления из нержавеющей стали на 1000 галлонов добавляли 2200 фунтов (998 кг) деминерализованной воды и добавляли мононатрия фосфат (5 фунтов, 2,27 кг) со взбалтыванием. Добавляли натрий гидроксид (5-60 фунтов, 2,27-27,2 кг) и <1% масс неионной додецилбензенсульфоновой кислоты. pH доводили до 6-8 с помощью натрий гидроксида. Затем добавляли культивированные бактерии и среду, и композицию перемешивали. Проверяли поверхностное натяжение и добавляли дополнительный концентрированный пенный конденсат сурфактина для обеспечения поверхностного натяжения, составляющего 27-35 дин/см.

Пример 6: Композиция

Способ примера 5 повторяли за исключением того, что с помощью лимонной кислоты pH доводили до 3,5-5.

Пример 7: Выработка аммиака в куриной подстилке

Куриную подстилку, содержащую куриный помет, делили на два короба в кубический ярд в равных количествах. Один короб отслеживали на образование аммиака без дополнительной обработки (регулирования). Другой короб обрабатывали посредством распыления на куриную подстилку композиции, содержащей микробы видов Bacillus, включая B. subtilis, остаток барды и сурфактин. Композицию получали в результате процесса культивирования и разбавляли водой до 5-25% на литр, и подстилку обрабатывали с нормой 1 л на 100 квадратных метров.

Результаты:

Контрольный короб имел концентрацию аммиака, равную 20 частей на миллион. Обработанный короб имел концентрацию аммиака, равную 8 частей на миллион.

Пример 8: выработка аммиака в птичниках для птицы

Использовали четыре птичника для птицы (бройлеров), каждый из которых имеет площадь, равную 22000 квадратных футов (2044 м²) и вмещает 22300 птиц. Во всех четырех зданиях, подстилку для птицы обрабатывали 5 дней перед помещением в птичник птенцов птицы.

Птичник Один обрабатывали композицией примера 4. 12,5 (47,3 л) галлонов композиции примера 5 смешивали со 185 галлонами (700 л) воды, затем перемешивали и распыляли на подстилку для птицы, содержащую опилки и компост в половине птичника. Данный процесс повторяли с другими 12,5 галлонами (47,3 л) композиции в 185 галлонах (700 л) воды для обработки другой половины птичника.

Птичник Два обрабатывали композицией примера 5. 12,5 галлонов (47,3 л) композиции примера 5 смешивали с 185 галлонами (700 л) воды, затем перемешивали и распыляли на подстилку для птицы в половине птичника. Данный процесс повторяли с другими 12,5 галлонами (47,3 л) композиции в 185 галлонах (700 л) воды для обработки другой половины птичника.

Птичники Три и Четыре обрабатывали алюминия бисульфатом, вещество для регулирования pH. В каждом птичнике, 1650 фунтов (748 кг) алюминия бисульфата перемешивали в 500 галлонах (1893 л) воды и распыляли на подстилку для птицы.

В каждом птичнике водную обработку проводили с помощью моторизованного распылителя с 6 форсунками, оборудованного резервуаром на 200 галлонов (757 л) для подачи, установленным на четырехколесное транспортное средство. После нанесения, подстилку для птицы валковали трактором.

После обработки из каждого птичника брали три образца подстилки и анализировали на газообразный аммиак.

Птенцов птицы помещали в птичники, и в 1, 5, 16, 21 и 39 день брали образцы воздуха и анализировали на концентрацию аммиака, используя анализаторы газа "Дрегер" (Drager Safety Inc., Pittsburgh, PA, USA). Результаты показаны в таблице 1.

Таблица 1
	Первый день	Пятый день	Шестнадцатый день	Двадцать первый день	39 день
Птичник Один	10	10	20	20	12
Птичник Два	10	10	20	20	15

Птичник Три	0	20	18	>25	Вентиляторы в полном объеме
Птичник Четыре	0	20	18	>25	Вентиляторы в полном объеме

Фраза «вентиляторы в полном объеме» указывает, что для требуемого снижения концентрации аммиака потребовалась механическая вентиляция птичника.

Птицам во всех четырех птичниках оценивали здоровье, заболеваемость и массу. Птицы во всех четырех птичниках были здоровы.

Ноги птицы анализировали посредством классифицирования лап; от здоровых лап, маркированных 1, до инфецированных и покрытых волдырями лап, маркированных 4. В птичниках Один и Два классификация лап составила 1. Ни одна из птиц не имела волдырей на ногах.

Уровни заболеваемости в птичниках Один и Два понизились в среднем у 133 птиц по сравнению с птичниками Три и Четыре.

Масса птиц увеличилась в птичниках Один и Два на 15-20 пунктов по сравнению с птичниками Три и Четыре. Она равняется в общем 11000 фунтам дополнительной массы за 35 дней в птичниках один и Два.

Пример 9:

На 21 день исследования на птицеферме примера 8, был взят образец подстилки для птицы и подстилку анализировали посредством высевания на агаровые пластинки. Пластинки инкубировали, а затем окрашивали по Граму. Присутствовали только грам-положительные штаммы.

Пример 10: Контроль патогенов Salmonellae

Куриный навоз стерилизовали автоклавированием при минимальной температуре, составляющей 121°C, в течение 35 минут, обеспечивая, чтобы образцы не содержали конкурирующих бактерий. После стерилизации, в куриный навоз инокулировали Salmonella enterica и обеспечивали возможность инкубирования в течение 24 часов. После инкубирования неконтрольные образцы куриного навоза обрабатывали композицией примера 6 посредством распыления приблизительно 100 мкл композиции на куриный навоз (25 г). Контрольные образцы содержали стерилизованный куриный навоз и стерилизованный куриный навоз, инокулированный Salmonella enterica и инкубированный в течение 24 часов, но данные контрольные образцы не обрабатывали композицией примера 6.

В образцах анализировали рост бактерий, как Salmonella enterica, так и Bacillus subtilis на ростовой среде (ATCC среда 3, питательный агар). Анализ контрольных образцов проводили после стерилизации (время 0), после инокуляции и инкубирования в течение 24 часов (время 0), а анализ тестируемых образцов выполняли через 3, 6, 24, 48 и 96 часов после нанесения композиции примера 6.

Для проведения различия между ростом Bacillus spp. и Salmonella spp. использовали дополнительный тест с трехсахарным агаром с железом (TSI). Salmonella enterica вырабатывает сульфид водорода, приводящий к темному цвету в данном тесте, тогда как Bacillus spp. не приводит.

Наличие Salmonella enterica оценивали в течение периода времени, равного четырем дням. После четырехдневного периода тестовые образцы повторно инокулировали Salmonella enterica и инкубировали в течение 24 часов. Затем образцы оценивали в течение дополнительного периода, равного четырем дням. Образцы для повторного инокулирования первоначально инокулировали Salmonella enterica, инкубированной в течение 24 часов, обрабатывали композицией примера 5, инкубировали в течение 4 дней, затем повторно инокулировали Salmonella enterica и инкубировали в течение 24 часов. Затем образец анализировали во время ноль (контроль) через 3, 6, 24, 48 и 96 часов. Результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2
Образец	Описание	Время (час)	Результаты	комментарии
Контроль 1	Стерилизованный куриный навоз	0	Без роста	-
Контроль 2	Стерилизованный куриный навоз, инокулированный S. enterica	0	рост	Положительный рост для S. enterica по тесту TSI
Образец 1	Стерилизованный куриный навоз, инокулированный S. enterica и обработанный композицией примера 5	3	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella
		6	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella
		24	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella
		48	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella
96	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella

Контроль 3	Обработанный образец, повторно инокулированный S. enterica	0	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella
Образец 2	образец, повторно инокулированный S. enterica	3	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella
		6	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella
		24	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella
		48	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella
96	рост	тест TSI отрицательный на Salmonella

Не наблюдалось роста патогенной Salmonella enterica в любом из тестируемых образцов, обработанных композицией примера 6 от 3 часов до 96 часов. Кроме того, нет роста Salmonella enterica в повторно инокулированных образцах в течение 3 часов до 96 часов.

Это демонстрирует, что композиция, содержащая микроорганизм рода Bacillus и биологическое поверхностно-активное вещество, является эффективной по сравнению с S. Enterica, обнаруженной в курином навозе. Обработка является эффективной в пределах 3 часов и имеет длительный эффект.

Пример 11: Контроль вредителей

25 галлонов (95 л) композиции примера 6 добавляли к 400 галлонам (1514 л) воды и распыляли на 21000 квадратных футов подстилки для птицы. Затем подстилку валковали. Подстилку проверяли на наличие личинок чернотелки, и любые обнаруженные личинки собирали и отслеживали. Личинки чернотелки погибали в пределах 2 часов воздействия при обработке подстилки. Спустя 24 часа после обработки в обработанной подстилке не было обнаружено живых личинок чернотелки.

Пример 12: Контроль патогена Campylobacter jejuni

Куриный навоз стерилизовали автоклавированием при минимальной температуре, равной 121°C, в течение 35 минут, для предоставления образцов, не содержащих конкурирующих бактерий. После стерилизации, куриный навоз инокулировали Campylobacter jejuni. Неконтрольные образцы куриного навоза обрабатывали композицией примера 6 посредством распыления приблизительно 100 мкл композиции на куриный навоз (25 г). Контрольные образцы содержали стерилизованный куриный навоз и стерилизованный куриный навоз, инокулированный Campylobacter jejuni, но ни один образец не обрабатывали композицией примера 6. Образцы инкубировали при 42°C.

В образцах анализировали рост бактерий в среде Campylobacter jejuni. Анализ контрольных образцов проводили после стерилизации (время 0), после инокуляции и инкубирования в течение 24 часов (время 0) соответственно, и анализ тестируемых образцов выполняли через 3, 6, 24, 48 и 96 часов после нанесения композиции примера 6.

После 96 часового тестового периода, тестируемые образцы повторно инокулировали Campylobacte jejuni. Образец (контроль 4) оценивали во время 0 для подтверждения жизнеспособности бактерий. Затем повторно инокулированные образцы инкубировали в течение 96 часов и снова оценивали. Результаты показаны в таблице 3.

Таблица 3
Образец	Описание	Время (час)	Результаты
Контроль 1	Стерилизованный куриный навоз	0	Нет роста
Контроль 2	Стерилизованный куриный навоз инокулированный C. jejuni	0	Рост
Контроль 3	Образец примера 5	0	Нет роста
Образец 1	Стерилизованный куриный навоз, инокулированный C. jejuni и обработанный композицией Примера 5	3	Нет роста
		6	Нет роста
		24	Нет роста
		48	Нет роста
96	Нет роста
Контроль 4	Обработанный куриный навоз, повторно инокулированый С. jejuni	0	рост
Образец 2	Обработанный куриный навоз с C. jejuni	96	Нет роста

Болезнетворные Campylobacter jejuni не наблюдались ни в одном из тестируемых образцов, обработанных композицией примера 6 от 3 часов до 96 часов. Кроме того, не наблюдали рост в повторно инокулированном образце после 96 часов инкубирования.

Это демонстрирует, что композиция, содержащая микроорганизм рода Bacillus и биологическое поверхностно-активное вещество, является эффективной по сравнению с C. jejuni, обнаруженной в курином навозе. Обработка была эффективной в пределах 3 часов и имеет длительный эффект.

Пример 13: Уменьшение аммиака на предприятии несущей яйца птицы

Имеющее четыре яруса помещение для откладывания яиц с содержанием птицы в клетках и навозом, падающим на транспортерные ленты, оценивали на концентрацию аммиака. На предприятии навоз с верхних ярусов доставляется с помощью транспортерной ленты в v-образную дверь платформы, разделяющей верхний и нижний этажи. Когда дверь открывается, навоз (16000 фунтов) помещается на валок приблизительно 6 футов высоты.

Валок навоза опыляли композицией примера 5 в 4 местах.

В местах 1 и 2, композицию наносили неразбавленной. В местах 3 и 4 композицию примера 5 наносили разбавленной водой 1:16. Вентиляторы не использовали, если уровни аммиака оставались ниже 50 частей на миллион.

Когда навоз оставляли необработанным, а для развеивания образующегося аммиака вентиляторы не использовали, уровни аммиака на предприятие достигали 500 частей на миллион. Когда вентиляторы использовали, уровни аммиака опускались до <50 частей на миллион.

Уровни аммиака замеряли с интервалами после обработки, а результаты показаны в таблице 4.

Таблица 4
Дата	Время	Место 1	Место 2	Место 3	Место 4	Место 5
30/10	9,21 am	19 частей на миллион	18 частей на миллион	23 частей на миллион	23 частей на миллион	25 частей на миллион
4/11	8,03 am	46 частей на миллион	44 частей на миллион	50 частей на миллион *	52 частей на миллион *	56 частей на миллион *
10/11	3,10 pm	30 частей на миллион	21 частей на миллион	30 частей на миллион	31 частей на миллион	41 частей на миллион
12/11	9,36 am	11 частей на миллион	6 частей на миллион	13 частей на миллион	11 частей на миллион	19 частей на миллион
15/11	10,05 am	26 частей на миллион	22 частей на миллион	42 частей на миллион	40 частей на миллион	40 частей на миллион
20/11	3,30 pm	29 частей на миллион	24 частей на миллион	36 частей на миллион	41 частей на миллион	45 частей на миллион
22/11	8,29 am	39 частей на миллион	28 частей на миллион	35 частей на миллион	36 частей на миллион	41 частей на миллион
24/11	9,40 am	31 частей на миллион	29 частей на миллион	36 частей на миллион	40 частей на миллион	44 частей на миллион
28/11	7,51 am	29 частей на миллион	39 частей на миллион	47 частей на миллион	53 частей на миллион	55 частей на миллион
*неэффективное распыление приводило к повышенным уровням аммиака, которые падали при правильном повторном нанесении.

Результаты показывают, что нанесение композиции изобретения на птичий помет было способно поддерживать уровни аммиака ниже 50 частей на миллион в течение более чем 28 дней.

В варианте, навоз можно обрабатывать посредством опыления с непрерывной низкой дозировкой во время помещения на дверь платформы или во время нахождения на двери платформы для обеспечения контакта с большей площадью поверхности.

Пример 14: Альтернативное получение биологического поверхностно-активного вещества

Таблица 5
	Количество/150 л	Количество/150 л
KH2PO4 15 мМ монокалия фосфат	306 г	2,04 кг
Na2HPO4	581,25 г	3,87 кг
27,3 мМ двунатрия фосфат (MW 141,96)
MgSO4⋅7H2O 2,4 мМ гептагидрат сульфата магния (MW 246,48)	88,7 г	592 г
CaCl2⋅6H2O 7 мкм гексагидрат хлорида кальция (MW 219,08)	0,23 г	1,5 г
C10H14N2Na2O8⋅2H2O 4 мкм дигидрат динатрия EDTA (MW 372,24)	0,22 г	1,5 г
FeSO4⋅7H2O 8 мкм гептагидрат сульфата железа (MW 284,05)	0,34 г	2,3 г
MnSO4⋅H2O 10мМ моногидрат мульфата магния (MW 151,0)	226 г	1,51 кг

C6H12O6⋅H2O 44г/л моногидрат глюкозы	6,6 кг	44 кг
Дрожжевой экстракт 1% м/о	150г	1 кг
NH4Cl 50мМ хлорид аммония (MW 53,49)	400 г	2,67 кг
NaNO3 50мМ нитрат натрия (MW 84,99)	638 г	4,25 кг

Соответствующее количество фильтрованной воды добавляли в биореактор и доводили до 35°C. С этого момента воду непрерывно аэрировали. Питательные вещества, перечисленные выше в таблице 5, добавляли в заданном порядке. Источники аммония и нитрата добавляли непосредственно перед инокуляцией препарата для предотвращения какого бы то ни было роста загрязняющих бактерий по причине отсутствия азота. Инокулят добавляли в количестве, необходимом для достижения первоначальной OD_66нм равной ~0,15. Условия и процесс культивирования контролировали по измерениям оптической плотности при OD_66нм.

Получение биологического поверхностно-активного вещества контролировали по измерениям поверхностного натяжения. Поверхностное натяжение бульона можно титровать посредством измерения неразбавленной культуральной жидкости и проводя разбавление для определения, что уровень биологического поверхностно-активного вещества выше критической концентрации мицеллообразования (CMC). Поверхностное натяжение не будет увеличиваться до тех пор, пока сурфактин не разбавят ниже CMC.

Штамм микроорганизма можно контролировать посредством культивирования образцов на MMS-Y и планшетах с кровяным агаром. Если используют смешанную культуру и типы колоний можно дифференцировать на агаровом планшете, инокуляты и итоговую культуру необходимо серийно разбавлять для проведения подсчета каждого штамма на планшете. Это может не только определять чистоту культуры, но также, если один штамм вне конкуренции с другими.

Пример 15: Эффект сульфата с различными концентрациями на культуре

Эффект сульфата на культуральной жидкости тестировали посредством удаления всех источников сульфата из среды и их замены хлоридными солями. Культуральную жидкость, содержащую монокалийфосфатный/двукалийфосфатный буфер, доводили до pH 7 гидроксидом калия. Затем в образцы вводили различные концентрации натрия сульфата (1,8 M) при 1 мл/л, 0,8 мл/л, 0,6 мл/л, 0,4 мл/л и 0,2 мл/л. Каждые полчаса оценивали оптическую плотность, pH и поверхностное натяжение. Данный тест проделали со штаммом бактерий RSA-203.

Результаты показаны на Фиг.1. Результаты показывают, что микроорганизмы растут одинаково хорошо с хлоридными солями, так же как с солями серной кислоты. Во всех образцах, поверхностное натяжение падало и стабилизировалось приблизительно на 27 дин за 5 часов.

1. Способ улучшения окружающей среды на птицеводческом предприятии, включающий нанесение на подстилку для птицы или на птичий помет на птицефабрике композиции, содержащей по меньшей мере один штамм Bacillus subtilis, по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, причем указанное биологическое поверхностно-активное вещество присутствует в композиции в количестве между приблизительно 2 мг/л и 7000 мг/л, а указанное поверхностно-активное вещество представляет собой алкилбензолсульфоновую кислоту или алкилбензолсульфонат.

2. Способ по п. 1, в котором композицию наносят на подстилку для птицы посредством распыления.

3. Способ по п. 1, в котором биологическое поверхностно-активное вещество присутствует в количестве, составляющем 2-850 мг/л.

4. Способ подавления или снижения образования аммиака на птицефабрике, включающий нанесение на подстилку для птицы или на птичий помет на птицефабрике композиции, содержащей по меньшей мере один штамм Bacillus subtilis, по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, причем указанное биологическое поверхностно-активное вещество присутствует в композиции в количестве между приблизительно 2 мг/л и 7000 мг/л, а указанное поверхностно-активное вещество представляет собой алкилбензолсульфоновую кислоту или алкилбензолсульфонат.

5. Способ уменьшения или уничтожения патогенных бактерий в подстилке для птицы, включающий нанесение на подстилку для птицы или на птичий помет на птицефабрике композиции, содержащей по меньшей мере один штамм Bacillus subtilis, по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, причем указанное биологическое поверхностно-активное вещество присутствует в композиции в количестве между приблизительно 2 мг/л и 7000 мг/л, а указанное поверхностно-активное вещество представляет собой алкилбензолсульфоновую кислоту или алкилбензолсульфонат.

6. Способ по п. 5, в котором патогенные бактерии выбирают из одного или более из Salmonella spp., Campylobacter spp., Staphylococcus spp., Escherichia spp., Pseudomonas spp, и Clostridium spp.

7. Способ по п. 6, в котором патогенные бактерии выбирают из одного или более из Salmonella enterica, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aerugenosa и Clostridium perfringens.

8. Способ уничтожения вредителей в подстилке для птицы, включающий нанесение на подстилку для птицы или на птичий помет на птицефабрике композиции, содержащей по меньшей мере один штамм Bacillus subtilis, по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, причем указанное биологическое поверхностно-активное вещество присутствует в композиции в количестве между, приблизительно, 2 мг/л и 7000 мг/л, а указанное поверхностно-активное вещество представляет собой алкилбензолсульфоновую кислоту или алкилбензолсульфонат.

9. Способ по п. 8, в котором вредителем являются личинки чернотелки.

10. Способ предотвращения или снижения пододерматита птицы или гангренозного дерматита на птицефабрике, включающий нанесение на подстилку для птицы на птицефабрике композиции, содержащей по меньшей мере один штамм Bacillus subtilis, по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, причем указанное биологическое поверхностно-активное вещество присутствует в композиции в количестве между приблизительно 2 мг/л и 7000 мг/л, а указанное поверхностно-активное вещество представляет собой алкилбензолсульфоновую кислоту или алкилбензолсульфонат.

11. Композиция для улучшения окружающей среды на птицеводческом предприятии, содержащая по меньшей мере один штамм Bacillus subtilis, по меньшей мере одно биологическое поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, причем указанное биологическое поверхностно-активное вещество присутствует в композиции в количестве между, приблизительно, 2 мг/л и 7000 мг/л, а указанное поверхностно-активное вещество представляет собой алкилбензолсульфоновую кислоту или алкилбензолсульфонат.

12. Композиция по п. 11, в которой указанный по меньшей мере один штамм Bacillus subtilis присутствует в количестве от 1×10⁴ кое/мл до 1×10¹³ кое/мл.

13. Композиция по п. 11, в которой указанный по меньшей мере один штамм Bacillus subtilis присутствует в вегетативном состоянии в виде эндоспор или смеси вегетативного состояния и эндоспор.

14. Композиция по п. 11, в которой биологическое поверхностно-активное вещество выбрано из сурфактина, лихенизина, фенгицина, итурина и их смесей.

15. Композиция по п. 14, в которой биологическое поверхностно-активное вещество выбрано из сурфактина, лихенизина и их смесей.

16. Композиция по п. 15, в которой биологическим поверхностно-активным веществом является сурфактин.

17. Композиция по п. 11, в которой биологическое поверхностно-активное вещество присутствует в количестве от 50 до 7000 мг/л.

18. Композиция по п. 11, в которой указанное поверхностно-активное вещество представляет собой алкилбензолсульфоновую кислоту.