Липосомы с ретиноидом для усиления модуляции экспрессии hsp47

Изобретение относится к биотехнологии. Описана Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, связанного с hsp47, содержащая носитель для лекарственного средства и двухнитиевую молекулу нуклеиновой кислоты, где носитель для лекарственного средства содержит ретиноид и липид, где двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты содержит структуру:

5' (N)_x-Z 3' (антисмысловая нить)

3' Z'-(N')_y-z'' 5' (смысловая нить),

где каждый N и N' представляет собой нуклеотид, который является немодифицированным или модифицированным или нестандартной составляющей. Также описан способ применения указанной композиции для лечения заболеваний, связанных с экспрессией hsp47, включая фиброз. Изобретение расширяет арсенал средств, предназначенных для лечения заболеваний, связанных с экспрессией hsp47. 2 н. и 47 з.п. ф-лы, 32 ил., 13 табл., 23 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ НА ПОЛУЧЕНИЕ ПАТЕНТА

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/497,447, поданной 15 июня 2011 г., и предварительной заявке на патент США №61/494,832, поданной 8 июня 2011 г. Каждая из которых включена в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие липосомы с ретиноидом для усиления модуляции экспрессии hsp47, осуществляемой siRNA.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фиброз печени может быть вызван звездчатыми клетками печени (HSC), приводящими к тому, что множество типов молекул коллагена и фибронектина осаждается на интерстициальной ткани. Это приводит к циррозу печени, печеночной недостаточности и/или гепатоцеллюлярной карциноме. Кроме того, хронический панкреатит развивается в результате панкреатического фиброза по тому же механизму, что и фиброз печени (Madro, et al, 2004; Med Sci Monit. 10:RA166-70; Jaster, 2004, Mol Cancer. 6:26). Кроме того, звездчатые клетки участвуют в нарушениях в голосовых связках и гортани, таких как рубцевание голосовых связок, фиброз слизистой оболочки голосовых связок и ларингеальный фиброз. Для профилактики или лечения фиброза в этих органах и в другом месте в организме необходимо разработать носитель для лекарственного средства и набор носителя для лекарственного средства.

Звездчатые клетки являются одним из важных целевых кандидатов для лечения фиброза (Fallowfield et al, 2004, Expert Opin Ther Targets. 8:423-35; Pinzani, et al, 2004, Dig Liver Dis.36:231-42). В ходе фиброза звездчатые клетки активируются цитокинами из близлежащих клеток с продуцированием множества факторов, которые вызывают фиброз печени. Звездчатые клетки несут витамин А и принадлежат к семейству миофибробластов.

С помощью терапевтических способов профилактики или лечения фиброза пытаются контролировать метаболизм коллагена, содействовать системе разрушения коллагена и ингибировать активацию звездчатых клеток. Однако во всех этих случаях низкая специфичность действия и/или низкая специфичность к органу вызывают проблемы, связанные с ограниченной эффективностью и нежелательными побочными эффектами.

Ингибирование синтеза белка коллагена не было установлено как терапевтический способ. Потенциал молекул, направленный на продуцирование коллагена, ограничен возможностью возникновения побочных эффектов. Непосредственное ингибирование продуцирования коллагена обеспечивает другой терапевтический способ профилактики или лечения фиброза. В таком способе требуется контролирование одного или более различных типов коллагена типов I-IV. Этот способ может осуществляться через белок теплового шока (HSP47), специфичный к коллагену молекулярный шаперон, который необходим для внутриклеточного транспорта и молекулярного созревания, необходимого для всех типов коллагена. Поэтому если функция HSP47 может специфически контролироваться в звездчатые клетки, существует возможность ингибирования фиброза печени.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к носителю для лекарственного средства и набору носителя для лекарственного средства, которые обеспечивают специфический транспорт диагностического и/или терапевтического лекарственного средства в звездчатые клетки. Носитель для лекарственного средства согласно настоящему изобретению может быть выбран из полимерных мицелл, липосом, эмульсий, микросфер и наносферных форм, и посредством связывания с ним или включения в него ретиноида или конъюгата ретиноида и терапевтическое средство могут быть специфически транспортированы в HSC. Ретиноиды включают следующие: витамин А, ретиноевая кислота, насыщенный витамин А, ретиналь, третиноин, адапален, ретинола пальмитат или фенретинид (4-HPR). Кроме того, при получении лекарственное средство включает одну молекулу или множество молекул, выбранных из следующего: ингибиторы активности TGFP, усеченный рецептор TGFP типа II и растворимый рецептор TGFP типа II, препараты фактора роста, такие как HGF, промоторы продукции ММР, такие как ММР ген-содержащий аденовирусный вектор, ингибиторы клеточной активации и/или ингибиторы роста, включающие PPARγ-лиганд, антагонист рецептора ангиотензина-II типа I, PDGF тирозинкиназный ингибитор, и ингибитор натриевых каналов, такой как амилорид, и индукторы апоптоза, такие как соединение 861 и глиотоксин; и при введении его, например, перорально, парентерально, внутривенно или интраперитонеально субъекту, у которого есть риск развития фиброза или симптомов фиброза, или субъектам, имеющим различные связанные с фиброзом нарушения, такие как, например, цирроз печени, печеночная недостаточность, рак печени или хронический панкреотит, активация звездчатых клеток может подавляться, и. таким образом, предотвращается, ингибируется или облегчается фиброз и/или связанное с фиброзом нарушение у указанного субъекта. Альтернативно или в дополнение к этому, посредством применения носителя для лекарственного средства, который заключает в себя рибозим, антисмысловую РНК или siRNA, которая специфически ингибирует HSP47 или TIMP, который является ингибитором ММР, секреция коллагенов типа I-IV может одновременно ингибироваться, и, как результат, фиброгенез может быть эффективно ингибирован. Вариантом выполнения настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая двухнитевую молекулу нуклеиновой кислоты и молекулу, содержащую смысловая нить и антисмысловую нить, где смысловая нить и антисмысловая нить выбираются из олигонуклеотидов, описанных как SERPINH12 (SEQ ID NOS: 60 и 127), SERPINH1_45a (SEQ ID NOS: 98 и 165), и SERPINH1_51 (SEQ ID NOS: 101 и 168) в Таблице 4, приводится ниже, и носитель для лекарственного средства, содержащий смесь липосомы и ретиноида или конъюгата ретиноида. Ретиноидом может быть одно или более из следующего: витамин А, ретиноевая кислота, насыщенный витамин А, ретиналь, третиноин, адапален, ретинола пальмитат или фенретинид. Предпочтительно ретиноид содержит конъюгат ретиноевой кислоты, более предпочтительно ретиноид-PEG конъюгат. Липосома может состоять из бислоя липидных молекул и, кроме того, может состоять из ретиноида. Ретиноид предпочтительно присутствует в концентрации от 0.2 до 20 мас. % в носителе для лекарственного средства. Липосома может состоять из внутренней поверхности, которая инкапсулирует внутреннюю часть липосомы, и внешней поверхности, которая доступна для внешней жидкой среды липосомы. Ретиноид может быть связан с липидным бислоем. Двухнитевая нуклеиновая кислота может быть выставлена на внешней поверхности липосомы.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты включает антисмысловую нить, имеющую SEQ ID NO:127 и содержащую 2'-O-метил остаток сахар, (2'ОМе)-модифицированные рибонуклеотиды; 2'-5'-рибонуклеотиды в по меньшей мере одном из положений 1, 5, 6 или 7; и 3'-терминальную ненуклеотидную составляющую, ковалентно связанную с 3'-концом; и смысловую нить, имеющую SEQ ID NO:60 и содержащую по меньшей мере один2'-5'-рибонуклеотид или 2'ОМе модифицированный рибонуклеотид; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу. В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:127 и содержит 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:60 и содержит пять последовательных 2'-5'-рибонуклеотиды в 3'-концевых положениях 15,16,17, 18, и 19; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает 2'ОМе модифицированный рибонуклеотид или 2'-5'-рибонуклеотид в положении 1 антисмысловой нити. (Все ссылки на нуклеотидные положения приводятся на основе 5'>3' направления олигонуклеотида как для смысловой, так и для антисмысловой нитей двухнитевой молекулы нуклеиновой кислоты.)

В различных вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:98 и содержит 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях при 3'-конце; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:165 и содержит 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6 или 7; и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу. В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:98 и содержит 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; С3-ОН 3' составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:165 и содержит 2'OMe модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит 2'ОМе модифицированный рибонуклеотид в положении 2.

В различных вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:101 и содержит 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды; необязательный 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9 или 10; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:168 и содержит 2'OMe модифицированные рибонуклеотиды; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6, или 7; и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу. В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:101 и содержит 2'OMe модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:168 и содержит 2'OMe модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 11 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит 2'OMe модифицированный рибонуклеотид в положении 13 в антисмысловой нити и или в положении 2 в смысловой нити.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая двухнитевую молекулу нуклеиновой кислоты и носитель для лекарственного средства, содержащий смесь ретиноида и липида, где двухнитевое олигонуклеотидное соединение содержит структуру (A1):

(A1) 5' (N)_x-Z 3' (антисмысловая нить)

3' Z'-(N')_y-z'' 5' (смысловая нить)

где каждый N и Ν' представляет собой нуклеотид, который является немодифицированным или модифицированным, или нестандартной составляющей;

где каждый (Ν)_x и (N')_y представляет собой олигонуклеотид, в котором каждый последующий N или Ν' соединен со следующим N или N' ковалентной связью;

где каждый Ζ и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, то включает 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует;

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу (N')_y;

где каждый из х и у независимо представляет собой целое число от 18 до 40;

где последовательность (N')_y комплементарна последовательности (N)_x; и где (N)_x включает антисмысловую последовательность к мРНК кодирующей последовательности для человеческого hsp47, где примером является SEQ ID NO:1, которая показана далее.

В настоящей заявке обеспечиваются композиции, способы и наборы для модуляции экспрессии генов-мишеней. Согласно различным объектам и вариантам настоящего изобретения композиции, способы и наборы, которые обеспечиваются в настоящей заявке, модулируют экспрессию белка теплового шока 47 (hsp47), который также известен как SERPINH1. Композиции, способы и наборы могут включать применение молекул нуклеиновых кислот (например, малые интерферирующие нуклеиновые кислоты (siNA), короткие интерферирующие РНК (siRNA), двухцепочечные РНК (dsPHK), микро-РНК (miPHK) или короткие РНК, образующие шпильки (shPHK)), которые связывают последовательность нуклеотидов (например, последовательность мРНК), кодирующую hsp47, например, кодирующую последовательность мРНК hsp47 человека, примером которой является SEQ ID NO:1. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации композиции, способы и наборы согласно настоящему описанию подавляют экспрессию hsp47. Например, обеспечиваются молекулы siNA (например, молекулы dsNA длины RISC или молекулы dsNA длины дайсера), которые снижают или подавляют экспрессию hsp47. Также обеспечиваются композиции, способы и наборы для лечения и/или предотвращения заболеваний, состояний или нарушений, вызываемых hsp47, таких как фиброз печени, цирроз печени, пневмофиброз, включая фиброз легких (включая интерстициальный легочный фиброз (ILF)), фиброз почек в результате любых заболеваний (например, хроническое заболевание почек (CKD), включая терминальную стадию почечной недостаточности (ESRD), перитонеальный фиброз, хроническое повреждение печени, фибриллогенез, фибротические заболевания других органов, аномальные рубцы (келоидные рубцы) в результате любых возможных типов повреждений кожи: случайных и ятрогенных (операции); склеродермия; кардиофиброз, неудачная фильтрующая операция при глаукоме, а также кишечные спайки.

Одним объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, как описано выше, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы) в качестве компонента фармацевтической композиции, в которой молекула включает смысловую нить и антисмысловую нить; каждая нить молекулы нуклеиновой кислоты независимо составляет 15-49 нуклеотидов в длину; 15-49 нуклеотидная последовательность антисмысловой нити комплементарна последовательности мРНК, кодирующей человеческий hsp47 (например, SEQ ID NO: 1); и 15-49 нуклеотидная последовательность смысловой нити комплементарна последовательности антисмысловой нити и включает 15-49 нуклеотидную последовательность мРНК, кодирующую человеческий hsp47 (например, SEQ ID NO: 1).

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, последовательность антисмысловой нити, которая комплементарна последовательности мРНК, кодирующей человеческий hsp47, включает последовательность, комплементарную последовательности между нуклеотидами 600-800; или 801-899; или 900-1000; или 1001-1300 последовательности SEQ ID NO: 1; или между нуклеотидами 650-730; или 900-975 последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить включает последовательность, комплементарную последовательности мРНК, кодирующей человеческий hsp47, соответствующую нуклеотидам 674-693 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части; или нуклеотидам 698-716 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части; или нуклеотидам 698-722 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части; или нуклеотидам 701-720 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части; или нуклеотидам 920-939 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части; или нуклеотидам 963-982 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части; или нуклеотидам 947-972 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части; или нуклеотидам 948-966 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части; или нуклеотидам 945-969 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части; или нуклеотидам 945-963 последовательности SEQ ID NO: 1 или ее части.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула) как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, включает последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 4 или ее части; или SEQ ID NO: 6 или ее части; или SEQ ID NO: 8 или ее части; или SEQ ID NO: 10 или ее части; или SEQ ID NO: 12 или ее части; или SEQ ID NO: 14 или ее части; или SEQ ID NO: 16 или ее части; или SEQ ID NO: 18 или ее части; или SEQ ID NO: 20 или ее части; или SEQ ID NO: 22 или ее части; или SEQ ID NO: 24 или ее части; или SEQ ID NO: 26 или ее части; или SEQ ID NO: 28 или ее части; или SEQ ID NO: 30 или ее части; или SEQ ID NO: 32 или ее части; или SEQ ID NO: 34 или ее части; или SEQ ID NO: 36 или ее части; или SEQ ID NO: 38 или ее части; или SEQ ID NO: 40 или ее части; или SEQ ID NO: 42 или ее части; или SEQ ID NO: 44 или ее части; или SEQ ID NO: 46 или ее части; или SEQ ID NO: 48 или ее части; или SEQ ID NO: 50 или ее части; или SEQ ID NO: 52 или ее части; или SEQ ID NO: 54 или ее части; или SEQ ID NO: 56 или ее части; или SEQ ID NO: 58 или ее части. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке, включает последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 3 или ее части; или SEQ ID NO: 5 или ее части; или SEQ ID NO: 7 или ее части; или SEQ ID NO: 9 или ее части; или SEQ ID NO: 11 или ее части; или SEQ ID NO: 13 или ее части; или SEQ ID NO: 15 или ее части; или SEQ ID NO: 17 или ее части; или SEQ ID NO: 19 или ее части; или SEQ ID NO: 21 или ее части; или SEQ ID NO: 23 или ее части; или SEQ ID NO: 25 или ее части; или SEQ ID NO: 27 или ее части; или SEQ ID NO: 29 или ее части; или SEQ ID NO: 31 или ее части; или SEQ ID NO: 33 или ее части; или SEQ ID NO: 35 или ее части; или SEQ ID NO: 37 или ее части; или SEQ ID NO: 39 или ее части; или SEQ ID NO: 41 или ее части; или SEQ ID NO: 43 или ее части; или SEQ ID NO: 45 или ее части; или SEQ ID NO: 47 или ее части; или SEQ ID NO: 49 или ее части; или SEQ ID NO: 51 или ее части; или SEQ ID NO: 53 или ее части; или SEQ ID NO: 55 или ее части; или SEQ ID NO: 57 или ее части.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, включает последовательность, соответствующую любой из антисмысловых последовательностей, показанных в Таблице 4. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить и смысловая нить выбираются из пары последовательностей, показанных в Таблице 4. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить и смысловая нить выбираются из пары последовательностей, как показано в SERPINH1_4, SERPINH1_2, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 и SERPINH1_88. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить и смысловая нить выбираются из пары последовательностей, как показано в SERPINH1_4 (SEQ ID NOS: 195 и 220), SERPINH1_12 (SEQ ID NOS: 196 и 221), SERPINH1_30 (SEQ ID NOS: 199 и 224), и SERPINH1_58 (SEQ ID NOS: 208 и 233).

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, включают пару последовательностей, как показано в SERPINH1_4 (SEQ ID NOS: 195 и 220). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке, включают пару последовательностей, как показано в SERPINH1_12 (SEQ ID NOS: 196 и 221). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке, включают пару последовательностей, как показано в SERPINH1_30 (SEQ ID NOS: 199 и 224). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке, включают пару последовательностей, как показано в SERPINH1_58 (SEQ ID NOS: 208 и 233).

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, включает последовательность, соответствующую любой из антисмысловых последовательностей, показанных в Таблицах В или С.

В особенно предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, включает последовательность, соответствующую одной из антисмысловых последовательностей, как показано в Таблице 5. В особенно предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить и смысловая нить выбираются из пар последовательностей, как показано в Таблице 5. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке, включает антисмысловую и смысловую нити, выбранные из пар последовательностей, как изложено далее

В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, представленных далее

В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке в качестве в качестве компонента фармацевтической композиции, включает антисмысловую и смысловую нити, выбранные из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2 (SEQ ID NOS: 60 и 127). В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловые и смысловые нити включают пары последовательностей как изложено в SERPINH1_6 (SEQ ID NOS: 63 и 130). В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула), как раскрывается в настоящей заявке в качестве в качестве компонента фармацевтической композиции, включает антисмысловую и смысловую нити, выбранные из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_11 (SEQ ID NOS: 68 и 135). В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловые и смысловые нити включают пары последовательностей как изложено в SERPINH1_13 (SEQ ID NOS: 69 и 136). В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловые и смысловые нити включают пары последовательностей как изложено в SERPINH1_45 (SEQ ID NOS: 97 и 164). I В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловые и смысловые нити включают пары последовательностей как изложено в SERPINH1_45a (SEQ ID NOS: 98 и 165). В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловые и смысловые нити включают пары последовательностей как изложено в SERPINH1_51 (SEQ ID NOS: 101 и 168).

Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить молекулы нуклеиновой кислоты(например, молекула siNA), как раскрывается согласно настоящему изобретению в качестве компонента фармацевтической композиции, включает последовательность, соответствующую любой из антисмысловых последовательностей, показанных в любой из Таблиц D или Е.

В различных вариантах выполнения настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, антисмысловая нить может иметь 15-49 нуклеотидов в длину (например, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 нуклеотидов в длину); или 17-35 нуклеотидов в длину; или 17-30 нуклеотидов в длину; или 15-25 нуклеотидов в длину; или 18-25 нуклеотидов в длину; или 18-23 нуклеотидов в длину; или 19-21 нуклеотидов в длину; или 25-30 нуклеотидов в длину; или 26-28 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, антисмысловая нить может иметь 15-49 нуклеотидов в длину (например, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47,48 или 49 нуклеотидов в длину); или 17-35 нуклеотидов в длину; или 17-30 нуклеотидов в длину; или 15-25 нуклеотидов в длину; или 18-25 нуклеотидов в длину; или 18-23 нуклеотидов в длину; или 19-21 нуклеотидов в длину; или 25-30 нуклеотидов в длину; или 26-28 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения в молекулах нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы), как раскрывается в настоящей заявке, смысловая нить может иметь 19 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения в молекулах нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы), как раскрывается в настоящей заявке, антисмысловая нить и смысловая нить могут иметь 19 нуклеотидов в длину. Область дуплекса молекул нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы), как раскрывается в описании настоящего изобретения, может иметь 15-49 нуклеотидов в длину (например, около 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 нуклеотидов в длину), 15-35 нуклеотидов в длину; или 15-30 нуклеотидов в длину; или около 15-25 нуклеотидов в длину; или 17-25 нуклеотидов в длину; или 17-23 нуклеотидов в длину; или 17-21 нуклеотидов в длину; или 25-30 нуклеотидов в длину; или 25-28 нуклеотидов в длину. В различных вариантах выполнения настоящего изобретения в молекулах нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы), как раскрывается в настоящей заявке, область дуплекса может иметь 19 нуклеотидов в длину.

Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения смысловая и антисмысловая нити нуклеиновой кислоты (например, молекулы нуклеиновой кислоты SINA), обеспечиваемой согласно настоящему изобретению в качестве компонента фармацевтической композиции, являются отдельными полинуклеотидными нитями. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения, отдельная антисмысловая и смысловая нити образуют двухцепочечную структуру посредством водородных связей, например, путем связывания пар оснований по Уотсону-Крику. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения смысловая и антисмысловая нити являются отдельными нитями, которые ковалентно связаны друг с другом. Согласно другим вариантам выполнения настоящего изобретения смысловая и антисмысловая нити являются частью одной нити полинуклеотидов, имеющей как смысловой, так и антисмысловой участок; согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения указанная полинуклеотидная нить имеет шпилечную структуру.

Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула sINA) представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты (dsNA), которая симметрична в отношении липких концов и имеет тупой конец с обоих концов. Согласно другим вариантам реализации молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула SINA) представляет собой молекулу dsNA, которая имеет симметричные выступающие концы и имеет выступающий конец с обеих сторон молекулы dsNA; предпочтительно указанная молекула имеет липкие концы длиной 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеотидов; предпочтительно молекула имеет липкие концы из 2 нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации липкие концы представляют собой 5' липкие концы; согласно другим вариантам реализации липкие концы представляют собой 3' липкие концы. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения нуклеотиды на липких концах модифицированы с помощью модификаций согласно настоящему описанию. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения нуклеотиды на липких концах представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

Согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула SINA), в качестве компонента фармацевтической композиции, представляет собой молекулу dsNA, которая является асимметричной по липким концам и имеет тупой конец на одном конце молекулы и липкий конец на другом конце молекулы. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения липкий конец имеет длину 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеотидов; предпочтительно липкий конец составляет 2 нуклеотида. Согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения асимметричная молекула dsN А имеет 3'-липкий конец (например, 3'-липкий конец из 2 нуклеотидов) на одной стороне двухнитевого участка, образованного на смысловой нити, и тупой конец на другом конце молекулы. Согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения асимметричная молекула dsNA имеет 5'-липкий конец (например, 5'-липкий конец длиной 2 нуклеотида) на одной стороне дуплекса, образованного на смысловой нити, и тупой конец на другой стороне молекулы. Согласно другим предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения асимметричная молекула dsNA имеет 3'-липкий конец (например, 3'- липкий конец длиной 2 нуклеотида) на одной стороне двухнитевого участка, образованного на антисмысловой нити, и тупой конец на другой стороне молекулы. Согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения асимметричная молекула dsNA имеет 5'-липкий конец (например, 5'-липкий конец длиной 2 нуклеотида) на одной стороне двухнитевого участка, образованного на антисмысловой нити, и тупой конец на другой стороне молекулы. Согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения липкие концы представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула SINA), как компонент фармацевтической композиции, имеет шпилечную структуру (имеющую смысловую и антисмысловую нити на одном полинуклеотиде) со структурой петли на одном конце и тупым концом на втором конце. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты имеет шпилечную структуру со структурой петли на одном конце и выступающим вторым концом (например, выступающим концом длиной 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеотидов); согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения липкий конец представляет собой 3'-липкий конец; согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения липкий конец представляет собой 5'-липкий конец; согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения липкий конец находится на смысловой нити; согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения липкий конец находится на антисмысловой нити.

Согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения молекулу нуклеиновой кислоты выбирают из молекул нуклеиновых кислот, показанных в Таблице 3.

Молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекула SINA), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, могут включать одну или несколько модификаций или модифицированных нуклеотидов, такие как описанные в настоящей заявке. Например, молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула SINA) согласно настоящему изобретению может включать модифицированный нуклеотид, имеющий модифицированный остаток сахара; модифицированный нуклеотид, имеющий модифицированное нуклеиновое основание, или модифицированный нуклеотид, имеющий модифицированную фосфатную группу. Аналогично, молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула SINA) согласно настоящему изобретению может включать модифицированный фосфодиэфирный остов и/или может включать модифицированную концевую фосфатную группу.

Молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы SINA), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, могут иметь один или несколько нуклеотидов, которые включают модифицированную сахарную группу, например, согласно настоящему описанию. Согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения модифицированную сахарную группу выбирают из группы, состоящей из 2'-0-метила, 2'-метоксиэтокси, 2'-дезокси, 2'-фторо, 2'-аллила, 2'-0-(2-(метиламино)-2-оксиэтила), 4'-тио, 4'-(СН₂)₂-0-2'-мостика, 2'-LNA (рибозная составляющая LNA нуклеотида модифицирована внешним мостиком, соединяющим 2' кислород и 4' углерод) и 2'-0-(N-метилкарбамата).

Молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы sINA), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, могут иметь одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований, например, согласно настоящему изобретению, которые предпочтительно могут представлять собой нуклеиновое основание, выбранное из группы, состоящей из ксантина, гипоксантина, 2-аминоаденина, 6-метила и других алкильных производных аденина и гуанина, 2-пропила и других алкильных производных аденина и гуанина, 5-галоурацила и цитозина, 5-пропинилурацила и цитозина, 6-азо урацила, цитозина и тимина, 5-урацила (псевдоурацила), 4-тиоурацила, 8-гало, амино, тиола, тиоалкила, гидроксила и других замещенных в положении 8-замещенных аденинов и гуанинов, 5-трифторметила и других 5-замещенных урацилов и цитозинов, 7-метилгуанина и ациклонуклеотидов.

Молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы sINA), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, могут иметь одну или более модификаций фосфодиэфирного остова, например, как раскрывается в настоящем изобретении. Согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения фосфодиэфирная связь модифицирована посредством замещения фосфодиэфирной связи на фосфотиоатную, 3'-(или -5')дезокси-3'- (или-5')тио-фосфотиоатную, фосфодитиоатную, фосфоселенатную, 3'-(или -5')дезокси фосфинатную, боранофосфатную, 3'-(или -5')дезокси-3'-(или 5'-)амино фосфоамидатную, гидрофосфонатную, боранофосфатэфирную, фосфоамидатную, алкил или арил фосфонатную и фосфотриэфирную или фосфористую связи.

Согласно различным вариантам выполнения настоящего изобретения обеспечиваемые молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы siNA), в качестве компонента фармацевтической композиции, могут включать одну или несколько модификаций в смысловой нити, но не в антисмысловой нити. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения обеспечиваемые молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы siNK) включают одну или несколько модификаций в антисмысловой нити, но не в смысловой нити. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения обеспечиваемые молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы siNK) включают одну или несколько модификаций как в смысловой нити, так и в антисмысловой нити.

Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы siNA) в качестве компонента фармацевтической композиции имеют модификации, смысловая нить включает последовательность чередующихся модифицированных и немодифицированных нуклеотидов, и/или антисмысловая нить включает последовательность чередующихся модифицированных и не модифицированных нуклеотидов; согласно некоторым предпочтительным вариантам таких вариантов выполнения настоящего изобретения указанная модификация представляет собой 2'ОМе составляющую. Последовательность чередующихся модифицированных и немодифицированных нуклеотидов может начинаться с модифицированного нуклеотида на 5'-конце или 3'-конце одной из нитей; например последовательность чередующихся модифицированных и немодифицированных нуклеотидов может начинаться с модифицированного нуклеотида на 5'-конце или 3'-конце смысловой нити, и/или последовательность чередующихся модифицированных и немодифицированных нуклеотидов может начинаться с модифицированного нуклеотида на 5'-конце или 3'-конце антисмысловой нити. Если и антисмысловая и смысловая нити включают последовательность чередующихся модифицированных нуклеотидов, последовательность модифицированных нуклеотидов может иметь такую конфигурацию, что модифицированные нуклеотиды в смысловой нити расположены напротив модифицированных нуклеотидов в антисмысловой нити, или может происходит сдвиг по фазе в указанной последовательности, такой что модифицированные нуклеотиды смысловой нити находятся напротив немодифицированных нуклеотидов антисмысловой нити и наоборот.

Молекулы нуклеиновых кислот (например, молекулы SINK), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, могут включать 1-3 (т.е. 1, 2 или 3) дезоксинуклеотида на 3'-конце смысловой и/или антисмысловой нити.

Молекулы нуклеиновых кислот (например, молекулы SINK), как раскрывается в настоящей заявке в качестве компонента фармацевтической композиции, могут фосфатную группу на 5'-конце смысловой и/или антисмысловой нити.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения компонентом фармацевтической композиции являются двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие структуру (А1):

где каждый N и N' представляет собой нуклеотид, который является немодифицированным или модифицированным, или нестандартной составляющей;

где каждый (N)_x и (N')_y представляет собой олигонуклеотид, в котором каждый последующий N или N' соединен со следующим N или N' ковалентной связью;

где каждый Z и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, то включает 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует;

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу (N')_y;

где каждый х и у независимо представляет собой целое число от 18 и 40;

где последовательность (N')_y комплементарна последовательности (N)_x; и где (N)_x включает антисмысловую последовательность для SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, (N)_x включает антисмысловой олигонуклеотид, представленный в Таблице 4. В других вариантах выполнения настоящего изобретения (N)_x выбирается из антисмыслового олигонуклеотида, представленного в Таблицах В или С.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, ковалентная связь, соединяющая каждый последовательный N или N', представляет собой фосфодиэфирную связь.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, х=у и каждый из х и у равен 19, 20, 21, 22 или 23. В различных вариантах выполнения настоящего изобретения, х=у=19.

В некоторых вариантах выполнения молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы), как раскрывается в настоящей заявке, двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты представляет собой siRNA, siNA или miRNA.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено:

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_4 (SEQ ID NOS: 195 и 220). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_12 (SEQ ID NOS: 196 и 221). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_30 (SEQ ID NOS: 199 и 224). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_58 (SEQ ID NOS: 208 и 233).

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты в качестве компонента фармацевтической композиции содержат ДНК составляющую или несоответствие целевой в положении 1 антисмысловой нити (5'-конец). Такая структура описывается далее. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения описываются модифицированные молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие структуры (А2), как изложено далее:

где каждый N², N и N' представляет собой немодифицированный или модифицированный рибонуклеотид, или нестандартную составляющую;

где каждый (N)_x и (N')_y представляет собой олигонуклеотид, в котором каждый последующий N или N' соединен с соседним N или N' ковалентной связью;

где каждый х и у независимо представляет собой целое число от 17 и 39;

где последовательность (N')_y комплементарна последовательности (N)_x, и (N)_x комплементарна последовательности в целевой РНК;

где N¹ ковалентно связан с (Ν)_x и не совпадает с целевой РНК или представляет собой комплементарность ДНК составляющей и целевой РНК;

где Ν¹ представляет собой составляющую, выбранную из группы, состоящей из природного или модифицированного уридина, дезоксирибоуридина, риботимидина, дезоксириботимидина, аденозина или дезоксиаденозина;

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу Ν²- (N')_y; и

где каждый Ζ и Ζ' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, независимо представляет собой 1-5 последовательных нуклеотидов, последовательных ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенных к 3'-концу нити, в которой присутствует.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения последовательность (N')_y полностью комплементарна последовательности (N)_x. В различных вариантах выполнения настоящего изобретения последовательность N²-(N')_y комплементарна последовательности N¹-(N)_x. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения (N)_x содержит антисмысловую нить, которая полностью комплементарна около 17 - около 39 последовательным нуклеотидам в целевой РНК. В других вариантах выполнения настоящего изобретения (N)_x содержит антисмысловую нить, которая по существу комплементарна около 17 - около 39 последовательным нуклеотидам в целевой РНК.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, N¹ и N² образуют пару оснований по Уотсону-Крику. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ и N² образуют пару оснований не по Уотсону-Крику. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения образуется пара оснований между рибонуклеотидом и дезоксирибонуклеотидом.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, x=у=18, x=у=19 или x=у=20. В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=18. Когда х=18 в Ν¹-(Ν)x, Ν¹ относится к положению 1, и положения 2-19 включены в (Ν)₁₈. Когда у=18 в N²-(N')_y, N² относится к положению 19, и положения 1-18 включены в (N')₁₈.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, N¹ ковалентно связан с (N)x и не совпадает с целевой РНК. В различных вариантах выполнения настоящего изобретения, N¹ ковалентно связан с (N)_x и представляет собой ДНК составляющую, комплементарную целевой РНК.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения уридин в положении 1 антисмысловой нити замещается N¹, выбранным из аденозина, дезоксиаденозина, дезоксиуридина (dU), риботимидина или дезокситимидина. Согласно различным вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ выбирают из аденозина, дезоксиаденозина или дезоксиуридина.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, гуанозин в положении 1 антисмысловой нити замещен на N¹, выбранный из аденозина, дезоксиаденозина, уридина, дезоксиуридина, риботимидина или дезокситимидина. Согласно различным вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ выбирают из аденозина, дезоксиаденозина, уридина или дезоксиуридина.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, цитидин в положении 1 антисмысловой нити замещается N¹, выбранный из аденозина, дезоксиаденозина, уридина, дезоксиуридина, риботимидина или дезокситимидина. Согласно различным вариантам реализации N¹ выбирают из аденозина, дезоксиаденозина, уридина или дезоксиуридина.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения аденозин в положении 1 антисмысловой нити замещается N¹, выбранный из дезоксиаденозина, дезоксиуридина, риботимидина или дезокситимидина. Согласно различным вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ выбирают из дезоксиаденозина или дезоксиуридина.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, N¹ и N² образуют пару оснований между уридином или дезоксиуридином, и аденозином или дезоксиаденозином. В других вариантах выполнения настоящего изобретения N¹ и N² образуют пару оснований между дезоксиуридином и аденозином.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты в качестве компонента фармацевтической композиции представляет собой siRNA, siNA или miPHK. Двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, обеспечиваемые настоящим изобретением, также упоминаются как "дуплексы".

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения (N)_x включает и антисмысловой олигонуклеотид, представленный в Таблице 5. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, х=у=18 и N¹-(N)_x включает антисмысловой олигонуклеотид, представленный в Таблице 4. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=19 или х=у=20. в определенных предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=18. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения х=у-18, и последовательности N¹-(N)_x и N²-(N')_y выбираются из пары олигонуклеотидов, как изложено в Таблице 4. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, х=у-18, и последовательности N¹-(N)_x и N²-(N')_y выбираются из пары олигонуклеотидов, как изложено в Таблице D и Е. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в

В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в

В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2 (SEQ ID NOS: 60 и 127). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_6 (SEQ ID NOS: 63 и 130). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_11 (SEQ ID NOS: 68 и 135). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_13 (SEQ ID NOS: 69 и 136). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_45 (SEQ ID NOS: 97 и 164). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_45a (SEQ ID NOS: 98 и 165). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_51 (SEQ ID NOS: 101 и 168). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_51a (SEQ ID NOS: 105 и 172). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в SERPINH1_52 (SEQ ID NOS: 102 и 169). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити представляют собой пары последовательностей, как изложено в (SEQ ID NOS: 123 и 190). В некоторых предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2 (SEQ ID NOS: 60 и 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NOS: 63 и 130), SERPINH1_45a (SEQ ID NOS: 98 и 165), SERPINH1_51 (SEQ ID NOS: 101 и 168), и SERPINH1_51a (SEQ ID NOS: 105 и 172).

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, N¹ и N² образуют пару оснований по Уотсону-Крику. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ и N² образуют пару оснований не по Уотсону-Крику. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения N¹ является модифицированным рибоаденозином или модифицированным рибоуридином.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, N¹ и Ν² N¹ и N² образуют пару оснований по Уотсону-Крику. В других вариантах выполнения настоящего изобретения N¹ и N² образуют пару оснований не по Уотсону-Крику. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения N¹ выбирают из группы, состоящей из рибоаденозина, модифицированного рибоаденозина, дезоксирибоаденозина, модифицированного дезоксирибоаденозина. Согласно другим вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ выбирают из группы, состоящей из рибоуридина, дезоксирибоуридина, модифицированного рибоуридина и модифицированного дезоксирибоуридина.

Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения положение 1 в антисмысловой нити (5'-конец) содержит дезоксирибоуридин (dU) или аденозин. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ выбирают из группы, состоящей из рибоаденозина, модифицированного рибоаденозина, дезоксирибоаденозина, модифицированного дезоксирибоаденозина, и N² выбирают из группы, состоящей из рибоуридина, дезоксирибоуридина, модифицированного рибоуридина и модифицированного дезоксирибоуридина. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ выбирают из группы, состоящей из рибоаденозина и модифицированного рибоаденозина, и N² выбирают из группы, состоящей из рибоуридина и модифицированного рибоуридина.

Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения N выбирают из группы, состоящей из рибоуридина, дезоксирибоуридина, модифицированного рибоуридина и модифицированного дезоксирибоуридина, и N² выбирают из группы, состоящей из рибоаденозина, модифицированного рибоаденозина, дезоксирибоаденозина, модифицированного дезоксирибоаденозина. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ выбирают из группы, состоящей из рибоуридина и дезоксирибоуридина, и N² выбирают из группы, состоящей из рибоаденозина и модифицированного рибоаденозина. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ представляет собой рибоуридин, и N² представляет собой рибоаденозин. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения N¹ представляет собой дезоксирибоуридин, и N² представляет собой рибоаденозин.

В некоторых вариантах выполнения структуры (А2), N¹ включает 2'ОМе модифицированный рибоурацил или 2'ОМе модифицированный рибоаденозин. В определенных вариантах выполнения структуры (А2), N² включает 2'ОМе модифицированный рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид.

В некоторых вариантах выполнения структуры (А2), N¹ включает 2'ОМе модифицированный рибоурацил или 2'ОМе модифицированный рибоцитозин. В определенных вариантах выполнения структуры (А2), N² включает 2'ОМе модифицированный рибонуклеотид.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения каждый N и N' представляет собой немодифицированный нуклеотид. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения по меньшей мере один из N или N' включает химически модифицированный нуклеотид или нестандартную составляющую. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, нестандартная составляющая выбирается из зеркального нуклеотида, остатка рибозы без основания и остатка дезоксирибозы без основания. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, нестандартная составляющая представляет собой зеркальный нуклеотид, предпочтительно L-DNA составляющую. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения по меньшей мере один из N или N' включает 2'ОМе модифицированный рибонуклеотид.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения последовательность (N')_y полностью комплементарна последовательности (N)_x. В других вариантах выполнения настоящего изобретения последовательность (N')_y по существу комплементарна последовательности (Ν)_x.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, (Ν)_x включает антисмысловую последовательность, которая полностью комплементарна около 17 - около 39 последовательным нуклеотидам в целевой мРНК. В других вариантах выполнения настоящего изобретения (Ν)_x включает антисмысловую последовательность по существу комплементарную около 17 - около 39 последовательным нуклеотидам в целевой мРНК.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения структуры A1 и структуры А2 соединение имеет тупые концы, например, когда оба Ζ и Ζ' отсутствуют. В альтернативном варианте выполнения настоящего изобретения по меньшей мере один из Ζ или Z' присутствует. Ζ и Z' независимо включают один или более ковалентно связанных модифицированных и или немодифицированных нуклеотидов, включая дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды, или нестандартную составляющую, например, инвертированную дезоксирибозную составляющую без основания или рибозную составляющую без основания; ненуклеотидную С3, С4 или С5 составляющую, амино-6 составляющую, зеркальный нуклеотид и тому подобное. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения каждый Ζ и Z' независимо включает С3 составляющую или амино-С6 составляющую. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения Z' отсутствует, и Ζ присутствует и включает ненуклеотидную С3 составляющую. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения Ζ отсутствует, и Ζ' присутствует и включает ненуклеотидную С3 составляющую.

В некоторых вариантах выполнения структуры A1 и структуры А2, каждый N состоит из немодифицированного рибонуклеотида. В некоторых вариантах структуры A1 и структуры А2, каждый Ν' состоит из немодифицированного рибонуклеотида. В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения по меньшей мере один из N и Ν' представляет собой модифицированный рибонуклеотид или нестандартную составляющую.

В других вариантах выполнения настоящего изобретения соединение структуры A1 или структуры А2 включает по меньшей мере один рибонуклеотид, модифицированный по остатку сахара. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения соединение включает модификацию в 2' положении остатка сахара. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения модификация в 2' положении включает присутствие амино, фтор, алкокси или алкильной группы. Согласно некоторым вариантам реализации модификация 2' включает алкоксигруппу. В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения алкокси группа представляет собой метокси группу (2'ОМе). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, соединение нуклеиновой кислоты включает чередующиеся рибонуклеотиды, модифицированные 2'ОМе по остатку сахара на одной или обеих антисмысловой и смысловой нитях. В других вариантах выполнения настоящего изобретения соединение включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды на антисмысловой нити, (Ν)_x или только N¹-(N)_x. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения средний рибонуклеотид антисмысловой нити; например, рибонуклеотид в положении 10 в 19-мерной нити, является немодифицированным. В различных вариантах выполнения настоящего изобретения соединение нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере 5 чередующихся 2'ОМе модифицированных и немодифицированных рибонуклеотидов. В дополнительных вариантах выполнения настоящего изобретения соединение структуры A1 или структуры А2 включает модифицированные рибонуклеотиды в чередующихся положениях, где каждый рибонуклеотид при 5' и 3'-концах (Ν)_x, или N¹-(N)_x модифицируются в их остатках сахара, и каждый рибонуклеотид при 5' и 3'-концах (N')_y, или N²-(N)_y являются немодифицированными по их остаткам сахара.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевая молекула в качестве компонента фармацевтической композиции включает одну или более из следующих модификаций

- N в по меньшей мере одном из положений 5, 6, 7, 8, или 9 антисмысловой нити выбирается из 2'-5'-нуклеотида или зеркального нуклеотида;

- Ν' в по меньшей мере одном из положений 9 или 10 смысловой нити выбирается из 2'-5'-нуклеотида и псевдоуриддин; и

- Ν' в 4, 5, или 6 последовательных положениях при 3'-концевых положениях (N')_y содержит 2'-5'-нуклеотид.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевая молекула включает комбинацию следующих модификаций

- антисмысловая нить включает 2'-5'-нуклеотид или зеркальный нуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6, 7, 8, или 9; и

- смысловая нить включает по меньшей мере один из 2'-5'-нуклеотида и псевдоуридина в положениях 9 или 10.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевая молекула включает комбинацию следующих модификаций

- антисмысловая нить включает а 2'-5'-нуклеотид или зеркальный нуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6, 7, 8, или 9; и

- смысловая нить включает 4, 5, или 6 последовательных 2'-5'-нуклеотидов в 3'-предпоследнем или 3'-терминальном положениях.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить ((Ν)_x или N¹-(N)_x) включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или 9 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 и 19. В других вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19. В других вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить включает один или более 2'ОМе модифицированных пиримидинов. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения все пиримидиновые нуклеотиды в антисмысловой нити являются 2'ОМе модифицированными. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить включает 2'ОМе модифицированные пиримидины.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения структуры A1 и структуры А2, ни смысловая нить ни антисмысловая нить не является фосфорилированной при 3'- и 5'-концах. В других вариантах выполнения настоящего изобретения одна из или обе смысловая нить или антисмысловая нить являются фосфорилированными при 3'-концах.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения структуры A1 и структуры А2, (N)_y включает по меньшей мере одну нестандартную составляющую, выбранную из зеркального нуклеотида, 2'-5'-нуклеотида и TNA. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения нестандартной составляющей является зеркальный нуклеотид. В различных вариантах выполнения настоящего изобретения зеркальный нуклеотид выбирается из L-рибонуклеотида (L-RNA) и L-дезоксирибонуклеотида (L-DNA). В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения зеркальный нуклеотид представляет собой L-DNA. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить содержит нестандартную составляющую в положении 9 или 10 (от 5'-конца). В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить включает нестандартную составляющую в положении 9 (от 5'-конца). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить составляет 19 нуклеотидов в длину и содержит 4, 5, или 6 последовательных нестандартных составляющих в положении 15 (от 5'-конца). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить включает 4 последовательных 2'-5'-рибонуклеотидов в положениях 15, 16, 17, и 18. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить включает 5 последовательных 2'-5'-рибонуклеотидов в положениях 15, 16, 17, 18 и 19. В различных вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить дополнительно содержит Ζ'. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, Z' включает С3ОН составляющую или C3Pi составляющую. В некоторых вариантах структуры A1 (N')_y включает по меньшей мере одну L-DNA составляющую. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=19, и (N')_y состоит из немодифицированных рибонуклеотидов в положениях 1-17 и 19 и один L-DNA в 3' предпоследнем положении (положение 18). В других вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=19, и (Ν')_y состоит из немодифицированных рибонуклеотидов в положениях в положениях 1-16 и 19 и двух последовательных L-DNA в 3' предпоследнем положении (положения 17 и 18). В различных вариантах выполнения настоящего изобретения нестандартная составляющая представляет собой нуклеотид, присоединенный к соседнему нуклеотиду 2'-5' межнуклеотидной фосфатной связью. Согласно различным вариантам выполнения настоящего изобретения (N')_y включает 2, 3, 4, 5, или 6 последовательных рибонуклеотида в 3'-конце, связанных 2'-5' межнуклеотидными связями. В одном варианте выполнения настоящего изобретения четыре последовательных нуклеотида в 3'-конце (N')_y соединены тремя 2'-5' фосфодиэфирными связями, где один или более из 2'-5' нуклеотидов, которые формируют 2'-5' фосфодиэфирные связи, дополнительную включает 3'-О-метильную (3'ОМе) модификацию сахара. Предпочтительно 3'-терминальный нуклеотид(N')_у включает 2'ОМе модификацию. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=19, и (N')_y включает два или более последовательных нуклеотида в положениях 15, 16, 17, 18 и 19, где нуклеотид соединен с соседним нуклеотидом 2'-5' межнуклеотидной связью (2'-5' нуклеотид). В различных вариантах выполнения настоящего изобретения нуклеотид, формирующий 2'-5' межнуклеотидную связь, включает 3' дезоксирибозный нуклеотид или 3' метокси нуклеотид (3' Η или 3'ОМе в положении 3' ОН). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=19, и (N')_y включает 2'-5' нуклеотиды в положениях 15, 16 и 17, так что соседние нуклеотиды связаны 2'-5' межнуклеотидной связью между положениями 15-16, 16-17 и 17-18; или в положениях 15, 16, 17, 18 и 19, так что соседние нуклеотиды связаны 2'-5' межнуклеотидной связью между положениями 15-16, 16-17, 17-18 и 18-19, и 3'ОН доступен в 3'-терминальном нуклеотиде или в положениях 16, 17 и 18, так что соседние нуклеотиды связаны 2'-5' межнуклеотидной связью между положениями 16-17, 17-18 и 18-19. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=19, и (N')_y включает 2'-5'-нуклеотиды в положениях 16 и 17 или в положениях 17 и 18 или в положениях 15 и 17, так что соседние нуклеотиды связаны 2'-5' межнуклеотидной связью между положениями 16-17 и 17-18 или между положениями 17-18 и 18-19 или между положениями 15-16 и 17-18, соответственно. В других вариантах выполнения настоящего изобретения пиримидиновые рибонуклеотиды (rU, rC) в (N')_y замещаются нуклеотидами, соединенными с соседним нуклеотидом 2'-5' межнуклеотидной связью. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 или SERPINH1_88, и х=у=19, и (N')_y содержит пять последовательных нуклеотида в 3'-конце, соединенных четырьмя 2'-5' связями, в частности связями между нуклеотидами в положении 15-16, 16-17,17-18 и 18-19.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения связи включают фосфодиэфирные связи. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 или SERPINH1_88 и х=у=19, и (N')_y содержит пять последовательных нуклеотидов в 3'-конце, соединенных четырьмя 2'-5' связями, и необязательно дополнительно включает Z' и z', независимо выбранные из инвертированной составляющей без основания и С3 алкил [С3; 1,3-пропандиол моно(гидрофосфат)] кэппирующую группу. С3 алкильная кэппирующая группа ковалентно связана с 3' или 5' терминальным нуклеотидом. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, 3' С3 терминальная кэппирующая группа дополнительно содержит 3' фосфат. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, 3' С3 терминальная кэппирующая группа дополнительно содержит 3'-терминальную гидроксильную группу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити в качестве компонентом фармацевтической композиции выбираются из пар последовательностей, как изложено далее SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 или SERPINH1_88 и x=y=19, и (Ν')_y включает L-DNA в положении 18; и (N')_y необязательно дополнительно включает Z' и z', независимо выбранные из инвертированной составляющей без основания и С3 алкил (С3; 1,3-пропандиолмоно(дигидрофосфат)) кэппирующую группу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, (N')y включает 3'-терминальный фосфат. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, (N')y включает 3'-терминальный гидроксил.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити в качестве компонентом фармацевтической композиции выбираются из пар последовательностей, как изложено далее SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 или SERPINH1_88 и х=у=19, и (Ν)_x включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1,3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19 или в положениях 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 и SERPINH1_88, и x=y=19, и (N)_x включает 2'ОМе модифицированные пиримидины. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения все пиримидины в (N)_x включают 2'ОМе модификацию.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINHl_45a, SERPINH1_51, SERPIN51a, SERPINH1_52 или SERPINH1_86, и x=y=18, и Ν² представляет собой рибоаденозивную составляющую.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPIN51a, SERPINH1_52 или SERPINH1_86, и x=y=18, и N²-(N')_y включает пять последовательных нуклеотидов в 3'-конце, соединенных четырьмя 2'-5' связями, в частности связями между нуклеотидами в положении 15-16, 16-17, 17-18 и 18-19. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения связи включают фосфодиэфирные связи.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_45, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 или SERPINH1_86, и x=y=18, и N²-(N')_y включает пять последовательных нуклеотидов в 3'-конце, соединенных четырьмя 2'-5' связями, и необязательно дополнительно включает Z' и z', независимо выбранные из инвертированной составляющей без основания и С3 алкил [С3; 1,3-пропандиолмоно(дигидрофосфат)] кэппирующей группы.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 или SERPINH1_86, и x=y=18, и N²-(N')_y включает L-DNA в положении 18; и (N')_y необязательно дополнительно включает Ζ' и z', независимо выбранные из инвертированной составляющей без основания и С3 алкил [С3; 1,3-пропандиолмоно(дигидрофосфат)] кэппирующей группы.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, N²-(N')_y содержит 3'-терминальный фосфат. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения N²-(N')_y содержит 3'-терминальный гидроксил.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити в качестве компонентом фармацевтической композиции выбираются из пар последовательностей, как изложено далее SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 или SERPINH1_86, и x=y=18, и Ν¹-(Ν)_x включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, или в положениях 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, или в положениях 2, 4, 6, 8,11, 13, 15, 17, 19. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45а, SERPINH1_51, SERPINH1_52 или SERPINH1_86, и x=y=18, и N¹-(N)_x включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 11, 13, 15, 17и 19. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1-45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 или SERPINH1_86, и x=y=18, и N¹-(N)_x включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или в положениях 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар последовательностей, как изложено в SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_52 или SERPINH1_86, и x=y=18, и Ν¹-(Ν)_x включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 4, 6, 8,11, 13, 15,17, 19.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити в качестве компонентом фармацевтической композиции выбираются из пар последовательностей, как изложено далее SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 или SERPINH1_86, и x=y=18, и N¹-(N)^x включает 2'OMe модифицированные пиримидины. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения все пиримидины в (N)_x включают 2'ОМе модификацию. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить дополнительно включает L-DNA или 2'-5' нуклеотид в положении 5, 6 или 7. В других вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить дополнительно включает рибонуклеотид, который создает 2'-5' межнуклеотидную связь между рибонуклеотидами в положениях 5-6 или 6-7.

В дополнительных вариантах выполнения настоящего изобретения N¹-(N)_x дополнительно включает Z, где Ζ включает ненуклеотидный липкий конец. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения ненуклеотидный липкий конец представляет собой С3-С3 [1,3-пропандиолмоно(дигидрофосфат)]2.

В некоторых вариантах выполнения структуры А2, (N)_y включает по меньшей мере одну L-DNA составляющую. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=18, и (N')_y состоит из немодифицированных рибонуклеотидов в положениях 1-16 и 18 и одной L-DNA в 3' предпоследнем положении (положение 17). В других вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=18, и (N')_y состоит из немодифицированных рибонуклеотидов в положении 1-15 и 18 и двух последовательных L-DNA в 3' предпоследнем положении (положения 16 и 17). В различных вариантах выполнения настоящего изобретения нестандартная составляющая представляет собой нуклеотид, соединенный с соседним нуклеотидом 2-5' межнуклеотидной фосфатной связью. Согласно различным вариантам выполнения настоящего изобретения, (N')_у включает 2, 3, 4, 5, или 6 последовательных рибонуклеотида в 3'-конце, связанных 2'-5' межнуклеотидными связями. В одном варианте выполнения настоящего изобретения четыре последовательных нуклеотида в 3'-конце (N')_y связаны тремя 2'-5' фосфодиэфирными связями, где один или более 2'-5' нуклеотидов, которые формируют 2'-5' фосфодиэфирные связи, дополнительно включают 3'-О-метильную (3'ОМе) модификацию сахара. Предпочтительно 3'-терминальный нуклеотид (N')_y включает 2'ОМе модификацию. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения, х=у=18, и в (N')y два или более последовательных нуклеотида в положениях 14, 15, 16, 17, и 18 включают нуклеотид, соединенный с соседним нуклеотидом 2'-5' межнуклеотидной связью. В различных вариантах выполнения настоящего изобретения нуклеотид, образующий 2'-5' межнуклеотидную связь, включает 3' дезоксирибозный нуклеотид или 3' метокси нуклеотид. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, х=у=18, и (N')_y включает нуклеотиды, соединенные с соседним нуклеотидом 2'-5' межнуклеотидной связью между положениями 15-16, 16-17 и 17-18 или между положениями 16-17 и 17-18. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, х=у=18, и (N')_y включает нуклеотиды, соединенные с соседним нуклеотидом 2'-5' межнуклеотидной связью между положениями 14-15, 15-16, 16-17, и 17-18 или между положениями 15-16, 16-17, и 17-18 или между положениями 16-17 и 17-18 или между положениями 17-18 или между положениями 15-16 и 17-18. В других вариантах выполнения настоящего изобретения пиримидиновые рибонуклеотиды (rU, rC) в (N')_y замещаются нуклеотидами, соединенными с соседним нуклеотидом 2'-5' межнуклеотидной связью.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар олигонуклеотидов, как изложено в Таблице 5 и согласно настоящему изобретению обозначаются SERPINH1_2 (SEQ ID NOS: 60 и 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NOS: 63 и 130), SERPINHl_45a (SEQ ID NOS: 98 и 165), SERPINH1_51 (SEQ ID NOS: 101 и 168), и SERPINH1_51a (SEQ ID NOS: 105 и 172).

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты в качестве компонента фармацевтической композиции включает антисмысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:127, и смысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:60; согласно настоящему изобретению обозначается SERPINH1_2. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты имеет структуру

где каждый "|" обозначает спаривание оснований между рибонуклеотидами;

где каждый А, С, G, U независимо представляет собой немодифицированный или модифицированный рибонуклеотид, или нестандартную составляющую;

где каждый Ζ и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, независимо представляет собой 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует; и

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу N²-(N')_y.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где антисмысловая нить (SEQ ID NO: 127) включает один или более 2'ОМе модифицированных пиримидинов и или пурины, 2'-5'-рибонуклеотид в положении 5, 6, 7 или 8, и 3'-терминальный нуклеотидный или ненуклеотидный липкий конец. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, смысловая нить (SEQ ID NO:60) включает 4 или 5 последовательных 2'-5'-нуклеотида в 3'-терминальном или предпоследнем положениях, нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу, и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу. В других вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить (SEQ ID NO:60) включает один или более 2'ОМе пиримидин, нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу, и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где антисмысловая нить (SEQ ID NO:127) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9,11,15, 17 и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:60) выбирается из смысловой нити, которая включает

- 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17,18 и 19; С3ОН 3'-терминальный ненуклеотидный липкий конец; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; или

- 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15,16, 17, 18 и 19; 3'-терминальный фосфат; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; или

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 5, 7, 13, и 16; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 18; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; или

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 7, 13, 16 и 18; а 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; или

- 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15,16,17,18, и 19; С3-Pi составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:127) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:60) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; С3 3'-липкий конец; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:127) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH 3'-липкий конец; и смысловая нить (SEQ ID NO:60) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15,16,17, 18, и 19; 3'-терминальный фосфат; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:127) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7 и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:60) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 5, 7, 13, и 16; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 18; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:127) включает 2'OMe модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7 и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:60) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 7,13,16 и 18; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:127) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:60) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; С3-Pi составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:127) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19; и С3-С3 3'-липкий конец; и смысловая нить (SEQ ID NO:60) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 7, 9, 13, 16 и 18; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:60) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; 3'-терминальный фосфат; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:127) включает антисмысловую нить, выбранную из одной из:

- 2'OMe модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19; и C3Pi-C3OH составляющая, ковалентно присоединенная к 3'-концу; или

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 17, 18; и C3Pi-C3OH составляющая, ковалентно присоединенная к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты в качестве компонента фармацевтической композиции, которая включает антисмысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:130, и смысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:63; согласно настоящему изобретению обозначается SERPINH1_6. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения дуплекс содержит структуру

где каждый "|" обозначает спаривание оснований между рибонуклеотидами;

где каждый А, С, G, U независимо представляет собой немодифицированный или модифицированный рибонуклеотид, или нестандартную составляющую;

где каждый Ζ и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, независимо представляет собой 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует; и

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу N²-(N')_y.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:63) включает один или более 2'ОМе модифицированных пиримидинов; 3'-терминальный нуклеотидный или ненуклеотидный липкий конец; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, антисмысловая нить (SEQ ID NO:130) включает один или более 2'ОМе модифицированный пиримидин; нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:63) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 14 и 18; С3ОН или C3Pi составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:130) выбирается из антисмысловой нити, которая включает

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11,13, 15 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 7, 9, 13 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 15 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 13, 15 и 17; dU в положении 1; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:63) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 14 и 18; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:130) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9,11,13,15 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается молекула дуплексного олигонуклеотида, где смысловая нить (SEQ ID NO:63) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 14 и 18 и необязательно в положении 2; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:130) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается молекула дуплексного олигонуклеотида, где смысловая нить (SEQ ID NO:63) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 14 и 18 С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:130) выбирается из антисмысловой нити, которая включает

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, И, 13, 15 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3Pi или C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3Pi или C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:63) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 14 и 18; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:130) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:63) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 14 и 18; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:130) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5,7, 9, 12, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH 3'-липкий конец.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, дуплексный компонент фармацевтической композиции включает антисмысловая нить, как изложено в SEQ ID NO:165, и смысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:98; согласно настоящему изобретению обозначается SERPINH1_45a. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения дуплекс содержит структуру

где каждый "|" обозначает спаривание оснований между рибонуклеотидами;

где каждый А, С, G, U независимо представляет собой немодифицированный или модифицированный рибонуклеотид, или нестандартную составляющую;

где каждый Z и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, независимо представляет собой 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует; и

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу N²-(N')_y

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения смысловая нить (SEQ ID NO:98) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, и 18 или 15, 16, 17, 18, и 19; нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить (SEQ ID NO:165) включает 2'ОМе модифицированный пиримидин и или пурины; 2'-5' нуклеотид в положении 5, 6, 7, или 8; и нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, смысловая нить (SEQ ID NO:98) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; C3Pi или С3-ОН 3'-терминальную ненуклеотидную составляющую; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:165) включает антисмысловую нить, выбранную из:

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 4, 6, 8, 11,13, 15,17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3Pi или C3Pi-C3OH 3'-липкий конец; или

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2,4, 6, 8, 11,13,15,17 и 19; и C3Pi-C3Pi или C3Pi-C3OH 3'-липкий конец;

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1,3, 5, 9, 11,13,15,17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3Pi или C3Pi-C3OH 3'-липкий конец; или

- 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,17 и 19; и C3Pi-C3Pi или C3Pi-C3OH 3'-липкий конец.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:98) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; С3-ОН 3'-терминальную составляющую; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:165) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-COH 3'-липкий конец.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты как компонент фармацевтической композиции включает антисмысловая нить, как изложено в SEQ ID NO: 168, и смысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:101; согласно настоящему изобретению обозначается SERPINH151. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения дуплекс содержит структуру

где каждый "|" обозначает спаривание оснований между рибонуклеотидами;

где каждый А, С, G, U независимо представляет собой немодифицированный или модифицированный рибонуклеотид, или нестандартную составляющую;

где каждый Z и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, независимо представляет собой 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует; и

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5-концу N²-(N')_y.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:101) включает 2'ОМе модифицированные пиримидины, необязательно 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9 или 10; нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и необязательно кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить (SEQ ID NO:168) включает 2'ОМе модифицированный пиримидин и или пурины; 2'-5' нуклеотид в положении 5, 6, 7, или 8; и нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:101) включает 2'ОМе модифицированные пиримидины в положениях 4, 11, 13, и 17; необязательно 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9 или 10; C3Pi или С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:168) выбирается из антисмысловой нити, которая включает

a) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 8, и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6 или 7; и C3Pi-C3OH липкий конец, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

b) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 13 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6 или 7; и C3Pi-C3OH липкий конец, ковалентно присоединенный к 3'-концу; или

c) 2'OMe модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 11 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH липкий конец, ковалентно присоединенный к 3'-концу; или

d) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 8, 12, 13, и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:101) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; необязательно 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3-ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:168) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 8, и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:101) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; необязательно 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3-ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:168) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 13 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:101) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:168) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 11 и 15; 2-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:101) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:168) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 8, 12, 13, и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты в качестве компонента фармацевтической композиции включает антисмысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:168, и смысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:101; согласно настоящему изобретению обозначается SERPINH1_51a. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения дуплекс содержит структуру

где каждый "|" обозначает спаривание оснований между рибонуклеотидами;

где каждый А, С, G, U независимо представляет собой немодифицированный или модифицированный рибонуклеотид, или нестандартную составляющую;

где каждый Z и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, независимо представляет собой 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует; и

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу N²-(N')_y.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:105) включает 2'ОМе модифицированные пиримидины; необязательно 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9 или 10; нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и необязательно кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить (SEQ ID NO:172) включает 2'ОМе модифицированный пиримидин и или пурины; 2'-5' нуклеотид в положении 5, 6, 7, или 8; и нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:105) включает 2'ОМе модифицированные пиримидины в положениях 4, 11, 13, и 17; необязательно 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9 или 10; C3Pi или С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:172) выбирается из антисмысловой нити, которая включает

a) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 8, и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6 или 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

b) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 8, 13 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6 или 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

c) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 8,11 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

d) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 8, 12,13, и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:105) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; необязательно 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3-ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:172) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 8 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:105) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; необязательно 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3-ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:172) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 8, 13 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:105) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3-ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:172) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 8, 11 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:105) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:172) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 8, 12, 13, и 15; 2-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая и смысловая нити выбираются из пар олигонуклеотидов, как изложено в Таблице 5 и согласно настоящему изобретению обозначается SERPINH14 (SEQ ID NOS: 195 и 220) и SERPINH1_12 (SEQ ID NOS: 196 и 221).

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты в качестве компонента фармацевтической композиции включает антисмысловая нить, как изложено в SEQ ID NO:220, и смысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:195; согласно настоящему изобретению обозначается SERPINH14. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты имеет структуру

где каждый "|" обозначает спаривание оснований между рибонуклеотидами;

где каждый А, С, G, U независимо представляет собой немодифицированный или модифицированный рибонуклеотид, или нестандартную составляющую;

где каждый Ζ и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, независимо представляет собой 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует; и

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу N²-(N')_y.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 15, 17 и 19, 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7, и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:195) выбирается из смысловой нити, которая включает

a) 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16,17,18 и 19, С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; или

b) 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15,16, 17, 18 и 19, 3'-терминальный фосфат; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; или

c) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 5, 7, 13, и 16; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 18; С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; или

d) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 7,13, 16 и 18; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; или

е) 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15,16,17,18, и 19; C3Pi составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:195) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; С3 составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:195) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; 3'-терминальный фосфат; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, И, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:195) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 5, 7, 13, и 16; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 18; С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:195) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 7, 13, 16 и 18; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:195) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; C3Pi составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить (SEQ ID NO:195) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 7, 9, 13, 16и18;и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:195) включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; 3'-терминальный фосфат и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает антисмысловую нить, выбранную из

a) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 7, 9,11, 13,15,17,19; и C3Pi-C3OH составляющая, ковалентно присоединенная к 3'-концу; или

b) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 6, 8,10, 12,14,17,18; и C3Pi-C3OH составляющая, ковалентно присоединенная к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты в качестве компонента фармацевтической композиции, которая включает антисмысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:130, и смысловую нить, как изложено в SEQ ID NO:63; согласно настоящему изобретению обозначается SERPINH112. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения дуплекс содержит структуру

где каждый "|" обозначает спаривание оснований между рибонуклеотидами;

где каждый А, С, G, U независимо представляет собой немодифицированный или модифицированный рибонуклеотид, или нестандартную составляющую;

где каждый Ζ и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, независимо представляет собой 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует; и

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу N²-(N')_y.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где смысловая нить (SEQ ID NO:196) включает один или более 2'OMe модифицированных пиримидинов; 3'-терминальный нуклеотидный или ненуклеотидный липкий конец; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить (SEQ ID NO:221) включает один или более 2'ОМе модифицированных пиримидинов; нуклеотидную или ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где смысловая нить (SEQ ID NO:196) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 14 и 18; С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:221) выбирается из антисмысловой нити, которая включает

a) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 13,15 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

b) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 7, 9,12, 13 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где смысловая нить (SEQ ID NO: 196) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 14 и 18; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:221) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 13, 15 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается молекула дуплексного олигонуклеотида, где смысловая нить (SEQ ID NO:196) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 14 и 18 и необязательно в положении 2; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:221) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 7, 9, 12, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается молекула дуплексного олигонуклеотида, где смысловая нить (SEQ ID NO:196) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 14 и 18; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:221) выбирается из антисмысловой нити, которая включает

a) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 13,15 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; или

b) 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 7, 9,12, 13 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:196) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 14 и 18; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Согласно настоящему изобретению обеспечивается двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, в которой смысловая нить (SEQ ID NO:196) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 14 и 18; С3-ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить (SEQ ID NO:220) включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5,7, 9, 12, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В других вариантах структур A1 и А2, (N')_y включает 1-8 модифицированных рибонуклеотидов, где модифицированный рибонуклеотид представляет собой ДНК нуклеотид. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения (N')_y включает 1, 3, 4, 5, 6, 7, или до 8 ДНК составляющих.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, или Ζ или Z' присутствует и независимо включает две ненуклеотидные составляющие.

В дополнительных вариантах выполнения настоящего изобретения, Ζ и Z' присутствуют и каждый независимо включает две ненуклеотидные составляющие.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, каждый Ζ и Z' включает составляющую без основания, например, дезоксирибосоставляющую без основания (упоминается также как "dAb") или рибосоставляющую без основания (упоминается также как "rAb"). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения каждый Ζ и/или Z' включает две ковалентно связанные составляющие без основания и представляет собой, например, dAb-dAb или rAb-rAb или dAb-rAb или rAb-dAb, где каждая составляющая ковалентно присоединена к соседней составляющей, предпочтительно посредством фосфорной связи. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения фосфорная связь включает фосфорная связь включает фосфотиоатную, фосфоноацетатную или фосфодиэфирную связь. Согласно предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения фосфорная связь включает фосфодиэфирную связь.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, каждый Ζ и/или Ζ' независимо включает алкильную составляющую, необязательно пропан ((СН₂)₃) составляющую ("С3") или ее производную, включая пропандиол (С3ОН) и фосфопроизводную пропандиола ("C3Pi"). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения каждый Ζ и/или Ζ' включает две алкильные составляющие, ковалентно связанные с 3'-концом антисмысловой нити или смысловой нити посредством фосфодиэфирной или фосфотиоатной связи, и ковалентно соединенные друг с другом посредством фосфодиэфирной или фосфотиоатной связи, и в некоторых примерах представляет собой C3Pi-C3Pi или C3Pi-C3OH. 3'-конец антисмысловой нити и/или 3'-конец смысловой нити ковалентно соединен с составляющей С3 посредством фосфорной связи, и составляющая С3 ковалентно конъюгирована с С3-ОН составляющей посредством фосфорной связи. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения фосфорные связи включают фосфодиэфирную, фосфоноацетатную или фосфодиэфирную связь. Согласно предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения фосфорная связь включает фосфодиэфирную связь.

Согласно различным вариантам Структуры A1 или Структуры А2, Ζ и Z' отсутствуют. Согласно другим вариантам выполнения настоящего изобретения присутствует каждый из Ζ и/или Ζ'. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения каждый из Ζ и/или Ζ' независимо друг от друга включает С2, С3, С4, С5 или С6 алкильную составляющую, необязательно С3 составляющую или ее производное, включая пропанол (С3-ОН/С3ОН), пропандиол, и фосфодиэфирное производное пропандиола (C3Pi). Согласно предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения каждый из Ζ и/или Z' включает две углеводородные составляющие и в некоторых примерах представляет собой C3Pi-C3OH или C3Pi-C3Pi. Каждая С3 ковалентно соединена с соседней С3 с помощью ковалентной связи, предпочтительно фосфорной связи. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения фосфорные связи включают фосфодиэфирную, фосфоноацетатную или фосфодиэфирную связь.

В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения х=у=19, и Ζ содержит по меньшей мере один С3 алкильный липкий конец. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения С3-С3 липкий конец ковалентно присоединен к 3'-концу (Ν)_x или (N')_y посредством ковалентной связи, предпочтительно фосфодиэфирной связи. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, связь между первой С3 и второй С3 представляет собой фосфодиэфирную связь. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения 3' ненуклеотидный липкий конец представляет собой C3Pi-C3Pi. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения 3' ненуклеотидный липкий конец представляет собой C3Pi-C3PL В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения 3' ненуклеотидный липкий конец представляет собой C3Pi-C3OH.

В различных вариантах выполнения настоящего изобретения алкильная составляющая содержит производное алкила, включая С3 алкил, С4 алкил, С5 алкил или С6 алкильную составляющую, содержащую концевую гидрокси, амино или фосфатную группу. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения алкильная составляющая представляет собой С3 алкил или С3 алкил производную. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения С3 алкильная составляющая содержит пропанол, пропилфосфат, пропилфосфотиоат или их комбинацию. С3 алкильная составляющая соединена с 3'-концом (N')_y и/или 3'-концом (N)_x с помощью фосфодиэфирной связи. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения алкильная составляющая содержит пропанол, пропилфосфат или пропил фосфотиоат. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения каждый из Ζ и Z' независимо выбираются из пропанола, пропил фосфата, пропил фосфотиоата их комбинаций или их кратных количеств, в частности 2 или 3 ковалентно соединенных пропанола, пропилфосфата, пропил фосфотиоата или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения каждый из Ζ и Z' независимо выбираются из пропилфосфата, пропил фосфотиоата, пропил фосфопропанола; пропил фосфопропил фосфотиоата; пропилфосфопропил фосфата; (пропил фосфата)₃, (пропил фосфата)₂- пропанола, (пропил фосфата)₂- пропил фосфотиоата. Любую группу, конъюгированную с пропаном или пропанолом, можно включить в Z или Z'.

Структуры примерных 3'-терминальных ненуклеотидных составляющих даны ниже:

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, каждый Z и Z' независимо выбирается из пропанола, пропил фосфата, пропил фосфотиоата их комбинаций или их кратных количеств.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, каждый Ζ и Z' независимо выбирается из пропил фосфата, пропил фосфотиоата, пропил фосфопропанола; пропил фосфопропил фосфотиоата; пропилфосфопропил фосфата; (пропил фосфата)₃, (пропил фосфата)₂-пропанола, (пропил фосфата)₂- пропил фосфотиоата. Любую группу, конъюгированную с пропаном или пропанолом, можно включить в Ζ или Ζ'.

В дополнительных вариантах выполнения настоящего изобретения каждый Ζ и/или Ζ' включает комбинацию составляющей без основания и немодифицированного дезоксирибонуклеотида или рибонуклеотида или комбинацию углеводородной составляющей и немодифицированного дезоксирибонуклеотида или рибонуклеотида или комбинацию составляющей без основания (дезоксирибо или рибо) и углеводородной составляющей. В таких вариантах выполнения настоящего изобретения каждый Ζ и/или Ζ' включает С3-rAb или С3-dAb, где каждая составляющая ковалентно связана с соседней составляющей через фосфорную связь, предпочтительно, фосфодиэфирной, фосфотиоатной или фосфотиоацетатной связи.

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, как раскрывается в настоящей заявке, включают смысловую олигонуклеотидную последовательность, выбранную из одного из олигонуклеотидов, приведенных далее в Таблицах 4 и 5 (SEQ ID NOS:60-126 и 194-218).

В определенных предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечиваемые соединения включают Соединение_1, Соединение_2, Соединение_3, Соединение_4, Соединение_5, Соединение_6, Соединение_7, Соединение_8, и Соединение_9, описываемые далее.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, (таких как, например, Соединение_1, Соединение_5, и Соединение_6) обеспечиваются 19-мерные двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, где антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:127 и смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:60. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения, обеспечиваются 19-мерные двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, где антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:127 и включает 2OMe модифицированные рибонуклеотиды; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 1, 5, 6, или 7; и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:60 и включает по меньшей мере один 2'-5'-рибонуклеотид или 2'ОМе модифицированный рибонуклеотид; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, обеспечиваются 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:127; и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:60 и включает пять последовательных 2'-5'-рибонуклеотидов в 3'-терминальных положениях 15, 16, 17, 18, и 19; C3Pi ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается Соединение_1, которым является 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO: 127 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:60 и включает пять последовательных 2'-5'-рибонуклеотидов в 3'-терминальных положениях 15, 16, 17, 18, и 19; C3Pi ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и дополнительно включает 2'ОМе модифицированный рибонуклеотид в положении 1 антисмысловой нити.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается Соединение 6, которым является 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:127 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:60 и включает пять последовательных 2'-5'-рибонуклеотидов в 3'-терминальных положениях 15, 16, 17, 18, и 19; C3Pi ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и дополнительно включает 2'-5'-рибонуклеотид в положении 1 антисмысловой нити.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается Соединение_5, которым является 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:127 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15,17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:60 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 7, 13, 16 и 18; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, (таких как, например, Соединение_2, и Соединение_7, описанные далее) обеспечиваются 19-мерные двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:63, и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:130. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечиваются 19-мерные двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:63 и включает 2'ОМе модифицированный пиримидин рибонуклеотиды; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:130 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечиваются 19-мерные двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:63 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:130 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6 или 7; и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается Соединение_2, которым является 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:63 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 14 и 18; С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:130 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 12, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6 или 7; и C3Pi-C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается Соединение_7, которым является 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:63 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 14 и 18; С3ОН составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:130 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, (таких как, например, Соединение З, описанное далее) обеспечиваются 19-мерные двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:98, и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:165. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, обеспечиваются 19-мерные двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:98 и включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях при 3'-конце; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:165 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6 или 7; и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу. В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается Соединение З, которым является 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:98 и включает 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18, и 19; С3-ОН 3' составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:165 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2,4, 6, 8, 11,13, 15, 17, и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7; и C3Pi-C3OH ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, (таких как, например, Соединение_4, Соединение_8 и Соединение_9, описанные далее) обеспечиваются 19-мерные двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:101, и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:168. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечиваются 19-мерные двухнитевые молекулы нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:101 и включает 2'ОМе модифицированный пиримидиновые рибонуклеотиды; необязательный 2'-5'-рибонуклеотид в одном из положений 9 или 10; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:168 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6, или 7; и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается Соединение_4, которым является 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:101 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:168 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 11 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; C3Pi-C3OH липкий конец, ковалентно присоединенный к 3'-концу.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается Соединение_8, которым является 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:101 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13, и 17; С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:168 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 13 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH липкий конец, ковалентно присоединенный к 3'-концу.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается Соединение_9, которым является 19-мерная двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты, где смысловая нить представляет собой SEQ ID NO:101 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 4, 11, 13, и 17; С3ОН ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить представляет собой SEQ ID NO:168 и включает 2'ОМе модифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 11 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6; и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

Другим объектом настоящего изобретения являются способы снижения экспрессии hsp47 в клетке посредством введения в клетку молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в количестве, достаточном для снижения экспрессии hsp47. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения клетка представляет собой звездчатую клетку печени. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения клетка представляет собой звездчатую клетку ткани почек или легких. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения способы осуществляют in vitro, согласно другим вариантам выполнения настоящего изобретения способ осуществляют in vivo.

Другим объектом настоящего изобретения являются способы лечения субъекта, страдающего от заболевания, вызванного hsp47. Способы включают введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, такой как обеспечивается согласно настоящему изобретению, в количестве, достаточном для снижения экспрессии hsp47. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения, заболевание, вызванное hsp47, представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из фиброза печени, цирроза, фиброза легких, включая фиброз легких (включая ILF), любое состояние, вызывающее фиброз почек (например, CKD, включая ESRD), перитонеального фиброза, хронического поражения печени, фибриллогенеза, фибротических заболеваний в других органах, ненормального рубцевания (келоидные рубцы), ассоциированные со всеми возможными типами травмы кожи: в результате несчастного случая и ятрогенными (операции); склеродермии, кардиофироза, неудачного исхода фильтрующей операции при глаукоме и кишечных спаек. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения соединение можно использовать для лечения орган-специфичных состояний, например, состояний, включая представленные в Таблице 1 ниже с перечислением органов и соответствующих состояний:

Таблица 1

Другим вариантом выполнения настоящего изобретения является способ лечения нарушения, связанного со звездчатыми клетками, причем способ включает введение эффективного количества фармацевтической композиции, описанной ниже, субъекту, нуждающемуся в этом. Нарушение включает гепатит, фиброз печени, цирроз печени, рак печени, панкреатит, фиброз поджелудочной железы, рак поджелудочной железы, рубцевание голосовых связок, фиброз слизистой оболочки голосовых связок и ларингеальный фиброз. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения предпочтительные состояния включают цирроз печени, вызванный гепатитом С, после трансплантации печени; цирроз печени по причине неалкогольного стеатогепатита (NASH); идиопатический фиброз легких; лучевой пневмонит, вызывающий фиброз легких; диабетическую нефропатию; перитонеальный склероз, вызванный хроническим перитонеальным диализом в амбулаторных условиях (CAPD), и пузырчатку глаз.

Фиброзные заболевания печени включают алкогольный цирроз, цирроз, вызванный гепатитом В, цирроз, вызванный гепатитом С, цирроз, вызванный гепатитом С (Hep С) после ортопической трансплантации печени (OLTX), безалкогольный стеатогепатит/ неалкогольную жировую дистрофию печени (NASH/NAFLD), первичный билиарный цирроз печени (РВС), первичный склерозирующий холангит (PSC), атрезию желчных протоков, дефицит альфа 1-антитрипсина (A1AD), болезни накопления меди (болезнь Вильсона), фруктоземию, галактоземию, болезни накопления гликогена (в частности, типов III, IV, VI, IX и X), синдромы перегрузки железом (гемохроматозы), нарушения липидного обмена (например, болезнь Гоше), пероксисомальные болезни (например, синдром Целлвегера), тирозинемию, врожденный фиброз печени, бактериальные инфекции (например, бруцеллез), паразитов (эхинококкоз), болезнь Бадда-Киари (облитерирующий эндофлебит печеночных вен).

Заболевания легких включают идиопатический фиброз легких, силикоз, пневмокониоз, бронхолегочную дисплазию новорожденных после синдрома острой дыхательной недостаточности, повреждение легких в результате применение блеомицина/химических агентов, облитерирующий бронхиолит (BOS) после трансплантации легких, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), муковисцидоз, астму.

Заболевания сердца включают кардиомиопатию, атеросклероз (заболевание Бергенра и т.д.), фиброз эндомиокарда, фибрилляцию предсердий, рубцевание после инфаркта миокарда (MI)

Другие заболевания торакальной области включают индуцированные облучением реакции ткани капсулы вокруг структурированных грудных имплантатов и субмукозальный фиброз полости рта.

Заболевания почек включают аутосомно-доминантный поликистоз почек (ADPKD), диабетическую нефропатию (диабетический гломерулосклероз), фокально-сегментарный гломерулосклероз (FSGS) (коллапсный против других гистологических вариантов), IgA нефропатию (болезнь Бергера), волчаночный нефрит, склеродермию, синдром Гудпасчера, тубулоинтерстициальный фиброз: вызванную лекарствами (защитными) пенициллинами, сергалоспоринами, анальгетиками нефропатию, мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит (MPGN), болезнь Шенлейн-Геноха, врожденные нефропатии: ювенильный нефронофтиз, наследственный онихоартроз и синдром Альпорта.

Болезни костного мозга включают лимфангиолиомиосистоз (LAM), хроническую реакцию трансплантат-против-хозяина, полицитемия, идиопатическую тромбоцитемию, миелофиброз.

Болезни глаз включают ретинопатию ретролентальную фиброплазию (RoP), пузырчатку глаз, фиброз слезных желез, операции по прикреплению сетчатки, помутнение роговицы, герпетический кератит, птеригиум, глаукому, возрастную макулярную дистрофию (AMD/ARMD), ретинопатию, вызванную фиброзом сетчатки при сахарном диабете (DM).

Гинекологические заболевания включают эндометриоз при гормональной терапии для предотвращения рубцевания, фиброз/сальфингит после STD.

Системные заболевания включают синдром Дюпюитрена, контрактуру ладонного апоневроза, болезнь Пейрони, Болезнь Леддерхозе, келоидные рубцы, множественный фибросклероз, нефрогенный системный фиброз, нефрогенный миелофиброз (анемия). Фибротические заболевания, вызванные травмами, включают образование рубцов и контрактур на коже и мягких тканях в результате ожогов (включая химические), вызванное облучением образование шрамов в коже и органах после применения облучения при терапии рака, келоидные рубцы (кожа).

Состояния после операций включают перитонеальный фиброз из-за катетера перитонеального диализа брюшины, имплантата роговицы, кохлеарного имплантата, других имплантов, силиконовых имплантов молочных желез, хронический синусит; спайки, псевдоинтимальная гиперплазия трансплантатов диализа.

Другие состояния включают хронический панкреатит.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается способ лечения субъекта, страдающего от фиброза печени, включающий введение субъекту эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, благодаря чему лечится фиброз печени. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения субъект страдает от цирроза печени из-за гепатита. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от цирроза печени, обусловленного NASH.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается применение молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения фиброза печени. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения фиброз печени вызван гепатитом. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения фиброз печени обусловлен NASH.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается способ ремоделирования рубцовой ткани, включающий введение субъекту, который в этом нуждается, эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, влияя, таким образом, на ремоделирование рубцовой ткани. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения рубцовая ткань находится в печени. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения субъект страдает от цирроза печени, обусловленного гепатитом. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения субъект страдает от цирроза печени, обусловленного NASH.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения способ влияния на регрессию фиброза, включающий введение субъекту, который в этом нуждается, эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, влияя, таким образом, на регрессию фиброза.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается способ уменьшения рубцовой ткани у субъекта, включающий стадию введения субъекту эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению для уменьшения рубцовой ткани. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается способ уменьшения рубцовой ткани у субъекта, включающий стадию топического нанесения на рубцовую ткань эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию для уменьшения рубцовой ткани.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается способ улучшения внешнего вида рубцовой ткани, включающий этап топического нанесения на рубцовую ткань эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению для улучшения внешнего вида рубцовой ткани.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается способ лечения субъекта, страдающего от фиброза легких, включающий введение субъекту эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, благодаря чему лечится фиброз легких. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения субъект страдает от интерстициального фиброза легких (ILF). В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения субъект страдает от лучевого пневмонита, вызывающего фиброз легких. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения субъект страдает от фиброза легких, вызванного лекарственными средствами.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обеспечивается применение молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения фиброза легких. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения фиброзом легких является ILF. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения фиброз легких представляет собой фиброз легких, вызванный лекарственными средствами или облучением.

В качестве объекта настоящего изобретения обеспечиваются фармацевтические композиции, которые включают молекулу нуклеиновых кислот (например, молекулу siNA) согласно настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает или содержит систему доставки, подходящую для доставки молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы) субъекту, такому как субъект; например, как например, системы доставки, более подробно описанные ниже.

В качестве родственного объекта настоящего изобретения обеспечиваются композиции или наборы, которые включают молекулу нуклеиновой кислоты (например, молекулу siNA) упакованную для использования субъектом. Упаковка может иметь этикетку или включать бирку места или вкладыш, на котором указано содержимое упаковки и дана конкретная информация относительно того, как субъект должен или может использовать молекулу нуклеиновой кислоты (например, молекулу siNA) например, этикетка может содержать информацию о дозе и/или показания к применению. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения содержание этикетки включает сообщение в форме, предписанной государственным учреждением, например, департаментом США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA). В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения на этикетке может быть указано, какая молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула siNA) подходит для применения для лечения субъекта, страдающего от заболевания, ассоциированного с hsp47; например, на этикетке может быть указано, какая молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула siNA) подходит для применения для лечения фиброза; или например, на этикетке может быть указано, какая молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула siNA) подходит для применения для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из фиброза, фиброза печени, цирроза, фиброза легких, фиброза почек, перитонеального фиброза, хронического поражения печени и фибриллогенеза.

Согласно настоящему изобретению термины "белок теплового шока 47" или "hsp47" или «HSP47» используются взаимозаменяемо и обозначают любой белок теплового шока 47, пептид или полипептид, обладающий любым действием белка hsp47. Белок теплового шока 47 представляет собой ингибитор сериновой протеазы (серпин), также обозначаемый термином, например, ингибитор пептидазы серпина, clade H, член 1 (SERPINH1), SERPINH2, белок, связывающий коллаген 1 (СВР1), СВР2, gp46; мышьяк-трансактивированный белок 3 (AsTP3); HSP47; ген, вызывающий пролиферацию 14 (PIG14); PPROM; антиген ревматоидного артрита А-47 (RA-A47); коллигин-1 и коллигин- 2. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации «hsp47» обозначает hsp47 человека. Белок теплового шока 47 (или более точно hsp47 человека) может иметь аминокислотную последовательность, которая является такой же или по существу такой же как SEQ ID NO. 2.

Согласно настоящему изобретению термин "нуклеотидная последовательность, кодирующая hsp47" означает последовательность нуклеотидов, которая кодирует белок hsp47 человека или его часть. Термин «нуклеотидная последовательность, кодирующая hsp47» также включает кодирующие последовательности hsp47, такие как изоформы hsp47, мутантные гены hsp47, варианты, полученные при сплайсинге генов hsp47, и полиморфизмы гена hsp47. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая hsp47, включает последовательности мРНК, кодирующие hsp47, которые также обозначаются термином «мРНК hsp47». Примером последовательностей мРНК hsp47 человека является SEQ ID. NO. 1.

Согласно настоящему изобретению термин "молекула нуклеиновой кислоты" или "нуклеиновая кислота" применяются взаимозаменяемо и означают олигонуклеотид, нуклеотид или полинуклеотид. Варианты «молекулы нуклеиновой кислоты» более подробно описаны в настоящей заявке. Молекула нуклеиновой кислоты включает как модифицированные молекулы нуклеиновой кислоты, так и немодифицированные молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию. Молекула нуклеиновой кислоты может включать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или аналоги нуклеотидов в любой комбинации.

Согласно настоящему изобретению термин "нуклеотид" означает химическую составляющую, содержащую сахар (или его аналог или модифицированный сахар), нуклеиновое основание (или его аналог или модифицированное основание), фосфатную группу (или ее аналог или модифицированную фосфатную группу). Нуклеотид включает как модифицированные нуклеотиды, так и немодифицированные нуклеотиды согласно настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению нуклеотиды могут включать дезоксирибонуклеотиды (например, немодифицированные дезоксирибонуклеотиды), рибонуклеотиды (например, немодифицированные рибонуклеотиды) и аналоги модифицированных нуклеотидов, включая, среди прочего, LNA и UNA, пептидные нуклеиновые кислоты, L-нуклеотиды (также обозначаемые термином зеркальные нуклеотиды), нуклеиновые кислоты с этиленовым мостиком (ΕΝΑ), арабинозиды, нуклеотиды с 6-углеродным сахаром, а также аналоги нуклеотидов (включая нуклеотиды, лишенные основания), которые зачастую считают ненуклеотидами. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеотиды могут быть модифицированы по остатку сахара, нуклеинового основания и/или фосфатной группе с помощью любых модификаций, известных в данной области техники, например, модификаций согласно настоящему описанию. Термины «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» согласно настоящему изобретению означают цепь связанных нуклеотидов; полинуклеотиды и олигонуклеотиды также могут иметь модификации в сахаре нуклеотида, нуклеиновых основаниях и фосфатных остовах, примеры которых хорошо известны в данной области техники и/или указаны в настоящей заявке.

Согласно настоящему изобретению термин "малая интерферирующая нуклеиновая кислота", "siNA" или "молекула малой интерферирующей нуклеиновой кислоты" означает любую молекулу нуклеиновой кислоты, способную изменять экспрессию гена или репликацию вируса. Предпочтительно siNA ингибирует или снижает экспрессию гена или репликацию вируса. siNA включает, без ограничения к этому, η молекулы нуклеиновой кислоты, которые способны опосредовать RNAi специфической последовательности, например, малые интерферирующие РНК (siRNA), двухнитевые РНК (dsRNA), микро-РНК (miRNA), малые шпилечные РНК (shRNA), малый интерферирующий олигонуклеотид, малую интерферирующую нуклеиновую кислоту, малый интерферирующий модифицированный олигонуклеотид, химически модифицированную siRNA, РНК постранскрипционного сайленсинга генов (ptgsRNA), и другие. Согласно настоящему изобретению термин "малая интерферирующая нуклеиновая кислота", "siNA" или "молекула малой интерферирующей нуклеиновой кислоты" имеет значения, описанные более подробно в описании настоящего изобретения.

Согласно настоящему изобретению термин "комплементарность" означает, что нуклеиновая кислота может образовывать водородную связь (связи) с другой последовательностью нуклеиновой кислоты посредством традиционных связей по Уотсону-Крику или других нетрадиционных связей. Для молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию свободная энергия связывания молекулы нуклеиновой кислоты с комплементарной ей последовательностью является достаточной для того, чтобы соответствующая функция нуклеиновой кислоты превратилась, например, в активность RNAi. Определение свободных энергий связывания для молекул нуклеиновых кислот хорошо известно в данной области техники (смотрите, например, Turner et al, 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LU pp. 123-133; Frier et al, 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785). Процент комплементарности указывает долю смежных остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (например, спаривание оснований по Уотсону-Крику) с последовательностью второй нуклеиновой кислоты (например, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 нуклеотидов из 10 нуклеотидов первого олигонуклеотида спариваются с 10 основаниями второй последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей 10 нуклеотидов, это означает 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100% комплементарности, соответственно). "Полная комплементарность" означает, что все смежные остатки последовательности нуклеиновой кислоты образуют водородные связи с тем же количеством смежных остатков в последовательности второй нуклеиновой кислоты. В одном варианте выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включает от около 15 до около 35 или более (например, около 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 или более) нуклеотидов, которые комплементарны одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот-мишеней или их частям.

Согласно настоящему изобретению термин "смысловая область" означает последовательность нуклеотидов молекулы siNA, комплементарную (частично или полностью) антисмысловой области молекулы siNA. Смысловая нить молекулы siNA может включать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую гомологией с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты. Согласно настоящему изобретению термин "смысловая нить" означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает смысловую область и также может включать дополнительные нуклеотиды. Положения нуклеотидов смысловой нити нумеруются в направлении 5'>3'.

Согласно настоящему изобретению термин "антисмысловая область" означает последовательность нуклеотидов молекулы siNA, комплементарную (частично или полностью) последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Антисмысловая нить молекулы siNA необязательно включает последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную смысловой области молекулы siNA. Согласно настоящему изобретению термин "антисмысловая область" означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает антисмысловую область и также может включать дополнительные нуклеотиды. Положения нуклеотидов смысловой нити нумеруются в направлении 5'>3'.

Согласно настоящему изобретению термин "РНК" означает молекулу, которая включает по меньшей мере один рибонуклеотидный остаток.

Согласно настоящему изобретению термин "дуплексная область" означает участок в двух комплементарных или существенно комплементарных олигонуклеотидах, которые образуют пары оснований друг с другом как с помощью спаривания оснований по Уотсону-Крику, так и другим образом, при котором образуется дуплекс между цепями олигонуклеотидов, которые являются комплементарными или существенно комплементарными. Например, олигонуклеотид, имеющий 21 нуклеотид, может образовывать пары оснований с другим олигонуклеотидов из 21 нуклеотидов, при этом только 19 оснований каждой нити являются комплементарными или существенно комплементарными, таким образом, «дуплексная область» состоит из 19 пар оснований. Остальные пары оснований могут, например, существовать в виде 5' и 3'-выступающих концов. Также в пределах дуплексной области не требуется 100% комплементарность; допускается существенная комплементарность в пределах дуплексной области. Комплементарность по существу означает такую комплементарность между нитями, при которой они могут гибридизоваться при биологических условиях. Методики эмпирического определения способности к гибридизации двух нитей при биологических условиях хорошо известны в данной области техники. В другом случае можно синтезировать и добавить и объединить при биологических условиях нити для того, чтобы определить, гибридизуются ли они друг с другом.

Согласно настоящему изобретению термин "не образующий пару аналог нуклеотида" означает аналог нуклеотида, который включает не образующую пару составляющую, включая, но без ограничения к этому: 6-дез-амино аденозин (небуларин), 4-Ме-индол, 3-нитропиррол, 5-нитроиндол, Ds, Ра, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-этил-dC, N3-Me dC. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения не образующий пару аналог нуклеотида представляет собой рибонуклеотид. В других вариантах выполнения настоящего изобретения он представляет собой дезоксирибонуклеотид.

Согласно настоящему изобретению термин "терминальная функциональная группа" включает, но без ограничения к этому, группы галогена, спирта, амина, карбокси, сложного эфира, амида, альдегида, кетона, простого эфира.

Согласно настоящему изобретению термин «нуклеотид без основания" или «аналог нуклеотида без основания" также часто может применяться в настоящей заявке и в данной области техники как псевдо-нуклеотид или нестандартная составляющая. Тогда как нуклеотид представляет собой мономерную единицу нуклеиновой кислоты, как правило, содержащую сахар рибозу или дезоксирибозу, фосфат и основание (аденина, гуанина, тимина или цитозина в ДНК; аденина, гуанина, урацила или цитозина в РНК), без основания или псевдо-нуклеотид не содержит основание, и поэтому он не является нуклеотидом, в том смысле, в котором термин обычно понимают в данной области техники. Дезоксирибозные составляющие без основания включают, например, дезоксири-боза-3'-фосфат; 1,2- дидезокси-О-рибофураноза-3-фосфат; 1,4-ангидро-2-дезокси-D-рибитол-3-фосфат. Инвертированные дезоксирибозные основания без основания, включают инвертированную дезоксирибозу без основания; 3',5' инвестированный де-зокси-5'-фосфат без основания.

Согласно настоящему изобретению термин "кэппирующая составляющая" (z'') включает составляющую, которая может быть ковалентно связана с 5'-концом (N')_y и включает рибозную составляющую без основания, дезоксирибозную составляющую без основания, модификации рибозных и дезоксирибозных составляющих без основания, включая 2' О алкильные составляющие; обращенные рибозные и дезоксирибозные составляющие и их модификации; С₆-имино-Pi; зеркальный нуклеотид, включая L-DNA и L-RNA; 5'ОМе нуклеотид; и нуклеотидные аналоги, включая 4',5'-метилен нуклеотид; 1-(β-В-эритрофуранозил)нуклеотид; 4'-тио нуклеотид, карбоциклический нуклеотид; 5'-амино-алкилфосфат; 1,3-диамино-2-пропилфосфат, 3-аминопропил фосфат; 6-аминогексил фосфат; 12-аминододецил фосфат; гидроксипропил фосфат; 1,5-ангидрогексит нуклеотид; альфа-нуклеотид; трео-пентофуранозил нуклеотид; ациклический 3',4'-секонуклеотид; 3,4-дигидроксибутил нуклеотид; 3,5-дигидроксипентил нуклеотид, 5'-5'- инвертированную составляющую без основания; 1,4-бутандиол фосфат; 5'-амино; и соединенные или не соединенные мостиком метилфосфонат и 5'-меркапто составляющие.

Определенными кэппирующими составляющими могут быть рибозные или дезоксирибозные составляющие без основания; обращенные рибозные или дезоксирибозные составляющие без основания; С6-амино-Pi; зеркальный нуклеотид, включая L-DNA и L-RNA. Молекулы нуклеиновой кислоты, как раскрывается в настоящей заявке, могут быть синтезированы с применением одного или более инвертированных нуклеотидов, например, инвертированного тимидина или инвертированного аденина (например, смотрите Takei, et al, 2002. JBC 277(26):23800-06).

Согласно настоящему изобретению термин "нестандартная составляющая" означает ненуклеотидные составляющие, включая составляющую без основания, инвертированную составляющую без основания, углеводородную (алкильную) составляющую и ее производные, и дополнительно включает дезоксирибонуклеотид, модифицированный дезоксирибонуклеотид, зеркальный нуклеотид (L-DNA или L-RNA), налог нуклеотида, не образующий пару, и нуклеотид, соединенный со смежным нуклеотидом посредством 2'-5' межнуклеотидной фосфатной связи; мостиковые нуклеиновые кислоты, включая LNA и нуклеиновые кислоты, соединенные мостиком из этилена, нуклеотиды с модифицированными связями (например, РАСЕ) и нуклеотиды с модифицированными основаниями, а также дополнительные составляющие, обозначенные в настоящей заявке как нестандартные составляющие.

Согласно настоящему изобретению термин "ингибировать", "понижать экспрессию" или "уменьшать" в отношении генной экспрессии означает, что генная экспрессия или уровень молекул РНК или эквивалентных молекул РНК, кодирующих один или несколько белков или субъединиц белков (например, мРНК) или активность одного или более белков или субъединиц белков уменьшена ниже уровня, который наблюдается в отсутствии подавляющего фактора (такого как молекула нуклеиновой кислоты, например, siNA, например, имеющая структурные признаки, как описано в настоящей заявке); например, имеющей структурные особенности согласно настоящему изобретению); например, экспрессия может быть снижена на 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или меньше, чем наблюдается в отсутствии ингибитора.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 показана схема протокола оценки gp46-siRNA in vitro с применением клеток NRK и определения оптимальной последовательности, времени и концентрации.

На Фиг. 2 показана фотографическая диаграмма, показывающая результат Вестерн-блоттинга gp46 и актина (24 часа культивирования, исследование оптимальной последовательности).

На Фиг. 3 показана фотографическая диаграмма, показывающая результат Вестерн-блоттинга gp46 и актина (24 часа культивирования, исследование оптимальной концентрации).

На Фиг. 4 показана фотографическая диаграмма, показывающая результат Вестерн-блоттинга gp46 и актина (концентрация 50 нМ, исследование оптимального времени культивирования).

На Фиг. 5 показана схема протокола оценки ингибирования экспрессии коллагена посредством gp46-siRNA в NRK клетках.

На Фиг. 6 показан график ингибирования синтеза коллагена посредством siRNA.

На Фиг. 7 показана фотографическая схема HSC-специфической siRNA трансфекции.

На Фиг. 8 показана фотографическая схема оценки процента HSC-специфической siRNA трансфекции.

На Фиг. 9 показана фотографическая схема оценки ингибирования экспрессии gp46 посредством siRNA.

На Фиг. 10 показана фотографическая схема азанового окрашивания печени крыс, которым был введен DMN.

На Фиг. 11 показана схема протокола лечения LC крыс.

На Фиг. 12 показана фотографическая схема азанового окрашивания печени LC крыс, которым был введен VA-Lip-gp46siRNA.

На Фиг. 13 показана схема способа экстракции окрашенной части посредством NIH Image (6 положений случайным образом берутся из азан-окрашенного изображения).

На Фиг. 14 показан график отношения по площади, занятой фибротическими частями в гистологии печени (отношение коллагена по площади, %).

На Фиг. 15 показан график количества гидроксипролина в ткани печени.

На Фиг. 16 показан график кривой выживания крыс с циррозом печени, которым интрапортально вводился VA-Lip-gp46siRNA.

На Фиг. 17 показана фотографическая схема азанового окрашивания ткани печени крыс с циррозом печени, которым интрапортально вводился VA-Lip-gp46siRNA.

На Фиг. 18 показан график кривой выживания крыс с циррозом печени, которым интрапортально вводился VA-Lip-gp46siRNA.

На Фиг. 19 показана фотографическая схема азанового окрашивания ткани печени крыс с циррозом печени, которым интрапортально вводился VA-Lip-gp46siRNA.

На Фиг. 20 показан график кривой выживания крыс с циррозом печени, которым интрапортально вводился VA-Lip-gp46siRNA.

На Фиг. 21 показан график кривой выживания крыс с циррозом печени, которым интрапортально вводился VA-Lip-gp46siRNA.

На Фиг. 22 показана фотографическая схема азанового окрашивания ткани печени крыс с циррозом печени, которым интрапортально вводился VA-Lip-gp46siRNA.

На Фиг. 23 показана схема улучшения эффективности трансфекции VA-Lip-gp46siRNA посредством RBP.

На Фиг. 24 показана схема ингибирования трансфекции VA-Lip-gp46siRNA посредством анти-RBP антитела.

На Фиг. 25 показана столбцовая диаграмма, показывающая действие GFP siNA на различные репортерные клеточные линии. Клеточные линии получали с помощью лентивирусного введения HSP47 cDNA-GFP или GP46 крысы cDNA-GFP конструкции в НЕК293, линию фибросаркомы человека HT1080, линию HSC человека hTERT или клеточную линию NRK. Отрицательный контроль siNA или siNA против GFP вводили в клетки, и измеряли GFP флуоресценцию. Результаты показали, что siNA против GFP снижает флуоресценцию в различной степени в разных клеточных линиях. Клеточные линии 293 HSP47-GFP и 293 GP46-GFP выбирались ля скрининга siHsp47 по причине легкости, с которой они поддаются трансфекции и чувствительности к снижению флуоресценции.

На Фиг. 26А, 26В, 26С и 26D показан набор столбцовых диаграмм, показывающих цитотоксичность и эффективность снижения различных siHsp47 в клеточных линиях 293_HSP47-GFP и 293 GP46-GFP. Результаты показали, что siHsp47-C, siHsp47-2 и siHsp47-2d эффективно понижают как HSP47 человека, так и GP46 крысы (гомолог hsp47 человека) без существенной цитотоксичности. siGp46A против GP46 не снижает HSP47 человека. Также заново созданные siHsp47 превосходили siGp46A в снижении GP46 крысы.

На Фиг. 27 показана столбцовая диаграмма, показывающая эффект снижения различных siHsp47s на мРНК hsp47, измеренный методом TaqMan® количественной ПЦР с использованием линии HSC клеток человека hTERT. На оси Y представлен остаточный уровень мРНК для hsp47. HSP47-C была самой эффективной среди всех протестированных hsp47 siNA.

На Фиг. 28 показана столбцовая диаграмма, показывающая влияние разных hsp47 siNA на экспрессию коллагена I в hTERT клетках. Уровень мРНК коллагена I определяли методом количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием зонда TaqMan®. На оси Y представлен остаточный уровень мРНК экспрессии коллагена I. Результат показал, что уровень мРНК коллагена I значительно снижен в клетках, обработанных некоторыми кандидатами (siHsp47-2, siHsp47-2d и их комбинацию с siHsp47-1).

На Фиг. 29 показан график уменьшения площади фиброза у животных, обработанных SÍHSP47.

На Фиг. 30 показана схема режима лечения и способа оценки, применяемого в Примере 22.

На Фиг. 31 показаны результаты гистологического окрашивания азаном в области легких. Картинки показывают соответствующую легочную область окрашенных азаном частей каждой группы при 80Х увеличении, (а) Предварительная обработка (BLM IT - 2W); (b) Больная крыса (BLM IT-5W+PBS i.v.); и (с) Лечение (BLM IT+siRNA i.v.), (d) Плацебо (соляной раствор-IT+PBS i.v.).

На Фиг. 32 показан масштаб фиброза, показывающий результаты оценки двадцати случайно выбранных легочных областей при 80Х увеличении каждой крысы. Столбцовая диаграмма суммирует масштаб фиброза окрашенной азаном секции каждой группы. Статистические анализы применялись в сравнительном тесте One-way-ANOVA Bonferroni multi с применением программного обеспечения Prism5.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ВЫПОЛНЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Интерференция РНК и молекулы нуклеиновой кислоты siNA

Интерференция РНК относится к процессу специфического в отношении последовательности пострансляционного сайленсинга генов у животных, регулируемому короткими интерферирующими РНК (siRNA) (Zamore et al, 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al, 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al, 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al, 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13:139-141; и Strauss, 1999, Science, 286, 886). Наличие dsRNA в клетках запускает ответ RNAi через механизм, который еще не был полностью охарактеризован.

Дайсер участвует в процессинге dsRNA в короткие части dsRNA, известные как короткие интерферирующие РНК (siRNA) (Zamore et al, 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2000, Cell, 101, 235; Berstein et al, 2001, Nature, 409, 363). siRNA, поученные в результате активности дайсера, могут составлять от около 21 до около 23 нуклеотидов в длину и включать около 19 дуплексов пар оснований (Zamore et al, 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashir et al, 2001, Genes Dev., 15, 188). Также дайсер участвует в вырезании малых временных РНК длиной 21- и 22-нуклеотида (stRNAs) из РНК-предшественника консервативной структуры, которые участвуют в контроле трансляции (Hutvagner et al, 2001, Science, 293, 834). Ответ RNAi также включает комплекс эндонуклеазы, обычно упоминаемый как РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечной РНК, имеющей последовательность, комплементарную антисмысловой нити дуплекса siRNA. Расщепление целевой РНК происходит посередине участка, комплементарного антисмысловой нити дуплекса siRNA (Elbashir et al, 2001, Genes Dev., 15,188).

RNAi исследовали в различных системах. Fire et al, 1998, Nature, 391, 806, впервые наблюдали RNAi в С.elegans. В Bahramian и Zarbl, 1999, Molecular и Cellular Biology, 19, 274-283 и Wianny и Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, описывается RNAi, опосредованная dsRNA в системах млекопитающих. В Elbashir et al, 2001, Nature, 411, 494 и Tuschl et al, WO 0175164, описывается, что RNAi индуцируется при введении дуплексов синтетических 21-нуклеотидных РНК в культивированных клетках млекопитающих, включая клетки печени эмбриона человека и клетки HeLa. Недавняя работа (Elbashir et al, 2001, EMBO J., 20, 6877 и Tuschl et al, WO 0175164) определили определенные требований к структуре, длине, химическому составу и последовательности siRNA, которые необходимы для опосредования эффективной активности RNAi.

Молекулы нуклеиновых кислот (например, имеющие структурные особенности согласно настоящему описанию) могут подавлять или отрицательно регулировать экспрессию генов или репликацию вирусов посредством опосредования РНК интерференции «RNAi» или сайленсинга генов специфичным в отношении последовательности. (Смотрите, например, Zamore et al, 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al, 2001, Nature, 411, 494-498; и Kreutzer et al, WO0044895; Zernicka-Goetz et al, WO0136646; Fire, WO 9932619; Plaetinck et al, WO0001846; Mello и Fire, WO0129058; Deschamps-Depaillette, WO9907409; и Li et al, WO0044914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al, 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al, 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al, 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al, 2002, Gene & Dev., 16,1616-1626; и Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831)

Молекула нуклеиновой кислоты siNA может быть образована двумя отдельными полинуклеотидными цепями, при этом одна нить является смысловой нитью, и вторая является антисмысловой, при этом антисмысловая и смысловая нити являются комлементарными друг другу (т.е. каждая нить включает последовательность нуклеотидов, которая комплементарна последовательности нуклеотидов во второй нити); таким образом, что антисмысловая нить и смысловая нить образуют дуплекс или двухцепочечную структуру любой длины и структуры согласно настоящему описанию для молекул нуклеиновых кислот, например, при этом двухцепочечный участок 25 (дуплексный участок) составляет от около 15 до около 49 (например, около 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 пар оснований); антисмысловая нить включает последовательность нуклеотидов, которая комплементарна последовательности нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты-мишени (т.е. hsp47 мРНК) или ее части, и смысловая нить включает последовательность нуклеотидов, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части (например, около от 17 до 49 или больше нуклеотидов молекул нуклеиновых кислот в настоящем описании комплементарны нуклеиновой кислоте-мишени или ее части).

В определенных объектах настоящего изобретения и вариантах выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула siNA) согласно настоящему изобретению может представлять собой молекулу "длины RISC" или может являться субстратом для дайсера, как более подробно описано ниже.

Молекула нуклеиновой кислоты siNA может включать отдельные смысловые и антисмысловые последовательности или участки, при этом смысловые и антисмысловые участки ковалентно соединены с помощью нуклеотидных или ненуклеотидных линкерных молекул, известных в данной области техники, или в другом случае не ковалентно соединены посредством ионных связей, водородных связей, Вад-дер-Ваальсовых связей, гидрофобных связей и/или стэкинг-взаимодействий. Молекулы нуклеиновых кислот могут включать последовательность нуклеотидов, которая комплементарна последовательности нуклеотидов целевого гена. Молекулы нуклеиновых кислот могут взаимодействовать с нуклеотидной последовательностью целевого гена таким образом, что это вызывает подавление экспрессии целевого гена.

Альтернативно молекула нуклеиновой кислоты siNA состоит из отдельного полинуклеотида, при этом комплементарные друг другу смысловой и антисмысловой участки молекулы нуклеиновой кислоты соединены посредством линкера (линкеров) на основе нуклеиновой кислоты или не на основе нуклеиновой кислоты, т.е. антисмысловая нить и смысловая нить являются частью одного полинуклеотида, имеющего антисмысловой участок и смысловой участок, которые укладываются для образования дуплексного участка (например, для образования структуры «шпильки», как хорошо известно в данной области). Такие молекулы нуклеиновой кислоты siNA могут представлять собой полинуклеотид с асимметричной дуплексной, шпилечной или асимметричной вторичной шпилечной структурой, имеющей комлементарные друг другу смысловые и антисмысловые участки, при этом антисмысловой участок включает последовательность нуклеотидов, которая комплементарна последовательности нуклеотидов в отдельной молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловой участок имеет последовательность нуклеотидов, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты (например, последовательности hsp47 мРНК). Такие молекулы нуклеиновой кислоты siNA могут представлять собой кольцевой одноцепочечный полинуклеотид, имеющий две или больше петельных структур и ствол, содержащий комплементарные смысловые и антисмысловые участки, при этом антисмысловой участок включает последовательность нуклеотидов, которая комплементарна последовательности нуклеотидов в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловой участок имеет последовательность нуклеотидов, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и при этом кольцевой полинуклеотид может подвергаться процессингу in vivo или in vitro с образованием активной молекулы нуклеиновой кислоты, способной опосредовать RNAi.

Следующую номенклатуру часто используют в данной области для описания длины и липких концов молекул siNA молекулы и она используется в настоящем описании и Примерах. Во всех описаниях олигонуклеотидов в описании настоящего изобретения, идентификация нуклеотидов в последовательности проводится в 5'-3' направлении как для смысловой, так и для антисмысловой нитей. Названия, присваиваемые дуплексам, указывают длину олигомеров и наличие или отсутствие выступающих концов. Например, дуплекс «21+2» содержит две нити нуклеиновых кислот, обе из которых имеют 21 нуклеотид в длину, также обозначают термином 21-мерный дуплекс siRNA 21-мерная нуклеиновая кислота, и имеет 3'- липкий конец из 2 нуклеотидов. «21-2» обозначает 21-мерный дуплекс нуклеиновых кислот с 5'-липким концом из 2 нуклеотидов. «21-02» представляет собой 21-мерный дуплекс нуклеиновых кислот без липких концов («тупые» концы). «21+2UU» представляет собой 21-мерный дуплекс с 3'-липким концом из 2 нуклеотидов, и оба 2 концевых нуклеотида на 3'-концах являются остатками U (что может приводить к несоответствию целевой последовательности). Указанную выше номенклатуру можно применять к молекулам siNA с различной длиной нитей, дуплексов и липких концов (например, 19-0, 21+2, 27+2 и т.п.). Согласно другой, но похожей номенклатуре «25/27» означает асимметричный дуплекс, имеющий смысловую нить из 25 оснований и антисмысловую нить из 27 оснований с 3'-липким концом из 2 нуклеотидов. «27/25» означает асимметричный дуплекс, имеющий смысловую нить из 27 оснований и антисмысловую нить из 25 оснований.

Химические модификации

Согласно определенным аспектам и вариантам реализации молекулы нуклеиновых кислот (например, молекулы siNA) согласно настоящему изобретению включают одну или несколько модификаций (или химических модификаций). Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения такие модификации включают любые изменения в молекуле нуклеиновой кислоты или полинуклеотида, которые сделают молекулу отличной от стандартного рибонуклеотида или молекулы РНК (т.е. которая включает стандартные группы аденозина, цитозина, урацила или гуанозина), которую можно обозначить как "немодифицированный" рибонуклеотид или немодифицированная рибонуклеиновая кислота. Традиционные основания ДНК и полинуклеотиды, имеющие 2'-дезоксисахар, представленные группами аденозина, цитозина, тимина или гуанозина, можно обозначить как "немодифицированный дезоксирибонуклеотид" или "немодифицированная дезоксирибонуклеиновая кислота"; соответственно термин "немодифицированный нуклеотид" или "немодифицированная нуклеиновая кислота" согласно настоящему изобретению означает "немодифицированный рибонуклеотид" или "немодифицированную рибонуклеиновую кислоту", если ясным образом не указано иного. Такие модификации могут происходить в сахаре нуклеотида, нуклеиновом основании, фосфатной группе нуклеотида и/или фосфатном остове полинуклеотида.

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения, модификации, как раскрывается в настоящей заявке, могут применяться для повышения активности RNAi молекулы и/или для повышения in vivo стабильности молекул, в частности стабильности в сыворотке, и/или для повышения биологической доступности молекул. Примеры модификаций включают, но не ограничиваются, межнуклеотидные или межнуклеозидные связи; дезоксинуклеотиды или дидезоксирибонуклеотиды в любом положении и нити молекулы нуклеиновой кислоты; нуклеиновую кислоту (например, рибонуклеиновую кислоту) с модификацией в 2'-положении, предпочтительно выбранную из амино, фтор, метокси, алкокси и алкила; 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'ОМе рибонуклеотиды, 2'-дезокси-2'- фтор рибонуклеотиды, нуклеотиды с "универсальным основанием", "ациклические" нуклеотиды, 5-С-метил нуклеотиды, биотиновую группу и вставки концевых глицериловых и/или инвертированных дезокси остатков без основания, пространственно затрудненные молекулы, такие как флуоресцентные молекулы и т.п. Другие модификаторы нуклеотидов могут включать 3-дезоксиаденозин (кордицепин), 3'-азидо-3'- дезокситимидин (AZT), 2',3'-дидезоксиинозин (ddI), 2',3'-дидезокси-3'-тиаацитидин (3ТС), 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидин (d4T) и монофосфатные нуклеотиды 3'- 25 азидо-3'-дезокситимидин (AZT), 2',3'-дидезокси-3'-тиаацитидин (3ТС) и 2',3'-дидегидро- 2',3'-диде-окситимидин (d4T). Другие подробности различных модификаций более подробно описаны ниже.

Модифицированные нуклеотиды включают нуклеотиды, имеющие нозерн- конформацию (например, цикл псевдовращения по Нозерну, смотрите например, Sanger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984). Неограничивающие примеры нуклеотидов, имеющих нозерн-конформацию, включают, но без ограничения к этому, LNA нуклеотиды(например, нуклеотиды 2'-0, 4'-С-метилен-(D- рибофуранозил)); нуклеотиды 2'-метоксиэтокси (МОЕ), 2'-метилтиоэтил, 2'-дезокси-2'-фтор, нуклеотиды 2'-дезокси-2'-хлор, нуклеотиды 2'-азидо и нуклеотиды 2'ОМе. LNA описываются, например, в Elman et al, 2005; Kurreck et al, 2002; Crinelli et al, 2002; Braasch и Corey, 2001; Bondensgaard et al, 2000; Wahlestedt et al, 2000; и WO 0047599, WO 9914226, WO 9839352 и WO 04083430. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, LNA встраиваются при 5'-конце смысловой нити.

Химические модификации также включают UNA, которые представляют собой ациклические ненуклеотидные аналоги, в которых отсутствует связь С2'-С3' (несмотря на то, что UNA не являются настоящими нуклеотидами, подчеркивается, что они включены в объем определения «модифицированных» нуклеотидов или модифицированных нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию). Согласно определенным вариантам реализации молекулы нуклеиновой кислоты с липкими концами могут быть модифицированы таким образом, что они содержат UNA в положениях выступающих концов (т.е. липкий конец из 2 нуклеотидов). Согласно другим вариантам выполнения настоящего изобретения UNA включены на 3'- или 5'-концах. UNA может быть расположена в любом месте нити нуклеиновой кислоты, т.е. в положении 7. Молекулы нуклеиновой кислоты могут содержать одну или больше UNA. Примеры UNA описаны в Nucleic Acids Symposium Series No. 52 p.133-134 (2008). В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы) согласно настоящему изобретению включают одну или более UNA; или одну UNA. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула) согласно настоящему изобретению, которая имеет 3'-липкий конец, включает одну или две UNA при 3' липком конце. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула) согласно настоящему изобретению включает UNA (например, одну UNA) в антисмысловой нити; например, в положении 6 или положении 7 антисмысловой нити. Химические модификации также включают аналоги нуклеотидов, не образующие пару, например, согласно настоящему описанию. Также химические модификации включают нетрадиционные группы согласно настоящему описанию.

Химические модификации также включают терминальные модификации в 5' и/или 3' части олигонуклеотидов и их обозначают термином блокирующие группы. Такие терминальные модификации выбирают из нуклеотида, модифицированного нуклеотида, липида, пептида и сахара.

Химические модификации также включают шестичленные "аналоги шестичленных кольцевых нуклеотидов." Примеры аналогов шестичленных кольцевых нуклеотидов описаны в Allart, et al (Nucleosides & Нуклеотиды, 1998, 17:1523-1526,; и Perez-Perez, et al, 1996, Bioorg. и Medicinal Chem Letters 6:1457-1460). Олигонуклеотиды, включающие аналоги шестичленных кольцевых нуклеотидов, включая мономеры нуклеотидов с гекситолом и альтриолом описываются в WO2006047842.

Химические модификации также включают "зеркальные" нуклеотиды, которые имеют обращенную хиральность по сравнению с обычным природным нуклеотидом; т.е. зеркальный нуклеотид может представлять собой "L-нуклеотидный" аналог природного D-нуклеотида (смотрите US 6602858). Зеркальные нуклеотиды могут также включать по меньшей мере одну модификацию сахара или основания и/или каркаса, например, согласно настоящему описанию, такую как группу фосфотиоата или фосфоната. В US 6602858 катализаторы нуклеиновых кислот, включающие замену по меньшей мере на один L-нуклеотид. Зеркальные нуклеотиды включают, например, L-ДНК (L-дезоксирибоаденозин-3'-фосфат (зеркальный dA); L- дезоксирибоцитидин-3'-фосфат (зеркальный dC); L-дезоксирибогуанозин-3'-фосфат 20 (зеркальный dG); L-дезоксириботимидин-3'-фосфат (зеркальный dT)) и L-PHK (L- рибоаденозин-3'-фосфат (зеркальный rА); L-рибоцитидин-3'-фосфат (зеркальный rC); L-рибогуанозин-3'-фосфат (зеркальный rG); L-рибоурацил-3'-фосфат (зеркальный dU).

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения модифицированные рибонуклеотиды включают модифицированные дезоксирибонуклеотиды, например, ДНК 5'OMe (5-метил-дезоксирибогуанозин-3'-фосфат), который можно использовать в качестве нуклеотида в 5'-концевом положении (положение номер 1); РАСЕ (дезоксирибоаденозин 3' фосфоноацетат, дезоксирибоцитидин 3' фосфоноацетат, дезоксирибогуанозин 3' фосфоноацетат, дезоксириботимидин 3' фосфоноацетат).

Модификации могут присутствовать в одной или более цепях молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, например, в смысловой нити, в антисмысловой нити или в обеих нитях. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить может включать модификации, и смысловая нить может включать только немодифицированную РНК.

Нуклеиновые основания

Нуклеиновые основания нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут включать немодифицированные рибонуклеотиды (пурины и пиримидины), такие как аденин, гуанин, цитозин, урацил. Нуклеиновые основания в одной или обеих нитях могут быть модифицированы природными и синтетическими нуклеиновыми основаниями, такими как тимин, ксантин, гипоксантин, инозин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, любые нуклеотиды с "универсальным основанием"; 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азо урацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, амино, тиол, тиоалкил, гидроксил и другие 8- замещенные аденины и гуанины, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин, деазапурины, гетероциклические замещенные аналоги пуринов 15 и пиримидинов, например, аминоэтокси фенооксазин, производные пуринов и пиримидинов (например, 1-алкил-, 1-алкенил-, гетероароматические- и 1-алкинил производные) и их таутомеры, 8-оксо- М6-метиладенин, 7-диазаксантин, 5-метилцитозин, 5-метилурацил, 5-(1-пропинил)урацил, 5-(1-пропинил) цитозин и 4,4-этанцитозин). Другие примеры подходящих оснований включают непуриниловые и непиримидиловые 20 основания, например, 2-аминопиридин и триазины.

Сахарные составляющие

Сахарные составляющие в нуклеиновой кислоте согласно настоящему изобретению могут включать сахарную составляющую 2'-гидроксил-пентофуранозил без модификаций. Альтернативно, сахарные составляющие могут быть модифицированы, как например, 2'-дезоксипентофуранозильная сахарная составляющая, D-рибоза, гексоза, модификация в 2' положении пентофуранозильной сахарной составляющей, такая как 2-O-алкил (включая 2'OMe и 2'-O-этил), т.е. 2'-алкокси, 2'-амино, 2'-O-аллил, 2'-Б-алкил, 2'-галоген (включая 2'-фтор, хлор и бром), 2'-метоксиэтокси, 2'-O-метоксиэтил, 2'-O-2-метоксиэтил, 2'-аллилокси (-OCH₂CH=СН₂), 2'-пропаргил, 2'-пропил, этинил, этенил, пропенил, CF, циано, имидазол, карбоксилат, тиоат, C1-С10 низший алкил, замещенный низший алкил, алкиларил или аралкил, OCF₃, OCN, O-, S-, или N-алкил; O-, S, или N-алкенил; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂, N₃; гетероциклоалкил; гетероциклоалкиларил; аминоалкиламино; полиалкиламино или замещенный силил, как среди прочих, например, как раскрывается в ЕР 0586520 или ЕР 0618925.

Алкильные группы включают насыщенные алифатические группы, включая неразветвленные алкильные группы (например, метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил, нонил, децил и т.д.), разветвленные алкильные группы (изопропил, трет-бутил, изобутил и т.д.), циклоалкильные группы (алициклические) (циклопропил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил), алкил-замещенные циклоалкильные группы и циклоалкил-замещенные алкильные группы. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения неразветвленная или разветвленная алкильная цепь имеет 6 или меньше атомов углерода в углеводородной цепи (например, С1-С6 для неразветвленной цепи, С3-С6 для разветвленной цепи) и более предпочтительно 4 или меньше. Аналогично предпочтительные циклоалкилы могут иметь от трех до восьми атомов углерода в структуре кольца и более предпочтительно имеют пять или шесть атомов углерода в структуре кольца. Термин С1-С6 включает алкильные группы, содержащие 1-6 атомов углерода. Алкильной группой может быть замещенная алкильная группа, например, алкильная группа, имеющая заместитель водорода у одного или более атомов углерода углероводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкокси, фосфат, фосфонат, фосфинат, циано, амино (включая алкиламино, диалкилалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбомил и уреидо), амидино, имино, сульфургидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкил-сульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклическую, алкиларил или ароматическую или гетероароматическую группу.

Алкокси-группа включает замещенные и незамещенные алкильную, алкенильную и алкинильную группу, ковалентно связанную с атомом кислорода. Примеры алкокси-групп включают метокси, этокси, изопропилокси, пропокси, бутокси и пентокси-группы. Примеры замещенных алкокси-групп включают галогенированные алкокси-группы. Алкокси-группы могут быть замещены на группы, такие как алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкокси, фосфат, фосфонат, фосфинат, циано, амино (включая алкил амино, диалкила-мино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфат, алкилсульфинил, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклическую, алкиларил или ароматическую или гетероароматическую группы. Примеры галоген-замещенных алкокси-групп включают, но не ограничиваются, фторметокси, дифторметокси, трифтор-метокси, хлорметокси, дихлорметокси, трихлорметокси и т.д.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения пентафуранозильное кольцо может быть замещено ациклическими производными, в которых отсутствует С₂'-С₃'-связь пентафуранозильного кольца. Например, ациклические нуклеотиды могут замещать 2- гидроксиэтоксиметильную группу на 2'-дезоксирибофуранозильный сахар, обычно представленный в dNMP.

Галогены включают фтор, бром, хлор, иод.

Остов

Нуклеозидные субъединицы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть соединены друг с другом с помощью фосфодиэфирной связи. Фосфоди-эфирная связь может быть заменена на другие связи. Например, фосфотиоат, тиофос-фат-D -рибоза, сложный триэфир, тиоат, 2'-5' мостиковый остов (также можно обозначать как 5'-2' или 2'-5' нуклеотид или 2'5' рибонуклеотид), РАСЕ, 3'-(или-5')-дезокси-3'-(или-5')-тио-фосфотиоат, фосфодитиоат, фосфоселенаты, 3'-(или 5')дезоксифосфинаты, боранофосфаты, 3'-(или -5')дезокси-3'-(или 5'-)аминофосфоамидаты, гидрофосфонаты, фосфонаты, боранофосфатные эфиры, фосфоамидаты, алкил или арил фосфонаты и фосфотриэфирные модификации, такие как алкилфосфотриэфиры, фосфотриэфирные фосфорные связи, 5'-этоксифосфодиэфир, Р-алкилоксифосфотриэфир, метилфосфонат и связи, не содержащие фосфор, например, карбонат, карбамат, силили, сульфур, сульфонат, сульфонамид, формацетал, тиоформацетил, оксим, метиленимино, метиленметилимино, метиленгидразо, метилендиметилгидразо и метиленоксиметилимино связи.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию могут включать пептидный остов нуклеиновой кислоты (PNA). PNA остов включает повторяющиеся единицы N-(2-аминоэитл)-глицина, соединенные пептидными связями. Различные основания, такие как пурин, пиримидин, природные и синтетические основания соединены в остове посредством метилен-карбонильных связей.

Терминальные фосфаты

Модификации могут быть сделаны при терминальных фосфатных группах. Неограничивающие примеры различных стабилизаторов, которые можно использовать, например, для того, чтобы стабилизировать 3'-конец последовательностей нуклеиновых кислот, включают, но не без ограничения к этому, (3'-3')-инвертированную дезоксирибозу; дезоксирибонуклеотид; (5'-3')-3'-дезоксирибонуклеотид; (5'-3')-рибонуклеотид; (5'-3')-3'-O-метил рибонуклеотид; 3'-глицерил; (3'-5')-3'-дезоксирибонуклеотид; (3'-3')-дезоксирибонуклеотид; (5'-2')-дезоксирибонуклеотид; и (5-3')-дидезоксирибонуклеотид. Кроме того, химия немодифицированного остова может быть объединена с одной или более различными модификациями остова, как описано в настоящей заявке.

Примеры химически модифицированных терминальных фосфатных групп включают показанные ниже:

Конъюгаты

Модифицированные нуклеотиды и молекулы нуклеиновых кислот (например, молекулы siNA) согласно настоящему изобретению могут включать конъюгаты, например, конъюгат, ковалентно соединенный с химически модифицированной молекулой нуклеиновой кислоты. Примеры конъюгатов включают, без ограничения к этому, конъюгаты и лиганды, описанные в Vargeese et al., U.S. Ser. No. 10/427,160. конъюгат может быть ковалентно соединен с молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой siNA) с помощью биодеградируемого линкера. Молекула конъюгата может быть соединена с 3'-концом смысловой нити и/или антисмысловой нити химически модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты. Молекула конъюгата может быть соединена с 5'-концом смысловой нити и/или антисмысловой нити химически модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты. Молекула конъюгата может быть соединена как 3'-концом, так и 5'-концом смысловой нити и/или антисмысловой нити химически модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты или любой их комбинации. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения молекула конъюгата может включать молекулу, которая облегчает доставку химически модифицированной нуклеиновой кислоты в биологическую систему, например, в клетку. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения молекула конъюгата, прикрепленная к химически модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, представляет собой полиэтиленгликоль, альбумин сыворотки человека или лиганд рецептора клетки, который опосредует поглощение клеткой. Примеры определенных молекул конъюгата согласно настоящему изобретению, которые могут быть присоединены к химически модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, описываются в Vargeese et al., U.S. Ser. No. 10/201,394.

Линкеры

Молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (например, siNA) может включать нуклеотид, ненуклеотидный или смешанный нуклеотидный/ненуклеотидный линкер, который соединяет смысловой участок нуклеиновой кислоты и антисмысловой участок нуклеиновой кислоты. Нуклеотидный линкер может представлять собой линкер длиной ≥2 нуклеотидов в длину, например, около 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов в длину. Нуклеотидным линкером может быть аптамер нуклеиновой кислоты. Термин "аптамер" или "аптамер нуклеиновой кислоты" согласно настоящему изобретению означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая специфично связывается с молекулой мишенью, при этом молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность, которая включает последовательность, распознаваемую целевой молекулой в естественных условиях. В другом случае аптамер может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая связывается с целевой молекулой (например, мРНК hsp47), при этом целевая молекула не связывается с нуклеиновой кислотой в естественных условиях. Например, аптамер можно использовать для связывания с лиганд-связывающим доменом белка, предотвращая при этом взаимодействие природного лиганда с белком. Это является неограничивающим примером, и специалистам в данной области техники будет ясно, что другие варианты реализации можно будет с легкостью получить с использованием методик, обычно известных в данной области техники. Смотрите, например, Gold et al; 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody и Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27; Hermann и Patel, 2000, Science, 287, 820; и Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628.

Ненуклеотидный линкер может включать нуклеотид без основания, простой полиэфир, полиамин, полиамид, пептид, углевод, липид, полиуглевод или другие полимерные соединения (например, полиэтилен гликоль, например, имеющие от 2 до 100 групп этиленгликоля). Некоторые примеры включают описанные в Seela и Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353 и Nucleic Acids Res. 1987, 15:3113; Cload и Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:6324; Richardson и Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:5109; Ma et al, Nucleic Acids Res. 1993, 21:2585 и Biochemistry 1993, 32:1751; Durand et al, Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10:287; Jschke et al, Tetrahedron Lett. 1993, 34:301; Ono et al, Biochemistry 1991, 30:9914; Arnold et al, WO 8902439; Usman et al, WO 9506731; Dudycz et al, WO 9511910 и Ferentz and Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:4000.

5'-конды, 3'-концы и липкие концы

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (например, молекулы siNA) могут иметь тупые концы с двух сторон, иметь липкие концы с обеих сторон или комбинацию тупых и липких концов. Липкие концы могут быть как на 5'-, так и на 3'-конце смысловой или антисмысловой нити.

5'- и/или 3'-концы двухнитевой молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA) могут быть тупыми концами или иметь липкий конец. 5'-конец может быть тупым концом, и 3'-конец может иметь липкий конец в либо смысловой нити, либо антисмысловой нити. В других вариантах выполнения настоящего изобретения 3'-конец может иметь тупой конец, и 5'-конец может иметь липкий конец либо в смысловой нити, либо в антисмысловой нити. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, оба 5'- и 3'-конец являются тупыми концами, или оба 5'- и 3'-конец являются липкими концами.

5'- и/или 3'-конец одной или обеих нитей нуклеиновой кислоты могут включать свободную гидроксильную группу. 5'- и/или 3'-конец любой нити молекулы нуклеиновой кислоты может быть модифицирован с включением химической модификации. Такая модификация может стабилизировать молекулы нуклеиновой кислоты, например, 3'-конец может иметь повышенную стабильность из-за наличия модификации молекулы нуклеиновой кислоты. Примеры модификаций конца (например, терминальные кэппирующие группы) включают, но без ограничения к этому, без основания, дезокси составляющую без основания, инвертированную (дезокси) составляющую без основания, глицерил, динуклеотид, ациклический нуклеотид, амино, фтор, хлор, бром, CN, CF, метокси, имидазол, карбоксилат, тиоат, C1-С10 низший алкил, замещенный низший алкил или арилалкил, OCF₃, OCN, O-, S-, или N-алкил; O-, S-, или N-алкенил; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂, N₃; гетероциклоалкил; гетероциклоалкиларил; аминоалкиламино; полиалкиламино или замещенный силил, в том числе, описанные в европейских патентах ЕР 586520 и ЕР 618925, и другие модификации согласно настоящему изобретению.

Молекулы нуклеиновой кислоты включают молекулы с тупыми концами, т.е. концами, которые не включают какие-либо свисающие нуклеотиды. Молекула нуклеиновой кислоты может включать один или несколько тупых концов. Молекула нуклеиновой кислоты с тупыми концами имеет некоторое количество пар нуклеотидов, равное числу нуклеотидов в каждой нити молекулы нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может включать один тупой конец, например, при этом 5'-конец антисмысловой нити и 3'-конец смысловой нити не имеет свисающих нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может включать один тупой конец, например, при этом 3'- конец антисмысловой нити и 5'-конец смысловой нити не имеет свисающих нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может включать два тупых конца, например, при этом 3'- конец антисмысловой нити и 5'-конец смысловой нити, а также 5'- конец антисмысловой нити и 3'-конец смысловой нити не имеет свисающих нуклеотидов. Другие нуклеотиды в молекулах нуклеиновых кислот с тупыми концами могут включать, например, ошибочно спаренные основания, петли, петли или неоднозначные пары оснований для модуляции активности молекулы нуклеиновой кислоты для опосредования РНК-интерференции.

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы) согласно настоящему изобретению при по меньшей мере одном конце молекулы имеют липкий конец из по меньшей мере одного нуклеотида (например, от одного до восьми свисающих нуклеотидов). Например, одна или обе нити двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут иметь липкий конец на 5'-конце и/или на 3'-конце. Липкий конец может быть как на одной, так и на обеих смысловой и антисмысловой нитях молекулы нуклеиновой кислоты. Длина липкого конца может составлять всего лишь один нуклеотид или от одного до восьми или более нуклеотидов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеотидов; согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения липкий конец составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеотидов; например, липкий конец может составлять всего 2 нуклеотида. Нуклеотид (нуклеотиды), образующий липкий конец, может представлять собой дезоксирибонуклеотид (дезоксирибонуклеотиды), рибонуклеотид (рибонуклеотиды), природные и неприродные нуклеиновые основания или любой нуклеотид с модифицированным сахаром, основанием или фосфатной группой, например, согласно настоящему изобретению. Двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты может иметь как 5'-, так и 3'-липкие концы. Липкие концы на 5'- и 3'-конце могут иметь разную длину. Липкий конец может включать по меньшей мере одну модификацию нуклеиновой кислоты, которая может представлять собой дезоксирибонуклеотид. Один или несколько дезоксирибонуклеотидов могут быть расположены на 5'-конце. 3'-конец соответствующей противоположно направленной нити молекулы нуклеиновой кислоты может не иметь липкий конец, более предпочтительно липкий конец из дезоксирибонуклеотидов. Один или более дезоксирибонуклеотидов могут быть расположены на 3'-конце. 5'-конец соответствующей противоположно направленной нити dsRNA может не иметь выступающий конец, более предпочтительно не липкий конец из дезоксирибонуклеотидов. Липкий конец на 5'-или 3'-конце нити может составлять 1-8 (например, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) неспаренных нуклеотидов, предпочтительно, липкий конец составляет 2-3 неспаренных нуклеотида; более предпочтительно 2 неспаренных нуклеотида. Молекулы нуклеиновой кислоты могут включать двуспиральные молекулы нуклеиновой кислоты с липкими концами длиной около 1-20 (например, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); предпочтительно 1-8 (например, около 1, 2, 3, 4, 20 5, 6, 7 или 8) нуклеотидов, например, приблизительно дуплексы из 21 нуклеотида с около 19 парами оснований и 3'-липкими концами из одного, двух или трех нуклеотидов. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут включать дуплекс молекул нуклеиновой кислоты с тупыми концами, при этом оба конца являются тупыми, или в другом случае один из концов является тупым. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию могут включать один или несколько тупых концов, т.е. при этом тупой конец не имеет свисающих нуклеотидов. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты с тупыми концами имеет число пар нуклеотидов, равное числу нуклеотидов в каждой нити молекулы нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может включать один тупой конец, например, при этом 5'-конец антисмысловой нити и 3'-конец смысловой нити не имеет свисающих нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может включать один тупой конец, например, при этом 3'- конец антисмысловой нити и 5'-конец смысловой нити не имеет свисающих нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может включать два тупых конца, например, при этом 3'- конец антисмысловой нити и 5'-конец смысловой нити, а также 5'- конец антисмысловой нити и 3'-конец смысловой нити не имеет свисающих нуклеотидов. Согласно некоторым предпочтительным вариантам выполнения настоящего изобретения соединения нуклеиновой кислоты имеют тупые концы. Другие нуклеотиды молекулы siNA с тупыми концами могут включать, например, ошибочно спаренные основания, петли, петли или неоднозначные пары оснований для модуляции активности молекулы нуклеиновой кислоты для опосредования РНК-интерференции.

Во многих вариантах выполнения настоящего изобретения один или более или все свисающие нуклеотиды молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула) согласно настоящему изобретению включает модификации согласно настоящему изобретению; например, один или более или все нуклеотиды могут представлять собой 2'-дезоксинуклеотиды

Количество, расположение и модели модификаций

Молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы) согласно настоящему изобретению могут включать модифицированные нуклеотиды в процентном отношении от общего числа нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты. Поэтому молекула нуклеиновой кислоты может включать от около 5% до около 100% модифицированных нуклеотидов (например, около 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов). Точное процентное отношение модифицированных нуклеотидов в данной молекуле нуклеиновой кислоты будет зависеть от общего числа нуклеотидов в нуклеиновой кислоте. Если молекула нуклеиновой кислоты является одноцепочечной, доля модификаций может зависеть от общего числа нуклеотидов в одноцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты. Аналогично, если молекула нуклеиновой кислоты является двухцепочечной, доля модификаций зависит от общего числа нуклеотидов в смысловой нити, антисмысловой нити или как в смысловой, так и в антисмысловой нитях.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут включать немодифицированную РНК в процентном отношении от общего числа нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты. Поэтому молекула нуклеиновой кислоты может включать от около 5% до около 100% модифицированных нуклеотидов (например, около 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% от всех нуклеотидов, присутствующих в молекуле нуклеиновой кислоты.

Молекула нуклеиновой кислоты (например, siNA молекула) может включать, смысловую нить, которая включает от около одного до около пяти, в частности около 1, 2, 3, 4, или 5 фосфотиоатных межнуклеотидных связей и/или один или более (например, около 1,2, 3, 4, 5 или более) 2'-дезокси, 2'ОМе, 2'-дезокси-2'-фторо, и/или один или более (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и, возможно, концевую блокирующую молекулу на 3-конце или 5'-конце или как на 3'-, так и на 5'-конце смысловой нити; и при этом антисмысловая нить включает от около одного до около пяти или более, в частности около 1, 2, 3, 4, 5 или более фосфотиоатных межнуклеотидных связей и/или один или более (например, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси, 2'ОМе, 2'-дезокси-2'-фтор и/или один или более (например, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и, возможно, терминальную кэппирующую молекулу на 3'-конце, 5'-конце или как 3'-, так и 5'-конце антисмысловой нити. Молекула нуклеиновой кислоты может включать около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более пиримидиновых нуклеотидов смысловой и/или антисмысловой нити нуклеиновой кислоты, химически модифицированные 2'-дезокси, 2'ОМе и/или 2'-дезокси-2'-фтор нуклеотиды, с или без от около одной до около пяти или более, например, около 1, 2, 3, 4, 5 или более фосфотиоатных межнуклеотидных связей, и/или терминальную кэппирующую молекулу при 3'-конце, 5'-конце или как 3'-, так и 5'-конце, находящихся на одной или разных нитях.

Молекула нуклеиновой кислоты может включать от около одного до около пяти или более (в частности около 1, 2, 3, 4, 5 или более) фосфотиоатных межнуклеотидных связей в каждой нити молекулы нуклеиновой кислоты.

Молекула нуклеиновой кислоты может включать 2'-5' межнуклеотидные связи, например, на 3'-конце, 5'-конце или как на 3'-, так и на 5'-конце одной или обеих нитях нуклеиновой кислоты. Кроме того, 2'- 5' межнуклеотидная связь (связи) могут присутствовать в различных положениях внутри одной или обеих нитей последовательности нуклеиновой кислоты, например, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, включая каждую межнуклеотидную связь пиримидинового нуклеотида в одной или обеих нитях молекулы siNA, может включать 2'-5' межнуклеотидную связь или около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, включая каждую межнуклеотидную связь пуринового нуклеотида в одной или обеих нитях молекулы siNA, может включать 2'-5' межнуклеотидную связь.

Химически модифицированная молекула короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (siNA) может включать антисмысловую область, при этом любые (например, один или более или все) пиримидиновые нуклеотиды в антисмысловой области представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды (например, при этом все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды или альтернативно множество пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды), и при этом любые (например, один или более или все) пуриновые нуклеотиды в антисмысловой области представляют собой 2'-дезокси пуриновые нуклеотиды (например, при этом все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси пуриновые нуклеотиды или в другом случае множество пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси пуриновые нуклеотиды).

Химически модифицированная молекула короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (siNA) может включать антисмысловую область, при этом любые (например, один или более или все) пиримидиновые нуклеотиды в антисмысловой области представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды (например, при этом все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды или в другом случае множество пиримидиновых нуклеотидов представляет собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды), и при этом любые (например, один или более или все) пуриновые нуклеотиды в антисмысловой области представляют собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды (например, при этом все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды или альтернативно множество пуриновых нуклеотидов представляет собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды).

Химически модифицированная молекула короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (siNA), способная опосредовать РНК-интерференцию (RNAi) против hsp47 внутри клетки или в системе in vitro, может включать смысловую область, при этом один или несколько пиримидиновых нуклеотидов в смысловой области представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды (например, при этом все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды, или альтернативно множество пиримидиновых нуклеотидов представляет собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды), и один или несколько пуриновых нуклеотидов в смысловой области представляют собой 2'-дезокси пуриновые нуклеотиды (например, при этом все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси пуриновые нуклеотиды или альтернативно множество пуриновых нуклеотидов представляет собой 2'-дезокси пуриновые нуклеотиды), и антисмысловую область, при этом один или более пиримидиновых нуклеотидов антисмысловой области представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды (например, при этом все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды, или альтернативно множество пиримидиновых нуклеотидов представляет собой 2'-дезокси-2'-фтор пиримидиновые нуклеотиды), и один или более пуриновых нуклеотидов в антисмысловой области представляют собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды (например, при этом пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды, или в другом случае множество пуриновых нуклеотидов представляет собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды). Смысловая область и/или антисмысловая область могут иметь модификацию терминальной кэппирующей группы, например, любую модификацию, которая необязательно находится на 3'-конце, 5'-конце или 3'- и 5'-концах смысловой и/или антисмысловой последовательности. Смысловая область и/или антисмысловая область могут, кроме того, необязательно включать 3'-концевой нуклеотидный липкий конец из около от 1 до 4 (например, около 1, 2, 3 или 4) 2'-дезоксинуклеотидов. Свисающие нуклеотиды могут, кроме того, включать одну или несколько (например, около 1, 2, 3, 4 или более) фосфотиоатную, фосфоноацетатную и/или тиофосфоноацетатную межнуклеотидные связи. Пуриновые нуклеотиды в смысловой области альтернативно могут представлять собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды (например, при этом все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды, или альтернативно множество пуриновых нуклеотидов представляет собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды) и один или несколько пуриновых нуклеотидов антисмысловой области представляют собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды (например, при этом все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды, или альтернативно множество пуриновых нуклеотидов представляет собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды). Один или несколько пуриновых нуклеотидов смысловой области могут альтернативно представлять собой пуриновые рибонуклеотиды (например, при этом все пуриновые нуклеотиды представляют собой пуриновые рибонуклеотиды или альтернативно множество пуриновых нуклеотидов представляют собой пуриновые рибонуклеотиды), и любые пуриновые нуклеотиды в антисмысловой области представляют собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды (например, при этом все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды, или альтернативно множество пуриновых нуклеотидов представляет собой 2'ОМе пуриновые нуклеотиды). В другом случае один или несколько пуриновых нуклеотидов в смысловой области и/или антисмысловой области можно выбрать из группы, состоящей из 2'-дезоксинуклеотидов, нуклеотидов LNA, 2'-метоксиэтилнуклеотидов, 4'-тионуклеотидов и 2'ОМе нуклеотидов (например, при этом все пуриновые нуклеотиды выбирают из группы, состоящей из 2'-дезоксинуклеотидов, нуклеотидов LNA, 2'-метоксиэтилнуклеотидов, 4'-тионуклеотидов и 2'ОМе нуклеотидов, или альтернативно множество пуриновых нуклеотидов выбирают из группы, состоящей из 2'-дезоксинуклеотидов, нуклеотидов LNA, 2'-метоксиэтилнуклеотидов, 4'-тионуклеотидов и 2'ОМе нуклеотидов).

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула siNA) согласно настоящему изобретению включает модифицированный нуклеотид (например, один модифицированный нуклеотид) в антисмысловой нити; например, в положении 6 или положении 7 антисмысловой нити.

Модели модификаций и альтернативные модификации

Молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы) согласно настоящему изобретению могут представлять собой модифицированные и немодифицированные нуклеиновые кислоты. Модель модификации нуклеотидов в протяженной нити нуклеотидов может быть модификацией, содержащейся в одном нуклеотиде или группе нуклеотидов, которые ковалентно соединены друг с другом с помощью стандартных фосфодиэфирных связей или по меньшей мере частично с помощью фосфотиоатных связей. Соответственно "модель" согласно настоящему изобретению, но не обязательно включает повторяющиеся единицы, хотя может. Примеры моделей модификаций, которые могут применяться в конъюгации с молекулой нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулой) согласно настоящему изобретению включают раскрытые в Giese, US 7452987. Например, молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы) согласно настоящему изобретению включают модели с модификациями, такими как, подобные или такие же, как модели, схематически показанные на Фиг. 2 в US 7452987.

Модифицированный нуклеотид или группа модифицированных нуклеотидов может находиться на 5'-конце или 3'-конце смысловой или антисмысловой нити, фланкирующий нуклеотид или группа нуклеотидов находится с обеих сторон модифицированного нуклеотида или группы, при этом фланкирующий нуклеотид или группа может быть не модифицирована или не иметь такую же модификацию, что и предшествующий нуклеотид или группа нуклеотидов. Фланкирующий нуклеотид или группа нуклеотидов, тем не менее, может иметь другую модификацию. Эта последовательность модифицированного нуклеотида или группы модифицированных нуклеотидов, соответственно, и немодифицированного или иначе модифицированного нуклеотида или группы немодифицированных или иначе модифицированных нуклеотидов могут повторяться один или несколько раз.

В некоторых моделях 5'-терминальный нуклеотид нити представляет собой модифицированный нуклеотид, тогда как в других моделях 5'-терминальный нуклеотид нити представляет собой немодифицированный нуклеотид. В некоторых моделях 5'-конец нити начинается с группы модифицированных нуклеотидов, тогда как в других моделях 5'-терминальный конец представляет собой немодифицированную группу нуклеотидов. Эта модель может быть либо на первой нити, либо на второй нити молекулы нуклеиновой кислоты или на обеих.

Модифицированные нуклеотиды одной нити молекулы нуклеиновой кислоты могут быть комплементарны в положении к модифицированным или не модифицированным нуклеотидам или группам нуклеотидов другой нити.

Может присутствовать фазовый сдвиг между модификациями или моделями модификаций на одной нити относительно модели модификации другой нити, так что группы модификаций перекрываются. В одном случае, t сдвиг происходит таким образом, что модифицированная группа нуклеотидов смысловой нити соответствует немодифицированной группе нуклеотидов антисмысловой нити и наоборот.

Может происходить частичный сдвиг модели модификаций, при котором модифицированные группы перекрываются. Группы модифицированных нуклеотидов в любой данной нити могут необязательно иметь одинаковую длину, но могут иметь и разную длину. Подобным образом, группы немодифицированных нуклеотидов любой данной нити могут иметь одинаковую длину или разную длину.

В некоторых моделях второй (предпоследний) нуклеотид на конце нити представляет собой немодифицированный нуклеотид или начало группы немодифицированных нуклеотидов. Предпочтительно, этот немодифицированный нуклеотид или немодифицированная группа нуклеотидов располагается на 5'-конце смысловой и/или антисмысловой нити и даже более предпочтительно на конце смысловой нити. Немодифицированный нуклеотид или немодифицированная группа нуклеотидов может быть расположена на 5'-конце смысловой нити. Согласно предпочтительному варианту выполнения настоящего изобретения модель модификаций состоит из отдельных чередующихся модифицированных и немодифицированных нуклеотидов.

В некоторых двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот включают 2'ОМе модифицированный нуклеотид и немодифицированный нуклеотид, предпочтительно, нуклеотид, который не является 2'ОМе модифицированным, встроены в обе нити чередующимся образом, что приводит к последовательности чередующихся 2'ОМе модифицированных нуклеотидов и нуклеотидов, которые могут быть немодифицированными или по меньшей мере не включают модификацию 2'ОМе. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения та же последовательность 2'ОМе модификации и немодификации существует на обеих нитях; в других вариантах выполнения настоящего изобретения чередующиеся 2'ОМе модифицированные нуклеотиды присутствуют в смысловой нити и не присутствуют в антисмысловой нити; и в других вариантах выполнения настоящего изобретения чередующиеся 2'ОМе модифицированные нуклеотиды присутствуют только в смысловой нити и не присутствуют в антисмысловой нити. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения, существует фазовый сдвиг между двумя нитями, при котором 2'ОМе модифицированный нуклеотид на первой нити образует пары оснований с немодифицированным (немодифицированными) нуклеотидом (нуклеотидами) на второй нити и наоборот. Это конкретное расположение, т.е. спаривание оснований 2'ОМе модифицированного и немодифицированного нуклеотида (нуклеотидов) на обеих нитях является особенно предпочтительным в определенных вариантах выполнения настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения последовательность чередующихся 2'ОМе модифицированных нуклеотидов существует на протяжении всей молекулы нуклеиновой кислоты или всего дуплексного участка. Согласно другим вариантам выполнения настоящего изобретения последовательность чередующихся 2'ОМе модифицированных нуклеотидов существует только в части нуклеиновой кислоты или всего дуплексного участка.

В моделях с "фазовым сдвигом" может быть предпочтительно, если антисмысловая нить начинается с 2'ОМе модифицированного нуклеотида при 5'-конце, тогда как следовательно второй нуклеотид является немодифицированным, третий, пятый, седьмой и т.д. нуклеотиды, таким образом, являются снова 2'ОМе модифицированным, тогда как второй, четвертый, шестой, восьмой и подобные нуклеотиды являются немодифицированными нуклеотидами.

Расположения и модели модификаций

В то время как примерные модификации подробно описываются ниже, рассматриваются все перестановки моделей со всеми возможными характеристиками молекул нуклеиновой кислоты, раскрытыми в настоящей заявке и известными из уровня техники (например, характеристики включают, но без ограничения к этому, длину смысловой нити, длину антисмысловой нити, длину дуплексного участка, длину липкого конца, при этом один или оба конца двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты могут быть тупыми или липкими, расположение модифицированной нуклеиновой кислоты, число модифицированных нуклеиновых кислот, типы модификаций, при этом двойная молекула нуклеиновой кислоты с липкими концами может иметь одинаковое или разное количество нуклеотидов на липких концах с каждой стороны, при этом в молекуле нуклеиновой кислоты используется один или больше одного типа модификаций, и число смежных модифицированных/немодифицированных нуклеотидов). По отношению ко всем подробным примерам, описанным ниже, несмотря на то, что показано, что дуплексный участок составляет 19 нуклеотидов, молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут иметь дуплексный участок в пределах от 1 до 49 нуклеотидов в длину, тогда как каждая нить дуплексного участка может независимо иметь 17-49 нуклеотидов в длину. Примеры моделей приведены в настоящем описании.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь тупой конец (когда n равно 0) на обоих концах, которые включают один или непрерывный ряд модифицированных нуклеиновых кислот. Модифицированная нуклеиновая кислота может находиться в любом положении на всем протяжении смысловой или антисмысловой нити. Молекулы нуклеиновой кислоты могут включать группу около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 непрерывных модифицированных нуклеотидов. Модифицированные нуклеиновые кислоты могут составлять 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 100% нити нуклеиновой кислоты. Модифицированные нуклеиновые кислоты в примерах, приведенных ниже, могут находиться только в смысловой нити, только в антисмысловой нити или как в смысловой, так и в антисмысловой нити.

Общие модели нуклеиновых кислот, где X = нуклеотид смысловой нити в дуплексной области; Х_а = нуклеотид 5'-липкого конца в смысловой нити; X_b = нуклеотид 3'-липкого конца в смысловой нити; Y = нуклеотид антисмысловой нити в дуплексной области; Y_a = нуклеотид 3'-липкого конца в антисмысловой нити; Y_b = нуклеотид 5'-липкого конца в антисмысловой нити; и M = модифицированный нуклеотид в дуплексной области. Каждый а и b независимо равны от 0 до 8 (например, 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8). Каждый X, Y, а и b являются независимо модифицированными или немодифицированными. Смысловая и антисмысловая нити каждая независимо могут составлять 17-49 нуклеотидов в длину. Приведенные ниже нуклеотиды имеют дуплексную область из 19 нуклеотидов; однако молекулы нуклеиновой кислоты, раскрытые в настоящей заявке, могут иметь дуплексную область в любом месте между 7 и 49 нуклеотидами, и каждая нить независимо составляет от 17 до 49 нуклеотидов в длину.

Другие примерные модели нуклеиновых кислот показаны ниже, где X = немодифицированные нуклеотиды смысловой нити; х = немодифицированный нуклеотид липкого конца смысловой нити; Y = немодифицированные нуклеотиды антисмысловой нити; у = немодифицированный нуклеотид липкого конца антисмысловой нити; и М = модифицированный нуклеотид. Смысловая и антисмысловая нити каждая независимо может иметь 17-49 нуклеотидов в длину. Смысловая и антисмысловая нити каждая независимо могут составлять 17-49 нуклеотидов в длину. Приведенные ниже нуклеотиды имеют дуплексную область из 19 нуклеотидов; однако молекулы нуклеиновой кислоты, раскрытые в настоящей заявке, могут иметь дуплексную область в любом месте между 7 и 49 нуклеотидами, и каждая нить независимо составляет от 17 до 49 нуклеотидов в длину.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь тупые концы на обоих концах с чередующимися модифицированными нуклеиновыми кислотами. Модифицированные нуклеиновые кислоты могут быть расположены в любом положении вдоль либо смысловой нити, либо антисмысловая нити.

Молекулы нуклеиновой кислоты с тупым 5'-концом и липким 3'-концом с одной модифицированной нуклеиновой кислотой.

Молекулы нуклеиновой кислоты с липким 5-концом и тупым 3'-концом с одной модифицированной нуклеиновой кислотой.

Молекулы нуклеиновой кислоты с липкими концами на обеих концах, и все липкие концы являются модифицированными нуклеиновыми кислотами. В модели, приведенной ниже, М означает n число модифицированных нуклеиновых кислот, где n означает целое число от 0 до 8 (то есть 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8).

Молекулы нуклеиновой кислоты с липкими концами на обоих концах, и некоторые нуклеотиды липкого конца являются модифицированными нуклеотидами. В моделях, приведенных непосредственно ниже, М означает n число модифицированных нуклеотидов, х означает n число немодифицированных нуклеотидов липкого конца в смысловой нити, у число немодифицированных нуклеотидов липкого конца в антисмысловой нити, где каждый n независимо представляет собой целое число от 0 до 8 (то есть 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8), и где каждый липкий конец составляет максимум 20 нуклеотидов; предпочтительно максимум 8 нуклеотидов (модифицированных и/или немодифицированных).

Модифицированный нуклеотид на 3'-конце смысловой области.

Липкий конец на 5'-конце смысловой области.

Липкий конец на 3'-конце антисмысловой области.

Модифицированный нуклеотид (нуклеотиды) в смысловой области.

Примеры молекул нуклеиновых кислот представлены ниже вместе с эквивалентной общей структурой в соответствии с символами, использованными выше:

siHSP47-C siRNA к hsp47 человека и крысы, имеющая 19 нуклеотидную (то есть, 19 мерная) дуплексную область и два модифицированных нуклеотида (то есть дезоксинуклеотид) липких концов на 3'-концах смысловой и антисмысловой нитей.

siHSP47-Cd siRNA к hsp47 человека и крысы, имеющая 25-мерную дуплексную область, 2 нуклеотида липкого конца при 3'-конце антисмысловой нити и 2 модифицированных нуклеотида в 5'- терминальном и предпоследнем положениях смысловой нити.

siHSP47-l siRNA к hsp47 кДНК 719-737 человека и крысы, имеющая 19-мерную дуплексную область, и два модифицированных нуклеотида (то есть дезоксинуклеотид) липких концов при 3'-концах смысловой и антисмысловой нитей.

siHSP47-1d siRNA к hsp47 кДНК 719-743 человека, 25-мерная с тупым концом на 3'-конце смысловой нити и имеющая 2 нуклеотида липкого конца при 3'-конце антисмысловой нити, и 2 модифицированных нуклеотида в 5'-терминальном и предпоследнем положениях смысловой нити.

siHSP47-2 siRNA к hsp47 кДНК 469-487 человека, имеющая 19-мерную дуплексную область, и два модифицированных нуклеотида (то есть дезоксинуклеотид) липких концов при 3'-концах смысловой и антисмысловой нитей.

siHSP47-2d siRNA к hsp47 кДНК 469-493 человека, имеющая 25-мерную дуплексную область с тупым концом при 3'-конце смысловой нити и 2 нуклеотида липкого конца при 3'-конце антисмысловой нити, и 2 модифицированных нуклеотида в 5'- терминальном и предпоследнем положениях смысловой нити.

siHSP47-2d крысиная siRNA к Gp46 кДНК 466-490 крысы, имеющая 25-мерную дуплексную область с тупым концом при 3'-конце смысловой нити и 2 нуклеотида липкого конца при 3'-конце антисмысловой нити, и 2 модифицированных нуклеотида в 5'- терминальном и предпоследнем положениях смысловой нити.

siHSP47-3 siRNA к hsp47 кДНК 980-998 человека, имеющая 19-мерную дуплексную область, и два модифицированных нуклеотида (то есть дезоксинуклеотид) липких концов при 3'-концах смысловой и антисмысловой нитей.

siHSP47-3d siRNA к hsp47 кДНК 980-1004 человека, имеющая 2 5-мерную дуплексную область с тупым концом при 3'-конце смысловой нити и 2 нуклеотида липкого конца при 3'-конце антисмысловой нити, и 2 модифицированных нуклеотида в 5'- терминальном и предпоследнем положениях смысловой нити.

siHSP47-4 siRNA к hsp47 кДНК 735-753 человека, имеющая 19-мерную дуплексную область, и два модифицированных нуклеотида (то есть дезоксинуклеотид) липких концов при 3'-концах смысловой и антисмысловой нитей.

siHSP47-4d siRNA к hsp47 кДНК 735-759 человека, имеющая 25-мерную дуплексную область с тупым концом при 3'-конце смысловой нити и 2 нуклеотида липкого конца при 3'-конце антисмысловой нити, и 2 модифицированных нуклеотида в 5'- терминальном и предпоследнем положениях смысловой нити.

siHSP47-5 siRNA к hsp47 кДНК 621-639 человека, имеющая 19-мерную дуплексную область, и два модифицированных нуклеотида (то есть дезоксинуклеотид) липких концов при 3'-концах смысловой и антисмысловой нитей.

siHSP47-6 siRNA к hsp47 кДНК 446-464 человека, имеющая 19-мерную дуплексную область, и два модифицированных нуклеотида (то есть дезоксинуклеотид) липких концов при 3'-концах смысловой и антисмысловой нитей.

siHSP47-7 siRNA к hsp47 кДНК 692-710 человека, имеющая 19-мерную дуплексную область, и два модифицированных нуклеотида (то есть дезоксинуклеотид) липких концов при 3'-концах смысловой и антисмысловой нитей.

Разрывы и пробелы в цепях нуклеиновой кислоты

Молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы siNA) согласно настоящему изобретению могут иметь нить, предпочтительно смысловую нить, которая имеет разрывы или пробелы. В связи с этим молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь три или более нитей, например, меродуплекс РНК (mdRNA), описанный в PCT/US 07/081836. Молекулы нуклеиновой кислоты с нитью, имеющей разрывы или пробелы, могут иметь от 1-49 нуклеотидов в длину или иметь длину RISC (например, около 15-25 нуклеотидов) или длину субстрата для дайсера (например, около 25-30 нуклеотидов), например, согласно настоящему изобретению.

Молекулы нуклеиновой кислоты с тремя или более нитями включают, например, 'А' (антисмысловую) нить, 'S1' (вторую) нить и 'S2' (третью) нить, в которой 'S1' и 'S2' нити являются комплементарными и образуют пары оснований с неперекрывающимися участками нити 'А' (например, mdRNA может иметь форму A:S1S2). S1, S2 или более нитей вместе формируют то, что о существу похоже на смысловую нить для антисмысловой нити 'А'. Двухцепочечный участок, образованный при гибридизации нитей 'S1' и 'А' отличается от и не перекрывается с двухцепочечным участком, образованным при гибридизации нитей 'S2' и 'А'. Молекула нуклеиновой кислоты (например, молекула siNA) может быть молекулой "с пробелами", что означает, что "пробел" составляет от 0 нуклеотидов до около 10 нуклеотидов (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов). Предпочтительно смысловая нить имеет пробелы. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения дуплекс A:S1 отделен от дуплекса A:S2 пробелом, образованным по меньшей мере одним неспаренным нуклеотидом (до около 10 неспаренных нуклеотидов) в 'А' нити, которая расположена между A:S1 дуплексом и A:S2 дуплексом, и который отличается от любого одного или более неспаренных нуклеотидов при 3'-конце одной или более из 'А', 'S1' или 'S2 нитей. Дуплекс A:S1 может быть отделен от дуплекса А:В2 пробелом из нуля нуклеотидов (т.е. разрывом, при котором в молекуле полинуклеотида отсутствует или разорвана только фосфодиэфирная связь между двумя нуклеотидами) между дуплексом A:S1 и дуплексом A:S2, который также можно обозначить dsRNA с разрывами (ndsRNA). Например, A:S1S2 может включать dsRNA, имеющую по меньшей мере два двухцепочечных участка, которые содержат в общем от около 14 пар оснований до около 40 пар оснований, и двухцепочечные участки разделены пробелом из около от 0 до около 10 нуклеотидов, при необходимости имеющую тупые концы, или A:S1S2 может включать dsRNA, имеющую по меньшей мере два двухцепочечных участка, разделенные пробелом до 10 нуклеотидов, при этом по меньшей мере один из двухцепочечных участков включает от около пяти пар оснований до тринадцати пар оснований.

Субстрат для дайсера

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA молекулы) согласно настоящему изобретению могут быть молекулой-предшественником "субстрат для дайсера", например, например, двухцепочечная нуклеиновая кислота, процессированная in vivo, для получения активных молекул нуклеиновых кислот, например, как раскрывается в Rossi, US 20050244858. При определенных условиях и ситуациях, было обнаружено, что эти относительно более длинные dsRNA siNA спейсеры, например, от около 25 до около 30 могут давать неожиданно эффективные результаты от отношении активности и продолжительности действия. Не желая быть связанными конкретной теорией, считается, что более длинные спейсеры dsRNA служат в качестве субстрата для фермента дайсер в цитоплазме клетки. Кроме расщепления двухцепочечной нуклеиновой кислоты на более короткие сегменты, дайсер может облегчать встраивание одноцепочечных продуктов расщепления, полученных из расщепленных dsRNA в комплекс сайленсинга, вызванный РНК (комплекс RISC), который отвечает за разрушение цитоплазматической РНК, полученной из целевого гена.

Субстраты для дайсер могут иметь некоторые свойства, которые усиливают их процессинг дайсером. Субстраты для дайсера имеют длину, достаточную для того, чтобы дайсер выполнял их процессинг, для получения активной молекулы нуклеиновой кислоты, и также могут включать одно или несколько из следующих свойств: (i) dsRNA является ассиметричной, например, имеет 3'-липкий конец на первой нити (антисмысловая нить) и (ii) dsRNA имеет модифицированный 3'-конец на антисмысловой нити (смысловой нити) с направлением ориентации связывания дайсера и процессинга dsRNA в активную siRNA. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения самая длинная нить в субстрате для дайсера может иметь 24-30 нуклеотидов.

Субстраты для дайсера могут быть симметричными или несимметричными. Субстрат для дайсера может иметь смысловую нить, включающую 22-28 нуклеотидов, и антисмысловая нить может включать 24-30 нуклеотидов; таким образом, в некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения полученный субстрат дайсер может иметь липкий конец на 3' конце антисмысловой нити. Субстрат дайсер может иметь смысловую нить из 25 нуклеотидов в длину, и антисмысловую нить, имеющую 27 нуклеотидов в длину с двумя основными 3'-липкими концами. Липким концом могут быть 1-3 нуклеотида, например, 2 нуклеотида. Смысловая нить может также иметь 5'-фосфат.

Несимметричный субстрат для дайсера может дополнительно содержать два дезоксинуклеотида на 3'-конце смысловой нити на месте двух рибонуклеотидов. Некоторые примерные длины и структуры субстрата для дайсера представляют собой 21+0, 21+2, 21-2, 22+0, 22+1, 22-1, 23+0, 23+2, 23-2, 24+0, 24+2, 24-2, 25+0, 25+2, 25-2, 26+0, 26+2, 26-2, 27+0, 27+2 и 27-2.

Смысловая нить субстрата для дайсера может составлять от около 22 до около 30 (например, около 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29 или 30); от около 22 до около 28; от около 24 до около 30; от около 25 до около 30; от около 26 до около 30; от около 26 до около 29; или от около 27 до около 28 нуклеотидов в длину. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения субстраты для дайсера содержат смысловую и антисмысловую нити, которые составляют по меньшей мере около 25 нуклеотидов в длину и но не более чем около 30 нуклеотидов; от около 26 и до около 29 нуклеотидов; или 27 нуклеотидов в длину. Смысловая и антисмысловая нити могут иметь одинаковую длину (тупые концы), различные длины (липкие концы), или комбинацию. Смысловая и антисмысловая нити могут существовать в одном и том же полинуклеотиде или на различных полинуклеотидах. Субстрат для дайсера может иметь дуплексную область из около 19,20, 21, 22, 23, 24,25 или 27 нуклеотидов.

Подобно другим siNA молекулам согласно настоящему изобретению антисмысловая нить субстрата для дайсера может иметь любую последовательность, которая гибридизуется с антисмысловой нитью при биологических условиях, таких как внутри цитоплазмы эукариотической клетки.

Субстраты для дайсера могут иметь любые модификации в нуклеиновом основании, сахаре или фосфатном остове, известные в данной области техники и/или согласно настоящему описанию для других молекул нуклеиновых кислот (например, siNA молекулы). В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения, субстраты для дайсера могут иметь смысловую нить, модифицированную для процессинга дайсера, подходящими модификаторами, расположенными на 3'-конце смысловой нити, то есть dsRNA предназначена для направления ориентации связывания и процессинга дайсера. Подходящие модификаторы включают нуклеотиды, например, дезоксирибонуклеотиды, дидезоксирибонуклеотиды, ациклические нуклеотиды и т.п. и стерически затрудненные молекулы, такие как флуоресцентные молекулы и т.п. Ациклические нуклеотиды замещают гидроксиэтоксиметильную группу на 2'-дезоксирибофуранозил сахар, обычно представленный в dNMP. Другие нуклеотидные модификаторы, которые могли бы применяться в siNA молекулах субстрата для дайсера, включают 3'-дезоксиаденозин (кордицепин), 3'-азидо-3'-дезокситимидин (AZT), 2',3'-дидезоксиинозин (ddI), 2',3'- дидезокси-3'-тиацитидин (3ТС), 2'3'-дидегидро-2'3'-дидезокситимидин (d4T) и монофосфатные нуклеотиды 3'-азидо-3'-дезокситимидина (AZT), 2',3'-дидезокси-3'- тиацитидина (3ТС) и 2'3'-дидегидро-2'3'-дидезокситимидина (d4T). Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения дезоксинуклеотиды применяются в качестве модификаторов. Если используют модификаторы нуклеотидов, они могут заменить рибонуклеотиды (например, 1-3 нуклеотидных модификатора или 2 нуклеотидных модификатора замещаются на рибонуклеотиды на 3'-конце смысловой нити), так что длина субстрата для дайсера не меняется. Если применяются стерически затрудненные молекулы, они могут быть прикреплены к рибонуклеотиду на 3'-конце антисмысловой нити. Таким образом, согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения длина нити не меняется при встраивании модификаторов. Согласно некоторым вариантам выполнения настоящего изобретения два основания ДНК в dsRNA являются замещенными для направления ориентации процессинга дайсером антисмысловой нити. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения два концевых ДНК основания замещены на два рибонуклеотида на 3'-конце смысловой нити, образующей тупой конец дуплекса на 3'-конце смысловой нити и 5'-конце антисмысловой нити, и липкий конец из двух нуклеотидов РНК расположен на 3'-конце антисмысловой нити. Это ассиметричная композиция с ДНК на тупом конце и РНК основаниями на липком конце.

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения модификации включаются в субстрат для дайсера, так что модификация не мешает молекуле нуклеиновой кислоты служить субстратом для дайсера. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения получают одну или более модификаций, которые усиливают процессинг дайсером субстрата для дайсера. Может быть сделана одна или несколько модификаций, которые приводят к получению более эффективной RNAi. Может быть сделана одна или несколько модификаций, которые поддерживают больший эффект RNAi. Может быть сделана одна или более модификаций, которые приводят к большему потенциалу на каждый субстрат для дайсера, который необходимо доставить в клетку. Модификации могут быть встроены при 3'-концевом участке, 5'-концевом участке, как при 3'-концевом, так и при 5'-концевом участке или в различных положениях в последовательности. Любое число и комбинация модификаций может быть встроена в субстрат для дайсера до тех пор, пока модификация не мешает молекуле нуклеиновой кислоты служить субстратом для дайсера. Если присутствуют множественные модификации, они могут быть одинаковыми или различными. Предусматриваются модификации оснований, групп сахара, фосфатного остова и их комбинации. Любой 5'- конец может быть фосфорилирован.

Примеры модификаций фосфатного остова субстрата для дайсера включают фосфонаты, включая метилфосфонат, фосфотиоат и фосфотриэфирные модификации, такие как алкилфосфотриэфиры и т.п. Примеры модификаций сахарных составляющих субстрата для дайсера включают 2'-алкилпиримидин, например, 2'ОМе, 2'-фтор, амино и дезокси модификации и т.п. (смотрите, например, Amarzguioui et al., 2003). Примеры модификаций групп оснований субстрата для дайсера включают сахара без оснований, 2-0- алкил модифицированные пиримидины, 4-тиоурацил, 5-бромурацил, 5-йодурацил и 5-(3- аминоаллил)-урацил и т.п. LNA также могут быть включены.

Смысловая нить может быть модифицирована для процессинга дайсером приемлемыми модификаторами, расположенными на 3'-конце смысловой нити, т.е. субстрат для дайсера разработан для направления ориентации связывания и процессинга дайсером. Приемлемые модификаторы включают нуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеотиды, дидезоксирибонуклеотиды, ациклические нуклеотиды и т.п. и стерически затрудненные молекулы, например, флуоресцентные молекулы и т.п. Ациклические нуклеотиды замещают 2-гидроксиэтоксиметильную группу в 2'-дезоксирибофуранозном сахаре, обычно представленную в dNMP. Другие модификаторы нуклеотидов могут включать кордицепин, AZT, ddI, 3ТС, d4T и монофосфатные нуклеотиды AZT, 3ТС и d4T. В одном варианте выполнения настоящего изобретения дезоксинуклеотиды используются в качестве модификаторов. Если используются нуклеотидные модификаторы, 1-3 нуклеотидные модификаторы или 2- нуклеотидные модификаторы замещены на рибонуклеотиды на 3'-конце смысловой нити. Если применяются стерически затрудненные молекулы, их присоединяют к рибонуклеотиду на 3'-конце антисмысловой нити. Таким образом, длина нитей не меняется при встраивании модификаторов. В другом варианте выполнения настоящего изобретения изобретение включает замещение двух оснований ДНК в субстрате для дайсера для ориентации процессинга дайсером антисмысловой нити. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения два концевых основания ДНК замещены на два рибонуклеотида на 3'-конце смысловой нити, образуя тупой конец дуплекса на 3'-конце смысловой нити и 5'-конце антисмысловой нити, и выступающий конец из 2 нуклеотидов РНК расположен на 3'-конце антисмысловой нити. Это ассимметричная композиция с ДНК на тупом конце и РНК основаниями на липком конце.

Антисмысловая нить может быть модифицирована для процессинга дайсером посредством подходящих модификаторов, расположенных на 3'-конце антисмысловой нити, т.е. dsRNA сконструирована для направления ориентации связывания и процессинга дайсером. Приемлемые модификаторы включают нуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеотиды, дидезоксирибонуклеотиды, ациклические нуклеотиды и т.п. и стерически затрудненные молекулы, такие как флуоресцентные молекулы и т.п. Ациклические нуклеотиды замещают 2-гидроксиэтоксиметильную группу на 2'-дезоксирибофуранозный сахар, обычно представленный в dNMP. Другие модификаторы нуклеотидов могут включать кордицепин, AZT, ddI, 3ТС, d4T и монофосфатные нуклеотиды AZT, 3ТС и d4T. В одном варианте выполнения настоящего изобретения дезоксинуклеотиды применяются в качестве модификаторов. Если используются нуклеотидные модификаторы, 1-3 нуклеотидные модификаторы или 2- нуклеотидные модификаторы замещаются на рибонуклеотиды на 3'-конце смысловой нити. Если используются стерически затрудненные молекулы, они присоединены к рибонуклеотиду на 3'-конце антисмысловой нити. Таким образом, длина нити не меняется при встраивании модификаторов. Согласно другому варианту реализации изобретение включает замещение двух оснований ДНК в dsRNA для ориентации процессинга дайсером антисмысловой нити. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения два концевых ДНК основания расположены на 3'-конце антисмысловой нити вместо двух рибонуклеотидов, образуя тупой конец дуплекса на 5'-конце смысловой нити и 3'-конце антисмысловой нити, и выступающий конец из 2 нуклеотидов РНК расположен на 3'-конце смысловой нити. Это асимметричная композиция с ДНК на тупом конце и РНК основаниями на выступающем (липком) конце.

Субстраты для дайсера со смысловой и антисмысловой нитью могут быть соединены посредством третьей структуры. Третья структура не блокирует активность дайсера на субстрате для дайсера и не мешает направленному разрушению РНК, транскрибированной с целевого гена. Третья структура может представлять собой химическую связывающую группу. Приемлемые химические связывающие группы известны в данной области техники и могут быть использованы. В другом случае, третья структура может представлять собой олигонуклеотид, который связывает два олигонуклеотида dsRNA таким образом, что образуется структура шпильки при гибридизации двух олигонуклеотидов, составляющих субстрат для дайсера. Структура шпильки предпочтительно не блокирует активность дайсера на субстрате для дайсера или не мешает направленному разрушению РНК, транскрибированной с целевого гена.

Смысловая и антисмысловая нити субстрата для дайсера не обязательно должны быть полностью комплементарны. Нужно, чтобы они были существенно комплементарными для гибридизации при биологических условиях и для обеспечения субстрата для дайсера, который дает siRNA, достаточно комплементарную целевой последовательности.

Субстрат для дайсера может иметь некоторые свойства, которые усиливают его процессинг дайсером. Субстрат для дайсера может иметь длину достаточную такую, что он процессируется дайсером с получением активной молекулы нуклеиновой кислоты (например, siRNA), и может иметь одно или несколько следующих свойств: (i) субстрат для дайсера является асимметрическим, например, имеет выступающий 3'-конец на первой нити (антисмысловая нить) и (ii) субстрат для дайсера имеет модифицированный 3'-конец на второй нити (смысловая нить) для направления ориентации связывания и процессинга Dicer для получения активной siRNA. Субстрат для дайсера может быть асимметричным, так что смысловая нить включает 22-28 нуклеотидов, и антисмысловая нить включает 24-30 нуклеотидов. Таким образом, получаемый субстрат для дайсера имеет 3'-липкий конец антисмысловой нити. Липкий конец состоит из 1-3 нуклеотидов, например, 2 нуклеотидов. Смысловая нить также может иметь 5'-фосфат.

Субстрат для дайсера может иметь 3'-липкий конец антисмысловой нити, и смысловая нить модифицируется для процессинга дайсером. 5'-конец смысловой нити может иметь фосфат. Смысловая и антисмысловая нити могут гибридизоваться при биологических условиях, например, условиях, обнаруживаемых в цитоплазме клетки. Участок одной из нитей, в частности, антисмысловой нити, субстрата для дайсера может иметь последовательность длиной по меньшей мере 19 нуклеотидов, при этом указанные нуклеотиды находятся в 21-нуклеотидном участке, прилегающем к 3'-концу антисмысловой нити, и достаточно комплементарны нуклеотидной последовательности РНК, полученной из целевого гена. Субстрат для дайсера также может иметь одно или больше из следующих дополнительных свойств: (а) антисмысловая нить имеет сдвиг вправо от соответствующего 21-мера (т.е. антисмысловая нить включает нуклеотиды с правой стороны молекулы, если сравнивать с соответствующим 21-мером), (b) нити могут не быть полностью комплементарными, т.е. нити могут содержать простые ошибочные спаренности оснований, и (с) модификации оснований, такие как LNA, могут быть включены на 5'-конце смысловой нити.

Антисмысловая нить молекулы нуклеиновой кислоты субстрата для дайсера может быть модифицирована с включением 1-9 рибонуклеотидов на 5'-конце с получением длины в 22-28 нуклеотидов. Если антисмысловая нить имеет длину 21 нуклеотид, то 1-7 рибонуклеотидов или 2-5 рибонуклеотидов или 4 рибонуклеотида могут быть добавлены к 3'-концу. Добавленные рибонуклеотиды могут иметь любую последовательность. Несмотря на то, что добавленные рибонуклеотиды могут быть комплементарны последовательности целевого гена, полной комлементарности между последовательностью-мишенью и антисмысловыми нитями не требуется. То есть, полученная антисмысловая нить достаточно комплементарна целевой последовательности. Затем смысловая нить может иметь 24-30 нуклеотидов. Смысловая нить быть достаточно комплементарна антисмысловой нити для гибридизации с антисмысловой нитью при биологических условиях. В одном варианте выполнения настоящего изобретения антисмысловая нить может быть синтезирована с содержанием модифицированного 3'-конца для направления процессинга дайсером. Смысловая нить может иметь 3'-липкий конец. Антисмысловая нить может быть синтезирована с включением модифицированного 3' -конца для направления процессинга и связывания дайсера, и смысловая нить имеет 3'-липкий конец.

Белок теплового шока 47

Белок теплового шока (HSP47) представляет собой молекулярный шаперон, специфичный в отношении коллагена, и располагается в эндоплазматическом ретикулуме. Он взаимодействует с коллагеном во время сворачивания, сборки и транспортировки из эндоплазматического ретикулума (Nagata Trends Biochem Sci 1996; 21:22-6; Razzaque et al. 2005; Contrib Nephrol 2005; 148: 57-69; Koide et al. 2006 J. Biol. Chem.; 281: 3432-38; Leivo et al. Dev. Biol. 1980; 76:100-114; Masuda et al. J. Clin. Invest. 1994; 94:2481-2488; Masuda et al. Cell Stress Chaperones 1998; 3:256-264). Сообщали, что HSP47 имеет повышенную экспрессию при фиброзе различных тканей (Koide et al. J Biol Chem 1999; 274: 34523-26), как например цирроз печени (Masuda et al. J Clin Invest 1994; 94:2481-8), фиброз легких (Razzaque et al. Virchows Arch 1998; 432:455-60; Kakugawa et al. Eur Respir J 2004; 24: 57-65), и гломерулосклероз (Moriyama et al. Kidney Int 1998; 54: 110-19). Примеры последовательности нуклеиновой кислоты целевой кДНК hsp47 человека описываются под номером доступа GenBank: NM_001235 и соответствующей последовательности мРНК, например, представленной как SEQ ID NO: 1. Специалисту в данной области техники будет ясно, что данная последовательность может меняться со временем и включать любые изменения, необходимые в молекулах нуклеиновых кислот в настоящем описании, соответственно.

Специфическое связывание HSP47 с различным рядом типов коллагена делает HSP47 возможной мишенью для лечения фиброза. Подавление экспрессии hsp47 может предотвращать секрецию внеклеточного коллагена I. Sato et al. (Nat Biotechnol. 25 2008; 26:431-442) исследовал эту возможность посредством использования РНК для подавления экспрессии hsp47 и предотвращения развития фиброза печени у крыс.Аналогично, Chen et al. (Br J Dermatol 2007; 156: 1188-1195) и Wang et al. (Plast. Reconstr Surg 2003; 111: 1980-7) исследовали подавление экспрессии hsp47 с помощью технологии РНК интерференции.

Способы и композиции для ингибирования hsp47

Обеспечиваются композиции и способы для ингибирования экспрессии hsp47 с применением малых молекул нуклеиновых кислот, таких как интерферирующая нуклеиновая кислота (siNA), интерферирующая РНК (RNAi), короткая интерферирующая РНК (siRNA), двухнитевая РНК (dsRNA), микро-РНК (miRNA), и малая шпильковая RNA (shRNA) молекулы, способные опосредовать или которые опосредуют интерференцию РНК, против экспрессии гена hsp47. Композиции и способы согласно настоящему изобретению также является полезными при лечении различного фиброза, например, фиброза печени, фиброза легких и фиброза почек.

Молекула (молекулы) нуклеиновых кислот и/или способы согласно настоящему изобретению используются для подавления экспрессии гена (генов), которые кодируют РНК, обозначаемые, например, номером Genbank NM_001235.

Композиции, способы и наборы согласно настоящему изобретению могут включать одну или несколько молекул нуклеиновых кислот (например, siNA) и способов, которые независимо или в комбинации модулируют (например, подавляют) экспрессию белка hsp47 и/или генов, кодирующих белки hsp47, белков и/или генов или нарушений, связанных с поддержанием и/или развитием заболеваний, состояний или нарушений, связанных с hsp47, таких как фиброз печени, цирроз, фиброз легких, фиброз почек, пе-ритонеальный фиброз, хроническое поражение печени и фибриллогенез (например, гены, кодирующие последовательности, содержащие последовательности под номером GenBank NM_001235), или члена семейства генов hsp47, при этом гены или семейство генов имеют гомологию последовательностей. Описание различных объектов и вариантов выполнения настоящего изобретения приводится со ссылкой на примеры гена hsp47. Однако различные объекты и варианты выполнения настоящего изобретения также направлены на другие родственные гены hsp47, например, гены-гомологи и варианты транскриптов и полиморфизмы (например, полиморфизм отдельных нуклеотидов (SNP)), ассоциированные с определенными генами hsp47. По этой причине различные объекты и варианты выполнения настоящего изобретения также направлены на другие гены, которые участвуют в путях передачи сигнала или экспрессии генов, опосредуемых hsp47, которые вовлечены, например, в сохранение или развитие заболеваний, признаков или состояний согласно настоящему описанию. Можно провести анализ указанных дополнительных генов на предмет сайтов-мишеней, используя способы, описанные в настоящей публикации для гена hsp 47. Таким образом, модуляцию других генов и эффекты такой модуляции других генов можно производить, определять и измерять согласно настоящему изобретению.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения композиции и способы согласно настоящему изобретению включают молекулу двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты siNA), которая подавляет экспрессию гена hsp47 (например, hsp47 человека, примером которого является SEQ ID ΝΟ:1), при этом молекула нуклеиновой кислоты включает от около 15 до около 49 пар оснований.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению можно применять для подавления экспрессии гена hsp47 или семейства гена hsp47, при этом последовательность гена или семейства генов имеют гомологию последовательностей. Такие гомологичные последовательности можно идентифицировать способами, известным в данной области техники, например, с использованием выравнивания последовательностей. Молекулы нуклеиновой кислоты можно разработать для нацеливания на такие гомологичные последовательности, например, с использованием идеально комплементарных последовательностей или посредством встраивания неканонических пар оснований, например, ошибочных пар оснований и/или неоднозначных пар оснований, что может давать дополнительные последовательности-мишени. Если идентифицируют ошибочные спаривания, можно использовать неканонические пары оснований (например, ошибочные спаривания и/или неоднозначно спаренные основания) для получения молекул нуклеиновых кислот, которые нацелены более чем на одну последовательность гена. Например, но без ограничения к этому, неканонические пары оснований, такие как UU и СС пары оснований используются для получения молекул нуклеиновых кислот, которые способны нацеливаться на последовательности для различения пзр47-мишеней, которые имеют гомологию последовательностей. Поэтому одним из преимуществ использования siNA согласно настоящему изобретению является то, что можно разработать одноцепочечную нуклеиновую кислоту, чтобы она включала последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна последовательности нуклеотидов, которая является консервативной среди гомологичных генов. При таком подходе отдельную нуклеиновую кислоту можно использовать для подавления экспрессии более чем одного гена вместо использования более чем одной молекулы нуклеиновой кислоты для воздействия на различные гены.

Молекулы нуклеиновых кислот можно использовать для нацеливания на консервативные последовательности, соответствующие семейству гена или семействам генов, таким как семейство генов hsp47. Поэтому молекулы нуклеиновой кислоты, нацеленные на различные мишени hsp47, могут обеспечивать повышенный терапевтический эффект. Кроме этого, нуклеиновую кислоту можно использовать для описания путей функции генов для различных применений. Например, молекулы нуклеиновых кислот можно использовать для подавления активности целевого гена (генов) в путях для определения функции неохарактеризованного гена (генов) в анализе функции гена (генов), анализе функции мРНК или анализе трансляции. Молекулы нуклеиновых кислот можно использовать для определения возможных путей гена-мишени, участвующих в различных заболеваниях и состояниях для разработки лекарственных средств. Молекулы нуклеиновых кислот можно использовать для понимания путей экспрессии генов, вовлеченных, например, в фиброзы, такие как фиброз печени, почек или фиброз легких, и/или воспалительные и пролиферативные признаки, заболевания, нарушения и/или состояния.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения композиции и способы согласно настоящему изобретению включают молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую активность RNAi против РНК hsp47, при этом молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность, комплементарную любой РНК, имеющей кодирующую последовательность hsp47, такую как последовательности, имеющие последовательности, показанные в Таблице 3. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты может иметь активность RNAi против РНК hsp47, при этом молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность, комплементарную РНК, имеющей вариант кодирующей последовательности hsp47, например, другие мутантные гены hsp47, не показанные в Таблице 3, но для которых в данной области техники известно, что они связаны с поддержанием и/или развитием фиброза. Химические модификации, показанные в Таблице 3, или иные согласно настоящему изобретению, можно применять по отношению к любой конструкции нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, которая может взаимодействовать с нуклеотидной последовательностью гена hsp47, и таким образом опосредовать сайленсинг экспрессии гена hsp47, например, при этом молекула нуклеиновой кислоты опосредует регуляцию экспрессии гена hsp47 через клеточные процессы, которые модулируют структуру хроматина или модели метилирования гена hsp47 и предотвращают транскрипцию гена hsp47.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут обладать активностью RNAi против РНК hsp47, при этом молекула нуклеиновой кислоты включает

последовательность, комплементарную любой РНК, имеющей последовательность, кодирующую hsp47, например, последовательность под номером GenBank NM_001235.

Молекулы нуклеиновых кислот могут обладать активностью RNAi против РНК hsp47, при этом молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность, комплементарную РНК, имеющей вариант кодирующей последовательности hsp47, например, другие мутантные гены hsp47, которые, как известно в данной области техники, связаны с поддержанием и/или развитием фиброза.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению включают последовательность нуклеотидов, которая может взаимодействовать с нуклеотидной последовательностью гена hsp47, и, таки образом, опосредовать сайленсинг экспрессии гена hsp47, например, если молекула 15 нуклеиновой кислоты опосредует регуляцию экспрессии гена hsp47 через клеточные процессы, которые модулируют структуру хроматина или модели метилирования гена hsp47 и предотвращают транскрипцию гена hsp47.

Способы лечения

Специфическое связываниеШР47 с различным рядом типов коллагена делает hsp47 возможной мишенью для лечения фиброза. Подавление экспрессии hsp47 может предотвращать секрецию внеклеточного коллагена I. Sato et al. (Nat Biotechnol 2008; 26:431-442) исследовал эту возможность посредством использования siRNA для ингибирования экспрессии hsp47 и предотвращения развития фиброза печени у крыс. Подобным образом, Chen et al. (Br J Dermatol 2007; 156: 1188-1195) и Wang et al. (Plast Reconstr Surg 2003; 111: 1980-7) исследовали подавление экспрессии hsp47 с помощью методики РНК интерференции.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения молекулы нуклеиновых кислот можно использовать для снижения или подавления экспрессии hsp47 и/или белков hsp47, происходящих от hsp47 и/или полиморфизмов гаплотипа hsp47, которые связаны с заболеванием или состоянием (например, фиброзом). Анализ уровней hsp47 и/или генов hsp47, hsp47 и/или белка hsp47 или уровня РНК можно применять для идентификации субъектов с такими полиморфизмами или субъектов, у которых есть риск развития признаков, состояний или заболеваний согласно настоящему описанию. Указанные субъекты поддаются лечению, например, лечению с помощью молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению и любой другой композиции, полезной для лечения заболеваний, связанных с hsp47 и/или экспрессией гена hsp47. Поэтому анализ уровней hsp47 и/или белка hsp47 или РНК можно использовать для определения типа и курса лечения для лечения субъекта. Мониторинг уровней hsp47 и/или белка hsp47 или РНК можно применять для предсказания клинического исхода и для определения эффективности соединений и композиций, которые модулируют уровень и/или активность определенных hsp47 и/или белков hsp47, связанных с признаком, состоянием или заболеванием.

Обеспечиваются способы и композиции для подавления экспрессии hsp47 посредством применения малых молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, таких как молекул siNA, RNAi, siRNA, двухцепочечных РНК (dsRNA), микро-РНК (miRNA)h коротких шпильковых РНК (shRNA), способных опосредовать или которые опосредуют РНК интерференцию, против экспрессии гена hsp47. Композиция и способы согласно настоящему изобретению также являются полезными при лечении различных форм фиброза, таких как фиброз печени, фиброз легких и фиброз почек.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению сами по себе или в комбинации или в соединении с другими лекарственными средствами можно использовать для предотвращения или лечения заболеваний, признаков, состояний и/или нарушений, связанных с hsp47, таких как фиброз печени, цирроз, фиброз легких, фиброз почек, перитонеальный фиброз, хроническое поражение печени и фибриллогенез.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению способны подавлять экспрессию hsp47 специфичным в отношении последовательности образом. Молекулы нуклеиновых кислот могут включать смысловую нить и антисмысловую нить, которые включают смежные нуклеотиды, которые являются по меньшей мере частично комплементарными (антисмысловыми) по отношению к мРНК hsp47.

В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения специфичную в отношении hsp47 dsRNA можно использовать в сочетании с другими dsRNA, специфичными для других молекулярных шаперонов, которые принимают участие в сворачивании вновь синтезированных белков, таких как кальнексин, кальретикулин и/или BiP (Bergeron et al. Trends Biochem. Sci. 1994; 19:124-128; Herbert et al. 1995; Cold Spring Harb. Symp.Quant. Biol. 60:405-415)

Фиброз можно вылечить с помощью РНК интерференции с применением молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Примеры фиброза включают фиброз печени, перитонеальный фиброз, фиброз легких, фиброз почек. Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут подавлять экспрессию hsp47 специфичным в отношении последовательности образом.

Можно проводить мониторинг лечения фиброза по определению уровня внеклеточного коллагена с использованием приемлемых методик, известных в данной области техники, например, с применением антител к коллагену I. Также можно проводить мониторинг лечения фиброза по определению уровня мРНК hsp47 или уровня белка HSP47 в клетках пораженной ткани. Также можно проводить мониторинг лечения фиброза с помощью неинвазивного сканирования пораженного органа или ткани, например, компьютерной томографии, магнитно-резонансной эластографии.

Способ лечения или профилактики у субъекта или организма заболевания или состояния, связанного с hsp47, может включать обеспечение контакта субъекта или организма с молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению при условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена hsp47 у субъекта или организма.

Способ лечения или профилактики фиброза у субъекта или организма может включать обеспечение контакта субъекта или организма с молекулой нуклеиновой кислоты при условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена hsp47 у субъекта или организма.

Способ лечения или профилактики одного или нескольких типов фиброза, выбранных из группы, состоящей из фиброза печени, фиброза почек и фиброза легких у субъекта или организма, может включать обеспечение контакта субъекта или организма с молекулой нуклеиновой кислоты при условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена hsp47 у субъекта или организма.

Фиброзные заболевания

Фиброзные заболевания обычно характеризуются избыточным отложением волокнистого материала во внеклеточном матриксе, которое способствуют анормальным изменениям архитектуры тканей и нарушает нормальную работу органов.

Все ткани, нарушенные при травме, отвечают посредством запуска программы заживления раны. Фиброз, тип заболевания, характеризующийся избыточным рубцеванием, возникает, если нарушается нормальный самоорганичивающийся процесс ответа заживления раны, и вызывает избыточную выработку и отложение коллагена. В результате нормальная ткань органа замещается рубцовой тканью, которая в итоге приводит к функциональному отказу органа.

Фиброз может быть вызван различными причинами и в разных органах. Цирроз печени, фиброз легких, саркоидоз, келоидные рубцы и фиброз почек являются хроническими заболеваниями, связанными с прогрессивным фиброзом, благодаря чему происходит постоянная утрата нормальной функции ткани.

Острый фиброз (обычно с внезапным и серьезным началом и быстрым течением) возникает как общий ответ на различные формы травм, включая травмы в результате несчастного случая (в частности травмы спинного мозга и центральной нервной системы), инфекций, хирургического вмешательства, ишемических заболеваний (например, образование рубцов в сердце после сердечного приступа), ожогов, загрязнения окружающей среды, алкоголя и других типов токсинов, синдрома острой дыхательной недостаточности, лучевой терапии и химиотерапии.

Фиброз, патология, вызванная фиброзом, или патология, вызванная неправильным образованием поперечных связей клеточных белков, все могут быть вылечены с помощью siRNA согласно настоящему изобретению. Фиброзные заболевания или заболевания, при которых очевиден фиброз (патология, вызванная фиброзом) включают как острые, так и хронические формы фиброза органов, включая все следующие этиологические варианты: фиброз легких, включая интерстициальную болезнь легких и фибротическую болезнь легких, фиброз печени, фиброз сердца, включая фиброз миокарда, фиброз почек, включая хроническую почечную недостаточность, фиброз кожи, включая склеродермию, келоидные и гипертрофические рубцы; миелофиброз (фиброз костного мозга); все типы рубцов глаз, включая пролиферативную витреоретинопатию (PVR) и рубцы в результате хирургического вмешательства для лечения катаракты или глаукомы; воспалительная болезнь кишечника различной этиологии, макулярная дегенерация, офтальмопатия Грейвса, эрготизм, вызванный лекарственными средствами, келоидные рубцы, склеродермия, псориаз, глиобластома при синдроме Ли-Фраумени, спорадическая глиобластома, миелоидная лейкемия, острая миелогенная лейкемия, миелодиспластический синдром, миелопродиферативный синдром, гинекологическая онкология, саркома Калоши, болезнь Гансена и коллагенозный колит.

В различных вариантах выполнения настоящего изобретения соединения (молекулы нуклеиновых кислот) согласно настоящему описанию можно использовать для лечения фиброзных заболеваний, например, согласно настоящему изобретению, а также множества других заболеваний и состояний, помимо фиброзных заболеваний, например, таких как согласно настоящему изобретению. Другие заболевания, которые необходимо лечить, включают фиброзные заболевания в других органах - фиброз почек любой причины (CDK, включая ESRD); фиброз легких (включая ILF); 15 миелофиброз, ненормальное рубцевание (келоидные рубцы), вызванные всевозможными типами травм кожи - случайными и ятрогенными (операции); склеродермию, кардиофиброз, неудачная фильтрующая операция при глаукоме; кишечные спайки.

Офтальмологическая хирургия и фиброзные осложнения

Часто может происходить контрактура рубцовой ткани в результате операции 20 на глазах. Хирургическое вмешательство при глаукоме для создания новых дренажных каналов часто заканчивается неудачно из-за образования рубцов и контрактуры тканей, и созданная дренажная система может быть блокирована, что требует дополнительного хирургического вмешательства. Существующие схемы лечения против рубцевания (митомицин С или 5FU) ограничены сопутствующими осложнениями (например, слепотой), например, смотрите публикацию Cordeiro MF, et al., Human anti-transformingH growth factor-beta2 antibody: a new glaucoma anti-scarring agent Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999 Sep;40(10):2225-34. Также могут происходить контрактура рубцовой ткани, образованной после травмы роговицы или операции на роговице, например, лазерного или хирургического лечения миопии или рефракционной аномалии, при которой контрактура тканей может привести к неверным результатам. Рубцовая ткань может быть образована, например, на/в стекловидном теле или сетчатке и в итоге может вызвать слепоту у некоторых субъектов с диабетом, и может быть образована после операции отслоения, имеющей название пролиферативная витреоретинапатия (PVR). PVR является обычным осложнением после отслойки сетчатки и связана с дырой или разрывом сетчатки. PVR обозначает рост клеточных мембран в полости стекловидного тела и на передней и задней поверхности сетчатки, содержащей клетки пигментного эпителия сетчатки (PVR). Эти мембраны, которые по существу представляют собой рубцовые ткани, растягиваются на сетчатке и могут привести к повторению отслоения сетчатки, даже после первоначально успешной процедуры отслоения сетчатки.

Рубцовая ткань может образоваться в орбите или на глазу и мышцах век после хирургических операций при косоглазии, операциях на орбите или веках или тиреоидной болезни глаза, и при которых происходит образование рубцов на конъюктиве, что может произойти после операции при глаукоме или при рубцовом заболевании, воспалительном заболевании, например, пемфигоиде или инфекционном заболевании, например, трахоме. Также глазным заболеванием, связанным с контрактурой тканей, содержащих коллаген, является помутнение и контрактура капсулы хрусталика после удаления катаракты. Была признана важная роль ММР в офтальмологических заболеваниях, включая заживление ран, сухой глаз, незаживающее изъязвление роговицы, возвратную эрозию эпителия, неоваскуляризацию роговицы, птеригий, халазию конъюктивы, глаукому, PVR и окулярный фиброз.

Фиброз печени

Фиброз печени (LF) является обычно необратимым последствием поражения печени нескольких этиологии. На западе главными этиологическими категориями являются: алкогольная болезнь печени (30-50%), вирусный гепатит (30%), болезнь желчных протоков (5-10%), первичный гемохроматоз (5%) и лекарственный и криптогенный цирроз неизвестной этиологии (10-15%). Также фиброз печени является одним из симптомов болезни Вильсона, недостаточности α₁-антитрипсина и других 25 редких заболеваний. При циррозе печени, последней стадии фиброза печени, часто необходима трансплантация печени, и цирроз печени входит в десять самых распространенных причин смертности на западе.

Фиброз печени и связанных состояний Хроническая почечная недостаточность (CRF)

Хроническая почечная недостаточность представляет собой постепенную и прогрессирующую потерю способности почек выводить отходы, концентрировать мочу и сохранять электролиты. CRF является медленно прогрессирующей. Наиболее часто она возникает в результате любого заболевания, которое вызывает постепенную потерю функции почек, и фиброз является основной патологией, при которой развивается CRF.

Диабетическая нефропатия

Диабетическая нефропатия, отличительным признаком которой является гломерулосклероз и тубулоинтерстициальный фиброз, является отдельной наиболее преобладающей причиной терминальной стадии почечной недостаточности в современном мире, и субъекты с диабетом составляют самую большую группу на диализе. Такой способ лечения является дорогостоящим и далек от оптимального. Трансплантация предлагает лучший исход, но страдает от серьезного недостатка доноров.

Хроническая болезнь почек

Хроническая болезнь почек (CKD) является мировой проблемой общественного здоровья и считается рядовым состоянием, которое связано с повышенным риском развития сердечно-сосудистых заболеваний и хронической почечной недостаточностью (CKD).

Инициатива Качества Лечения Заболевания Почек (K/DOQI) Национального Почечного Фонда (NKF) определяет хроническую болезнь почек как повреждение почек или сниженную скорость клубочковой фильтрации (GRF) в течение трех или более месяцев. Другие маркеры ХБП также известны и используются для диагностики. В общем, разрушение тела почки с необратимым склерозом и утратой нефронов приводит к прогрессивному ухудшению GRF. Недавно K/DOQI опубликовала следующую классификацию стадий CKD:

Стадия 1: повреждение почек с нормальной или повышенной GFR (>90 мл/мин/1.73 м2)

Стадия 2: слабое снижение GFR (60-89 мл/мин/1.73 м2)

Стадия 3: умеренное снижение GFR (30-59 мл /мин/1.73 м2)

Стадия 4: серьезное снижение GFR (15-29 мл /мин/1.73 м2)

Стадия 5: почечная недостаточность (GFR<15 мл /мин/1.73 м2 или диализ)

На 1 и 2 стадии CKD, GFR в отдельности не подтверждает диагноз. Можно полагаться на другие маркеры повреждения почек, включая нарушения в составе крови или мочи или отклонения в рентрегологических исследованиях.

Патофизиология CKD

Около 1 миллиона нефронов находится в каждой почке, каждый из которых вносит вклад в общую GFR. Независимо от этиологии повреждения почки с прогрессивным разрушением нефронов, почка может поддерживать GFR с помощью гиперфильтрации и компенсаторной гипертрофии оставшихся здоровых нефронов. Эта приспособляемость нефронов способствует длительному нормальному клиренсу растворенных веществ плазмы, вследствие чего такие вещества, как мочевина и креатинин начинают показывать значительное повышение уровней в плазме только после того, как общая GFR снизилась до 50%, когда почечный резерв исчерпан. Уровень креатинина в плазме приблизительно удвоится при снижении GFR на 50%. Поэтому повышение уровня креатинина в плазме в два раза по сравнению с исходным значением 0,6 мг/дл до 1,2 мг/дл у субъекта фактически представляет потерю 50% массы функционирующих нефронов.

Считается, что остаточная гиперфильтрация и гипертрофия нефронов, несмотря на ее полезность в силу отмеченных причин, представляет основную причину прогрессирующей дисфункции почек. Считается, что это происходит из-за повышенного капиллярного давления в клубочках, которое повреждает капилляры и сначала приводит к местному и сегментному гломерулосклерозу, а в итоге к глобальному гломерулосклерозу. Эта гипотеза основывается на исследованиях крыс с 5/6 нефроэктомией, у которых развились поражения, которые были идентичны поражениям, наблюдаемым у людей с CKD.

Двумя наиболее распространенными причинами хронической болезни почек являются диабет и гипертензия. Другие факторы включают острые инсульты в результате нефротоксинов, включая контрастирующие агенты или сниженную перфузию; протеинурии; повышенного почечного аммониагенеза с интерстициальной травмой, гиперлипидемии, гиперфосфатемии с отложением фосфата кальция, пониженных уровней оксида азота и курения.

В США частота и распространенность CKD повышается с плохими исходами и высокой стоимостью для системы здравоохранения. Болезнь почек является девятой ведущей причиной смерти в США. Высокая степень смертности заставила включить в приказ Министра здравоохранения США для граждан Америки, Здоровые люди 2010, главу, посвященную CKD. Целями этой главы является сформулировать задачи и обеспечить стратегии для снижения распространенности, заболеваемости, смертности и расходов здравоохранения на хроническую болезнь почек в США.

Встречаемость терминальной стадии хронической почечной недостаточности (ESRD) в мире также постоянно повышается с 1989. Соединенные Штаты Америки имеют самую высокую степень встречаемости ESRD, после них следует Япония. Япония имеет самую высокую распространенность на миллион популяции, после нее следуют США.

Смертность, вызванная гемодиализом, является поразительной и указывает, что ожидаемая продолжительности жизни субъектов, которым начинают проводить гемодиализ, заметно сокращается. В любом возрасте субъекты с ESRD на диализе имеют значительно повышенную смертность по сравнению с субъектами без диализа и людьми без болезни почек. В возрасте 60 лет здоровый человек может предполагать прожить еще 20 лет, тогда как ожидаемая продолжительность жизни 60-летнего субъекта, начинающего гемодиализ, приближается к 4 годам.

Фиброз легких

Интерстициальный фиброз легких (IPF) представляет собой образование рубцов в почках, вызванное различными вдыхаемыми агентами, включая минеральные частицы, органическую пыль и окислительные газы или по неизвестным причинам (идиопатический фиброз легких). Заболевание поражает миллионы человек в мире, и эффективные способы лечения отсутствуют. Главной причиной отсутствия полезного лечения является то, что мало молекулярных механизмов исследовали в достаточной степени для разработки соответствующих мишеней терапии (Lasky, et al, 2000, Environ Health Perspect; 108:751-62).

Фиброз сердца

Сердечная недостаточность занимает уникальное место среди главных сердечнососудистых заболеваний, поскольку только у него распространенность повышается, в то время как происходит заметное снижение других заболеваний. Частично это может объясняться старением населения США и Европы. Возможность спасать субъектов с повреждением миокарда также является главным фактором, поскольку у этих субъектов может развиваться прогрессия дисфункции левого желудочка из-за разрушительного ремоделирования сердца.

Нормальный миокард состоит из разных клеток, кардиомиоцитов и не кардиомиоцитов, и которые включают эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов и фибробласты.

Ремоделирование структуры стенки желудочка является ключевой детерминантой клинического исхода болезни сердца. Такое ремоделирование включает 10 выработку и деградацию белков внеклеточного матрикса, пролиферацию и миграцию клеток и апоптотическую или некротическую гибель клеток. Фибробласты сердца принципиально вовлечены в эти процессы, вырабатывая факторы роста и цитокины, которые действуют как аутокринные и паракринные факторы, а также белки и протеиназы внеклеточного матрикса. Недавние исследования показали, что взаимодействия между фибробластами сердца и кардиомиоцитами абсолютно необходимы для прогрессии ремоделирования сердца, совокупным эффектом которого является нарушение работы сердца и начало сердечной недостаточности (Manabe, et al, 2002, Cire Res. 13:1103-13).

Ожоги и рубцы

Отдельной проблемой, которая может возникнуть, в частности при фиброзном заболевании, является контрактура тканей, например, контрактура рубцов. Сморщивание тканей, включая компоненты внеклеточного матрикса, в частности, тканей, содержащих коллаген, может происходить в связи со многими различными патологическими состояниями и хирургическими или косметическими процедурами. Сморщивание, например, рубцов может вызывать физические проблемы, которые могут приводить к необходимости медицинского вмешательства, или она может вызывать проблемы чисто косметической природы. Коллаген является главным компонентом рубца и поэтому является наиболее важным структурным компонентом для рассмотрения. Тем не менее, рубцы и другие сморщенные ткани также включают другие структурные компоненты, в частности другие компоненты внеклеточного матрикса, например, эластин, который также может способствовать контрактуре ткани.

Сморщивание ткани, содержащей коллаген, которая также может включать другие компоненты внеклеточного матрикса, часто встречается при заживлении ожогов. Ожоги могут быть химическими, термическими или радиационными ожогами, и могут быть на глазах, поверхности кожи или на коже и лежащих ниже тканях. Также в некоторых случаях ожоги могут быть на внутренних тканях, например, вызванные действием облучения. Сморщивание ожоговых тканей часто является проблемой и может приводить к физическим и/или косметическим проблемам, например, потере подвижности и/или обезображиванию.

Кожные трансплантаты могут применяться по различным причинам, и они могут претерпевать сморщивание после нанесения. При заживлении обожженных тканей сморщивание может приводить к физическим и косметическим проблемам. Это является особенно серьезной проблемой, если необходимо много кожных трансплантатов, например, в случае серьезных ожогов.

Сморщивание также является проблемой при создании искусственной кожи. Для получения искусственной кожи необходимо иметь эпидермис, состоящий из эпителиальных клеток (кератиноцитов), и дермис, состоящий из коллагена, заселенного фибробластами. Важно иметь оба типа клеток, т.к. они запускают сигналлинг и стимулируют друг друга с использованием факторов роста. Коллагеновый компонент искусственной кожи часто сжимается менее чем до десятой части от его исходной площади при заселении фибробластами.

Сморщивание рубцов, сморщивание из-за сжимания фиброзной ткани рубца, является обычной. В некоторых случаях рубец может превратиться в деформирующий рубец, рубец, в котором сморщивание вызывает серьезное уродство. Желудок субъекта может быть фактически разделен на две отдельные камеры контрактурой песочных часов при сокращении рубцовой ткани, образованной при заживлении язвы желудка. Закупорка проходов и протоков, рубцовый стеноз могут возникнуть при сокращении рубцовой ткани. Сморщивание кровеносных сосудов может быть связана с первичной обструкцией или хирургической травмой, например, после операции или ангиопластики. Может также произойти стеноз других полых органов, например, мочеточников. Проблемы могут возникнуть, если происходит любая форма образования рубцов, как в результате случайного ранения, так и после операции. Заболевания кожи и сухожилий, которые включают сокращение тканей, включающих коллаген, включают посттравматические состояния, вызванные операцией или несчастным случаем, например, травмы сухожилий рук или ног, состояния после трансплантации и патологические состояния, такие как склеродермия, контрактура Дюпюитрена и буллезный эпидермолиз. Рубцевание и контрактура тканей в глазах может встречаться при различных состояниях, например, последствиях отслойки сетчатки или диабетического поражения глаз (как упоминалось выше). Контрактура глазницы, обнаруженное в черепе глазных яблок, и связанных с ней структур, в том числе внеглазных мышц и век, может возникать, если существует травма или воспалительное повреждение. Ткани сокращаются в глазнице, вызывая целый ряд проблем, включая удвоение в глазах и неприглядный внешний вид.

Для получения большей информации о различных типах фиброза смотрите публикации:: Molina V, et al, 2002, Harefuah, 141: 973-8, 1009; Yu, et al, 2002, Curr Opin Pharmacol. 2(2):177-81; Keane, et al, 2003, Am J Kidney Dis. 41: S22-5; Bohle, et al, 1989, Pathol Res Pract. 185:421-40; Kikkawa, et al, 1997, Kidney Int Suppl. 62:S39-40; Bataller et al, 2001, Semin Liver Dis. 21:437-51; Gross, et al, 2001 N Engl J Med. 345:517-25; Frohlich, 2001, Am J Hypertens; 14:194S-199S; Friedman, 2003, J Hepatol. 38:S38-53; Al-banis, et al, 2003, Curr Gastroenterol Rep.5:48-56; Weber, 2000, Curr Opin Cardiol. 15:264-72).

Доставка молекул нуклеиновых кислот и фармацевтические композиции

Ретиноид или конъюгат ретиноида, полезный для доставки нуклеиновой кислоты, находится в состоянии, в котором он растворяется в среде или смешивается со средой, которая может растворять или сохранять его.

Любой ретиноид или конъюгат ретиноида может применяться в настоящей заявке до тех пор, пока он активно аккумулируется стволовыми клетками; примеры ретиноида включают, но без ограничения к этому, третиноин, адапален, ретинол пальмитат и, в частности, витамин А, насыщенный витамин А, ретиноевая кислота, примеры конъюгата ретиноида включают ПЭГ-ретиноид конъюгаты. В настоящем изобретении применяется свойство стволовых клеток положительно включать ретиноид и/или конъюгат ретиноида, и посредством ретиноида и/или конъюгата ретиноида в качестве носителя для лекарственного средства или посредством связывания с или включения в другой компонент носителя для лекарственного средства, желательный материал или организм специфически транспортируется в стволовые клетки. Ретиноид является членом класса соединений, имеющих скелет, в котором четыре изопреноидные единицы связываются образом голова к хвосту. See G.P. Moss, "Biochemical Nomenclature и Related Documents," 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992). Витамин А является общим дескриптором качества ретиноида, показывающий биологическую активность ретинола. Ретиноид согласно настоящему изобретению способствует специфической доставке вещества в раковую клетку и CAF (то есть вещество нацеливается в эти клетки). Такой ретиноид в частности не ограничивается, и его примеры включают ретинол, витамин А, насыщенный витамин А, ретиналь, ретиноевая кислота, сложный эфир ретинола и жирной кислоты, сложный эфир алифатического спирта и ретиноевой кислоты, этретинат, третиноин, изотретиноин, адапален, акитретин, тазаротен и ретинол пальмитат, и аналоги витамина А, такие как фенретинид и бексаротен. Конъюгаты ретиноида включают ПЭГ-конъюгаты, например, diVA-PEG-diVA, показанные в следующей структуре.

Носитель для лекарственного средства согласно настоящему изобретению поэтому может содержать компонент для лекарственного средства отличен от ретиноида и/или конъюгата ретиноида. Такой компонент в частности не ограничен, и любой компонент, известный в области медицины и фармацевтики может применяться, но предпочтительно он способен включать ретиноид и/или конъюгат ретиноида. Примеры такого компонента включают липид, например, фосфолипид, такой как глицерофосфолипид, сфинголипид, такой как сфингомиелин, стирол, такой как холестерин, растительное масло, такое как соевое масло или масло семян мака, минеральное масло, и лецитин, такой как лецитин яичного желтка, но примеры не ограничиваются этим. Среди них, те, которые могут формировать липосому, являются предпочтительными, например, природные фосфолипиды, такие как лецитин, полусинтетические фосфолипиды, такие как димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) и дистеароилфосфатидилхолин и холестерин

Кроме того, носитель для лекарственного средства согласно настоящему изобретению содержит вещество, которое улучшает включение в стволовые клетки, например, ретинол-связывающий белок (RBP).

Связывание ретиноида и/или конъюгата ретиноида с носителем для лекарственного средства согласно настоящему изобретению или включение ретиноида и/или конъюгата ретиноида в носитель для лекарственного средства согласно настоящему изобретению может осуществляться посредством связывания или включения ретиноида и/или конъюгата ретиноида с другим компонентом носителя для лекарственного средства химическими и/или физическими методами. Альтернативно, связывание ретиноида и/или конъюгата ретиноида с носителем для лекарственного средства согласно настоящему изобретению или включение ретиноида и/или конъюгата ретиноида в носитель для лекарственного средства согласно настоящему изобретению может также осуществляться посредством смешивания ретиноида и/или конъюгата ретиноида, имеющего аффинность к образованию, и основных компонентов носителя для лекарственного средства, в компонентах носителя для лекарственного средства в ходе получения носителя для лекарственного средства. Количество ретиноида и/или конъюгата ретиноида, связанного с носителем для лекарственного средства согласно настоящему изобретению, или включенного в него, может составлять от 0.01 мас. % до 100 мас. % относительно компонентов носителя для лекарственного средства, предпочтительно от 0.2 мас. % до 20 мас. %, и более предпочтительно от 1 мас. % до 5 мас. %.

Системы доставки нуклеиновых кислот могут включать, например, водные и безводные гели, кремы, различные эмульсии, микроэмульсии, липосомы, мази, водные и безводные растворы, лосьоны, аэрозоли, углеводородные основы и порошки, и могут включать наполнители, такие как растворители, усилители проникновения (например, жирные кислоты, эфиры жирных кислот, жирные спирты и аминокислоты), и гидрофильные полимеры (например, поликарбофил и поливинилпирролидон). В одном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель представляет собой липосому или усилитель чрескожного проникновения. Примеры липосом, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают следующие:

- Cytofectin GSV, 2:1 (М/М) липосомная форма катионного липида и DOPE (Glen Research);

- DOTAP (N-[1-(2,3-диолеоилокси)-N,N,N-три-метил-аммрния метилсуль-фат) (Boehringer Manheim);

- Lipofectamine, 3:1 (М/М) липосомная форма поликатионного липида DOSPA, нейтрального липида DOPE (GIBCO BRL) и диалкилированной аминокислоты (DiLA2);

- Lipotrust, 4:3:3 (М/М) липосомная форма O,O'-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмониоацетил) диэтаноламин хлорид (DC-6-14, холестерин и диолеилфосфатидилэтаноламин (Hokkaido System Science). DC-6-14 имеет следующую структуру.

Могут применяться другие липиды: перманентные катионные липиды и ионизируемые катионные липиды, включая

и ПЭГ-липиды, включая

- 1,2-димиристоелоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-PEG (PEG-DMPE)

- 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин -N-PEG (PEG-DPPE),

- 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин -N-PEG (PEG-DSPE),

или

- 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин -N-PEG (PEG-DOPE)

и/или

- PEG-церамид.

Системы доставки могут включать пластыри, таблетки, суппозитории, свечи, гели и кремы, а также могут содержать наполнители, такие как растворители и усилители, например, пропиленгликоль, соли желчных кислот и аминокислоты), и другие носители (например, полиэтиленгликоль, эфиры жирных кислот и их производные, а также гидрофильные полимеры, такие как гидроксипропилметилцелюлоза и гиалуроновая кислота).

Носитель для лекарственного средства согласно настоящему изобретению может быть в любой форме до тех пор, пока желательный материал или организм может быть транспортирован в целевые звездчатые клетки, и примеры формы включают, но без ограничения к этому, полимерную мицеллу, липосому, эмульсию, микросферу и наносферу. Кроме того, носитель для лекарственного средства может включать в его внутренней части вещество, которое должно быть транспортировано, присоединенное к его внешней части вещество, которое должно транспортироваться, или быть смешанным с веществом, которое должно быть транспортировано, до тех пор, пока ретиноид и/или конъюгат ретиноида, включенный в него, по меньшей мере частично выставлен на внешней части препарата пока он не достигнет наконец звездчатых клеток.

Носитель для лекарственного средства согласно настоящему изобретению специфически нацелен на звездчатые клетки и обеспечивает желательный эффект, такой как, например, ингибирование или предупреждение фиброза, показываемый с максимальным эффектом и минимальными побочными эффектами посредством эффективного транспортирования в звездчатые клетки желательного вещества или организма, как например, лекарственное средство для контроля активности или роста звездчатых клеток. Вещество или организм, который доставляет носитель для лекарственного средства согласно настоящему изобретению, в частности не ограничен, но предпочтительно имеет размер, который обеспечивает физическое перемещение в живом организме от места введения до печени, поджелудочной железы и т.д., где присутствуют стволовые клетки. Носитель для лекарственного средства согласно настоящему изобретению поэтому может транспортировать не только вещество, такой как атом, молекула, соединение, белок или нуклеиновая кислота, но также и организм, такой как вирус, частица вируса, клетка, система высвобождения лекарственного средства, составленная из одного или более элементов, или микромашины. Вещество или организм предпочтительно имеет свойство оказания некоторого эффекта на звездчатые клетки, и примерами которого является метка звездчатых клеток и контроль активности или роста звездчатых клеток.

Поэтому в одном варианте выполнения настоящего изобретения лекарственное носитель для лекарственного средства доставляет средство контролирует активность и рост звездчатых клеток. Это может быть любое лекарственное средство, которое непосредственно или косвенно ингибирует физико-химические действия звездчатых клеток, которые участвуют в развитии фиброзов, и его примеры включают, но без ограничения к этому, ингибиторы активности TGFβ, такие как усеченный рецептор TGFβ типа II и растворимый рецептор TGFβ типа II, препараты фактора роста, такие как HGF и экспрессионные векторы для них, промоторы продукции ММР, как например аденовирусный вектор, содержащий ген ММР, ингибиторы продукции TIMP, такие как антисмысловая TIMP нуклеиновая кислота, PPARγ лиганд, ингибиторы клеточной активности и/или ингибиторы клеточного роста, такие как ингибитор активности ангиотензина, ингибитор активности PDGF, и ингибитор натриевого канала, а также индукторы апоптоза, такие как соединение 861 и глиотоксин, адипонектин, и соединение, имеющее ингибиторную активность в отношении киназы Rho, такое как (+)-транс-4-(1-аминоэтил)-1-(4-пиридилкарбамоил)циклогексан. Кроме того, лекарственное средство для контроля или роста звездчатых клеток согласно настоящему изобретению может быть любым лекарственным средством, которое непосредственно или косвенно вызывает физико-химические действия звездчатых клеток, непосредственно или косвенно участвующих в ингибировании фиброза, и его примеры включают, но без ограничения к этому, лекарственное средство для активации системы разрушения коллагена, например, промоторы продукции ММР, как например ММР экспрессионный вектор, HGF, и лекарственные средства, имеющие HGF-подобную активность, такие как аналоги HGF и их экспрессионные вектора.

Другие примеры лекарственных средств для контроля активности или роста звездчатых клеток согласно настоящему изобретению включают лекарственное средство для контроля метаболизма внеклеточного матрикса, как например коллагена, например, вещество, оказывающее эффект на ингибирование экспрессии целевой молекулы, как например siRNA, рибозим и антисмысловая нуклеиновая кислота (включая РНК, ДНК, PNA и их композит), вещество, имеющее доминантный отрицательный эффект, и вектора, экспрессирующие их, которые нацеливаются, например, на молекулу, составляющую внеклеточный матрикс, продуцируемую звездчатыми клетками, или нацеливаются на одну или более молекулы, которые имеют функцию продуцирования или секретирования молекулы, составляющей внеклеточный матрикс.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству для лечения нарушения, связанного со звездчатыми клетками, причем лекарственное средство содержит носитель для лекарственного средства и лекарственное средство для контроля активности или роста звездчатых клеток, и относится к применению носителя для лекарственного средства для получения фармацевтической композиции для лечения нарушения, связанного со звездчатыми клетками. Нарушение, связанное со звездчатыми клетками, в контексте настоящего изобретения означает нарушение, в котором звездчатые клетки непосредственно или косвенно участвуют в процессе нарушения, то есть, вспышке, обострении, улучшении, ремиссии, излечении и т.д. нарушения, и его примеры включают нарушения печени, такие как гепатит, в частности хронический гепатит, фиброз печени, цирроз печени и рак печени, и панкреатические нарушения, такие как панкреатит, в частности хронический панкреатит, фиброз поджелудочной железы и рак поджелудочной железы.

В препарате согласно настоящему изобретению носитель для лекарственного средства может включать лекарственное средство в его внутренней части, содержать присоединенное к его внешней части вещество, содержащее лекарственное средство, или быть смешанным с лекарственным средством до тех пор, пока ретиноид и/или конъюгат ретиноида, включенный в носитель для лекарственного средства, по меньшей мере частично выставлен на внешней части препарата до того, как он достигает наконец звездчатых клеток. Поэтому, в зависимости от пути введения или образа, которым лекарственное средство высвобождается, препарат может быть покрыт подходящим веществом, таким как, например, энтеральное покрытие или материал, который разрушается со временем, или может быть включен в соответствующую систему высвобождения лекарственного средства.

Поэтому настоящее изобретение включает носитель для лекарственного средства или набор для получения препарата, содержащий один или более контейнеров, содержащих один или более составляющих носителя для лекарственного средства, ретиноид и/или конъюгат ретиноида, и/или лекарственное средство, а также включает существенный компонент для носителя для лекарственного средства, или препарат, обеспечиваемый в форме такого набора. Набор согласно настоящему изобретению может содержать, в дополнение к описанным выше, описание и т.д., где описывается способ получения или способ введения носителя для лекарственного средства и препарата согласно настоящему изобретению. Кроме того, набор согласно настоящему изобретению может содержать все компоненты для получения носителя для лекарственного средства или препарата согласно настоящему изобретению, но не обязательно содержит все компоненты. Поэтому набор согласно настоящему изобретению необязательно должен содержать реагент или растворитель, который, как правило, доступен на месте лечения, эксперимента и т.д., как например, например, стерильная вода, соляной раствор или раствор глюкозы.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу лечения нарушения, связанного со звездчатыми клетками, причем способ включает введение эффективного количества препарата субъекту, нуждающемуся в этом. Эффективное количество в контексте настоящего изобретения относится к количеству, которое подавляет вспышку целевого нарушения, уменьшение его симптомов или предотвращение его развития, и предпочтительно представляет собой количество, которое предотвращает вспышку целевого нарушения или излечивает целевое нарушение Оно также представляет собой количество, которое не вызывает побочный эффект, который превышает благоприятный эффект от введения. Такое количество может быть определено подходящим образом посредством in vitro теста с применением культивированных клеток и т.д. или посредством тестирования на животной модели, такой как мышь, крыса, собака или свинья, и такие способы тестирования хорошо известны специалистам в данной области техники.

В способе согласно настоящему изобретению термин "субъект" означает любое живое существо, предпочтительно животное, более предпочтительно млекопитающее и еще более предпочтительно человека. В контексте настоящего изобретения субъект может быть здоровым или подверженным такому нарушению, и в случае лечения рассматриваемого нарушения, субъект, как правило, означает субъект, у которого обнаружено нарушение или имеющий риск развития нарушения.

Кроме того, термин "лечение" включает все типы приемлемого с медицинской точки зрения профилактического и/или терапевтического вмешательства в целях излечения, временного ослабления, профилактики и т.д. нарушения. Например, когда нарушением является фиброз печени, термин "лечение" включает приемлемое с медицинской точки зрения вмешательство в различных целях, включая замедление или остановку развития фиброза, регрессию или исчезновение очагов, профилактику вспышки фиброза или профилактику повторного развития.

Настоящее изобретение также относится к способу доставки лекарственного средства в звездчатые клетки с применением носителя для лекарственного средства. Этот способ включает, но без ограничения к этому, стадию нанесения вещества, подлежащего доставке, на носитель для лекарственного средства, и стадию введения или добавления носителя для лекарственного средства, несущего вещество, подлежащее доставке, в живой организм или среду, содержащую звездчатые клетки, как например, культуральную среду. Эти стадии могут быть достигнуты подходящим способом в соответствии с известным способом, описанным в настоящем изобретении способом и т.д. Этот способ доставки может быть объединен с другим способом доставки, например, другим способом доставки, в котором орган, в котором присутствуют звездчатые клетки, является целевым и т.д.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть адаптированы для применения для профилактики или лечения фиброзных клеток (например, печени, почек, перитонеального и легких), признаков, состояний и/или нарушений, и/или любого другого признака, заболевания, нарушения или состояния, которое связано с или зависит от уровней hsp47 в клетке или ткани, сами по себе или в комбинации с другими терапиями. Молекула нуклеиновой кислоты может включать среду для доставки, включая липосомы, для введения субъекту, носители и разбавители и их соли, и/или может присутствовать в фармацевтически приемлемых композициях.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут включать последовательности, показанные в Таблице 3. Примерами таких молекул нуклеиновой кислоты по существу состоят из последовательностей, приведенных в Таблице 3.

Молекулы нуклеиновых кислот можно вводить с помощью введения в легкие, например, посредством вдыхания высушенной лекарственной формы в виде аэрозоля или спрея, вводимой с помощью устройства для ингаляции или распылителя, обеспечивающего быстрое местное поглощение молекул нуклеиновых кислот соответствующими тканями легких. Твердые дисперсные композиции, содержащие подходящие для вдыхания сухие частицы тонко измельченных композиций нуклеиновых кислот, можно изготовить посредством измельчения высушенных или лиофилизированных композиций нуклеиновых кислот и затем пропускания измельченных композиций, например, через сито с размером ячеек 400, чтобы разбить или отделить крупные агломераты. Твердая дисперсная композиция, содержащая композиции нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, может дополнительно содержать диспергатор, который служит для облегчения образования аэрозоля, а также другие терапевтические соединения. Приемлемым диспергатором является лактоза, которую можно смешивать с соединением нуклеиновой кислоты в любом приемлемом соотношении, например, соотношении 1 к 1 по массе.

Аэрозоли жидких частиц могут включать молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию и могут быть получены любыми приемлемыми способами, например, с помощью распылителя (смотрите, например, патент США №4,501,729). Распылители представляют собой коммерчески доступные устройства, которые превращают растворы или суспензии активного ингредиента в терапевтический аэрозоль, например, с помощью ускорения сжатого газа, обычно воздуха или кислорода, через узкие отверстия трубки Вентури или с помощью ультразвукового перемешивания. Приемлемые композиций для использования в распылителях включают активный ингредиент в жидком носителе в количестве до 40% масс/масс, предпочтительно меньше, чем 20% масс/масс, композиции. Обычно носитель представляет собой воду или разбавленный водно-спиртовой раствор, предпочтительно сделанный изотоничным жидкостям тела посредством добавления, например, хлорида натрия или других приемлемых солей. Возможные добавки включают консерванты, если лекарственная форма изготавливается нестерильной, например, метил гидроксибензоат, антиоксиданты, ароматизаторы, эфирные масла, буферные вещества и эмульгаторы и другие поверхностно активные вещества. Аэрозоли твердых частиц, включая активную композицию и поверхностно активное вещество, также можно изготовить с помощью любого твердодисперсного генератора аэрозолей. Генераторы аэрозолей для введения твердодисперсного лекарственного средства субъекту производят частицы, которые 20 можно вдыхать, как описано выше, и генерируют объем аэрозоля, содержащий предварительно измеренную дозу терапевтической композиции со скоростью, подходящей для введения человеку. Одни примером типа твердодисперсного генератора аэрозолей является инжектор. Приемлемые лекарственные формы для введения посредством вдувания включают тонко измельченные порошки, которые можно вводить с помощью инжектора. В инжекторе порошок, например, его измеренная доза, эффективная для осуществления лечения согласно настоящему описанию, заключена в капсулы или картриджи, обычно сделанные из желатина или пластика, которые прокалывают или открывают in situ, и порошок, доставляемый воздухом, выпускаемым из устройства при вдыхании или с помощью ручной помпы. Порошок, используемый в инжекторе, состоит только из активного ингредиента или из смеси порошков, содержащей активный ингредиент, приемлемый разбавитель порошка, такой как лактоза, и, возможно, поверхностно активное вещество. Активный ингредиент обычно содержит от 0,1 до 100 мас./мас. композиции. Второй тип примеров генераторов аэрозолей включает дозирующий ингалятор. Дозирующие ингаляторы представляют собой аэрозольные распылители под давлением, обычно содержащие суспензию или раствор активного ингредиента в сжиженном пропелленте. В процессе применения указанные устройства выбрасывают лекарственную форму через клапан для доставки измеренного объема для производства тонкодисперсного спрея, содержащего активный ингредиент. Приемлемые пропелленты включают некоторые соединения хлорфторуглеродов, например, дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан и их смеси. Дополнительно лекарственная форма может содержать один или несколько сорастворителей, например, этанол, эмульгаторов и других поверхностно активных веществ, таких как масляная кислота или сорбитан триолеат, антиоксидантов и приемлемых ароматизаторов. Другие способы для доставки в легкие описываются, например, в заявке на патент США №20040037780 и патентах США №6,592,904; 6,582,728; 6,565,885. В WO 2008/132723 относится к аэрозольной доставке олигонуклеотидов в общем и в частности siRNA в дыхательную систему.

Молекулы нуклеиновых кислот можно вводить в центральную нервную систему (ЦНС) или периферическую нервную систему (ПНС). Эксперименты показали эффективное поглощение in vivo нуклеиновых кислот нейронами. Смотрите, например, Sommer et al, 1998, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 8:75; Epa et al, 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10:469; Broaddus et al, 1998, J. Neurosurg., 88:734; Karle et al, 1997, Eur. J. Pharmocol., 340:153; Batumi et al, 1998, Brain Research, 784:304; Rajakumar et al, 1997, Synapse, 26:199; Wu-pong et al, 1999, BioPharm, 12:32; Bannai et al, 1998, Brain Res. Protoc, 3:83; и Simantov et al, 1996, Neuroscience, 74:39. Молекулы нуклеиновых кислот, таким образом, подходят для доставки и поглощения клетками в ЦНС и/или ПНС.

Доставка молекул нуклеиновых кислот в ЦНС обеспечивается большим количеством различных стратегий. Традиционные подходы к доставке в ЦНС, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются, интратекальное и интрацеребровентрикулярное введение, имплантацию катетеров и помп, непосредственную инъекцию или перфузию в место поражения или травмы, инъекцию в систему мозговых артерий или введение посредством химического или осмотического 30 открытия гематоэнцефалического барьера. Другие подходы могут включать использование различных транспортных систем и систем носителей, например, посредством использования конъюгатов и биодеградируемых полимеров. Более того, методы генной терапии, например, согласно описанию Kaplitt et al, патент США №6,180,613 и Davidson, WO 04/013280, могут быть использованы для экспрессии молекул нуклеиновых кислот в ЦНС.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут входить в композиции с или быть объединены с полиэтиленимином (например, линейный или разветвленный PEI) и/или производными полиэтиленимина, включая например, привитые PEI, такие как производные, как галактоза PEI, холестерин PEI, полученный из антител PEI, и полиэтиленгликоль PEI (ПЭГ-PEI) (смотрите, например, Ogris et al, 2001, ААРА PharmSci, 3, 1-11; Furgeson et al, 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847; Kunath et al, 2002, Pharm Res 19:810-17; Choi et al, 2001, Bull. Korean Chem. Soc, 22:46-52; Bettinger et al, 1999, Bioconjugate Chem., 10:558-561; Peterson et al, 2002, Bioconjugate Chem. 13:845-54; Erbacher et al, 1999, J Gene Med 1:1-18; Godbey et al, 1999., PNAS, 96:5177-81; Godbey et al, 1999, J Controlled Release, 60:149-60; Diebold et al, 1999, J Biol Chem, 274:19087-94; Thomas et al, 2002, PNAS, 99, 14640-45; и Sagara, U.S. Pat. No. 6,586,524).

Молекулы нуклеиновых кислот могут включать биоконъюгаты, например, конъюгат нуклеиновой кислоты, как описано в Vargeese et al, патент США №. 10/427,160; патент США №. 6,528,631; патент США №. 6,335,434; патент США №. 6,235,886; патент США №. 6,153,737; патент США №. 5,214,136; патент США №. 5,138,045.

Композиции, способы и наборы согласно настоящему описанию могут включать экспрессионный вектор, который включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, таким образом, что это способствует экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты. Способы введения молекул нуклеиновых кислот или одного или нескольких векторов, способных экспрессировать цепи dsRNA в среде клетки, будут зависеть от типа клетки и состава ее среды. Молекулу нуклеиновой кислоты или векторную конструкцию можно вводить непосредственно в клетку (т.е. внутриклеточно) или вводить внеклеточно в полость, интерстициальное пространство, в кровообращение организма, вводить перорально или можно вводить посредством погружения организма или клетки в раствор, содержащий dsRNA. Клетка предпочтительно представляет собой клетку млекопитающего, более предпочтительно клетку человека. Молекула нуклеиновой кислоты вектора экспрессии может включать смысловую область и антисмысловую область. Антисмысловая область может включать последовательность, комплементарную последовательности РНК или ДНК, кодирующей hsp47, и смысловая область может включать последовательность, комплементарную антисмысловой области. Молекула нуклеиновой кислоты может включать две отдельные цепи, имеющие комплементарные смысловую и антисмысловую области. Молекула нуклеиновой кислоты может включать одну цепь, имеющую комплементарные смысловую и антисмысловую области.

Молекулы нуклеиновых кислот, которые взаимодействуют с целевыми молекулами РНК и подавляют ген, кодирующий целевые молекулы РНК (например, целевые молекулы РНК, обозначаемые в настоящем описании номерами доступа Genbank), могут экспрессироваться из единиц транскрипции, вставленных в векторы ДНК или РНК. Ре-комбинантные векторы могут представлять собой ДНК плазмиды и вирусные векторы. Молекула нуклеиновой кислоты, экспрессирующая вирусные векторы, может быть сконструирована на основе, но без ограничения к этому, аденассоциированного вируса, ретровируса, аденовируса или альфавируса. Рекомбинантные векторы, способные к экспрессии молекул нуклеиновых кислот, могут быть доставлены согласно настоящему описанию и сохраняться в клетках-мишенях. В другом случае, можно использовать вирусные векторы, которые способствуют временной экспрессии молекул нуклеиновых кислот. Такие векторы при необходимости можно вводить повторно. После экспрессии молекулы нуклеиновых кислот связываются с и подавляют функцию или экспрессию гена посредством РНК интерференции (RNKi). Доставка молекулы нуклеиновой кислоты, экспрессирующей векторы, может быть системной, например, посредством внутривенного или внутримышечного введения, посредством введения в клетки-мишени эксплантированные из субъекта, с последующим обратным введением субъекту, или другими способами, которые позволяют вводить в желательную клетку-мишень.

Экспрессионные вектора могут включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, таким образом, это способствует экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты. Например, вектор может содержать последовательность (последовательности), кодирующие обе цепи молекулы нуклеиновой кислоты, которые включают дуплекс. Также вектор может содержать последовательность (последовательности), кодирующую одну молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной самой себе и, таким образом, образует молекулу нуклеиновой кислоты. Не ограничивающие примеры таких векторов экспрессии описаны в Paul et al, 2002, Nature Biotech 19, 505; Miyagishi et al, 2002, Nature Biotech 19, 497; Lee et al, 2002, Nature Biotech 19, 500; и Novina et al, 2002, Nature Med:10.1038/nm725. Экспрессионные вектора также могут быть включены в клетку млекопитающего (например, человека).

Экспрессионный вектор может включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую две или несколько молекул нуклеиновых кислот, которые могут быть одинаковыми или разными. Экспрессионные вектора могут включать последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, комплементарную молекуле нуклеиновой кислоты под номером доступа Genbank NM 001235, например, показанную в Таблице 2.

Экспрессионный вектор может кодировать одну или обе цепи дуплекса нуклеиновых кислот, или одну комплементарную себе самой цепь, которая гибридизуется сама с собой с образованием дуплекса нуклеиновой кислоты. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие молекулы нуклеиновых кислот, могут быть функционально соединены таким образом, который способствует экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты (смотрите, например, Paul et al, 2002, Nature Biotech, 19:505; Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotech 19:497; Lee et al, 2002, Nature Biotech 19:500; и Novina et al, 2002, Nature Med, 10.1038/nm725).

Экспрессионный вектор может включать одно или несколько из следующих: а) участок инициации транскрипции (например, участок инициации полимеразы I, II или III эукариот); Ь) участок терминации транскрипции (например, участок терминации полимеразы I, II или III эукариот); с) интрон и d) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, при этом указанная последовательность функционально связана с участком инициации и участком терминации таким образом, который способствует экспрессии и/или доставке молекулы нуклеиновой кислоты. Вектор может включать открытую рамку считывания (ORF) для белка, функционально соединенную с 5'- стороной или 3'-стороной последовательности, кодирующей молекулу нуклеиновой кислоты; и/или интрон (промежуточные последовательности).

Транскрипция последовательностей молекулы нуклеиновой кислоты может запускаться с промотора эукариотической РНК полимеразы I (pol I), РНК полимеразы (pol II) или РНК полимеразы III (pol III). Транскрипты промоторов pol II или pol III экспрессируются в клетке на высоком уровне; уровни данного промотора pol II в данном типе клеток зависит от природы регуляторных последовательностей гена (энхансеры, сайленсеры и т.п.), расположенных поблизости. Также используют промоторы прокариотиче-ской РНК полимеразы, если фермент прокариотической РНК полимеразы экспресси-рутся в соответствующих клетках (Elroye/ al, 1990, PNAS, 87:6743-47; Gao et al, 1993, Nucleic Acids Res 21:2867-72; Lieber et al, 1993, Methods Enzymol., 217:47-66; Zhou et al, 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4529-37). Несколько исследователей показали, что молекулы нуклеиновой кислоты, экспрессированные с таких промоторов, могут функционировать в клетках млекопитающих (например, Kashani-Sabet et al, 1992, Antisense Res. Dev., 2:3-15; Ojwang et al, 1992, PNAS 89:10802-06; Chen et al, 1992, Nucleic Acids Res., 20:4581-89; Yu et al, 1993, PNAS, 90:6340-44; L'Huillier et al, 1992, EMBO J., 11:4411-18; Lisziewicz et al, 1993, PNAS 90: 8000-04; Thompson et al, 1995, Nucleic Acids Res., 23:2259; Sullenger et al, 1993, Science, 262:1566). Более конкретно, единицы транскрипции, например, полученные от генов, кодирующих U6 малые ядерные (snRNK), транспортные РНК (tRNK) и аденовирусные VA RNK, являются полезными при получении высоких концентраций желаемых молекул РНК, таких как siNA, в клетках (Thompson et al, supra; Couture и Stinchcomb, 1996, supra; Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res. 22:2830; Noonberg et al., U.S. Pat. No. 5,624,803; Good et al., 1997, Gene Then, 4:45; Beigelman et al., международная публикация РСТ № WO 96/18736. Указанные выше транскрипты нуклеиновых кислот могут быть встроены в различные векторы для введения в клетки млекопитающих, включая, но не ограничиваясь ими, векторы плазмид ДНК, вирусные ДНК векторы (например, векторы на основе аденовируса или аденоассоциированного вируса) или вирусные РНК векторы (например, ретровирусные или альфавирусные векторы) (смотрите Couture and Stinchcomb, 1996, выше).

Молекула нуклеиновой кислоты может экспрессироваться в клетке с эукариотических промоторов (например Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry и Lindquist, 1986, PNAS 83, 399; Scanlon et al., 1991, PNAS 88:10591-95; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2:3-15; Dropulic et al, 1992, J. Virol., 66:1432-41; Weerasinghe et al, 1991, J. Virol., 65:5531-34; Ojwang et al, 1992, PNAS, 89:10802-06; Chen et al, 1992, Nucleic Acids Res., 20:4581-89; Sarver et al, 1990 Science, 247:1222-25; Thompson et al, 1995, Nucleic Acids Res., 23:2259; Good et al, 1997, Gene Therapy, 4:45). Специалистам в данной области техники будет понятно, что любая нуклеиновая кислота может экспрессироваться в эукариотической клетке с соответствующего ДНК/РНК вектора. Активность таких нуклеиновых кислоты может быть повышена при их высвобождении от первичного транскрипта с помощью ферментативной нуклеиновой кислоты (Draper et al, РСТ WO 93/23569, и Sullivan et al, РСТ WO 94/02595; Ohkawa et al, 1992, Nucleic Acids Symp.Ser., 27:15-6; Taira et al.,1991, Nucleic Acids Res., 19:5125-30; Ventura et al, 1993, Nucleic Acids Res., 21:3249-55; Chowrira et al, 1994, J. Biol. Chem., 269:25856.)

Вирусная конструкция, упакованная в вирусную частицу, будет осуществлять как эффективное внедрение конструкции экспрессии в клетку, так и транскрипцию конструкции dsRNA, кодируемой конструкцией экспрессии.

Способы перорального введения включают непосредственное смешивание РНК с пищей организма, а также методы генной инженерии, при которых виды, которые используют в качестве пищи, модифицированы методами инженерии для экспрессии РНК, затем вводят в организм, на который необходимо подействовать. Физические способы можно использовать для введения раствора молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Физические способы введения нуклеиновых кислот включают инъекцию раствора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, бомбардировку частицами, покрытыми молекулой нуклеиновой кислоты, выдерживание клетки или организма в растворе РНК или электропорацию мембран клеток в присутствии молекулы нуклеиновой кислоты.

Другие способы, известные в данной области техники, для введения нуклеиновых кислот в клетки могут быть использованы, такие как опосредованный липидами перенос носителей, опосредованный химически транспорт, например, фосфатом кальция и т.п. Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот можно вводить вместе с компонентами, которые выполняют одну или более из следующих действий: усиливают поглощение РНК клеткой, обеспечивают гибридизацию цепей дуплекса, стабилизируют гибридизованные цепи или иным образом усиливают подавление целевого гена.

Дозировки

Полезные дозы для введения и определенный способ введения будут различаться в зависимости от таких факторов, как тип клетки, или для использования in vivo, возраста, веса и определенного животного и части его тела, которую надо лечить, определенной нуклеиновой кислоты и использованного способа доставки, предполагаемого терапевтического или диагностического применения и формы лекарственной формы, например, суспензии, эмульсии, мицеллы или липосомы, что будет очевидно для специалистов в данной области техники. Обычно дозу вводят на более низких уровнях и увеличивают до тех пор, пока достигают желаемый эффект.

Если используют липиды для доставки нуклеиновой кислоты, количество липидного соединения, которое вводят, может варьировать и обычно зависит от количества нуклеиновой кислоты, которое вводят. Например, соотношение по массе липидного соединения к нуклеиновой кислоте составляет предпочтительно от около 1:1 до около 30:1, при этом соотношение по массе от около 5:1 до около 15:1 является более предпочтительным.

Приемлемые единицы дозирования молекул нуклеиновых кислот могут находится в пределах 0,001-0,25 миллиграмм на килограмм массы тела реципиента в сутки, или в пределах 0,01-20 микрограмм на килограмм массы тела в сутки или в пределах 0,01-10 микрограмм на килограмм массы тела в сутки или в пределах 0,10-5 микрограмм на килограмм массы тела в сутки или в пределах 0,1-2,5 микрограмм на килограмм массы тела в сутки.

Подходящие количества молекул нуклеиновых кислот можно вводить, и эти количества можно определить эмпирически с использованием стандартных методов. Эффективные концентрации отдельных типов нуклеиновых кислот в среде клетки могут оставлять около 1 фемтомолярную, около 50 фемтомолярную, 100 фемтомолярную, 1 пикомолярную, 1,5 пикомолярную, 2,5 пикомолярную, 5 пикомолярную, 10 пикомолярную, 25 пикомолярную, 50 пикомолярную, 100 15 пикомолярную, 500 пикомолярную, 1 наномолярную, 2,5 наномолярную, 5 наномолярную, 10 наномолярную, 25 наномолярную, 50 наномолярную, 100 наномолярную, 500 наномолярную, 1 микромолярную, 2,5 микромолярную, 5 микромолярную, 10 микромолярную, 100 микромолярную или больше.

Уровни доз порядка от около 0,1 мг до около 140 мг на кг массы тела в сутки являются полезными для лечения перечисленных выше состояний (от около 0,5 мг до около 7 г для субъекта в сутки). Количество активного ингредиента, который можно сочетать с носителем для получения единичной лекарственной формы, меняется в зависимости от хозяина, которого лечат, и конкретного способа введения. Единичные лекарственные формы обычно содержат от около 1 мг до около 500 мг активного ингредиента.

Понятно, что определенный уровень дозы для любого конкретного субъекта зависит от многих факторов, включая активность использованного определенного соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, питание, время введения, способ введения и скорость выведения, комбинацию лекарственного средства и тяжесть конкретного заболевания, которое лечат.

Фармацевтические композиции, которые включают молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию можно вводить один раз ежедневно, четыре раза в день, три раза в день, два раза в день, ежедневно или с любым интервалом и в течение любого времени, которое приемлемо с медицинской точки зрения. Тем не менее, терапевтический агент также можно включать в дозу в единицы дозирования, содержащие две, три, четыре, пять, шесть или более частей дозы, вводимых с соответствующими интервалами в течение дня. В таком случае молекулы нуклеиновых кислот, заключенные в каждой части дозы, могут быть соответственно меньше для того, чтобы обеспечить полную ежедневную единицу дозирования. Также единица дозирования может быть составлена для одной дозы в течение нескольких дней, например, с использованием традиционной лекарственной формы с замедленным высвобождением, которая обеспечивает замедленное и последовательное высвобождение dsRNA в течение нескольких дней. Лекарственные формы с замедленным высвобождением хорошо известны в данной области техники. Единица дозирования может содержать соответствующее кратное количество ежедневной дозы. Композиция может быть составлена таким образом, что сумма множественных единиц нуклеиновой кислоты вместе содержат достаточную дозу.

Фармацевтические композиции, наборы и контейнеры

Также обеспечиваются композиции, наборы, контейнеры и лекарственные формы, которые включают молекулу нуклеиновой кислоты (например, молекулу SiNA) согласно настоящему описанию для снижения экспрессии hsp47 для введения или распространения молекулы нуклеиновой кислоты субъекту. Набор может включать по меньшей мере один контейнер и по меньшей мере одну этикетку. Приемлемые контейнеры включают, например, бутылки, ампулы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть образованы из различных материалов, таких как стекло, металл или пластик. Контейнер может содержать аминокислотную последовательность (последовательности), малую молекулу (молекулы), последовательность (последовательности) нуклеиновой кислоты, популяцию (популяции) клеток и/или антитело (антитела). Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения контейнер содержит полинуклеотид для использования для изучения профиля экспрессии мРНК клетки вместе с реагентами, используемыми для этой цели. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения контейнер содержит антитело, его связывающий фрагмент или специфичный связывающий белок для применения для оценки экспрессии белка hsp47 в клетках и тканях или для соответствующих лабораторных, прогностических, диагностических, профилактических и терапевтических целей; показания и/или указания для таких применений могут быть включены на или вместе с таким контейнеров, как и реагенты и другие композиции или инструменты, используемые для таких целей. Набор также может включать ассоциированные показания и/или указания, реагенты и другие композиции или инструменты, используемые для таких целей, также могут быть включены

Альтернативно контейнер может содержать композицию, которая является эффективной для лечения, диагностики, прогнозирования или профилактики состояния, и может иметь порт для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет внутривенного раствора или ампулу, имеющую пробку, под дающуюся прокалыванию гиподермической иглой для инъекций). Активные агенты в композиции могут представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, способную к специфическому связыванию hsp47 и/или модуляции функции hsp47.

Набор дополнительно может включать второй контейнер, который содержит фармацевтически приемлемый буфер, например, фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и/или раствор декстрозы. Также он может включать другие материалы, желательные с коммерческой или потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, мешалки, шприцы и/или вкладыши с показаниями и/или инструкциями для применения.

Ампулы с единичной дозой или многодозовые контейнеры, в которых молекулы нуклеиновых кислот упакованы перед использованием, могут включать герметически запаянный контейнер, содержащий количество полинуклеотида или раствор, содержащий полинуклеотид, подходящий для его фармацевтически эффективной дозы или нескольких эффективных доз. Полинуклеотид упакован в виде стерильной лекарственной формы, и герметически запаянный контейнер разработан для сохранения стерильности лекарственной формы до применения.

Контейнер, в котором находится полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, может включать упаковку, которая имеет этикетку, и этикетка может нести уведомление в форме, предписанной государственным органом, например, Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов, которое отражает одобрение органом в рамках федерального закона изготовления, применения или распространения материала полинуклеотида для применения для человека.

Федеральные законы требуют, чтобы применение фармацевтических композиций для лечения людей было одобрено агентством Федерального правительства. В Соединенных Штатах контроль осуществляется Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов, которое выпускает соответствующие нормативные акты для гарантии такого одобрения, подробно описанные в 21 U.S.C. § 301-392. Нормативные акты для биологического материала, включая продукты, изготовленные из тканей животных, обеспечиваются 42 U.S.С. § 262. Аналогичное одобрение необходимо в большинстве зарубежных стран. Нормативные акты различаются в странах, но отдельные процедуры хорошо известны специалистам в данной области, и композиции и способы согласно настоящему описанию предпочтительно соответствуют им.

Доза для введения в большой степени зависит от состояния и размера субъекта, которого необходимо лечить, а также от частоты лечения и способа введения. Схемы для продолжения терапии, включая дозу и частоту, можно установить по начальному ответу и клинической оценке. Парентеральный путь введения в интерстициальное пространство ткани является предпочтительным, но также другие парентеральные способы введения, например, вдыхание аэрозольной лекарственной формы, могут потребоваться для конкретного введения, например, на слизистые оболочки носа, горла, ткани бронхов или легкие.

Поэтому согласно настоящему описанию обеспечивается фармацевтический продукт, который может включать полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, в растворе в фармацевтически приемлемом инъекционном носителе и подходящий для введения интерстициально в ткань для того, чтобы клетки ткани экспрессировали элемент клеточного иммунного ответа, контейнер содержит раствор и уведомление вместе с контейнером в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим изготовление, применение или распространение лекарственных средств, которое отражает одобрение органом изготовления, применения или распространения раствора полинуклеотида для применения для человека.

Показания

Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию можно использовать для лечения заболеваний, состояний или нарушений, ассоциированных с hsp47, таких как фиброз печени, цирроз, фиброз легких, фиброз почек, перитонеальный фиброз, хроническое поражение печени и фибриллогенез, и любого другого заболевания или состояния, которые связаны или отвечают на уровни hsp47 в клетке или ткани, по отдельности или в комбинации с другими способами лечения. По этой причине композиции, наборы и методы согласно настоящему описанию могут включать упаковку молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию, которая включает этикету или аннотацию. Этикета может включать показания к применению молекул нуклеиновых кислот, например, для лечения или предотвращения фиброза печени, перитонеального фиброза, фиброза почек и фиброза легких и любого другого заболевания или состояний, которые связаны или ответят на уровни hsp47 в клетке или ткани, по отдельности или в комбинации с другими способами лечения. Этикетка может включать показание к применению для снижения экспрессии hsp47. «Аннотация» обозначает инструкции, обычно вложенные в коммерческие упаковки лекарственных продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях, других терапевтических средствах, которые можно сочетать с упакованным продуктом, и/или предупреждения, касающиеся применения таких 20 терапевтических продуктов и т.д.

Специалистам в данной области техники будет ясно, что другие способы лечения фиброза, лекарственные средства и способы лечения, известные в данной области техники можно с легкостью сочетать с молекулами нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию (например, молекулами siNA), и, таким образом, это также предусматривается настоящим изобретением.

Способы и композиции согласно настоящему изобретению будут описаны более подробно с помощью следующих не ограничивающих примеров.

Пример 1. Получение siRNA для gp46

Серди оптимальных последовательностей для распознавания siRNA при нацеливании основной последовательности HSP47, которая является общим молекулярным шаперо-ном для коллагенов (типы I-IV), Последовательности А и В были предпочтительными согласно программе siRNA oligo design от iGENE Therapeutics, Inc. Последовательность С получили посредством поиска по интернету с применением siRNA Target Finder от Ambion, Inc. и выбора 19 основных последовательностей, которые являются целевыми для gp46 крысы (гомолог HSP47 человека, GenBank Accession No. М69246). При осуществлении конструирования начали с 75-100 оснований в 5'-3' направлении от инициирующего кодона, располагая первый АА димер, и убеждаясь, что содержание GC составляет от 30% до 70%. В этом примере были получены siRNA. Имеющие последовательности, приведенные ниже.

Пример 2. Ингибирование экспрессии gp46 посредством полученной siRNA

Нормальные клетки почек крысы (NRK клетки), которые несли крысиный gp46 и представляли собой фибробласты, продуцирующие коллаген, трансфектировали с 0.1 нМ - 50 нМ siRNA и культивировали в течение 12-48 часов (Фиг. 1). Количество экспрессии gp46 проверили способом вестерн-блоттинга (Фиг. 2-4, верхняя линия соответствует gp46, нижняя линия соответствует актиновому контролю). Все siRNA заметно ингибировали экспрессию белка gp46 по сравнению со средой (Фиг. 2). В приведенном ниже эксперименте применялась siRNA последовательность А, которая показала самый сильный эффект. Ингибирование посредством siRNA зависело от концентрации (Фиг. 3); экспрессия белка посредством gp46 составляла около 90% при ингибировании посредством 50 нМ siRNA за 48 часов (Фиг. 4).

Пример 3. Ингибирование синтеза коллагена полученной siRNA

Для того, чтобы проанализировать количество синтезированного коллагена, ³Н-пролин добавили к супернатанту культуры фибробластов крысы (NRK крысы) при вышеуказанных условиях (siRNA концентрация 50 нм, время 48 часов), и после трансфекции количества ³Н определили секретированный белок (Фиг. 5). Количество секретированного коллагена вычислили по отношению секретированного белка в супернатанте к белку, расщепленному коллагеназой при культивировании gp46siRNA-трансфектиорванных фибробласт в присутствии ³Н-пролина в соответствии с Peterkofsky etal, 1971 Biochemistry 10:988-94.

Отношение синтеза коллагена = коллагеназа - чувствительная фракция ×100 (5.4 × коллагеназа - чувствительная фракция + коллагеназа - чувствительная фракция)

Отношение синтеза коллагена в фибробластах крыс уменьшилось на около 40% по сравнению с контрольной группой (Фиг. 6).

Пример 4. Специфическая трансфекция нуклеиновой кислоты в HSC

Эмульсия (VA-Lip-GFP) была получена посредством смешивания GFP экспрессионной плазмиды и липосома-инкапсулированного VA, образованного смешиванием 10% витамина A (VA) и липосомы. Катионные липосомы, содержащие O,O'-дитетрадеканолил-N-(α-триметиламмониоацетил) диэтаноламин хлорид (DC-6-14) в качестве катионного липида, холестерин и диолеоилфосфатидилэтаноламин при мольном отношении 4:3:3, растворили в смеси хлороформа и метанола (4:1, об.:об.), и растворитель удалили посредством выпаривания в вакууме. Липиды смешали с 9% водным раствором сахарозы и гидрагировали при 60°С. и гомогенизировали до однородности. Дисперсию дважды экструдировали через поливинилидендифторидную мембрану фильтра с размером пор 0.22 мкм. Аликвотны дисперсии перенесли в стеклянные сосуды и заморозили и затем лиофилизировали. Высушенные липосомы повторно разбавили дистиллированной водой при концентрации 1 мМ DC-6-14 при встряхивании перед применением. В частности, 25 мг витамина А сначала растворили в 87 мкл DMSO с получением, таким образом, 100 мМ сток-раствора. Для получения липосом с VA, 200 нмоль VA, растворенного в DMSO, смешали с 100 нмоль DC-6-14 при встряхивании при комнатной температуре. VA-siRNA-липосомы интрапортально вводили крысе, ткань печени собирали и фиксировали. Эмульсия была получена при предположении, что количество плазмы для 200 г крысы составляет около 10 мл, и устанавливая концентрации VA и GFP в портальной крови при 10 мкмМ. 1 мкл этого сток-раствора смешали с 10 мкл VA-липосом и 179 мкл PBS, и затем добавили 10 мкг GFP экспрессионной плазмиды с получением в общем 200 мкл, и смесь встряхивали в течение 3 минут с получением VA-Lip-GFP. Вскрыли брюхо SD крысы, и VA-Lip-GFP медленно ввели посредством инъекции в периферическую воротную вену. Через сорок восемь часов после инъекции взяли ткань печени. Так как по сравнению с клетками печени десмин промежуточных микрофиламентов специфически экспрессировался в HSC, при фиксировании ткань печени окрашивалась Alexa Fluor 568-меченными антителами к десмину, и исследовали флуоресцентное изображение двойной точности с GFP, это подтвердило, что GFP экспрессировался в HSC (Фиг. 7). Для необработанных контролей и группы, которой вводился один GFP экспрессионный плазмидный вектор, экспрессия в HSC крыс не наблюдалась, но в группе, которой VA-Lip-GFP вводилась, экспрессия GFP наблюдалась специфически в звездчатых клетках.

Пример 5. Количественный анализ скорости трансфекции нуклеиновой кислоты

Тем же образом, что и в Примере 4, за исключением того, что FITC-меченная gp46siRNA применялась вместо GFP экспрессионной плазмиды, эмульсию (VA-Lip-gp46siRNA (FITC)), содержащую VA-инкапсулирующую липосому и FITC-меченную gp46siRNA получили. Раствор siRNAgp46 (580 пмоль/ мкл в дистиллированной воде) добавили к раствору липосомы с VA согласно Примеру 4 при перемешивании при комнатной температуре. Отношение siRNA к DC-6-14 составляло 1:11.5 (моль/моль), и отношение siRNA к липосоме (масс/масс.) составляло 1:1. Свободный VA или siRNA были удалены посредством микропарации с применением VIVASPIN концентратора, 30К MWCO, за три подхода. Материал, захваченный мембраной, повторно растворили в PBS и интрапортально ввели SD крысы (10 мкг количества siRNA/200 мкл). Через сорок восемь часов после введения собрали ткань печени, aSMA (актин гладкой мышцы), который, при сравнении с другими клетками печени, специфически экспрессировался в HSC, окрасили с помощью Alexa Fluor 568-меченных анти-aSMA антител, клеточные ядра окрасили с помощью DAPI, и флуоресцентное изображение исследовали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (LSM). Как показано слева на Фиг. 8, наблюдалось, что в группе, которой вводилась VA-Lip-gp46siRNA (FITC) большое число клеток испускает как зеленую флуоресценцию благодаря FITC, так и красную флуоресценцию благодаря Alexa Fluor 568, и количественный анализ проводили посредством NIH Image (число клеток, посчитанных посредством выбора любых 10 областей XI ООО фотографии флуоресцентного микроскопа), эффективность трансфекции составила 77.6% (среднее для 10 областей). С другой стороны, в группе, которой вводилась Lip-gp46siRNA (FITC) без содержания VA, эффективность трансфекции имела низкое значение, равное 14.0%, и, более того, трансфекция в клетки, отличные от звездчатых клеток, наблюдалась при 3.0% (правая сторона на Фиг. 8). Из приведенных выше результатов было обнаружено, что эффективность трансфекции в звездчатые клетки заметно увеличивается при включении VA.

Пример 6. Ингибирование экспрессии gp46 посредством VA-Lip-gp46siRNA

В отношении другой части ткани, собранной в Примере 5, gp46 окрашивали Alexa Fluor 568-меченными анти-Н8Р47 антителами, и клеточные ядра окрашивали с помощью DAPI, и флуоресцентное изображение исследовали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Как показано на Фиг. 9, наблюдалось, что в группе, которой вводилась VA-Lip-gp46siRNA, экспрессия gp46, которая наблюдалась как красная флуоресценция (правая сторона на рисунке), заметно уменьшалась по сравнению с контрольной группой, которой вводилась VA-Lip-случайная siRNA, содержащая случайную siRNA, которая не специфична для gp46 (левая сторона на рисунке). Скорость ингибирования экспрессии относительно средней для 6 областей контрольной группы составляла 75%, что чрезвычайно высоко, когда число gp46-отрицательных клеток исследовали посредством выбора любых десяти областей X1000 фотографии флуоресцентного микроскопа с применением NIH Image тем же образом, что и в Примере 7.

Пример 7. Обработка LC крысы (интрапортальное введение 1)

Согласно сообщению Jezequel et al (Jezequel et al, 1987, J Hepatol. 5:174-81), LC крысиная модель была получена с применением диметилнитрозамина (DMN) (Фиг. 10). В частности, 1 мл/кг дозы 1% DMN (интраперитонеальное введение) вводилось SD крысе в возрасти пяти недель (мужская особь), три световых дня в неделю. Как уже сообщалось, увеличение в волокне наблюдалось со второй недели, и на четвертую неделю наблюдалось наблюдение заметного фиброза, разрушение печеночной дольковой структуры, и наблюдалось образование регенеративных узелков (Фиг. 11). Затем, тем же образом, что и в Примерах 4 и 5, эмульсию (VA-Lip-gp46siRNA) получали посредством приготовления gp46siRNA в виде липосомы и смешивания с 10% VA, и вводили. Введение VA-Lip-gp46siRNA начиналось с третьей недели, во время которой наблюдался существенный фиброз, и оценку осуществляли на четвертой и пятой неделях. Так как Примером 2 подтверждено, что эффекты наблюдались в течение до 48 часов in vitro, введение осуществлялось дважды в неделю (Фиг. 11).Вводимое количество определялось согласно отчету, в котором siRNA инъецируется непосредственно (McCaffery et al, 2002, Nature 418: 38-39), и 40 мкг составляло общее количество siRNA. На основании азанового окрашивания печени после введения siRNA, на четвертой недели наблюдалась заметная разница между группой, которой вводился соляной раствор, группой, которой вводилась siRNA (случайная), и группой, которой вводилась siRNA (gp46), но на пятую неделю наблюдалось уменьшение количества волокна у группы, которой вводили gp46siRNA (Фиг. 12). Для того чтобы количественно проанализировать количество волокна, неокрашенную часть извлекли с применением NIH Image, ее область измерили (Фиг. 13), и значительное уменьшение площади коллагена наблюдалось для группы, которой вводили gp46siRNA (Фиг. 14). Кроме того, для того, чтобы оценить степень фиброза с применением другого измерения, количество гидроксипролина, который является показателем фиброза, количественно измеряли стандартным способом. В частности, после того, как 20 мг замороженной-высушенной ткани печени гидролизовали с помощью НС1 в течение 24 часов, реакционную жидкость центрифугировали, и супернатант обработали реагентом, таким как раствор Эрлиха, и центрифугировали. Супернатант восстановили, и измерили количество гидроксипролина в ткани печени посредством измерения поглощения при 560 нм (Hepatology 1998, 28:1247-52). Как показано на Фиг. 15, в группе, которой вводилась gp46siRNA, количество гидроксипролина стало очень маленьким.

Пример 8. Обработка LC крысы (интрапортальное введение 2)

Кроме того, для того, чтобы исследовать изменение коэффициента выживаемости при введении лекарственного средства согласно настоящему изобретению, согласно способу Qi Ζ et al (PNAS 1999; 96:2345-49), LC крысиную модель получили с применением DMN в количестве, которое на 20% выше нормального количества. В этой модели, все четыре интрапортальных введения осуществлялись на первой и второй неделях. Детали введения: PBS, Lip-gp46siRNA, VA-Lip-случайная siRNA, и VA-Lip-gp46siRNA (n=7 для каждой группы). После третьей недели все контроли (группа, которой вводился PBS, группа, которой вводилась VA-Lip-случайная siRNA, и группа, которой вводилась Lip-gp46siRNA) умерли, но 6 из 7 выживали для группы. Которой вводилась VA-Lip-gp46siRNA (Фиг. 16). Кроме того, при азановом окрашивании печени на 21-ый день, наблюдалось очевидное уменьшение количества волокна для группы, которой вводилась gp46siRNA (Фиг. 17).

Пример 9. Обработка LC крысы (интрапортальное введение 3)

В другом эксперименте интрапортальное введение осуществлялось на третьей недели LC крысиных моделей (1% DMN 1 мг/кг, интраперитонеальное введение 3 раза в неделю), полученной в соответствии со способом по Qi et al. и способом по Ueki et ah, 1999, Nat Med. 5:226-30, как показано в Таблице 2, приведенной ниже (n=6 для каждой группы). PBS добавляли к каждому веществу, которое вводилось, так чтобы получить общий объем 200 мкл, и частота введения составляла 1 раз в неделю.

В результате, в группах, отличных от группы, которой вводили лекарственное средство согласно настоящему изобретению (обрабатываемые группы 9-4), все 6 крыс умирали на 45-ый день после введения DMN, но в группе, которой вводили лекарственное средство согласно настоящему изобретению, все особи за исключением одного, который умер на 36-ой день, проживали более 70 дней после введения DMN (Фиг. 18). Для мертвых особей количество гепатического волокна было количественно проанализировано на основе площади коллагена таким же образом, как в Примере 7, и увеличение количества гепатического волокна заметно ингибировалось посредством введения VA-Lip-gp46siRNA (Фиг. 19).

Пример 10. Обработка LC крысы (внутривенное введение)

Внутривенное введение осуществлялось с третьей недели LC крысиным моделям (1% DMN 1 мкг/BW (г) интраперитонеальное введение 3 раза в неделю), полученным таким же образом, как в Примере 9, как показано в приведенной ниже таблице (п=6 для каждой группы). PBS добавляли к каждому вводимо веществу, так чтобы достичь общего объема 200 мкл. Период введения, за исключением случаев смерти, достигал доходил до седьмой недели для группы 10-4 и шестой недели для группы 10-10.

В результате, в группах, отличных от групп, которым вводилось лекарственное средство согласно изобретению (обрабатываемые группы 10-4 и 10-10), все 6 крыс умирали на 45-ый день после на чала введения DMN, но в группах, которым вводили лекарственное средство согласно настоящему изобретению, все особи за исключением двух, которые умерли на 45-ый день в обрабатываемой группе 10-4, проживали более 70 дней после начала введения DMN (Фиг. 20 и 21). Для мертвых особей количество гепатического волокна было количественно проанализировано на основе площади коллагена таким же образом, как в Примере 7, и увеличение количества гепатического волокна заметно ингибировалось посредством введения VA-Lip-gp46siRNA (Фиг. 22).

Вышеприведенные результаты показали, что лекарственное средство согласно настоящему изобретению чрезвычайно эффективно для профилактики и лечения фиброза, в котором участвуют звездчатые клетки.

Пример 11. Улучшение результатов посредством RBP (ретинол-связывающий белок)

Влияние RBP на эффективность трансфекции VA-Lip-gp46siRNA проанализировали с применением LI90, клеточной линии, полученной из HSC человека. 100 нМ VA-Lip-gp46siRNA (FITC), полученной в Примере 5, вместе с различными концентрациями (то есть 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, или 10%) FBS (фетальная бычья сыворотка), добавили к LI90 в ходе культивирования и инкубировали в течение 48 часов, флуоресцентное изображение получили посредством LSM, и количество siRNA, включенной в отдельные клетки, количественно проанализировали посредством FACS. FBS содержала около 0.7 мг/дл RBP. Как показано на Фиг. 23, FBS (RBP) показала зависимое от концентрации увеличение количества трансфекции siRNA. Затем 100 нМ VA-Lip-gp46siRNA (FITC) и 4% FBS, вместе с 10 мкг (21.476 нмоль) анти-RBP антител, добавили к LI90 в ходе культивирования, и эффективность трансфекции siRNA оценили таким же образом. Как показано на Фиг. 24, увеличение количества трансфекции посредством RBP заметно уменьшилось посредством добавления анти-RBP антитела. Вышеупомянутые результаты показали, что RBP эффективен для дальнейшего усиления трансфекции лекарственного средства согласно настоящему изобретению.

Пример 12. Селекция последовательностей молекул нуклеиновой кислоты hsp47

Молекулы нуклеиновой кислоты (например, siNA ≤25 нуклеотидов) против Hsp47 были разработаны с применением нескольких компьютерных программ, включая siRNA при Whitehead Institute for Biomedical Research, siRNA Design (Integrated DNA Technologies), BLOCK-iT RNAi Designer (Invitrogen), siDESIGN Center (Dharmacon), и BIOPREDsi (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research). Последовательности вышеуказанных siRNA из этих программ сравнили и выбрали (смотрите Таблицу 3) на основе алгоритмов, как например гомология последовательностей между человеком и крысой. Кандидатные последовательности были оценены посредством in vitro подавляющего анализа.

Несколько параметров были рассмотрены для выбора последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (например, 21-мерная siRNA). Примерные параметры включают:

- Термодинамическую стабильность (RISC способствует нити с меньшей стабильностью 5'-конца)

- 30-52% GC содержание

- Предпочтительное расположение нуклеотидов:

где N представляет собой любой нуклеотид

- отсутствие предполагаемых иммуностимулирующих мотивов

- 2-нуклеотид 3' липкого конца

- положение siRNA внутри транскрипта (предпочтительно внутри области кДНК)

- специфичность последовательности (проверено с применением BLAST)

- вариации в одном нуклеотиде посредством проверки базы данных SNP

iRNA последовательности, имеющие ≤25 нуклеотидов, были сконструированы в соответствии с вышеизложенными способами. Соответствующая siRNA субстрата для дайсера (например, ≥26 нуклеотидов) были сконструированы на основе подобных последовательностей и расширяла целевой сайт siNA ≤25 нуклеотидов путем добавления четырех оснований 3'-концу смысловой нити и 6 оснований к 5'-концу антисмысловой нити. Субстраты для дайсера, которые обычно получают, имеют 25 оснований смысловой нити и 27 оснований антисмысловой нити с ассиметричными тупыми концами и 3'-липким концом. Последовательности смысловой и антисмысловой нити без модификации оснований (основная последовательность) и с модификациями (экспериментальная последовательность) приведены в Таблице 3.

Пример 13

Для скрининга сильных из различных молекул siNA против генов hsp47 крысы и человека получали разнообразные репортерные клеточные линии посредством введения кДНК HSP47 человека, меченую зеленым флуоресцентным белком (GFP) или конструкции кДНК GP46 крысы с GFP в клеточную линию 293, НТ1080, линию HSC человека hTERT или линию NRK. Затем в указанных клеточных линиях определяли siRNA против GFP. Измеряли сигнал остаточной флуоресценции и нормировали его относительно случайной siRNA (Ambion) и затем нормировали по жизнеспособности клеток. Результаты показали, что siRNA против GFP подавляет флуоресценцию в различной степени в разных клеточных линиях (Фиг. 25). Клеточные линии 293_HSP47- GFP и 293_GP46-GFP выбирали с помощью скрининга siHsp47 по причине легкости их трансфекции и чувствительности к подавлению флуоресценции.

Клетки трансфицировали 1,5 пмоль на лунку siNA против GFP в 96-луночных 15 планшетах для культур клеток с использованием Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) методом обратной трансфекции. Клетки высеивали в плотности 6,000 клеток на лунку и смешивали с комплексами siNA. Флуоресценцию считывали через 72 часа инкубации на ридере микропланшетов Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek).

Определяли жизнеспособность клеток, обработанных или не обработанных siHK, через 72 часа инкубации с использованием набора CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit в соответствии с инструкцией (Promega). Результаты считывания нормировали относительно образцов, обработанных случайными молекулами siNA.

Пример 14. Оценка эффективности подавления siHsp47 экспрессии hsp47 в репортерных клеточных линиях

Оценивали эффективность подавления siHK hsp47 в клеточных линиях 293_HSP47-GFP и 293_GP46-GFP посредством регистрации изменений сигнала флуоресценции репортерного GFP. Эксперименты проводили согласно описанию в Примере 2. Сигналы флуоресценции нормировали относительно сигналов флуоресценции от клеток, обработанных случайными siRNA (Ambion), которые служили контролем. Результаты показали, что исследованные молекулы siNA hsp47 были эффективными в отношении подавления мРНК hsp47 в обеих клеточных линиях. Однако siNA против GP46 мРНК (согласно публикации 2008 Sato et al) была эффективна только в отношении клеточной линии 293_GP46-GFP. Результаты показаны на Фиг. 26А и 26 В.

Определяли жизнеспособность клеточных линий 293_HSP47-GFP и 293_GP46-GFP, обработанных siNA против hsp47 и gp46, с использованием способов, описанных в Примере 2. Жизнеспособность клеток нормировали относительно клеток, обработанных случайными siRNA (Ambion). Результаты показали, что обработка молекулами siHK не оказывала существенного действия на жизнеспособность клеток. Тем не менее, жизнеспособность клеток клеточной линии 293 HSP47-GFP, обработанных различными молекулами siNA hsp47, различалась в зависимости от использованных молекул siNA тогда как жизнеспособность клеточных линий 293_GP46-GFP была похожа. Жизнеспособность клеток 293_HSP47-GFP была ниже у клеток, обработанных siHsp47-6 и Hsp47-7, чем у остальных клеток. Результаты показаны на Фиг. 26С и 26D.

Пример 15. Оценка подавляющего действия siHsp47 на мРНК hsp47 методом количественной ПЦР TaqMan®

В Примере 14 эффективность подавления siHsp47s в репортерных клеточных линиях оценивали по изменению сигнала флуоресценции. Для того, чтобы обосновать результат уровня мРНК, siRNA, направленные на эндогенный hsp47, тарифицировали стволовые клетки человека линии hTERT с использованием Lipofectamine RNAi MAX (Invi-trogen) методом обратной трансфекции согласно описанию в Примере 13.

Уровень мРНК hsp47 оценивали по эффективности подавления различных исследованных молекул siNA siHsp47. Вкратце, мРНК выделяли из клеток hTERT через 72 часа после трансфекции с использованием мининабора RNeasy (Qiagen). Уровень мРНК hsp47 определяли методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией с использованием зондов TaqMan®. Вкратце, синтез кДНК проводили с использованием набора High-Capacity cDNA Reverse Transcription (ABI) согласно инструкции производителя, и проводили ее анализ методом TaqMan Gene Expression Assay (ABI, hsp47 анализ ID Hs01060395_gl). Уровень мРНК hsp47 нормировали относительно уровня мРНК GAPDH согласно инструкции производителя (ABI). Результаты показали, что siHsp47-С была наиболее эффективной среди всех siRNA hsp47, siHsp47-2 и siHsp47-2d находились на втором месте по эффективности. Комбинации siHsp47-l с siHsp47-2 или siHsp47-l с siHsp47-2d были более эффективны, чем siHsp47-l по отдельности. Результаты показаны на Фиг. 27.

Пример 16. Подтверждение действия подавления siHsp47 на уровне белка

Подавляющее действие различных молекул siNA Hsp47 (siHsp47) на экспрессию мРНК hsp47 подтверждали на уровне белка с помощью измерения HSP47 в клетках hTERT, трансфицированных различными siHsp47. Трансфекцию клеток hTERT различными siHsp47 осуществляли согласно описанию в Примере 13. Трансфицированные клетки hTERT лизировали и лизаты клеток осаждали центрифугированием. Белки в очищенном лизате клеток разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле SDS. Уровень белка HSP47 в лизате клеток определяли с использованием антитела к HSP47 (Assay Designs) в качестве первичного антитела, антитела козы против IgG мыши, конъюгированных с HRP (Millipore) в качестве вторичного антитела с последующей 15 детекцией с использованием набора Supersignal West Pico Chemiluminescence (Pierce). Антитело к антину (Abeam) использовали в качестве контроля загрузки белка. Результаты показали значительное снижение уровня белка Hsp47 в клетках, обработанных siHsp47-C, siHsp47-2d, по отдельности или комбинацией siHsp47-l с siHsp47-2d.

Пример 17. Подавление экспрессии коллагена I siRNA hsp47

Для определения влияния siHsp47 на уровень экспрессии коллагена I определяли уровень мРНК коллагена I в клетках hTERT, обработанных различными siRNA против hsp47. Вкратце, клетки hTERT трансфицировали различными siHsp47 согласно описанию в Примере 13. Клетки лизировали через 72 часа и выделяли мРНК с использованием мининабора RNeasy согласно инструкции (Qiagen). Уровень мРНК коллагена I определяли методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией с использованием зондов TaqMan®. Вкратце, синтез кДНК проводили с использованием набора High-Capacity cDNA Reverse Transcription (ABI) согласно инструкции и проводили ее анализ методом TaqMan Gene Expression Assay (ABI, COL1A1 ID набора 30 Hs01076780_gl). Уровень мРНК коллагена I нормировали относительно уровня мРНК GAPDH согласно инструкции производителя (ABI). Сигналы нормировали относительно сигнала, полученного от клеток, трансфицированных случайными siNA Результаты показали, что уровень мРНК коллагена I значительно снижен в клетках, обработанных некоторыми кандидатными siHsp47-2, siHsp47-2d и их комбинациями с siHsp47-l, как показано на Фиг. 28.

Пример 18. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток hTERT, обработанных siRNA hsp47

Для визуализации экспрессии двух маркеров фиброза - коллагена I и альфа- актина гладких мышц (SMA) - в клетках hTERT, трансфицированных или не трансфицированных siHsp47, клетки окрашивали антителом кролика против коллагена I (Abeam) и мышиным антителом против альфа-SMA (Sigma). Антитела козы Alexa Fluor 594 против IgG мыши и антитела козы Alexa Fluor 488 против IgG кролика (Invitrogen (Molecular Probes)) использовали в качестве вторичных антител для визуализации коллагена I (зеленый) и альфа-SMA (красный). Hoescht использовали для визуализации ядра (голубой). Результаты показали наличие корреляции между подавлением siRNA некоторых генов-мишеней и экспрессией коллагена/SMA.

Пример 19. Исследование SÍHSP47 in vivo на животных моделях фиброза печени

Дуплексная последовательность siRNA для HSP47 (siHSP47C) перечислены ниже.

Маточный раствор siRNA 10 мг/мл готовили посредством, растворяя в воде, не содержащей нуклеаз (Ambion). Для лечения крыс с циррозом готовили лекарственную форму siRNA с липосомой, соединенной с витамином А, согласно описанию в публикации Sato et al (Sato Y. et al. Nature Biotech. 26:431) для того, чтобы воздействовать на активированные звездчатые клетки печени, которые продуцируют коллаген. Композиция витамин A (VA)-липосома-siRNA состояла из 0,33 мкМ/мл VA, 0,33 мкМ/мл липосомы (Coatsome EL-01-D, NOF Corporation) и 0,5 мкг/мкл siRNA в 5% растворе глюкозы. Цирроз печени у 4-недельных самцов мышей SD вызывали 0,5% диметилнитрозамином (DMN) (Wako Chemicals, Japan) в фосфатном буфере (PBS). Дозу 2 мл/кг массы тела вводили интраперитонеально в течение 3 последовательных дней в неделю на 0, 2, 4, 7, 9, 11,14, 16, 18,21,23,25,28, 30, 32, 34, 36, 38 и 40 сутки.

Обработка siRNA: Обработку siRNA проводили, начиная с 32 дня и в течение 5 внутривенных инъекций. Более подробно, крыс обрабатывали siRNA на 32, 34, 36, 38 и 40 сутки. Затем крыс забивали на 42 или 43 сутки. Исследовали 3 различных дозы siRNA (1,5 мг siRNA на кг массы тела, 2,25 мг siRNA на кг массы тела, 3,0 мг siRNA на кг массы тела).

Подробное описание групп исследования и количество животных в каждой группе представлено ниже:

1) Цирроз вызывали инъекцией DMN, затем вводили 5% глюкозу вместо siRNA) (n=10)

2) VA-Lip-siHSP47C 1.5 мг/кг (n=10)

3) VA-Lip-siHSP47C 2.25 мг/кг (n=10)

4) VA-Lip-siHSP47C 3.0 мг/кг (n=10)

5) Ложно обработанные животные (вместо DMN вводили PBS. 5% глюкозу вводили вместо siRNA) (n=6)

6) Контроль без обработки (интактный) (n=6)

VA-Lip обозначает комплекс витамин А - липосома.

Оценка терапевтической эффективности: На 43 день 2 из 10 животных в группе «заболевшие крысы» и 1 из 10 животных в группе «VA-Lip-siHSP47C siRNA 1,5 мг/кг» умерли из-за развития цирроза печени. Оставшиеся животные выжили. После того, как животных забили, ткани печени фиксировали в 10% формалине. Затем левую долю каждой печени заключали в парафин для гистологического исследования. Срезы ткани окрашивали Сириус красным и гематоксилином и эозином (ГЭ). Окрашивание Сириус красным использовали для визуализации отложений коллагена для определения степени цирроза. Окрашивание ГЭ использовали для контрастной окраски ядер и цитоплазмы. Каждое стекло рассматривали под микроскопом (BZ-8000, Keyence Corp. Japan) определяли и процент площади на срезе, окрашенной Сириус красным, с помощью программного обеспечения анализа изображений, прилагаемого к микроскопу. Из каждой печени приготовили по меньшей мере 4 стекла для анализа изображений, и всю площадь каждого стекла (среза печени) фотографировали камерой и анализировали. Статистическую обработку проводили методом t-критерия Стьюдента.

Результаты: На Фигуре 29 показаны области фиброза. Площадь фиброза в группе «заболевших крыс» была больше, чем в «ложно обработанных» или «не обработанных» группах. Таким образом, обработка DMN вызывала отложение коллагена в печени, что обычно наблюдается при фиброзе печени. Тем не менее, площадь фиброза была значительно снижена при обработке SiRNA, направленной на ген HSP47, по сравнению с группой «заболевших крыс» (Фигура 29). Полученные результаты показали, что SiRNA согласно настоящему описанию обладает терапевтической эффективностью при данном заболевании.

Дополнительные соединения siRNA исследовали на животной модели фиброза печени и показали, что они снижают площадь фиброза в печени.

Пример 20. Получение последовательностей активных соединений двухцепочечной РНК к 15 HSP47/SERPINH1 и получение siRNA. представленных в Таблицах 4. 5. В. С. D и Е.

Дуплексы получали посредством гибридизации комплементарных одноцепочечных олигонуклеотидов. В ламинарном боксе готовили приблизительно 500 мкМ маточного раствора одноцепочечных олигонуклеотидов посредством разведения в WFI (вода для инъекций). Фактические концентрации ssPHK определяли, разбавляя каждые 500 мкМ ssPHK в отношении 1:200 с использованием WFI и измеряя OD с использованием Nano Drop. Эту процедуру повторяли 3 раза и рассчитывали среднюю концентрацию. Затем разбавляли маточный раствор до конечной концентрации 250 мкМ. Комплементарные отдельные цепи гибридизовали при нагревании до 85°С и охлаждении до комнатной температуры в течение по меньшей мере 45 минут. Проверяли полную гибридизацию дуплексов посредством нанесения 5 мкл на 20% 30 полиакриламидный гель и окрашивания. Образцы хранили при -80°С.

В Таблицах 4, 5, В, С, D и Ε представлены siRNA для HSP47/SERPINH1. Для каждого гена существует отдельный список 19-мерных последовательностей siRNA, которые являются приоритетными на основе количества баллов у них в собственном алгоритме в качестве наилучших последовательностей для нацеливания на экспрессию гена человека.

Следующие аббревиатуры используются в Таблицах 4, 5, В, С, D и Ε в настоящей заявке: «другие виды или Sp» обозначает межвидовую идентичность с другими животными: D-собака, Rt-крыса, Rb-кролик, Rh-макака Резуса, Р- свинья, М- мышь; ORF: открытая рамка считывания. 19-меры и 18+1-меры обозначают олигомеры длиной 19 и 18+1 (U в положении 1 антисмысловой цепи, А в положении 19 смысловой цепи) рибонуклеиновых кислот, соответственно.

Олигонуклеотиды siRNA, полезные при создании двухнитевых молекул РНК, как раскрывается в Таблицах 4, 5, В, С, D и Е, приведенных ниже.

Наиболее активные последовательности были выбраны при следующем анализе.

Из Таблицы 4 siRNA соединения SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_13, SERRINH1_45 SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 и SERPINH1_86 были выбраны в качестве предпочтительных соединений (Таблицы 6-А и В).

Из Таблицы 5 siRNA соединения SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 и SERPINH1_88 были выбраны в качестве предпочтительных соединений (Таблица 7).

Пример 21. Системы животных моделей фиброзных заболеваний

Анализ активных siPHK согласно настоящему изобретению можно было выполнять напредиктивных животных моделях. Крысиные диабетические и стареющие модели фиброза почек включали крыс Цукера, страдающих ожирением и диабетом (ZDF), старых fa/fa крыс Цукера с ожирением, старых мышей Спрейг-Доули (SD) и крыс Гото Какизаки (GK); крысы GK представляют собой инбредный штамм, полученный от крыс линии Вистар, отобранных по спонтанному развитию NIDDM (диабета типа II). Индуцированные модели фиброза почек включали модель перманентной односторонней обструкции мочеточника (UUO), которая представляет собой модель острого фиброза кишечника, встречающегося у здоровых не диабетических животных; фиброз почек развивается через несколько дней после обструкции. Другой индуцированной моделью фиброза почек является нефреэктомия на 5/6.

Две модели фиброза печени на крысах представляли собой Перевязку желчных протоков (BDL) с имитацией операции в качестве контролей и отравление CCl4 с животными, содержавшихся на диете из оливкового масла, в качестве контролей, как описано в следующих публикациях: Lotersztajn S, et al Hepatic Fibrosis: Molecular Mechanisms and Drug Targets. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2004 Oct 07; Uchio K, et al., Down-regulation of connective tissue growth factor and type I collagen мРНК expression by 5 connective tissue growth factor antisense oligonucleotide during experimental liver fibrosis. Wound Repair Regen. 2004 Jan-Feb;12(l):60-6; Xu XQ, et al., Molecular classification of liver fibrosis in a rat model by proteomics and bioinformatics Proteomics. 2004 Oct; 4(10):3235-45.

Модели образования шрамов на глазах хорошо известны в данной области техники, например, в Sherwood MB et al, J Glaucoma. 2004 Oct;13(5):407-12. A new model of glaucoma filtering surgery in the rat; Miller MH et al, Ophthalmic Surg. 1989 May;20(5):350-7. Wound healing in an animal model of glaucoma fistulizing surgery in the Rb; vanBockxmeer FM et al, Retina. 1985 Fall-Winter; 5(4): 239-52. Models for assessing scar tissue inhibitors; Wiedemann P et al, J Pharmacol Methods. 1984 Aug; 12(1): 69-78. Proliferative vitreoretinopathy: the Rb cell injection model for screening of antiproliferative drugs.

Модели катаракты описываются в следующих публикациях: Zhou et al, 2002.1nvest Ophthalmol Vis Sci.43:2293-300; Wang et al 2004 Curr Eye Res. 29:51-58.

Соединения в Таблице 5 и Таблицы 4 исследовали на указанных моделях фиброзных заболеваний, на которых обнаружили, что они являются эффективными при лечении фиброза печени и других фиброзных заболеваниях.

Модельные системы глаукомы

Исследование активных siRNA согласно настоящему изобретению для лечения Зили профилактики глаукомы проводили на крысиных животных моделях повреждения зрительного нерва, описанных, например, в: Maeda et al, 2004 Investigative Ophthalmology и visual Science (IOVS), 45:851. В частности, для поперечного разреза зрительного нерва обнажали глазничную часть зрительного нерва (ON) крыс под анастезией с заходом через надглазничную часть, разрывали мягкие оболочки мозга и все аксоны в ON рассекали с помощью шипцов в течение 10 секунд, 2 мм от решетчатой пластинки.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию исследовали на данной животной модели, и результаты показали, что указанные соединения siRNA являются полезными при лечении и/или предотвращении глаукомы.

Крысиная модель повреждения зрительно нерва (ΟΝC): интравитриальная доставка siRNA и доставка в виде глазных капель

Для поперечного разреза зрительного нерва обнажали глазничную часть зрительного нерва (ON) крыс под анестезией с заходом через надглазничную часть, разрывали мягкие оболочки мозга и все аксоны в ON рассекали с помощью щипцов в течение 10 секунд, 2 мм от решетчатой пластинки.

Соединения siRNA доставляли по-отдельности или в комбинации в объеме 5 мкл (10 мкг/мкл) в виде глазных капель. Непосредственно после разрушения оптического нерва (ONC) вводили 20 мкг/10 мкл исследуемых siRNA или 10 мкл PBS в один или оба глаза взрослым крысам Вистар и определяли уровни siRNA, впитавшихся в рассеченные и быстрозамороженные цельные сетчатки через 5 часов и 1 день и позже на 2, 4, 7, 14 и 21 день после инъекции. Похожие эксперименты проводили для проверки активности и эффективности siRNA, введенных в виде глазных капель.

Модельные системы травмы реперфузии ишемии после трансплантации легких у крыс

Получали травму ишемия/реперфузия легких на крысиной модели согласно Mizobuchi et al, 2004 J Heart Lung Transplantation, 23 и Kazuhiro et al, 2001 Am. J. Respir. Cell Mol Biol, 25:26-34.

В частности, после выполнения анестезии изофлураном в трахею вставляли тефлоновый катетер 14 размера и крысе осуществляли механическую вентиляцию с помощью вентилятора для грызунов с использованием 100% кислорода, со скоростью 70 вдохов в минуту и положительным давлением в конце выдоха в 2 см H2O. Левую легочную артерию, вены и главный ствол бронха перевязывали с помощью зажима Кастанеды. Во время операции легкое увлажняли физиологическим раствором и разрез закрывали для сведения к минимуму потерь от испарения. Продолжительность периода ишемии составила 60 минут.В конце периода ишемии снимали зажим и обеспечивали вентиляцию и реперфузию легкого в течение следующих 4, 24 часов и 5 дней после стимуляции ишемии легких. В конце указанного эксперимента аккуратно изымали легкие и замораживали для выделения РНК или фиксировали в коктейле глутарового альдегида для последующего гистологического исследования.

Животная модель блеомицина в качестве модели идиопатического фиброза легких (IPF).

Исследование осуществимости доставки в легкие и печень SiRNA в составе лекарственной формы с витамином A-Coatsome, введенной посредством внутривенной инъекции, и интратрахеальное введение комплекса siRNA-витамин A-Coatsome здоровым мышам и мышам, получавшим блеомицин.

Цель: Проверить два способа введения на осуществимость доставки лекарственной формы siRNA с витамином A-Coatsome в нормальные легкие и фиброзные легкие мышей. Главная проверяемая гипотеза настоящего исследования- обеспечивает ли системное введение лекарственной формы модифицированной siRNA с витамином А-Coatsome полезное поглощение и специфичное в отношении клеток распределение в фиброзных и нормальных легких мышей. Одновременно исследовали интратрахеальный способ введения лекарственной формы модифицированной siRNA с витамином А-Coatsome. Определение siRNA и специфичное в отношении клеток распределение в легких и печени осуществляли методом гибридизации in situ (ISH)

Модель фиброза легких, вызванного блеомицином, была успешно разработана и охарактеризована в течение последних трех десятилетий (Moeller, et al. 2008Int J Biochem Cell Biol, 40:362-82,; Chua et al, 2005Am J Respir Cell Mol Biol 33:9-13,). Гистологические признаки, такие как внутриальвеолярные утолщения, встраивание в стенку коллагена и облитерация пространства альвеол, присутствуют у животных BLM, как и у субъектов с IPF. Ранние исследования показали, что мыши С57/В1 были систематически склонны к вызванному BLM фиброзу легких, тогда как мыши Balb/C были по своей природе устойчивы. В зависимости от способа введения развиваются различные картины фиброза. Интратрахеальное введение BLM приводит к акцентированному бронхиоцентрическому фиброзу, тогда как внутривенное или интраперитонеальное введение вызывает образование рубцов под плеврой, как и в случае болезни у человека (Chua et al. ibid). Использовали мышиную модель обычной интерстициальной пневмонии (UIP). Данная модель проявляет гетерогенное распределение накопления фибрилл (фибропролиферации), в основном расположенное субплеврально, что приводит к повреждениям, похожим на наблюдаемые в легких субъектов с идиопатическим фиброзом легких (Onuma, et al, 2001 J Exp Med 194:147-56, и Yamaguchi et al, 1988 Nature 336:244-46). UIP вызывают интраперитонеальной инъекцией блеомицина через день в течение 7 суток для постоянного поддержания субплевральной фибропролиферации в легких мышей (Swiderski et al 1998 Am J Pathol 152: 821-28, и Shimizukawa et al, 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284: L526-32,).

Липосомы, загруженные витамином А, содержащие siRNA, взаимодействуют с ретинолсвязывающим белком (RBP) и обеспечивают эффективную доставку в HSC через рецептор RBP. Эти липосомы эффективно поглощаются активированными миофибробластами, экспрессирующими рецептор RBP, в легких мышей обработанных блеомицином.

Модель исследования

Мышь - С57 Bl самцы

Исходное N (BLM I.P.) - 40 (6 для первой пилотной группы, 34 для исследования, принимая во внимание ожидаемую смертность 25%)

Исходное N (общее) - 60

Исследуемые siRNA: SERPINHI соединения согласно настоящему изобретению.

Фиброз легких, вызванный блеомицином. Фиброз легких у женских особей мышей в возрасте 12 недель C57BL/6 вызывали интраперитонеальным введением хлората блеомицина: 0.75 мг/кг массы тела, растворенный в 0,1 мл физиологического раствора, через день в течение 7 дней, на 0,2,4 и 6 сутки.

Пилотная оценка установления фиброза. Мышей (N=30) подвергали действию BLM в группах с интервалом в одну неделю между первой обработанной группой (N=5) и остальными животными. На 14 день забивали двух мышей из первой группы и забирали легкие для быстрой окраски ГЭ и гистопатологической оценки фиброза. Если подтверждали диагноз фиброза легких, оставшихся крыс распределяли по группам и обрабатывали SiRNA на 14 сутки после первого введения BLM. Если на 14 день у животных не развивался достаточный фиброз в легких, остальных мышей из первой из обработанной группы забивали на 21 день с последующей быстрой гистопатологической оценкой фиброза. Остальных животных обрабатывали комплексом исследуемой SiRNA, начиная с 21 дня после введения BLM.

siRNA введение. На 14 или 21 день после первого введения BLM (TBD во время исследования, на основе пилотных оценок установления фиброза) животных распределяли по группам по массе тела. Животным из 1 и 2 группы вводили внутривенно (инъекция в хвостовую вену) комплекс Б1РНК/витамин A/Coatsome с концентрацией SiRNA 4,5 мг/кг массы тела. Интактных животных того же возраста (группы 5 и 6) обрабатывали таким же образом. Мышей, обработанных BLM (группа 9), использовали как контроль с носителем витамин A-coatsome. Через 24 часа инъекцию повторяли всем животным согласно описанию выше.

Животным BLM из группы 3 и 4 и интактным мышам из 7 и 8 группы проводили анестезию изофлутраном и подвергали их интратекальному введению 2,25 мг/кг массы тела siRNA в составе лекарственной формы с липосомами, загруженными витамином А. Мышам из группы 10 BLM вводили только носитель витамин A/Coatsome. Интратекальное введение повторяли через 24 часа.

Завершение исследования. Животных из групп 1, 3, 5, 7, 9 забивали через 2 часа после второй инъекции или введения комплекса siRNA. Животных из групп 2, 4, 6, 8, 10 забивали через 24 часа после второй инъекции или введения комплекса siRNA.

После умерщвления мышам транскардиально вводили 10% нейтральный забуференный формалин. Легкие наполняли 0,8-1,0 мл 10% NBF и перевязывали трахею. Вырезали легкие и фиксировали их в течение 24 часов в 10% NBF. Печень получали у каждого животного и фиксировали ее в 10% NBF в течение 24 часов.

Получение срезов и оценка. Полученные срезы были приготовлены из легких и печени. Сначала полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином для определения морфологии легких и печени, затем срезы окрашивали Сириус Красным (трехцветный) для идентификации коллагена. Затем полученные срезы подвергали гибридизации in situ (ISH) для определения siRNA.

Пример 22. In vivo активность против легочного фиброза siRNA-содержащей VA-связанной липосомы

(1) Индукция легочного фиброза и введение лекарственного средства

S-D самцы крыс (8 крыс/группа, возраст восемь недель, Charles River Laboratories Japan, Inc.) один раз вводили 0.45 мг блеомицина (BLM), растворенного в 0.1 ил соляного раствора, в легкие посредством интратрахеальной канюляции (MicroSprayer, Penn-Century, Inc.) под анестезией, с получением модели фиброза легкого, вызванного блеомицином. В этом способе значительный фиброз в общем встречается в легких после 2 недель. Липосомную композицию (1.5 мг/кг в качестве количества siRNA, 1 мл/кг в объеме, то есть 200 мкл для крысы 200 г) или PBS (1 мл/кг в объеме) вводили крысам через хвостовую вену, начиная со второй недели после введения блеомицина, в общем за 10 раз (на каждый последующий день). Крыс умертвили через два дня после последней обработки, провели гистологическое исследование ткани легких (смотрите Фиг. 30). One way ANOVA и Bonferroni multi сравнительные тесты применяли для оценки статистически значимого различия.

Композиция липосом представляла собой HEDC/S-104/DOPE/холестерин/PEG-DMPE/diVA-PEG-diVA (20:20:30:25:5:2 мол. %. Подробности siRNA раскрываются далее:

где: rX означает рибонуклеотиды; mX означает 2'-O-метил рибонуклеотиды; 25rX означает рибонуклеотиды с 2'-5' связями; С3 означает 1,3-пропандиольный спейсер; idAB означает инвертированную 1,2-дидезокси-D-рибозу; Р означает фосфатную группу на 3'-конце. 3'-концевой С3 вводится посредство загруженного на подложку 1,3-пропандиольного спейсера. 3'-концевая фосфатная группа (Р) вводится посредством применения загруженного на подложку диэтилсульфонильного (Pi) спейсера.

(2) Гистологическое исследование

Часть удаленного легкого зафиксировали формалином в соответствии с путем введения и подвергли азановому окрашиванию (азокармин, сине-оранжевый раствор анилина G). Как показано по результатам азанового окрашивания на Фиг. 31, в группе введения PBS (Disease), наблюдалось заметное фиброзное изображение, охарактеризованное расширением проходов в результате большого количества окрашенного в синий цвет коллагенового волокна, тогда как в группе введения композиции (обработка), фиброз очевидным образом подавлялся.

Как показано по результатам гистологического исследования (Т. Ashcroft score) на Фиг. 32, в группе введения композиции (обработка), масштаб фиброза значительно уменьшался.

Пример 23. In-vivo уменьшение HSP47 мРНК (DMN модель)

In vivo активность липосом HSP47 Примера 22 оценили на модели краткосрочного повреждения печени (обозначается как Quick Model). В этой модели краткосрочное повреждение печени вызывают обработкой гепатотоксичным агентом, таким как диметилнитрозамин (DMN), сопровождалось повышением уровней HSP47 мРНК. Для индукции этих изменений Sprague-Dawley самцам крыс интраперитонеально инъецировали DMN в течение шести последовательных дней. В конце периода обработки DMN, животных разделили на группе на основе индивидуальной массы тела животных. Образец липосомы вводили в виде одной IV дозы (0.375 или 0.75 мг/кг, отражает siRNA дозу) через один час после инъекции DMN. Одним днем позже отделяли доли печени, и уровни HSP47 и GAPDH мРНК определяли посредством анализа количественной ПЦР в реальном времени (TaqMan). Уровни HSP47 мРНК нормализовали до уровней GAPDH. Как показано на Фиг. 33, сильное и зависимое от дозы уменьшение мРНК для HSP47 обнаружили в печени. После одной дозы 0.75 мг/кг ND-L02-0101 наблюдали уменьшение 80% для HSP47 мРНК. Даже при более низкой дозе 0.375 мг/кг наблюдалось значительное подавление 40%.

Содержание статей, патентов и заявок на патент и все другие документы и сведения в электронном виде, которые указаны или цитируются в настоящем документе, приведены в качестве ссылки во всей их полноте в той же степени, как если было бы отдельно указано, что каждая публикация должна быть включена посредством ссылки.

Заявители оставляют за собой право физически включить в публикацию все без исключения материалы и информацию из любых таких статей, патентов, заявок на патент или других физических и электронных документов.

Специалисту в данной области будет очевидно, что различные замены и модификации могут быть внесены в изобретение согласно настоящему описанию без отклонения от объема и сущности изобретения. Таким образом, такие дополнительные варианты реализации находятся в рамках настоящего изобретения и формулы изобретения. Настоящее изобретение учит специалистов в данной области проверять различные сочетания и/или замены химических модификаций согласно настоящему описанию для получения конструкций нуклеиновых кислот с улучшенной активностью для опосредования активности RNAi. Такая улучшенная активность может включать в себя улучшенную стабильность, улучшенную биодоступность и/или улучшенную активацию клеточных ответов, опосредующих RNAi. Таким образом, конкретные варианты согласно настоящему описанию не являются ограничивающими, и специалисты в данной области с легкостью поймут, что можно исследовать определенные комбинации изменений согласно настоящему описанию без неоправданных экспериментов для идентификации молекул нуклеиновых кислот с улучшенной активностью RNAi.

Изобретения наглядно согласно настоящей заявке можно осуществлять на практике в отсутствии любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, не конкретно согласно настоящему описанию. Таким образом, например, неопределенный артикль и определенный артикль и похожие определения в контексте изобретения (особенно в контексте следующих пунктов формулы) следует толковать как единственное и множественное число, если не указано иначе или из контекста не следует противоположное. Термины «содержащий», «имеющий», «включающий» и т.п. следует понимать в широком смысле и без ограничения (например, означающими «включая, но не ограничиваясь ими»). Перечисление пределов значений в настоящем описании направлено только на то, чтобы служить сокращенным способом обозначения отдельного значения, попадающего в предел, если не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы было отдельно перечислено. Все способы согласно настоящему описанию можно осуществлять в любом порядке, если не указано иное, или не следует иначе из контекста. Использование любых примеров (например, «такие как») согласно настоящему описанию предназначено только для лучшего освещения изобретения и не создает ограничений объема изобретения, если не указано иначе. Ни одно выражение в описании не должно быть истолковано как указание, что любой не заявленный элемент является важным для практики изобретения. Кроме того, термины и выражения, используемые в настоящем описании, были использованы 10 в качестве условия описания, а не ограничения, и указанные термины и выражения не нацелены на исключение любых эквивалентов показанных и описанных функций или их частей, наоборот, признается, что в рамках заявленного изобретения возможны различные модификации. Таким образом, следует понимать, что, хотя изобретение было конкретно раскрыто в предпочтительных вариантах и дополнительных функциях, специалисты в данной области могут прибегать к модификациям и изменениям изобретений, изложенных в настоящей публикации, и считается, что такие изменения и вариации находятся в рамках данного изобретения.

Изобретение было описано широко и в общем в настоящей заявке. Каждый узкий вид и подродовая группа, входящие в общее раскрытие информации, также являются частью изобретения. Это включает обобщенное описание изобретения с оговоркой или отрицательным ограничением, удаляющим любой предмет из рода, вне зависимости от того, изложен ли вырезанный материал в настоящем описании. Другие варианты находятся в пределах следующей формулы. Кроме того, если функции и аспекты изобретения, описанного в терминах групп Маркуша, специалистам в данной области будет понятно, что изобретение также описывается в терминах отдельных членов или подгруппы членов группы Маркуша.

1. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, связанного с hsp47, содержащая носитель для лекарственного средства и двухнитиевую молекулу нуклеиновой кислоты, где носитель для лекарственного средства содержит ретиноид и липид, где двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты содержит структуру:

5' (N)_x-Z 3' (антисмысловая нить)

3' Z'-(N')_y-z'' 5' (смысловая нить)

где каждый N и N' представляет собой нуклеотид, который является немодифицированным или модифицированным или нестандартной составляющей,

где модифицированный нуклеотид включает модифицированную сахарную группу, выбранную из группы, состоящей из 2'-O-метила, 2'-метоксиэтокси, 2'-дезокси, 2'-фторо, 2'-аллила, 2'-O-(2-(метиламино)-2-оксиэтила), 4'-тио, 4'-(CH₂)₂-O-2'-мостика, 2'-LNA и 2'-O-(N-метилкарбамата), модифицированное нуклеиновое основание, выбранное из группы, состоящей из ксантина, гипоксантина, 2-аминоаденина, 6-метила и других алкильных производных аденина и гуанина, 2-пропила и других алкильных производных аденина и гуанина, 5-галоурацила и цитозина, 5-пропинилурацила и цитозина, 6-азо урацила, цитозина и тимина, 5-урацила (псевдоурацила), 4-тиоурацила, 8-гало, амино, тиола, тиоалкила, гидроксила и других замещенных в положении 8-замещенных аденинов и гуанинов, 5-трифторметила и других 5-замещенных урацилов и цитозинов, 7-метилгуанина и ациклонуклеотидов, или модифицированную фосфатную группу, и/или включает модифицированный фосфодиэфирный остов, где фосфодиэфирная связь модифицирована посредством замещения фосфодиэфирной связи на фосфотиоатную, 3'-(или -5')дезокси-3'-(или-5')тио-фосфотиоатную, фосфодитиоатную, фосфоселенатную, 3'-(или -5')дезоксифосфинатную, боранофосфатную, 3'-(или -5')дезокси-3'-(или 5'-)амино фосфоамидатную, гидрофосфонатную, боранофосфатэфирную, фосфоамидатную, алкил или арил фосфонатную и фосфотриэфирную или фосфористую связи, и/или модифицированную концевую фосфатную группу,

где нестандартная составляющая представляет собой ненуклеотидные составляющие, включая составляющую без основания, инвертированную составляющую без основания, углеводородную (алкильную) составляющую и ее производные, и дополнительно включает дезоксирибонуклеотид, модифицированный дезоксирибонуклеотид, зеркальный нуклеотид (L-DNA или L-RNA), аналог нуклеотида, не образующий пару, и нуклеотид, соединенный со смежным нуклеотидом посредством 2'-5' межнуклеотидной фосфатной связи, мостиковые нуклеиновые кислоты, включая LNA и нуклеиновые кислоты, соединенные мостиком из этилена, нуклеотиды с модифицированными связями (например, РАСЕ) и нуклеотиды с модифицированными основаниями;

где каждый (N)_x и (N')_y представляет собой олигонуклеотид, в котором каждый последующий N или N' соединен со следующим N или N' ковалентной связью;

где каждый Z и Z' независимо присутствует или отсутствует, но если присутствует, то включает 1-5 последовательных нуклеотида или ненуклеотидных составляющих, выбранных из группы, состоящей из пропанола, пропил фосфата, пропил фосфотиоата или их комбинаций, или их комбинацию, ковалентно присоединенную к 3'-концу нити, в которой присутствует;

где z'' может присутствовать или отсутствовать, но если присутствует, то является кэппирующей группой, присоединенной к 5'-концу (N')_y;

где каждый x и y независимо представляет собой целое число от 18 и 40;

где последовательность (N')_y комплементарна последовательности (N)_x;

где (N)_x включает антисмысловую последовательность для мРНК кодирующей последовательности для человеческого hsp47, примером которой является SEQ ID NO: 1, и

где липидом является HEDC

и/или S104

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где siRNA содержит олигонуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOS: 60 и 127 (SERPINH1_2), SEQ ID NOS: 98 и 165 (SERPINH1_45a) и SEQ ID NOS: 101 и 168 (SERPINH1_51).

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, где ретиноид состоит из молекулы, выбранной из группы, состоящей из витамина А, ретиноевой кислоты, ретиналя, третиноина, адапалена, ретинол пальмитата и фенретинида (4-HPR).

4. Фармацевтическая композиция по п. 1, где носитель для лекарственного средства содержит ретиноид в виде молекулы ретиноида, конъюгированной с молекулой полиэтиленгликоля.

5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где молекула ретиноида, конъюгированная с молекулой полиэтиленгликоля, представляет собой diVA-PEG-diVA.

6. Фармацевтическая композиция по п. 1, где ретиноид по меньшей мере частично выставляется на внешней части носителя для лекарственного средства, прежде чем носитель для лекарственного средства достигает звездчатой клетки.

7. Фармацевтическая композиция по п. 1, где носитель для лекарственного средства находится в форме, выбранной из группы, состоящей из полимерной мицеллы, липосомы, эмульсии, микросферы и наносферы.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, где носитель для лекарственного средства находится в форме липидной везикулы, содержащей бислой липидных молекул.

9. Фармацевтическая композиция по п. 8, где ретиноид составляет от 0.2 мас. % до 20 мас. % липидных молекул.

10. Фармацевтическая композиция по п. 1, где двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты выставляется на внешней части поверхности липидной везикулы.

11. Фармацевтическая композиция по п. 1, где двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты инкапсулируется липидной везикулой.

12. Фармацевтическая композиция по п. 11, где двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты резистентна к нуклеазам.

13. Фармацевтическая композиция по п. 1, где двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты уменьшает экспрессию hsp47 в звездчатой клетке.

14. Фармацевтическая композиция по п. 1, где композиция обеспечивает профилактику или лечение заболевания, выбранного из группы, состоящей из фиброза органов и тканей, включая печень, легкие, почки, поджелудочную железу, кожу, сердце, головной мозг, кишечник, ободочную кишку, голосовые связки, брюшную полость, глаза, гладкую мышцу, костный мозг, кости, яичники, мочеточник и матку; и рака и связанных с раком фиброзных тканей.

15. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения фиброза печени.

16. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения фиброза легких.

17. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения фиброза почек.

18. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения перитонеального фиброза.

19. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения хронического повреждения печени.

20. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения фибриллогенеза.

21. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения цирроза печени, вызванного гепатитом С после трансплантации печени или неалкогольным стеатогепатитом (NASH); идиопатического фиброза легких; лучевого пневмонита, вызывающего фиброз легких; диабетической нефропатии; перитонеального склероза, вызванного хроническим перитонеальным диализом в амбулаторных условиях (CAPD), и пузырчатки глаз.

22. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения цирроза печени, вызванного гепатитом С после трансплантации печени или неалкогольным стеатогепатитом (NASH).

23. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения идиопатического фиброза легких.

24. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения лучевого пневмонита, вызывающего фиброз легких.

25. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения диабетической нефропатии.

26. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения перитонеального склероза, вызванного хроническим перитонеальным диализом в амбулаторных условиях (CAPD).

27. Фармацевтическая композиция по п. 1, где фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения пузырчатки глаз.

28. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-27, где одна нить двухнитевой молекулы нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 127 и вторая нить содержит SEQ ID NO: 60.

29. Фармацевтическая композиция по п. 28, где антисмысловая нить содержит SEQ ID NO: 127 и смысловая нить содержит SEQ ID NO: 60.

30. Фармацевтическая композиция по п. 29, где антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 1, 5, 6 или 7 и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и где смысловая нить дополнительно содержит по меньшей мере один 2'-5'-рибонуклеотид или 2'-O-метилмодифицированный рибонуклеотид; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

31. Фармацевтическая композиция по п. 29, где антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7 и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и где смысловая нить дополнительно содержит пять последовательных 2'-5'-рибонуклеотидов в 3'-терминальных положениях 15, 16, 17, 18 и 19; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

32. Фармацевтическая композиция по п. 29, где антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 и 19 и C3C3 ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и где смысловая нить дополнительно содержит C3Pi ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

33. Фармацевтическая композиция по п. 29, где антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7 и C3Pi-C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и где смысловая нить дополнительно содержит пять последовательных 2'-5'-рибонуклеотидов в 3'-терминальных положениях 15, 16, 17, 18 и 19; C3Pi ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

34. Фармацевтическая композиция по п. 29, где антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7 и C3Pi-C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и где смысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 7, 13, 16 и 18; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; C3 ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу.

35. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-27, где одна нить двухнитевой молекулы нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 98 и вторая нить содержит SEQ ID NO: 165.

36. Фармацевтическая композиция по п. 35, где смысловая нить содержит SEQ ID NO: 98 и антисмысловая нить содержит SEQ ID NO: 165.

37. Фармацевтическая композиция по п. 36, где смысловая нить дополнительно содержит 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях при 3'-конце или около 3'-конца; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированный рибонуклеотид; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6 или 7 и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

38. Фармацевтическая композиция по п. 36, где смысловая нить дополнительно содержит 2'-5'-рибонуклеотиды в положениях 15, 16, 17, 18 и 19; C3-OH 3' составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-О-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 и 19; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 7 и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

39. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-27, где одна нить двухнитевой молекулы нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 101 и вторая нить содержит SEQ ID NO: 168.

40. Фармацевтическая композиция по п. 39, где смысловая нить содержит SEQ ID NO: 101 и антисмысловая нить содержит SEQ ID NO: 168.

41. Фармацевтическая композиция по п. 40, где смысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные пиримидин рибонуклеотиды; необязательный 2'-5'-рибонуклеотид в одном из положений 9 или 10; ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и кэппирующую составляющую, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и где антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-О-метилмодифицированный рибонуклеотид; 2'-5'-рибонуклеотид в по меньшей мере одном из положений 5, 6 или 7 и ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

42. Фармацевтическая композиция по п. 40, где смысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13 и 17; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 9; C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и где антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 11 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6 и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

43. Фармацевтическая композиция по п. 40, где смысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 4, 11, 13 и 17; C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и где антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 13 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6 и C3Pi-C3OH составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

44. Фармацевтическая композиция по п. 40, где смысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 2, 4, 11, 13 и 17; C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу; и инвертированную дезоксирибонуклеотидную составляющую без основания, ковалентно присоединенную к 5'-концу; и где антисмысловая нить дополнительно содержит 2'-O-метилмодифицированные рибонуклеотиды в положениях 1, 4, 8, 11 и 15; 2'-5'-рибонуклеотид в положении 6 и C3Pi-C3OH ненуклеотидную составляющую, ковалентно присоединенную к 3'-концу.

45. Способ лечения или профилактики заболевания, связанного с hsp47, где способ содержит введение эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп. 1-44 субъекту, нуждающемуся в этом.

46. Способ по п. 45, где заболевание выбирается из группы, состоящей из гепатита, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, панкреатита, фиброза поджелудочной железы, рака поджелудочной железы, рубцевания голосовых связок, фиброза слизистой оболочки голосовых связок и ларингеального фиброза.

47. Способ по п. 45, где заболеванием является гепатит или фиброз печени.

48. Способ по п. 45, где заболевание связано с хронической инфекцией вируса гепатита С (HCV).

49. Способ по п. 45, где препарат вводится парентерально.