Способ моделирования тяжёлого спонтанно необратимого повреждения печени

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается моделирования тяжелой хронической печеночной недостаточности. Способ включает подкожное введение крысе 60% масляного раствора CCl₄. На первом этапе моделирования раствор вводят по следующей схеме: сначала по 0,5 мл на 100 г веса животного 2 раза в неделю в течение 2 –х недель с интервалом 3-4 дня, а затем по 0,3 мл на 100 г веса животного 2 раза в неделю с интервалом 3-4 дня также в течение 2-х недель. На втором этапе в течение последующих трех недель продолжают введение 60% масляного раствора CCl₄ в дозе 0,5 мл на 100 г веса 1 раз в неделю. При этом на втором этапе за сутки до введения раствора внутрибрюшинно вводят 1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Способ обеспечивает создание модели тяжелой печеночной недостаточности без спонтанной реверсии биохимических и гистологических признаков повреждения печени за счет стабильного уменьшения массы жизнеспособных клеток, образования печеночного аутоантигена и торможения на этом фоне процессов восстановительной регенерации в печени при индукции аутоиммунного воспаления. 13 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к гепатологии, патофизиологии, трансплантологии, и предназначено для доклинического исследования новых способов лечения цирроза печени с помощью современных биотехнологических методов.

В экономически развитых странах хронические заболевания печени и цирроз печени (ЦП) входят в число шести основных причин смерти пациентов от 35 до 60 лет, составляя 14-30 случаев на 100 тыс. населения. Ежегодно в мире умирают 40 млн. человек от цирроза печени. Возрастание медицинской и социальной значимости хронических заболеваний печени требует новых усилий в разработке вопросов этиологии, патогенеза, иммунологии, диагностики, лечения и профилактики этих заболеваний на адекватных моделях тяжелой печеночной недостаточности.

Печень относится к органам с чрезвычайно высокой регенеративной активностью, которая поддерживается и регулируется иммунной системой организма [Бабаева А.Г. Регенерация и система иммуногенеза. - М.: Медицина, 1985, 255 с.; Бабаева А.Г., Зотиков Е.А. Иммунология процессов адаптивного роста, пролиферации и их нарушений. - М.: Наука, 1987, 207 с.; Бабаева А.Г. Репаративные процессы и иммунитет. Известия А.Н., серия биол., 1999, №3, с. 261-269; Храмцова Ю.С. Роль иммунной системы в регуляции регенерации тканей с разной восстановительной способностью: Дис. Канд. биол. наук: 03.00.13: Екатеринбург, 2004, 184 с.]. Из-за высокой регенерационной активности ткани печени попытки создать в эксперименте модель длительно устойчивой хронической печеночной недостаточности крайне тяжелой степени выраженности без постепенного спонтанного, т.е. самостоятельного, восстановления нарушенных функций пока не увенчались успехом [А.Г. Скуратов, А.Н. Лызиков, Е.В. Воропаев, С.Л. Ачинович, Б.Б. Осипов. Экспериментальное моделирование токсического повреждения печени. Журнал «Проблемы здоровья и экологии», выпуск 4 (30), 2011]. Поэтому в модельных опытах при оценке эффективности терапевтических средств, используемых при лечении печеночной недостаточности, исследователи всегда ориентируются на скорость обратного развития возникших нарушений в леченой группе по сравнению с контролем. Между тем, для оценки эффективности новых биотехнологических методов лечения хронической печеночной недостаточности, основанных на постепенной компенсации нарушенных функций с помощью имплантируемых клеточно- и ткане-инженерных конструкций, необходимо использовать модели стабильно тяжелой печеночной недостаточности, не поддающейся спонтанной реверсии в течение длительного времени (9-10 месяцев и более).

В настоящее время моделирование печеночной недостаточности у животных осуществляют различными способами. К их числу относятся:

1) хирургические способы - гепатэктомия и перевязка сосудов; 2) токсическое поражение (тетрахлорметан, тиоацетамид, дипин, совтол-1 и др.); 3) специальные диеты (холин-дефицитная и др.); 4) сочетание гепатотоксинов с гепатоканцерогенами, подавляющими пролиферацию; 5) сочетание ретрорсина (ДНК-связывающий пирролизидиновый алкалоид) с гепатэктомией; 6) генетические модели [С. Constandinou, N. Henderson, J.P. Iredale // Modeling liver fibrosis in rodents / Methods Mol Med. - 2005. - Vol. 117. - C. 237-250; J.G. Abraldes; M. Pasarin, J.C. Garcia-Pagan // Animal model of portal hypertension / World J. Gastroenterol. – 2006. - Vol. 12, №41. - P. 6577-6584. H. Hayashi, T. Sakai // Animal models for the study of liver fibrosis mew insights from knockout mouse models / Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. - 2011. - Vol. 300(5). - C. 729-738. Лопухин, Ю.M. Экспериментальная хирургия / М.: Медицина, 1971. - 344 с. W. Laleman [et al.] A stable model of cirrhotic portal hypertension in the rat: thioacetamide revisited // Eur. J. Clin. Invest. - 2006. - Vol. 36, №4. - P. 242-249. B. Kreft [et al.] Evaluation of different models of experimentally induced liver cirrhosis for MRI research with correlation to histopathologic findings / J. Invest. Radiol. - 1999. - Vol. 34, №5. - P. 360-366; А.Г. Скуратов, A.H. Лызиков, E.B. Воропаев, С.Л. Ачинович, Б.Б. Осипов. Экспериментальное моделирование токсического повреждения печени Журнал «Проблемы здоровья и экологии», выпуск 4 (30)/2011].

Модель острой печеночной недостаточности, обычно создают путем хирургической резекции 65-70% паренхимы печени (удаление левой и медиальной долей печени у крыс) [Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени. Будапешт АН Венгрии 1961, 30 с; Iggins G.M; Anderson R.M. Experimental pathology of the liver: Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. pathol, 1931. V 12, p. 186-202]. При создании этой модели летальность крыс уже на 1-3 сутки достигает 90% и выше. Модель требует расхода большого количества животных, а также не позволяет изучить динамику восстановительных процессов под влиянием терапевтических средств на хирургически интактной печени.

Наиболее широко используются токсические модели хронической печеночной недостаточности у крыс путем пролонгированного курсового внутрижелудочного введения гепатотропного яда, так как применение его не имеет технических проблем.

Известна модель печеночной недостаточности путем курсовой подкожной затравки крыс 60% раствором CCl₄ на персиковом масле по 0,3 мл 2 раза в неделю в течение 6 недель по схеме с общим расходом чистого CCl₄ до 3,6 мл на 100 гр веса животного [О.А. Костырев. Экспериментальный цирроз печени, создаваемый малыми дозами CCl₄ и влияние его на развитие гипо- и гипертиреоза. Автореферат, дисс. канд. мед. наук, М., 1975, 17 с.]. Указанная модель воспроизводит фиброзирующее повреждение печени, которое, однако, спонтанно обратимо.

Известна также модель, в которой токсическое повреждение печени гепатотропным ядом (50% раствором совтола-1 на оливковом масле), выполняемое путем внутрижелудочного введения по индивидуальным схемам в течение 4-8 недель, усиливается дополнительным пероральным введением 10% раствора этанола вместо питьевой воды для усиления токсического повреждения и создания условий устойчивого повреждения [RU 2197018 С2, Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека, 20.01.2003].

Указанные модели также обеспечивают фиброзирование печени, однако эти модели токсического повреждения печени характеризовались на этапе развившейся печеночной недостаточности (в течение 2 месяцев после окончания затравки) только морфологическими (цирротическое разрастание соединительной ткани) и не резко выраженными биохимическими нарушениями в крови (оставались повышенными печеночные ферменты - аланинаминотрансфераза (АлАТ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ) и щелочная фосфатаза (ЩФ) и др.). Другие клинические признаки тяжелого (спонтанно необратимого) повреждения печени, при котором снижение массы паренхимы достигает критического уровня, в этих моделях воспроизводились редко (асцит, варикозное расширение вен пищевода, портальная гипертензия и др.) и были обратимы. Это обстоятельство указывало на сохраняющуюся возможность спонтанной реверсии структурных и биохимических сдвигов в печени в моделях токсического повреждения, что подтверждают сами авторы этих публикаций [А.Г. Скуратов, А.Н. Лызиков, Е.В. Воропаев, С.Л. Ачинович, Б.Б. Осипов. Экспериментальное моделирование токсического повреждения печени. Журнал «Проблемы здоровья и экологии», выпуск 4 (30), 2011].

Кроме того, при этих моделях имеет место также токсическое повреждение слизистой всего желудочно-кишечного тракта, а также бесконтрольное и не унифицированное поступление и выведение токсического вещества, что не позволяет точно дозировать количество токсина, оказывающего повреждающее воздействие.

Так как токсическое повреждение печени гепатотропным ядом CCl₄ сопровождается только местным повреждением печени (которое обратимо во времени), то это означало, что в использованных моделях не воспроизводятся те глубокие изменения в ней, которые возникают у человека в клинике при развитии тяжелой (терминальной) спонтанно необратимой хронической печеночной недостаточности и которые, как известно, поддерживаются декомпенсацией в системе иммунной регуляции регенераторных процессов в печени [Бабаева А.Г. Регенерация и система иммуногенеза. - М.: Медицина, 1985, 255 с.; Бабаева А.Г., Зотиков Е.А. Иммунология процессов адаптивного роста, пролиферации и их нарушений. - М.: Наука, 1987, 207 с.; Бабаева А.Г. Репаративные процессы и иммунитет. Известия А.Н., серия биол., 1999, №3, с. 261-269; Храмцова Ю.С. Роль иммунной системы в регуляции регенерации тканей с разной восстановительной способностью: Дис. Канд. биол. наук: 03.00.13: Екатеринбург, 2004, 184 с.].

Известна модель хронически активного гепатита (ХАГ) у крыс [Егорова Т.Н., Пушкарь М.С., Соловьева Л.А., Кравчук В.В., Король А.П., Тереховская Е.И. Радоновые ванны в лечении аутоиммунного гепатита: экспериментально-морфологическое исследование, pushkar.doc 2013 г.], для создания которой животным вводят одновременно печеночный антиген от здоровых беспородных крыс с неполным адъювантом в количестве и по временной схеме, которые гарантируют стойкую сенсибилизацию животного, исключая возможность десенсибилизации (схема сенсибилизации авторами не приведена).

После моделирования ХАГ уже через 1 месяц возникают воспалительно-некротические изменения паренхимы печени и признаки начинающегося фиброзирования печени. Между тем, клинические признаки тяжелой печеночной недостаточности, соответствующие терминальной стадии повреждения печени, этот метод не позволяет воспроизвести. Метод моделирования ХАГ на крысах имеет одну преимущественную деталь перед моделями токсического повреждения печени. Она состоит в том, что деструктивные процессы, возникающие в печени при ХАГ, обусловленные воспалительным процессом в ней, протекают с выраженным иммунопатологическим компонентом, т.е. в условиях иммунной дезрегуляции регенераторных процессов в организме, которые, однако, у генетически здоровых людей обычно проявляются и поддерживаются только на необратимой стадии хронических прогрессирующих заболеваний органов, в том числе и печени человека.

Между тем указанный метод моделирования хронического активного гепатита имеет ряд недостатков: метод предусматривает обязательное использование печеночного антигена, приготовление которого требует дополнительного расхода здоровых животных той же породы (указанная модель не может служить истинной аутоиммунной моделью повреждения печени, т.к. для иммунизации крыс использовался не собственный печеночной антиген, а суммарный печеночный антиген беспородных крыс); кроме того, иммунная сенсибилизация животных печеночным антигеном и адъювантом проводится на фоне отсутствия выраженных признаков дефицита паренхиматозной ткани печени (отсутствие выраженных признаков некротического повреждения клеток печени) и поэтому в модели преобладает иммунный (воспалительный), т.е. непаренхимный компонент деструкции ткани печени, что не позволяет воспроизвести клинику терминальной (необратимой) стадии хронической печеночной недостаточности, обусловленной, прежде всего, деструкцией паренхиматозных клеток, т.е. гепатоцитов. Модель ХАГ не имеет широкого экспериментального применения, так как количество больных с исходной аутоиммунной патологией печени в общей популяции печеночных больных составляет только 10-23%, т.е. основную популяцию печеночных больных (77%-90%) составляют люди, у которых исходно отсутствуют какие-либо генетические отклонения.

Токсическая модель повреждения печени CCl₄ без дополнительного перорального применения этанола [А.В. Люндуп. Применение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга для коррекции фиброзирующего повреждения печени. Автореферат дисс. канд. мед. наук, М., 2011, 26 с.] была выбрана в качестве прототипа, так как в токсической модели повреждение паренхимы печеночной ткани первично, что обычно имеет место в клинике при развитии печеночной недостаточности.

Техническая проблема заключается в создании модели тяжелой хронической печеночной недостаточности (спонтанно необратимой печеночной недостаточности), воспроизводящей клинические признаки терминальной или декомпенсированной стадии заболевания с явлениями портальной гипертензии (асцит, варикозное расширение вен пищевода, спленомегалия) без их спонтанной реверсии в течение длительного времени (до 9-10 месяцев), и которая является пригодной для оценки степени истинной компенсации нарушенных печеночных функций с помощью нетрадиционных новых биотехнологических методов лечения.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, заключается в: создании модели тяжелой печеночной недостаточности без спонтанной реверсии биохимических и гистологических признаков повреждения печени за счет стабильного уменьшения массы жизнеспособных клеток в печени, образования в организме больших количеств печеночного аутоантигена и торможения на этом фоне процессов восстановительной регенерации в печени путем точного и последовательного дозирования комбинации факторов токсического воздействия и индукции аутоиммунного воспаления.

Впервые установлено, что комбинация гепатотропного яда - 60% масляного раствора CCl₄ (который снижает массу жизнеспособных клеток печени и ведет к накоплению в организме печеночного аутоантигена) и неполного адъюванта Фрейнда (эмульсии, содержащей вазелиновое масло, ланолин и эмульгатор, который депонирует антиген, усиливая его захват фагоцитами) при определенном режиме их введения позволяет получить надежную адекватную модель тяжелой печеночной недостаточности без спонтанной реверсии биохимических и гистологических признаков повреждения печени, которая сочетает в себе развитие повреждения паренхимы печеночной ткани и наличие выраженного иммунопатологического компонента, что приближает модель к тяжелой печеночной недостаточности, наблюдаемой в клинике.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Используют крысу в качестве экспериментального животного и создают на ней токсическую модель устойчивой печеночной недостаточности в 2 этапа. На первом этапе вызывают токсическое повреждение паренхимы печени подкожным введением гепатотропного яда CCl₄ в течение 4-х недель по схеме: сначала по 0,5 мл 60% масляного раствора CCl₄ на 100 г веса 2 раза в неделю с интервалом в 3-4 дня в течение 2 недель и затем по 0,3 мл 60% масляного раствора CCl₄ на 100 г веса 2 раза в неделю с интервалом в 3-4 дня также в течение в течение 2 недель. Затем на втором этапе в течение 3-х недель ингибируют регенераторные процессы в печени путем активации в ней хронического иммунного воспаления на фоне продолжающегося токсического повреждения печени. Для этого трехкратно внутрибрюшинно вводят 1 раз в неделю 1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Введение адъюванта проводят на фоне продолжающейся затравки CCl₄: CCl₄ вводят - по 0,5 мл 60% масляного раствора CCl₄ на 100 г веса 1 раз в неделю через каждые 7 суток, причем неполный адъювант Фрейнда в указанной дозе вводят трехкратно за 1 сутки до введения CCl₄.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Индукция токсического повреждения печени. Затравку животных (крыс) 60% масляного раствором CCl₄ на персиковом масле осуществляют под кратковременным эфирным наркозом в интервале между 9 и 12 часами дня, что исключает суточные колебания митотической активности клеток печени. Подкожные инъекции 60% раствора CCl₄ на персиковом масле проводят 2 раза в неделю (понедельник, четверг) после обработки передней поверхности бедра по Филончикову-Гроссиху (смазывание йодопироном или йодонатом операционного поля) в течение 4 недель по схеме: на 1-ой и 2-ой неделе по 0,5 мл 60% масляного раствора CCl₄ на 100 г веса животного; на третьей и четвертой неделе по 0,3 мл 60% масляного раствора CCl₄ на 100 г веса животного. Всего выполняют 8 инъекций CCl₄. После каждой инъекции в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости.

2. Через 6 суток после последнего (восьмого) подкожного введения 60% масляного раствора CCl₄ (на 34 сутки от начала затравки) под эфирным наркозом дезинфицируют поверхность передней брюшной стенки по Филончикову-Гроссиху и осуществляют первое введение неполного адъюванта Фрейнда в объеме 1 мл в место предварительно обработанной кожи. Неполный Адъювант Фрейнда представляет собой эмульсию, содержащую вазелиновое масло, ланолин и эмульгатор, который депонирует антиген, усиливая его захват фагоцитами [Freund J. The mode of action of immunologic adjuvants, Advanc. Tuberc. Res., v. 7, p. 130, 1956]. После внутрибрюшинной инъекции в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости после чего, обрабатывают раствором повидон-йод.

3. Через одни сутки после первого внутрибрюшинного введения 1 мл неполного адъюванта Фрейнда (на 35-е сутки от начала затравки) осуществляют 9-ое подкожное введение CCl₄ (конец 5 недели затравки) в количестве 0,5 мл 60% масляного раствора CCl₄ на 100 г веса животного, которое завершается соответствующей обработкой места введения.

4. Через 7 суток после 1-го введения неполного адъюванта Фрейнда (на 41-е сутки) осуществляют второе внутрибрюшинное введение адъюванта Фрейнда в объеме 1 мл в место предварительно обработанной области передней брюшной стенки. После внутрибрюшинного введения в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости после чего, обрабатывают раствором повидон-йод.

5. Через сутки после второго введения неполного адъюванта Фрейнда (на 42-е сутки) осуществляют 10-ое подкожное введение CCl₄ в количестве 0,5 мл 60% масляного раствора на 100 г веса животного, которое завершается соответствующей обработкой места введения.

6. Через 7 суток после второго введения неполного адъюванта Фрейнда (на 48-е сутки) осуществляют третье внутрибрюшинное введение адъюванта Фрейнда в объеме 1 мл в место предварительно обработанной области передней брюшной стенки. После внутрибрюшинного введения в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости после чего, обрабатывают раствором повидон-йод.

7. Через сутки после третьего введения неполного адъюванта Фрейнда (на 49 сутки) осуществляют 11 подкожное введение CCl₄ в количестве 0,5 мл 60% масляного раствора на 100 г веса животного, которое завершается соответствующей обработкой места введения.

Примеры выполнения методики моделирования печеночной недостаточности по способу-прототипу и по заявленному способу.

Опыты по моделированию печеночной недостаточности по способу-прототипу выполнены на 40 крысах породы ВИСТАР, которым проводили подкожное введение 60% масляного раствора CCl₄ по 0,3 мл на 100 г веса животного в течение 6 недель. К концу моделирования погибло 15% животных (6 крыс). При моделировании печеночной недостаточности по заявленному способу из 40 крыс к концу моделирования погибло 33% животных (13 крыс). По окончании затравки проводилось динамическое наблюдение за животными обеих групп по динамике изменения в крови содержания печеночных ферментов (ферментов цитолиза и холестаза): аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазаы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и по динамике макроскопических и гистологических изменений печени животных.

Установлено, что при моделировании печеночной недостаточности по способу прототипу восстановление показателей печеночных ферментов в крови происходило к концу первого месяца после окончания затравки.

На фиг. 1 представлена динамика изменения уровня АлАТ, на фиг. 2 представлена динамика изменения уровня АсАТ, и на фиг. 3 представлена динамика изменения уровня ЩФ в сыворотке крови крыс после моделирования хронической печеночной недостаточности по способу-прототипу и по заявленому способу. Уровень АлАТ для здоровых животных: до 40 ед/л. Уровень АсАТ для здоровых животных: до 60 ед/л. Уровень ЩФ для здоровых животных: 238-350 ед/л.

При моделировании печеночной недостаточности по заявленному способу восстановления показателей печеночных ферментов в крови не наблюдалось в течение 270 суток, а в дальнейшем происходило некоторое снижение исследуемых показателей, однако значения их оставались достоверно повышенными (фиг. 1, 2, 3). (* - Различие достоверно по сравнению с уровнем ферментов цитолиза и холестаза в опытах с моделированием печеночной недостаточности по способу-прототипу, р<0,05.)

Гистологическое исследование подтвердило создание более тяжелой хронически поддерживаемой формы токсического повреждения печени при моделировании печеночной недостаточности по заявленному способу.

Эти изменения отчетливо проявлялись уже при макроскопическом исследовании печени.

На фиг. 4 и фиг. 5 представлены макрофотографии нормальной и цирротически измененной печени. Здоровая печень (фиг. 4) и печень после окончания моделирования печеночной недостаточности (фиг. 5 и фиг. 6): Фиг. 5 - печень ex vivo после окончания затравки CCl₄ по способу-прототипу. Фиг. 6 - печень in vivo после окончания затравки CCl₄ и введения неполного адъюванта Фрейнда по заявленному способу.

Печень по заявленному способу (фиг. 6) сразу после окончания моделирования была не только увеличена в размерах, но и была более бугристой и деформированной по сравнению с контролем - способом-прототипом (фиг. 5). Было установлено также, что сразу после окончания затравки в брюшной полости из-за нарушений портального кровотока имело место накопление жидкости, причем по способу прототипу асцит встречался у 32% крыс, тогда как по заявленному способу у 80% крыс. В дальнейшем количество животных с асцитом к 90 суткам в контроле снижалось до 20% тогда как при моделировании печеночной недостаточности по заявленному способу количество крыс с асцитом составило 70%.

На фиг. 7 изображена морфологическая картина здоровой печени: срез печени интактной крысы. Ув.х100.

На фиг. 8 и 9 представлена печень крысы на 14 сутки после окончания моделирования печеночной недостаточности. Фиг. 8 - ув.х200 по способу-прототипу, возникновение диффузного распределения отдельных клеток печени с жировой дистрофией. Фиг. 9 - по заявленному способу, возникновение крупных очагов тотальной жировой и белковой дистрофии печени (клетки белые с голубым окрашиванием внутри).

На ранних сроках (на 14 сутки) отмечаются отчетливые признаки жировой дистрофии гепатоцитов, причем при моделировании печеночной недостаточности по способу-прототипу имело место возникновение диффузного распределения отдельных клеток печени с жировой дистрофией (фиг. 8), тогда как по заявленному способу имело место возникновение крупных очагов тотальной жировой и белковой дистрофии печени (фиг. 9).

В дальнейшем на 60 сутки после окончания моделирования печеночной недостаточности по способу-прототипу выявляются ложные дольки, окруженные тонкими прослойками соединительной ткани; в то же время на аналогичном сроке по заявленному способу идет более выраженное формирование ложных долек на фоне склерозирования сосудов, что усиливает ишемизацию и тяжесть повреждения печени.

На фиг. 10 и 11 изображена гистологическая картина тяжелого токсического повреждения печени: печень крысы после окончания моделирования печеночной недостаточности на 60 сутки. Ув.х200 фиг. 10 - по способу-прототипу, ложные дольки; фиг. 11 - по заявленному способу: усиленное формирование ложных долек на фоне склерозирования сосудов.

На 90 сутки наблюдения изображения ложных долек по способу-прототипу постепенно нивелируются, тогда как по заявленному способу рисунок ложных долек был усилен. На фиг. 12 и 13 представлена печень крысы после окончания моделирования печеночной недостаточности на 90 сутки. Фиг. 12 - по способу-прототипу - постепенное нивелирование ложных долек. Фиг. 13 - по заявленному способу - продолжающееся усиленное формирование ложных долек.

Подтверждением микроскопических исследований структуры печени являются морфометрические исследования печени, проведенные в динамике и представленные в таблице. В таблице представлены результаты морфологической характеристики ткани печени после моделирования печеночной недостаточности по способу-прототипу и по заявленному способу. При гистологическом исследовании печени после затравки как в контроле, так и при моделировании печеночной недостаточности по заявленному способу нарушается дольковое строение печени по сравнению с интактной (здоровой) печенью.

Из данной таблицы видно, что на 30, 60 и 90 сутки наблюдения имеют место достоверно более высокие цифры содержания в печени гепатоцитов с признаками жировой дистрофии, гепатоцитов с дегенерирующими ядрами и гепатоцитов с внутриядерными липидными включениями в опытах с моделированием печеночной недостаточности по заявленному способу по сравнению с моделированием печеночной недостаточности по способу-прототипу.

Имеют место также достоверно более высокие цифры удельной площади соединительной ткани в печени при моделировании печеночной недостаточности по заявленному способу на 90-е сутки после затравки.

Полученные результаты показывают, что использование неполного адъюванта Фрейнда усиливает токсическое повреждение паренхимы печени, а поддерживаемое в печени воспаление тормозит восстановительные процессы в ней, поэтому данная модель не только воспроизводит большую тяжесть повреждения, но и тормозит развитие спонтанных восстановительных процессов, которые имеют место в опытах с моделированием печеночной недостаточности по способу-прототипу.

Способ моделирования тяжелой хронической печеночной недостаточности, включающий подкожное введение крысе 60% масляного раствора CCl₄, отличающийся тем, что на первом этапе моделирования 60% масляный раствор CCl₄ вводят по следующей схеме: сначала по 0,5 мл на 100 г веса животного 2 раза в неделю в течение 2-х недель с интервалом 3-4 дня, а затем по 0,3 мл на 100 г веса животного 2 раза в неделю с интервалом 3-4 дня также в течение 2-х недель; далее на втором этапе в течение последующих трех недель продолжают введение 60% масляного раствора CCl₄ в дозе 0,5 мл на 100 г веса 1 раз в неделю, при этом на втором этапе за сутки до введения 60% масляного раствора CCl₄ внутрибрюшинно вводят 1 мл неполного адъюванта Фрейнда.