Способ получения l-a-глицерофосфорилхолина фармакопейного качества
Изобретение относится к способу получения L-α-глицерофосфорилхолина фармакопейного качества и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Предложенный способ включает этапы, на которых сорбируют L-α-глицерофосфорилхолин из метанольного обезжиренного раствора L-α-глицерофосфорилхолина, полученного переэтерификацией лецитина, на катионите в среде безводного растворителя, элюируют его с катионита обессоленной водой, обесцвечивают элюат активированным углем, очищают от минеральных и органических солей на ионообменных смолах и концентрируют, при этом сорбцию и элюирование с катионита проводят при пониженной температуре 0÷5°C, а перед концентрированием применяют фильтрацию через стерилизующий фильтр. Предложен новый эффективный способ получения ценного вещества с высоким выходом и чистотой. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно к методам выделения целевого компонента, обладающего фармацевтической активностью, из продуктов переработки растительного сырья.
Целью изобретения является способ получения L-α-глицерофосфорилхолина со степенью чистоты, соответствующей фармакопейным требованиям (международное непатентованное название активной фармацевтической субстанции - холина альфосцерат гидрат).
Из уровня техники известны следующие решения
Известен способ получения L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина из соевого или яичного лецитина, включающий алкоголиз лецитина, последующее формирование нерастворимого осадка в виде комплекса с солями цинка, отделение осадка, разрушение комплекса органическими основаниями, такими, как пиридин, лутидин и т.п., и финальную очистку целевого продукта на ионообменных смолах (Европейский патент №0217765, "Process for the preparation of L-α-glycerylphosphorylcholine, L-α-glycerylphosphorylethanolamine from crude and/or deoleated lecithins", опубликован 16.08.1990).
Недостатками этого решения является применение токсичных солей цинка и органических оснований, затрудняющих очистку продукта до фармакопейного уровня, и наличие отходов, вызывающих повышенную нагрузку на окружающую среду.
Также известен способ получения L-α-глицерофосфорилхолина (Патент США №8658401 «Method for Preparing High Purity L-alpha-Glycerylphosphorylcholine», опубликован 25.02.2014), в котором лецитин подвергают ферментативному гидролизу с использованием фермента фосфолипазы, дальнейшая обработка включает обессоливание продукта на ионообменных смолах и финишную очистку от примесей на колонне с силикагелем.
Недостатками этого решения является использование для очистки силикагеля, обладающего невысокой емкостью по нагрузке, что вызывает увеличение размеров оборудования и повышенный расход растворителей, нуждающихся затем в регенерации. Кроме того, в методе не предусмотрены меры обеспечения микробиологической чистоты продукта и его апирогенности (отсутствия бактериальных эндотоксинов).
Наиболее близким аналогом предлагаемого решения является способ получения L-α-глицерофосфорилхолина, описанный в патенте США №5250719 «Process for the preparation of L-α-glycerylphosphorylcholine and of L-α-glycerylphosphorylethanolamine», опубликованном 05.10.1993, включающий нанесение на катионообменную смолу в Н+-форме в безводном растворителе спиртового экстракта переэтерифицированного лецитина, промывку смолы спиртом или водно-спиртовым раствором, выделение очищенной смеси L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина путем промывки смолы водой, разделение смеси на анионите в ОН--форме с получением чистых L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина.
Недостатком прототипа является неудовлетворительная для фармакопейного качества чистота продукта, вызванная присутствием бактериальных эндотоксинов, продуктов разложения L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина, катализируемого катионитом, а также возможное микробиологическое загрязнение водных растворов сверх допустимых норм.
Техническим результатом предлагаемого решения является повышение качества продукта до уровня фармакопейного.
Указанный технический результат достигается за счет способа получения L-α-глицерофосфорилхолина, включающего сорбцию L-α-глицерофосфорилхолина из метанольного обезжиренного раствора L-α-глицерофосфорилхолина, полученного переэтерификацией лецитина, на катионите в среде безводного растворителя, последующее элюирование его с катионита обессоленной водой, обесцвечивание элюата активированным углем, финишную очистку от минеральных и органических солей на ионообменных смолах и концентрирование, при этом с целью достижения фармакопейного качества сорбцию и элюирование с катионита проводят при пониженной температуре, а перед концентрированием применяют фильтрацию через стерилизующий фильтр.
Температура процессов сорбции и элюирования с катионита поддерживается в интервале 0÷5°C за счет охлаждения потоков в теплообменнике холодильной машиной, либо другим методом.
С целью достижения микробиологической чистоты и одновременного удаления бактериальных эндотоксинов для фильтрации применяют стерилизующий фильтр с Z-потенциалом поверхности.
Повышение качества получаемого продукта до фармакопейного достигается за счет уменьшения разложения целевого продукта при очистке его на катионите при пониженной температуре, стерилизующей фильтрации раствора продукта через фильтр с рейтингом фильтрации 0,20÷0,22 мкм и заряженной поверхностью фильтра (так называемый фильтр с Z- или Zeta-потенциалом).
Разложение (гидролиз) L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина на катионите в Н+-форме происходит из-за снижения величины рН (процесс происходит в кислой среде). В кислой среде, по литературным данным, процесс гидролиза идет в две стадии: на первой стадии происходит отщепление холина или этаноламина с образованием глицерофосфорной кислоты, на второй стадии проходит отщепление глицерина с образованием фосфорной кислоты (G. Shmidt, M.J. Bessman, S.J. Thannhauser. J.Biol. Chem. 1953, 203, 849-853).
Отщеплению холина или этаноламина предшествует изомеризация молекулы α-формы в β-форму через промежуточное циклическое соединение, что дает равновесную смесь α- и β- глицерофосфорных кислот (Lecithins: Sources, Manufacture & Uses (Ed: B.F. Szuhaj), AOCS monograph, Illinois 1989)
В статических условиях заявителем установлено влияние температуры на разложение L-α-глицерофосфорилхолина при контакте с катионитом в Н+-форме (см. Пример 1).
Пример 1
Суспензию из 100 мл 5% водного раствора L-α-глицерофосфорилхолина (GPC) и 100 мл влажного сильнокислотного макропористого катионита в Н+-форме перемешивают в колбе роторного испарителя, находящейся на водяной бане с температурой 40°C, периодически отбирая пробу жидкости для анализа на содержание GPC методом ВЭЖХ. Наблюдаемое снижение концентрации GPC с течением времени приведено в Таблице 1.
Аналогичную суспензию из 100 мл 5% водного раствора L-α-глицерофосфорилхолина (GPC) и 100 мл влажной влажного сильнокислотного макропористого катионита в Н+-форме перемешивают магнитной мешалкой в стеклянном закрытом стакане, находящемся в бане со льдом (температура реакционной смеси составляет 2°C), периодически отбирая пробу жидкости для анализа на содержание GPC методом ВЭЖХ. Наблюдаемое снижение концентрации GPC с течением времени приведено в Таблице 2.
Из данных таблиц 1 и 2 видно, что скорость разложения GPC, определяемая по убыли его концентрации в растворе, контактирующем с катионитом, в 6 раз ниже при температуре 2°C, нежели при температуре 40°C. Соответственно и скорость накопления примесей продуктов разложения, наиболее трудноудаляемой из которых является глицерин, существенно меньше при низких температурах.
Положительный технический эффект предлагаемого решения, а именно - очистка L-α-глицерофосфорилхолина на катионите при пониженной температуре в сочетании с фильтрацией получаемого продукта на фильтре с Z-потенциалом виден из примеров 2 и 3.
Пример 2
Метанольный раствор, полученный при переэтерификации лецитина в присутствии метилата натрия с последующим отделением жирных кислот, содержащий 3.19 г GPC при его концентрации в растворе около 11%, прокачивают перистальтическим насосом через колонку с 85 см3 макропористым сильнокислотным катионитом в Н+-форме, уравновешенной метанолом, при температуре +23°C. Отмывают колонку метанолом температурой 22÷23°C. После отмывки метанолом пропускают через колонку дистиллированную воду температурой 22÷23°C, собирают фракции, содержащие элюированный L-α-глицерофосфорилхолин. По результатам анализа в полученном элюате содержится 2.49 г GPC, то есть выход составляет 78%.
Полученные фракции обесцвечивают перемешиванием с активированным углем, отфильтровывают на фильтре с пористостью 40 мкм, фильтрат прокачивают перистальтическим насосом последовательно через колонки со слабоосновным анионитом в форме свободного основания, сильноосновным анионитом в ОН--форме и слабокислотным катионитом в Н+-форме. Полученный обессоленный и обесцвеченный раствор концентрируют в вакуумном роторном испарителе роторного испарителя до концентрации 84% по сухому веществу. Получают продукт, в котором содержание примесей 5%, что превышает норму. Продукт также содержит сверхнормативное количество микроорганизмов и эндотоксинов (см. Таблицу 3).
Пример 3
Метанольный раствор, полученный при переэтерификации лецитина в присутствии метилата натрия с последующим отделением жирных кислот, содержащий 4.5 кг GPC при его концентрации в растворе около 12%, прокачивают плунжерным насосом после охлаждения в теплообменнике холодильной машины через колонну со 120 л макропористого сильнокислотного катионита в Н+-форме, уравновешенной метанолом, при температуре +5°C. Отмывают колонку метанолом температурой +5°C. После отмывки метанолом прокачивают через колонну охлажденную обессоленную воду температурой 1÷5°C, собирают фракции, содержащие элюированный L-α-глицерофосфорилхолин. По результатам анализа в полученном элюате содержится 4.43 кг GPC, то есть выход составляет 94%.
Полученные фракции обесцвечивают перемешиванием с активированным углем, отфильтровывают на нутч-фильтре с фильтротканью. Фильтрат прокачивают плунжерным насосом последовательно через колонки со слабоосновным анионитом в форме свободного основания, сильноосновным анионитом в ОН--форме и слабокислотным катионитом в Н+-форме. Полученный обессоленный и обесцвеченный раствор фильтруют через капсульный фильтр с с рейтингом фильтрации 0,22 мкм, в котором фильтрующий материал (например, Nylon-66) несет поверхностный Z-потенциал. Фильтрат концентрируют в вакуумном роторном испарителе роторного испарителя до концентрации 84,5% по сухому веществу. Получают продукт, в котором содержание примесей менее 4%,
Продукт также соответствует фармакопейным требованиям по микробиологической чистоте и содержанию бактериальных эндотоксинов (см. Таблицу 3).
1. Способ получения L-α-глицерофосфорилхолина фармакопейного качества, характеризующийся тем, что включает этапы, на которых сорбируют L-α-глицерофосфорилхолин из метанольного обезжиренного раствора L-α-глицерофосфорилхолина, полученного переэтерификацией лецитина, на катионите в среде безводного растворителя, элюируют его с катионита обессоленной водой, обесцвечивают элюат активированным углем, очищают от минеральных и органических солей на ионообменных смолах и концентрируют, отличающийся тем, что сорбцию и элюирование с катионита проводят при температуре 0÷5°C, а перед концентрированием применяют фильтрацию через стерилизующий фильтр.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что температуру процессов сорбции и элюирования с катионита поддерживают в интервале 0÷5°C за счет охлаждения потоков.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для фильтрации применяют стерилизующий фильтр с Z-потенциалом поверхности.
