Способ детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода барретта
Владельцы патента RU 2635964:
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет) (ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)) (RU)
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода Барретта. В образцах слизистой пищевода, полученных в ходе биопсии при эндоскопическом исследовании, определяют метилирование промоторных районов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом метилчувствительной ПЦР. При обнаружении аномального метилирования хотя бы одного из указанных генов делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 10 раз. Изобретение обеспечивает повышение точности при диагностике риска малигнизации эпителия пищевода. 1 ил., 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может найти применение в диагностике аденокарциномы пищевода (АКП) и прогнозе развития пищевода Барретта (ПБ).
В основе развития ПБ лежат процессы метаплазии эпителия пищевода, при которых вследствие рефлюкса желудочного сока и желчных кислот, нормальный плоскоклеточный эпителий пищевода замещается цилиндрическим эпителием кишечного типа, и затем ПБ прогрессирует до дисплазии и аденокарциномы (АК) пищевода. Прогрессия от предраковых состояний до опухоли связана с появлением в клетках нарушений генома, которые ассоциированы со злокачественной трансформацией. Генетические и эпигенетические изменения, обусловливающие опухолевый рост, могут служить маркерами прогноза клинического течения заболевания.
KazA. М. и соавт. в 2011 году опубликовали результаты полногеномных исследований профилей метилирования ДНК при ПБ и АК пищевода, в которых показали значительные различия в профилях метилирования этих процессов, а также позволили идентифицировать десятки генов, метилирование которых различается при этих состояниях [Kaz A.M., Wong C. J., LuoY., Virgin J.B., et al. DNA methylation profiling in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma reveals unique methylation signatures and molecular subclasses. Epigenetics. 2011; (6:12): 1403-1412]. Однако чтобы собрать метилированные гены в системы, которые можно использовать в практической медицине, необходимо проводить их исследование на различных выборках больных с получением статистически значимых ассоциаций.
Smith E. и соавт. (2008) определяли метилирование 9 генов (АРС, CDKN2A, ID4, MGMT, RBP1, RUNX3, SFRP1, TIMP3 и TMEFF2) в образцах пациентов с ПБ, АК пищевода и нормальном эпителии установили, что частота метилирования для CDKN2A и RUNX3 была значительно выше для АК по сравнению с образцами пациентов с ПБ [Smith E., De Young N.J., Pavey S.J., Hayward N.K., Nancarrow D.J., Whiteman D.C., et al. Similarity of aberrant DNA methylation in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Mol. Cancer. 2008; 7: 75].
ZheJinetal. (2009) в двойном-слепом мультицентровом исследовании изучили аномальное метилирование панели генов (р16, RUNX3, НРР1, NELL1, ТАС1, SST, AKAP12 и CDH13) в 195 образцах биопсий эпителия пищевода у больных пищеводом Барретта с целью использования данных маркеров для оценки риска прогрессии заболевания [Zhe Jin, Yulan Cheng, Wen Gu et al. А multicenter, double-blinded validation study of methylation biomarkers for progression prediction in Barrett's esophagus. Cancer Res. 2009; 69(10): 4112-4115]. Было показано, что метилирование генов НРР1, p16 и RUNX3 выявляется достоверно чаще при прогрессировании ПБ до дисплазии высокой степени и АК пищевода, (р=0.0025, 0.0066 и 0.0002 соответственно) в сравнении с остальными 5 маркерами из исследованной панели. Использование всей панели из 8 генов позволило выявить более 50% больных ПБ с прогрессией до дисплазии высокой степени и АК пищевода, которые не смогли выявить на столь раннем этапе диагностики без применения биомаркеров. Специфичность панели по данным авторов достигала 90%, а чувствительность достигала 50%.
Timmer M.R. et al. исследовали систему маркеров, в которую входили структурные изменения локусов 8q24 (MYC), 9р21 (CDKN2A/p16), 17q12 (erbB2/HER-2/Neu), и 20q13.2 (ZNF217). В материале, полученном от 181 пациентов с ПБ, у которых проводилось консервативное лечение с применением эндоскопической резекции слизистой в сочетании с медикаментозной терапией, исследовали структурные изменения локусов 8q24 (MYC), 9р21 (CDKN2A/p16), 17q12 (erbB2/HER-2/Neu), и 20q13.2 (ZNF217) [Timmer M.R., Brankley S.M., et al. Prediction of Response to Endoscopic Therapy of Barrett's Dysplasia using Genetic Biomarkers. Gastrointest Endosc. 2014; 80(6): 984-991]. Авторы наблюдали полную регрессию изменений слизистой у 72% больных и прогрессию у 16% пациентов. Изменения копийности исследуемых локусов изучаемой панели авторы наблюдали у 88/181 (44%) больных.
На сегодняшний день сертифицированных тест-систем и способов ДНК-диагностики не существует.
Задачей изобретения является ранняя диагностика аденокарциномы пищевода.
Поставленная задача решается способом детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода Барретта, заключающимся в том, что в образцах слизистой пищевода, полученных в ходе биопсии при эндоскопическом исследовании, определяют метилирование промоторных районов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом метилчувствительной ПЦР и при обнаружении аномального метилирования хотя бы одного из указанных генов делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 10 раз.
Выделение геномной ДНК из опухолевого материала
Для получения ДНК ткани опухоли использовали следующий метод выделения ДНК.
Ткань опухоли или материал, полученный с помощью эндоскопии, отмывали 1 mlPBS, измельчали и затем гомогенизировали, растирая со стеклом.
Гомогенат переносили в пробирку, затем добавляли экстракционный буфер (10 мМ Tris-HCl, 2 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCl, рН=8,0) и протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0,5%.
Инкубировали 2 часа при 37°С до получения прозрачного раствора. Далее проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформом с последующим центрифугированием и отбором верхней фазы.
Полученный в результате раствор ДНК перемешивали с 1/10 объема 5 М ацетата натрия, рН 5,3 и ДНК осаждали с помощью 2,5 объемов холодного 96% этанола, выдерживали образец 30 мин при температуре -70°С.
Пробу центрифугировали при 0°С 15 мин с ускорением 12000 g. Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН 8,0.
Выход ДНК составлял 25-50 мкг на 1 г ткани, в случае эндоскопического материала выход ДНК соответствовал примерно 5 мкг на образец.
После полного растворения ДНК измеряли ее концентрацию на спектрофлюориметре фирмы «Hoefer» (Германия) и снимали спектр поглощения в диапазоне от 220 до 320 нм с целью определения чистоты ДНК.
При этом проверяли выполнение следующих условий: отношение поглощения на длинах волн 230 нм/260 нм<0,5, 260 нм/280 нм>1,8. Максимум поглощения наблюдался в районе 260 нм.
Рестрикционный анализ
Для определения аномального метилирования проводилась обработка опухолевой ДНК соответствующей метилчувствительной рестриктазой HpaII по следующей схеме: к 1000 нг геномной ДНК добавляли 10 е.а. фермента и 2 мкл соответствующего 10×буфера, доводили до 20 мкл дистиллированной водой и оставляли на 10 часов в термостате при температуре, оптимальной для используемой рестриктазы.
Определение аномального метилирования промоторных областей генов-супрессоров опухолевого роста генов МGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3
Метилирование CpG-островков промоторных областей генов определяли при помощи метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин.
В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК гидролизованную метилчувствительными рестриктазами HpaII (CCGG) или HhaI (CGCG). Геномную ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед активной рестриктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение ночи.
Для амплификации использовали 150 нг гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтов узнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте, который содержал не менее трех-четырех HpaII или HhaI сайтов. Количество сайтов указано в таблице 1.
В случае модификации цитозинов в метилцитозин ДНК не гидролизуется, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования сайтов узнавания для используемых рестриктаз ДНК полностью гидролизуется и продукт ПЦР не образуется.
Для исключения ложноотрицательных результатов проводили мультилокусные ПЦР с двумя парами праймеров: один фрагмент принадлежал изучаемому гену {MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3), другой служил внутренним контролем ПЦР, фрагмент гена НВВ или фрагмент гена CUX1, не содержащие сайтов узнавания указанных рестриктаз (таблица 1).
ПЦР проводили по следующей схеме:
- к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,4), 5 мМ MgCl2, 10% диметилсульфоксида;
- затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95°С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95°С - 30 с, отжиг и элонгация при 58-62°С - 2 мин 30 с.
Разделение продуктов ПЦР в 8%-ном полиакриламидном геле методом вертикального электрофореза.
Разделение ПЦР-продуктов по молекулярной массе при анализе метилирования проводили с помощью вертикального электрофореза в 8%-ном ПААГ следующего состава: 8.4 мл 30%-го раствора акриламида, 0.6 мл 10%-го персульфата аммония, 26 мкл ТЕМЕД, до 30 мл разведенного буфера ТВЕ. Персульфат аммония и ТЕМЕД вносят после всех остальных компонентов и тщательно перемешивают полученную смесь. Электрофорез проводят при напряжении 400 В с использованием камеры для вертикального фореза («Хеликон», Москва) в течение 2.0-3.0 часов.
В качестве контроля молекулярной массы ДНК используют ДНК стандартного молекулярного веса pUC19/Msp1. Визуальный контроль пробега проб ДНК проводят по ксиленцианолу и бромфеноловому синему. Окрашивание геля нитратом серебра для визуализации продуктов ПЦР проводят по приведенной ниже методике.
Ультратонкое окрашивание нитратом серебра
Окрашивание гелей проводят по усовершенствованной методике Liberman. После электрофореза гель инкубируют в растворе 0,011 М AgNO3 в течение 10-15 минут, затем трижды промывают в дистиллированной воде. Проявление проводят в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75 М NaOH; 0,5 М НСНО; 2,3 mM Na(BH4) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивности проявления геля.
Оптимальные критерии интерпретация результатов исследования
Если в ДНК, полученной из биопсийного материала или опухоли, присутствует аномальное метилирование промоторов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3, то цитозины в составе CpG-динуклеотидов заменены на 5-метилцитозины, в том числе в сайтах узнавания HpaII. В этом случае рестриктаза HpaII не в состоянии гидролизовать геномную ДНК в сайтах узнавания, матрица для МЧ-ПЦР остается интактной. В результате в окрашенном ПААГ видны фрагменты, соответствующие промоторным районам MGMT, CDH1, p16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 (рис. 1). В тех образцах, где метилирование генов отсутствует, происходит гидролиз геномной ДНК в сайтах узнавания HpaII. При первой денатурации матрица для ПЦР разрушается и ПЦР-продукт, соответствующий промотору гена, отсутствует в ПААГ. Внутренний контроль МЧ-ПЦР, не содержащий сайтов узнавания HpaII, должен присутствовать во всех анализируемых образцах. Отрицательный контроль не должен содержать фрагментов, соответствующих ПЦР-продуктам, в положительном контроле должны присутствовать ПЦР-продукты внутреннего контроля и промоторов исследуемых генов.
На фиг. 1 представлены примеры определения метилирования генов MGMT, CDH1, pl6/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом МЧ-ПЦР.
Цифрами обозначены ДНК пациентов с ПБ; положительный сигнал показан стрелкой и в положительных дорожках обозначен звездочками. На геле имеется фрагмент, соответствующий метилированной форме гена, и внутренний контроль ПЦР.
Способ обеспечивает повышение точности ранней ДНК-диагностики риска малигнизации эпителия пищевода. Специфичность предложенной и исследованной нами панели генетических маркеров составила 60%, а чувствительность 86%. У больных с аномальным метилированием вероятность прогрессии заболевания почти в 10 раз выше (OR=9,559).
У 60 больных, проходивших оперативное лечение в клинике факультетской хирургии им. Н.Н. Бурденко Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по поводу рефлюкс-эзофагита, осложненного пищеводом Барретта, до и после операционного лечения выполняли исследование метилирования генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3. Из 60 пациентов с ПБ у 32 определяли метаплазию эпителия пищевода, у 28 - дисплазию эпителия. Также аномальное метилирование генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 исследовали в операционных образцах у 34 больных с аденокарциномой пищевода.
Было выявлено достоверное возрастание частоты метилирования генетических маркеров по мере прогрессирования стадии опухолевого процесса от IA и IIA до IIIC и IV (р=0,0084).
Аномальное метилирование исследуемой генетической панели у больных ПБ до хирургического лечения достоверно чаще наблюдали в измененном эпителии по сравнению с неизмененным (р<0,0001), при дисплазии, при сравнении с метаплазией (р=0,0358) и при наличии длинных (>3 см) сегментов измененного эпителия, выявленных в результате эндоскопического исследования, по сравнению с короткими (<3 см) (р=0,0068). В нормальном эпителии до операции аномальное метилирование панели генов определяли у 7/60(12%) пациентов. В измененном эпителии наблюдали статистически значимое снижение частоты метилирования после лечения (р=0,0024).
Гены, используемые нами в системе, характеризуются высокой частотой метилирования и клинически значимыми ассоциациями. В нашем исследовании мы не стремились определить частоты метилирования отдельных генов, а использовали все гены в панели, чтобы сделать различия более достоверными.
Специфичность предложенной и исследованной нами панели генетических маркеров {MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3) составила 60%, а чувствительность 86%. Таким образом, у больных группы мет + вероятность прогрессии заболевания почти в 10 раз выше (OR=9,559). При этом в нашем исследовании мы тестировали результаты проведенной антирефлюксной операции и соотносили его с показаниями эндоскопического исследования.
Анализируя полученные результаты, можно сказать, что использование предложенной нами системы молекулярно-генетических маркеров у больных пищеводом Барретта позволяет на раннем этапе диагностировать и осуществлять мониторинг данной группы пациентов с целью формирования группы риска развития АК пищевода.
Способ детекции молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с прогрессией пищевода Барретта, заключающийся в том, что в образцах слизистой пищевода, полученных в ходе биопсии при эндоскопическом исследовании, определяют метилирование промоторных районов генов MGMT, CDH1, р16/CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом метилчувствительной ПЦР и при обнаружении аномального метилирования хотя бы одного из указанных генов делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 10 раз.