Человеческие антитела и конъюгаты антитело-препарат против cd74

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлены варианты антител, которые связываются с вариантами 1 и 2 CD74 человека. Представлена рекомбинантная клетка-хозяин, которая вырабатывает указанный вариант антитела. Представлены композиции для лечения и профилактики рака, содержащие указанный вариант антитела. Группа изобретений позволяет эффективно и избирательно вызывать гибель опухолевых клеток, экспрессирующих CD74, что может быть использовано при лечении раковых заболеваний. 12 н. и 43 з. п. ф-лы., 15 ил., 14 табл., 25 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается специфичных к CD74 антител и их конъюгатов с лекарственными препаратами (ADCs), фармацевтических композиций таких антител или ADCs и их лечебного применения.

Уровень техники

Гамма-цепь лейкоцитарных антигенов человека (HLA) из комплекса гистосовместимости II класса, также известная как связанная с антигеном HLA-DR инвариантная цепь, связанная с антигеном Ia инвариантная цепь, Ii или CD74, представляет собой трансмембранный белок с коротким цитоплазматическим хвостом. Главной функцией CD74 является регулирование посадки пептидов на гетеродимеры главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса во внутриклеточных компартментах.

Лишь небольшая часть от общего содержания CD74 в клетках экспрессируется на клеточной поверхности. Находящийся на клеточной поверхности CD74 очень быстро интернализируется как с антителами к CD74, так и без них (Roche PA et al., PNAS 1993, 90:8581-8585; Hansen HJ et al., Biochem J 1996, 320:293-300; Ong GL et al., Immunology 1999, 98:296-302). Стационарный уровень CD74 на клеточной поверхности является довольно низким и колеблется у моноцитов от нескольких сотен до нескольких тысяч молекул на клетку.

Точная функция экспрессированного на клеточной поверхности CD74 не известна, но исследования показали, что CD74 является мембранным рецептором для провоспалительного цитокина - фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF). Связывание MIF с CD74 активирует нижележащую передачу сигнала через пути МАРК и Akt и способствует пролиферации и выживанию клеток. Это взаимодействие, вероятно, также регулируется наличием CD44, CXCR2 или CXCR4 в качестве корецепторов.

Усиление экспрессии CD74 наблюдалось при многих видах рака, а также при некоторых инфекциях и воспалительных заболеваниях. Для лечения положительных на CD74 опухолей предлагались различные форматы гуманизированного специфичного к CD74 моноклонального антитела - hLL1 (Chang CH et al., Blood 2005, 106:4308-4314; Sapra P et al., Clin Can Res 2005, 11:5257-5264; Stein R et al., Blood 2004, 104:3705-11; Govindan SV et al., J Nucl Med 2000, 41:2089-2097; Hertlein E et al., Blood 2010; 116:2554-2558; Stein R et al., Clin Cancer Res 2009, 15:2808-2817; Sharkey RM et al., J Nucl Med 2009, 50:444-453; Lundberg BB et al., Drug Deliv 2007, 14:171-175; Griffiths GL et al., Int J Cancer 1999, 81:985-992; Griffiths GL et al., Cancer Res 2003, 9:6567-6571; Ochakovskaya R et al., Clin Cancer Res 2001, 7:1505-1510; Shin L et al., Cancer Immunol Immunother; Burton JD et al., Clin Cancer Res 2004, 10:6606-6611; Lundberg BB et al., J Control Release 2004, 94:155-161).

Несмотря на то что уже достигнут значительный прогресс, все еще остается потребность в улучшении способов лечения серьезных заболеваний, например, улучшении лечения рака, на основе терапевтических антител и ADCs.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является получение новых высокоспецифичных и эффективных моноклональных специфичных к CD74 антител и ADCs из таких специфичных к CD74 антител. Антитела или ADCs по изобретению проявляют характеристики связывания CD74 или другие эффекты на экспрессирующие CD74 клетки, отличные от антител, описанных в данной области. В частности, антитела характеризуются быстрой интернализацией после связывания с антигеном CD74, что делает их пригодными для терапевтического применения в виде ADCs и для других применений, в которых быстрая интернализация является преимуществом. Новые ADCs характеризуются высокой эффективностью при уничтожении экспрессирующих CD74 опухолевых клеток.

Антитела и соответствующие ADCs могут быть представлены в различных форматах, включая, без ограничения, форматы фрагментов антител и биспецифических антител. В предпочтительных воплощениях антитела представляют собой человеческие антитела.

Также целью настоящего изобретения является получение ADCs на основе таких специфичных к CD74 антител для медицинского применения, обеспечивающих эффективный и избирательный способ причинения гибели опухолевых клеток.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения описаны более подробно ниже.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Аминокислотные последовательности рекомбинантных белков CD74, использовавшихся в примерах. CD74v1 и -v2, CD74de12-36v1 и -v2, HisCD74v1 и -v2 соответствуют SEQ ID NOs:1-6 соответственно.

Фиг.2. Совмещение последовательностей вариабельной области тяжелой (V_H) и легкой (V_L) цепи антител настоящего изобретения. SEQ ID NO:каждой последовательности V_H/V_L приведен в круглых скобках справа от последовательности. Участки, определяющие комплементарность (CDRs) по номенклатуре IMGT, выделены следующим образом: последовательности CDR1 выделены курсивом, последовательности CDR2 подчеркнуты, а последовательности CDR3 выделены жирным шрифтом.

Фиг.3. Связывание специфичных к CD74 антител с рекомбинантным белком, представляющим внеклеточный домен изоформ варианта 1 и 2 (CD74v1 и CD74v2), при определении методом ELISA. Все человеческие антитела были получены путем кратковременной котрансфекции клеток HEK-293F векторами, экспрессирующими соответствующие тяжелые и легкие цепи.

Фиг.4. Связывание специфичных к CD74 антител с клеточным CD74 на клетках Raji при определении методом FACS. Все человеческие антитела были получены путем кратковременной котрансфекции клеток HEK-293F векторами, экспрессирующими соответствующие тяжелые и легкие цепи.

Фиг.5. Перекрестная реактивность специфичных к CD74 антител с CD74 макаки яванской. Лимфатические узлы миндалин человека (верхняя панель) и яванской макаки (нижняя панель) окрашивали с помощью специфичных к CD74 антител. Зародышевый центр; Mf - макрофаги; ^# В-клетки области мантии.

Фиг.6. Дозозависимая индукция уничтожения клеток специфичными к CD74 антителами, предварительно проинкубированными с анти-каппа-ЕТА'. Представлен репрезентативный эксперимент. Данные представлены в виде среднего процента жизнеспособности по двойным лункам клеток, обработанных предварительно проинкубированными с анти-каппа-ЕТА' антителами HuMab к CD74. Процент жизнеспособности рассчитывали так, как описано в примере 14.

Фиг.7. Связывание антител HuMab к CD74 №005 и 006 (А) и 011 (В) и соответствующих ADCs с рекомбинантным белком внеклеточного домена CD74v1 при определении методом ELISA. Представлен один репрезентативный эксперимент.

Фиг.8. Связывание антител HuMab к CD74 №005 и 006 (А) и 011 (В) и соответствующих ADCs с экспрессированным на поверхности. CD74 при определении методом FACS на клетках Daudi. Данные представлены в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI), рассчитанной из трех независимых экспериментов.

Фиг.9. Дозозависимая индукция уничтожения клеток специфичными к CD74 ADCs. Представлен один репрезентативный эксперимент для каждой из следующих клеточных линий: Daudi (А), Raji (В), М4А4 (С) и клетки NCI-H747 (D). Данные представлены в виде процента выживаемости по двойным лункам клеток, обработанных специфичными к CD74 ADCs.

Фиг.10. Эффективность in vivo специфичных к CD74 ADCs при терапевтическом лечении ксенотрансплантатов Daudi-luc у мышей SCID. Мышей с привитыми опухолями Daudi-luc обрабатывали специфичными к CD74 ADCs. Данные представлены в виде средних значений биолюминесценции на снимках (BLI)±S.E.M. на группу (n=7 мышей в группе).

Фиг.11. Эффективность in vivo специфичных к CD74 ADCs при терапевтическом лечении ксенотрансплантатов Raji-luc у мышей SCID. Мышей с привитыми опухолями Raji-luc обрабатывали специфичными к CD74 ADCs. Данные представлены в виде средних значений BLI±S.E.M. на группу (n=7 мышей в группе).

Фиг.12. Эффективность in vivo специфичных к CD74 ADCs при терапевтическом лечении ксенотрансплантатов Raji у мышей SCID. Мышей с привитыми s.c. опухолями Raji обрабатывали специфичными к CD74 ADCs. Данные представлены в виде среднего объема опухолей ± S.E.M. на группу (n=6 мышей в группе).

Фиг.13. Эффективность in vivo ADCs против CD74 при терапевтическом лечении ксенотрансплантатов М4А4 у мышей SCID. Мышей с привитыми опухолями М4А4 обрабатывали ADCs против CD74. Данные представлены в виде среднего объема опухолей ± S.E.M. на группу (n=7 мышей в группе).

Фиг.14. Определение значений k_off у специфичных к CD74 антител HuMab. Представлен один репрезентативный эксперимент. Данные представлены в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI) по тройным лункам клеток, инкубированных с меченными красителем Alexa Fluor 488^® антителами HuMab к CD74, с последующей инкубацией с немечеными антителами HuMab к CD74 в течение указанных промежутков времени.

Фиг.15. Временная зависимость интернализации и накопления антител HuMab против CD74. Представлен один репрезентативный эксперимент для каждой линии клеток. Данные представлены в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI) по двойным лункам клеток, инкубированных с меченными Alexa-488 антителами HuMab против CD74. Клетки Daudi инкубировали с меченными Alexa-488 антителами HuMab против CD74 при 4°С (А) или 37°С (В). Клетки Raji (С) и клетки М4А4 (D) инкубировали при 37°С.

Фиг.16. Эффективность in vivo антител HuMab против CD74 при профилактическом лечении ксенотрансплантатов Daudi-luc у мышей SCID. Мышей обрабатывали антителами HuMab против CD74 в пределах одного часа после внутривенной инокуляции опухолей Daudi-luc. Данные представлены в виде средних значений BLI±S.E.M. на группу (n=7 мышей в группе).

Раскрытие сущности изобретения Определения

Термины "CD74" и "антиген CD74" используются здесь взаимозаменяемо. Если не указано иначе, эти термины охватывают любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD74 человека, которые экспрессируются клетками в природе или экспрессируются на клетках, трансфецированных геном CD74. Как известно, у человека существует по меньшей мере четыре изоформы: р43, р41, р35 и рр33 (Borghese F et al., Expert Opin Ther Targets 2011, 15(3):237-251). Они образуются в результате альтернативного сплайсинга транскриптов и двух сайтов начала трансляции. Белок р43 (также известный как изоформа 1, изоформа а или "длинная" изоформа CD74; см. запись Р04233-1 в UniProt и эталонную последовательность NP 001020330 в NCBI) содержит 296 аминокислот, при этом остатки 73-296 образуют внеклеточную часть. Белковые конструкции CD74, содержащие внеклеточную часть изоформы 1, обозначаются здесь как "вариант 1" или "CD74v1". Белок р35 (также известный как изоформа 2, изоформа b или "короткая" изоформа CD74; см. запись Р04233-2 в Uniprot и эталонную последовательность NP 004346 в NCBI) не содержит остатков 209-272 из внеклеточной части вследствие альтернативного сплайсинга. Белковые конструкции CD74, содержащие внеклеточную часть изоформы 2, обозначаются здесь как "вариант 2" или "CD74v2". Белки р41 и p33 возникают из альтернативного сайта начала трансляции (на 48 п.о. ниже; белок становится короче на 16 аминокислот), что приводит к вариантам, у которых отсутствует сигнал удержания в эндоплазматическом ретикулуме (ER), который находится в пределах этих 16 аминокислот, но имеется такая же внеклеточная часть, как у р43 и р35, соответственно. Последовательность еще одной изоформы (известной как изоформа 3 и изоформа с), в которой остатки 148-160 заменены, а остатки 161-296 отсутствуют, представлена в NP 001020329. Последовательности гомологов CD74 яванской макаки представлены, например, в NCBI: эталонная последовательность ХР_001099491.2 и эталонная последовательность ХР_002804б24.1.

Термином "иммуноглобулин" обозначается класс структурно родственных гликопротеинов, состоящих из двух пар полипептидных цепей: одной пары легких (L) низкомолекулярных цепей и одной пары тяжелых (Н) цепей, причем все четыре соединяются между собой дисульфидными связями. Структура иммуноглобулинов хорошо изучена. Например, см. Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul W., ed., 2^nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Вкратце, каждая тяжелая цепь обычно состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно V_H или VH) и константной области тяжелой цепи (C_H или СН). Константная область тяжелой цепи обычно состоит из трех доменов: C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь обычно состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно V_L или VL) и константной области легкой цепи. Константная области легкой цепи обычно состоит из одного домена, C_L или CL. Как правило, нумерация аминокислотных остатков в константной области производится в соответствии с индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Области V_H и V_L дополнительно подразделяются на участки гипервариабельности (или гипервариабельные участки, которые могут быть гипервариабельными по последовательности и/или образовывать структурно определенные петли), именуемые определяющими комплементарность участками (CDRs), которые чередуются с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FRs). Каждый V_H и V_L, как правило, состоит из трех CDRs и четырех FRs, которые располагаются с N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (см. также Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)).

Термин "антитело" или "Ab" в контексте настоящего изобретения относится к молекуле иммуноглобулина, фрагменту молекулы иммуноглобулина или производному того или другого, которые, обладают способностью к специфическому связыванию с антигеном при обычных физиологических условиях со временем полужизни, составляющим значительный промежуток времени, как то: по меньшей мере около 30 мин, по меньшей мере 45 мин, по меньшей мере 1 час, по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 12 часов, 24 часа или больше, 48 часов или больше, около 3, 4, 5, 6, 7 или больше дней и т.д., или любой другой соответствующий функционально определенный период (к примеру, время, достаточное, чтобы индуцировать, способствовать, усиливать и/или модулировать физиологическую реакцию, связанную со связыванием антитела с антигеном, и/или время, достаточное, чтобы антитело приобрело эффекторную активность). Вариабельные области тяжелых и легких цепей молекулы иммуноглобулина содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител (Abs) могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (как то эффекторные клетки) и такие компоненты системы комплемента, как C1q, первый компонент классического пути активации комплемента. Антитело также может быть мультиспецифическим, обладающим специфичностью к двум или нескольким разным эпитопам, обычно не перекрывающимся. Примеры мультиспецифических антител включают биспецифические антитела, диатела и подобные молекулы антител. Как указано выше, термин антитело, если здесь не оговорено иначе или четко не противоречит контексту, включает фрагменты антител, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антител может осуществляться фрагментами полноразмерных антител, например. Fab- и F(ab')₂-фрагментами. Также следует иметь в виду, что термин антитело, если не указано иначе, также охватывает поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAbs), антителоподобные полипептиды типа химерных антител и гуманизированных антител. Полученные антитела могут обладать любым изотипом.

Термины "человеческое антитело", "человеческое Ab" или "HuMab" в настоящем изобретении охватывают антитела, содержащие вариабельные и константные области, происходящие из гаметных последовательностей иммуноглобулинов человека. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, которые не кодируются гаметными последовательностями иммуноглобулинов человека (например, мутации, введенные при случайном или сайт-специфичном мутагенезе in vitro либо при соматической мутации in vivo). Однако термин "человеческое антитело" в настоящем изобретении не должен включать такие антитела, у которых в каркасные последовательности человека были пересажены последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии других видов млекопитающих, как то мыши.

В настоящем изобретении человеческое антитело "происходит из" определенной гаметной последовательности, если антитело получено из системы, в которой используются последовательности иммуноглобулинов человека, например, при иммунизации трансгенных мышей, несущих гены иммуноглобулинов человека, или при скрининге библиотеки генов иммуноглобулинов человека, причем выбранное человеческое антитело по меньшей мере на 90%, как то: по меньшей мере на 95%, например, по меньшей мере на 96%, как то: по меньшей мере на 97%, например, по меньшей мере на 98% или же 99% идентично аминокислотной последовательности, кодируемой гаметным геном иммуноглобулина. Как правило, за пределами CDR3 тяжелой цепи человеческое антитело, происходящее из определенной гаметной последовательности, должно отличаться не более чем по 20 аминокислотам, например, не более чем 10 аминокислотам, к примеру, не более чем по 9, 8, 7, 6 или 5, к примеру, не более чем по 4, 3, 2, или 1 аминокислоте от аминокислотой последовательности, кодируемой гаметным геном иммуноглобулина.

Термины "моноклональное антитело", "моноклинальное Ab", "композиция моноклонального антитела", "mAb" и т.п. в настоящем изобретении относятся к препаратам молекул антител, состоящим из одинаковых молекул. Композиция моноклонального антитела проявляет одинарную специфичность связывания и сродства к определенному эпитопу. Соответственно, термин "человеческое моноклональное антитело" относится к таким антителам, проявляющим одинарную специфичность связывания, у которых вариабельные и константные области происходят из гаметных последовательностей иммуноглобулинов человека. Человеческие моноклональные антитела могут вырабатываться гибридомой, включающей В-клетки, полученные из трансгенного или трансхромосомного животного, но не человека, к примеру, трансгенной мыши, геном которой содержит трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи человека, слитые с иммортализованными клетками.

В настоящем изобретении термин "изотип" относится к классу иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM), который кодируется генами константной области тяжелой цепи.

Термин "полноразмерное антитело" в настоящем изобретении относится к таким антителам, которые содержат все константные и вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, которые обычно встречаются в антителах данного изотипа.

В настоящем изобретении, если это не противоречит контексту, термин "Fab-плечо" или "плечо" относится к одной паре тяжелая цепь - легкая цепь.

В настоящем изобретении, если это не противоречит контексту, термин "Fc-участок" относится к участку антитела, содержащему по меньшей мере один шарнирный участок, домен C_H2 и домен C_H3.

"Антитело, дефектное по эффекторной функции" или "антитело с дефектом эффекторной функции" относится к таким антителам, у которых существенно понижена или отсутствует способность к активации одного или нескольких эффекторных механизмов, таких как активация комплемента или связывание с Fc-рецептором. Таким образом, антитела, дефектные по эффекторной функции, обладают значительно меньшей или не обладают способностью опосредовать зависимую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC) и/или зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC). Примером таких антител являются антитела изотипа IgG4 или их шарнирно-стабилизированные формы. Другим примером является введение мутаций в Fc-область, способных сильно уменьшить взаимодействие с белками комплемента и Fc-рецепторами. К примеру, см. Bolt S et al., Eur J Immunol 1993, 23:403-411; Oganesyan, Acta Crys. 2008, D64, 700-704; и Shields et al., JBC 2001, 276:6591-6604.

В настоящем изобретении термин "эффекторная клетка" относится к таким иммунным клеткам, которые вовлечены в эффекторную фазу иммунного ответа, в отличие от распознающей и активационной фаз иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например лимфоциты (как то В-клетки и Т-клетки, в том числе цитолитические Т-клетки (CTLs)), клетки-киллеры, нормальные клетки-киллеры, макрофаги, моноциты, тучные клетки и гранулоциты, как то нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Fc-рецепторы (FcRs) и выполняют специфические иммунные функции. В некоторых воплощениях эффекторные клетки способны индуцировать ADCC, типа нормальных клеток-киллеров. Например, моноциты, макрофаги, экспрессирующие FcRs, участвуют в специфическом уничтожении клеток-мишеней и презентации антигенов другим компонентам иммунной системы. В некоторых воплощениях эффекторные клетки могут подвергать фагоцитозу антиген мишени или клетки мишени. Экспрессия определенных FcR на эффекторных клетках может регулироваться такими гуморальными факторами, как цитокины. Эффекторные клетки могут подвергать фагоцитозу антиген мишени либо подвергать фагоцитозу или лизису клетки мишени.

В контексте настоящего изобретения "ADC" означает конъюгат антитело-препарат, что в контексте настоящего изобретения обычно означает специфичное к CD74 антитело, которое соединено с другой молекулой, как описано в настоящей заявке.

"Антитело к CD74", "антитело против CD74", "Ab к CD74", "специфичное к CD74 антитело" или "Ab против CD74" означает такое антитело, описанное выше, которое специфически связывается с антигеном CD74.

В предпочтительном воплощении антитело по изобретению является выделенным. "Выделенное Ab" в настоящем изобретении служит для обозначения таких антител, которые практически не содержат других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с CD74, практически не содержит антител, специфически связывающихся с другими антигенами, чем CD74). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом CD74 человека, может обладать перекрестной реактивностью к другим родственным антигенам, к примеру, из других видов (типа видовых гомологов CD74). Более того, выделенное антитело может практически не содержать и других клеточных материалов и/или химических веществ. В одном воплощении настоящего изобретения в одной четко определенной композиции комбинируются два или несколько "выделенных" моноклональных антител с различными специфичностями связывания антигенов.

В применении к двум или нескольким антителам термин "конкурирует с" или "перекрестно конкурирует с" означает, что два или несколько антител конкурируют за связывание с CD74, например, с вариантом 1 или 2 CD74 или с обоими. Например, при таком анализе могут использоваться конструкции, описанные в примере 1. В одном типичном варианте анализа на планшет наносят CD74 и дают ему связаться с первым антителом, после чего добавляют второе, меченое антитело. Если в присутствии первого антитела снижается связывание второго антитела, это означает, что антитела конкурируют. Термин "конкурирует с" в настоящем изобретении охватывает и такие комбинации антител, в которых одно антитело снижает связывание другого антитела, но при добавлении их в обратном порядке конкуренция не наблюдается.

Термин "эпитоп" обозначает детерминанту белка, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из поверхностных группировок таких молекул, как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и не конформационные эпитопы отличаются тем, что связывание первых, но не последних, теряется в присутствии денатурирующих растворителей. Эпитоп может включать аминокислотные остатки, которые непосредственно участвуют в связывании, и другие аминокислотные остатки, которые прямо не участвуют в связывании, например, аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются или покрываются пептидом, специфически связывающимся с антигеном (то есть те аминокислотные остатки, которые составляют "отпечаток" пептида, специфически связывающегося с антигеном).

В настоящем изобретении термин "связывание" в контексте связывания антитела с заданным антигеном или эпитопом обычно означает связывание со сродством, соответствующим K_D примерно 10^-7 М или меньше, как то 10^-8 М или меньше, как то 10^-9 М или меньше, 10^-10 М или меньше или же 10^-11 М и даже меньше при определении, к примеру, методом поверхностного плазменного резонанса (SPR) на приборе BIAcore 3000 с использованием растворимой формы антигена в качестве лиганда и антитела в качестве аналита. Как правило, антитело связывается с заданным антигеном со сродством, соответствующим значению K_D, которое по меньшей мере в 10 раз меньше, как то по меньшей мере в 100 раз меньше, например, по меньшей мере в 1000 раз меньше, как то по меньшей мере в 10000 раз меньше, например, по меньшей мере в 100000 раз меньше, чем значение K_D для связывания, с таким неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином), который не является идентичным или близкородственным заданному антигену. Если значение K_D у антитела очень низкое (т.е. антитело обладает высоким сродством), то значение K_D, с которым оно связывается с антигеном, обычно по меньшей мере в 10000 раз меньше, чем значение K_D для неспецифического антигена.

Термин "k_d" (сек^-1) в настоящем изобретении обозначает константу скорости диссоциации определенного взаимодействия Ab-антиген. Данная величина также известна как значение k_off.

Термин "k_a" (M^-1×сек^-1) в настоящем изобретении обозначает константу скорости ассоциации определенного взаимодействия Ab-антиген.

Термин "K_D" (М) в настоящем изобретении обозначает равновесную константу диссоциации определенного взаимодействия Ab-антиген.

Термин "K_A" (M^-1) в настоящем изобретении обозначает равновесную константу ассоциации определенного взаимодействия Ab-антиген, которую получают делением k_a на k_d.

"Интернализация" в применении к антителам к CD74 означает любой механизм, посредством которого антитело подвергается интернализации из поверхности клетки в экспрессирующую CD74 клетку. Интернализацию антитела можно оценить косвенным методом путем измерения эффекта интернализованного конъюгата Ab-токсин или токсина, специфически связавшегося с антителом при предварительной инкубации (таким, например, как метод с анти-каппа-ЕТА' из примера 14).

В настоящем изобретении термин "ингибирует рост".(например, в отношении клеток, как то опухолевых клеток) охватывает любое измеримое снижение роста клеток при контакте с антителом к CD74 или ADC по сравнению с ростом тех же самых клеток, не находящихся в контакте с антителом к CD74 или ADC, например, ингибирование роста клеточной культуры по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99% или 100%. Такое снижение роста клеток может происходить по различным механизмам, например, интернализации, зависимого от антител клеточного фагоцитоза (ADCP), зависимой от антител опосредованной клетками цитотоксичности (ADCC), зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC), опосредованной лекарственными препаратами гибели клеток и/или апоптоза.

Настоящим изобретением также предусмотрены антитела, содержащие функциональные варианты области V_L, области V_H либо одного или нескольких CDRs из антител из примеров. Функциональный вариант V_L, V_H или CDR в применении к антителам к CD74 означает, что у антитела все-таки сохраняется по крайней мере значительная часть (по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95% или больше) сродства/авидности и/или специфичности/избирательности исходного антитела, а в некоторых случаях, такое антитело к CD74 может обладать большим сродством, избирательностью и/или специфичностью, чем исходное Ab.

Такие функциональные варианты, как правило, сохраняют значительную степень идентичности с последовательностью исходного Ab. Степень идентичности между двумя последовательностями является функцией от числа идентичных положений, общих для этих последовательностей (т.е. процент гомологии = число идентичных положений/общее число положений × 100), с учетом количества пробелов и длины каждого пробела, которые нужно ввести для оптимального совмещения двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение степени идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с помощью математического алгоритма, как описано ниже в неограничивающих примерах.

Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить с помощью программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступен на http://www.gcg.com), используя матрицу NWSgapdna.CMP, вес пробела = 40, 50, 60, 70 или 80 и вес длины = 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями также можно определить с помощью алгоритма, описанного Е. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)), который встроен в программу ALIGN (версия 2.0), используя таблицу весов остатков РАМ 120, пеню за длину пробела = 12 и пеню за пробел = 4. Кроме того, степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить при помощи алгоритма Needleman и Wunsch (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)), который встроен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступен на http://www.gcg.com), используя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу РАМ250, вес пробела = 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины = 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Последовательности вариантов CDR могут отличаться от последовательностей CDR исходных антител в основном консервативными заменами; например, по меньшей мере 35%, 50% или больше, 60% или больше, 70% или больше, 75% или больше, 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше (например, 65-95%, как то 92%, 93% или 94%) замен у варианта представлены консервативными заменами аминокислотных остатков.

Последовательности вариантов CDR могут отличаться от последовательностей CDR исходных антител в основном консервативными заменами; например, по меньшей мере 10, как то по меньшей мере 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замена у варианта представлены консервативными заменами аминокислотных остатков.

Термин "стабилизированное антитело типа IgG4" относится к таким антителам типа IgG4, которые были модифицированы для уменьшения обмена полумолекул (например, см. Международную патентную публикацию WO2008145142 или van der Neut Kolfschoten M et al. (2007) Science 14, 317(5844) и приведенные там ссылки.

В контексте настоящего изобретения консервативные замены можно определить как замены в пределах классов аминокислот, приведенных в одной или нескольких из трех следующих таблиц.

Классы аминокислотных остатков для консервативных замен
Кислые остатки	Asp (D) и Glu (E)
Основные остатки	Lys (K), Arg (R) и His (Н)
Гидрофильные незаряженные остатки	Ser (S), Thr (Т), Asn (N) и Gln (Q)
Алифатические незаряженные остатки	Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L) и Ile (I)
Неполярные незаряженные остатки	Cys (C), Met (M) и Pro (P)
Ароматические остатки	Phe (F), Tyr (Y) и Trp (W)
Альтернативные классы консервативных замен аминокислотных остатков
1	А	S	Т
2	D	E
3	N	Q
4	R	K
5	I	L	M
6	F	Y	W
Альтернативная физическая и функциональная классификация аминокислотных остатков
Остатки, содержащие спиртовую группу	S и Т
Алифатические остатки	I, L, V и М
Остатки, связанные с циклоалкенилами	F, Н, W и Y
Гидрофобные остатки	А, С, F, G, Н, I, L, М, R, Т, V, W и Y
Отрицательно заряженные остатки	D и Е
Полярные остатки	С, D, E, Н, K, N, Q, R, S и Т
Положительно заряженные остатки	Н, K и R
Небольшие остатки	А, С, D, G, N, P, S, Т и V
Очень маленькие остатки	А, G и S
Остатки, участвующие в образовании складок	А, С, D, E, G, Н, K, N, Q, R, S, Р и Т
Гибкие остатки	Q, Т, K, S, G, Р, D, Е и R

Другая разбивка консервативных замен на группы включает: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин.

Можно составить и другие группы аминокислот по принципам, изложенным, например, в Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2nd Ed. 1993), W.H. Freeman and Company.

У вариантов CDR также в значительной степени сохраняется консервативность по гидрофобности/гидрофильности и весу/размеру остатков по сравнению с CDR у антител из примеров (например, весовая категория, индекс гидрофобности или то и другое у последовательностей сохраняется по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или больше (например, на 65-99%)). Например, консервативные замены остатков могут основываться и на заменах из сильно или слабо консервативных по весу групп, которые известны в этой области.

Консервативность аналогичных остатков можно измерить и по степени сходства, которая определяется при помощи программы BLAST (например, BLAST 2.2.8, доступной через NCBI), используя стандартные настройки: BLOSUM62, Open Gap=11 и Extended Gap=1. Подходящие варианты обычно проявляют сходство с исходным пептидом по меньшей мере на 45%, например, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или больше (например, на 70-99%).

Термин "вектор" в настоящем изобретении служит для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним из типов вектора является "плазмида", что означает кольцевую петлю двухцепочечной ДНК, в которую могут быть вставлены дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, при этом в вирусный геномом могут быть вставлены дополнительные сегменты ДНК. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в клетках хозяина, в которые они введены (к примеру, бактериальные векторы, содержащие бактериальное начало репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут встраиваться в геном клетки хозяина при введении в клетки хозяина и при этом реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию тех генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы именуются здесь как "рекомбинантные экспрессирующие векторы" (или просто "экспрессирующие векторы"). Вообще экспрессирующие векторы, используемые в технологии рекомбинантной ДНК, часто находятся в виде плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее распространенной формой вектора. Тем не менее, настоящее изобретение охватывает и другие формы экспрессирующих векторов типа вирусных векторов (как то дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Термин "рекомбинантные клетки хозяина" (или просто "клетки хозяина") в настоящем изобретении служит для обозначения таких клеток, в которые был введен экспрессирующий вектор. Следует иметь в виду, что такие термины служат для обозначения не только каких-то конкретных клеток, но также и потомства таких клеток. Поскольку в последующих поколениях могут иметь место некоторые модификации вследствие мутации или же влияния окружающей среды, то такое потомство может оказаться не совсем идентичным родительским клеткам, тем не менее оно охватывается используемым здесь термином "клетки хозяина". Рекомбинантными клетками хозяина являются, к примеру, трансфектомы, как то клетки СНО, клетки HEK-293, PER.C6, клетки NS0, лимфоцитарные клетки и такие прокариотические клетки, как Е.coli.

Термин "трансфектома" в настоящем изобретении охватывает рекомбинантные эукариотические клетки хозяина, экспрессирующие Ab, как то клетки СНО, PER.C6, клетки NSO, клетки HEK-293, клетки растений или грибов, включая дрожжевые клетки.

Термин "трансгенное животное" относится к таким животным, у которых геном содержит один или несколько трансгенов тяжелых и/или легких цепей человека или трансхромосом (встроенных или не встроенных в природную геномную ДНК животного) и способен экспрессировать полностью человеческие Abs. Например, трансгенная мышь может содержать трансген легкой цепи человека и либо трансген тяжелой цепи человека, либо трансхромосому тяжелой цепи человека, так что эта мышь будет вырабатывать человеческие антитела к CD74 при иммунизации антигеном CD74 и/или клетками, экспрессирующими CD74. Трангсген тяжелой цепи человека может быть встроенным в хромосомную ДНК мыши, как в случае с такими трансгенными мышами, к примеру, мышами HuMAb^®, как мыши НСо7 или НСо12, или же трансген тяжелой цепи человека может быть находиться вне хромосом, как в случае трансхромосомных мышей КМ, описанных в WO02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши (которые собирательно именуются здесь как "трансгенные мыши") способны вырабатывать несколько изотипов моноклональных антител человека к данному антигену (как то IgG, IgA, IgM, IgD и/или IgE), подвергаясь рекомбинации V-D-J и переключению изотипа. Трансгенные животные также могут использоваться для вырабатывания антител против определенного антигена при введении генов, кодирующих данное Ab, к примеру, путем функционального связывания генов с таким геном, который экспрессируется в молоке животного.

"Лечение" означает введение эффективного количества терапевтически активного соединения настоящего изобретения с целью ослабления, уменьшения, прекращения или устранения (излечения) симптомов или заболеваний.

Термин "эффективное количество" означает количество, эффективное, в дозах и в течение необходимого времени, для достижения требуемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела к CD74 может варьировать в зависимости от таких факторов, как заболевание, возраст, пол и вес индивида и способности антитела к CD74 вызвать требуемую реакцию у индивида. Терапевтически эффективное количество также означает такое, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела перевешиваются положительными терапевтическими эффектами.

"Антиидиотипическое" (Id) антитело представляет собой такое антитело, которое распознает уникальные детерминанты, обычно связанные с антигенсвязывающим сайтом какого-либо Ab.

Другие аспекты и воплощения изобретения

Изобретением предусмотрены выделенные антитела, например, моноклональные антитела человека, которые связывается с изоформами 1 и 2 CD74 человека. Антитело может дополнительно связываться с другими изоформами CD74 или такими видовыми гомологами, как гомолог макаки. В частности, антитело по изобретению эффективно интернализируется после связывания с CD74, экспрессированным на поверхности клетки, что выгодно для терапевтического применения метода ADC. Как показано в примерах 19-22, конъюгаты ADCs антител к CD74 и комбинации линкер-препарат vcMMAE или mcMMAF эффективно уменьшают размер опухолей в нескольких моделях опухолей in vivo. ADCs к CD74 оказались очень эффективными, несмотря на низкую экспрессию мишени - CD74 на поверхности раковых клеток (пример 22). Кроме того, оказалось, что антитела к CD74 эффективно предотвращают разрастание опухолей на модели профилактики рака in vivo (пример 25).

Антитело может дополнительно характеризоваться одним или несколькими функциональными свойствами, как то тем, что оно связывается с одним или несколькими вариантами CD74 человека с высоким сродством, ингибирует связывание МЕР с CD74, или любым сочетанием указанных свойств.

В одном аспекте антитело по изобретению связывается с высоким сродством с вариантами 1 и/или 2 CD74 человека или с клетками человека, естественным образом экспрессирующими CD74. Например, в одном воплощении антитело (а) связывается с внеклеточным доменом варианта 1 CD74 со значением EC₅₀ (кажущееся сродство) менее 500 нг/мл, менее 400 нг/мл, менее 350 нг/мл или менее 330 нг/мл; b) связывается со внеклеточным доменом варианта 2 CD74 со значением ЕС₅₀ (кажущееся сродство) менее 400 нг/мл, менее 300 нг/мл, менее 250 нг/мл или менее 220 нг/мл; либо (с) и (а), и (b) при определении так, как описано в примере 11. С другой стороны, антитело может связываться с CD74 на клетках Raji со значением ЕС₅₀ менее 400 нг/мл, менее 300 нг/мл, менее 250 нг/мл или менее 200 нг/мл при определении так, как описано в примере 12. С другой стороны, антитело может связываться с вариантом 1 или 2 CD74 или с обоими со значением K_D в 10^-8 М или меньше, как то 10^-9 М или меньше или даже 10^-10 M или меньше.

В одном аспекте антитело интернализируется после связывания с CD74, экспрессированным на поверхности клетки. Это можно определить в соответствии с методом, описанным в примере 24, используя флуоресцентно меченые антитела, или методом, описанным в примере 14, используя метод ADC, отражающий интернализацию антитела, или же методом, описанным в Ong GL et al., Immunology 1999, 98:296-302; Hansen HJ et al., Biochem J 1996, 320:293-300; Koch NG et al., J hnmunol 1991, 147:2643-2651; Roche PA et al., PNAS 1993, 90:8581-8585). Клетки могут происходить из линии В-клеток типа клеток Raji или из линии раковых клеток другого типа, экспрессирующих высокие уровни CD74 при обработке IFNγ (к примеру, клеток рака толстой кишки НТ-29 или клеток меланомы SK-MEL-37). В одном воплощении клетки представляют собой клетки Raji. В другом воплощении антитело имеет значение ЕС₅₀ менее 60 нг/мл, менее 40 нг/мл, менее 30 нг/мл или же 25 нг/мл или меньше при индуцировании гибели клеток Raji методом анти-каппа-ЕТА', при определении так, как описано в примере 14. В другом варианте антитело имеет значение ЕС₅₀ от 25 до 60 нг/мл, от 25 до 40 нг/мл или от 25 до 30 нг/мл при таком определении.

В одном аспекте антитело по изобретению имеет значение ЕС₅₀ менее 30 нг/мл или же 25 нг/мл или меньше при определении так, как описано в примере 14.

В одном аспекте антитело характеризуется скоростью диссоциации (off-rate) из антигена CD74, необязательно экспрессированного на поверхности клетки. Скорость диссоциации можно определить, к примеру, клеточным методом типа приведенного в примере 23, как правило, с использованием флуоресцентно (или иным образом) меченых антител и с определением скорости диссоциации при 0°С. Клетки могут происходить из линии В-клеток, такой, например, как клетки Daudi или Raji, или из подходящей линии раковых клеток другого типа (например, клеток М4А4 или клеток NCI-H747). В одном воплощении клетки представляют собой клетки Daudi. В одном воплощении антитело проявляет скорость диссоциации (off-rate) в пределах от 0,02 до 1,0 мин^-1, как то от 0,03 до 0,30 мин^-1 либо от 0,04 до 0,10 или от 0,15 до 0,30 мин^-1. В одном воплощении антитело проявляет скорость диссоциации примерно 0,07 мин^-1. В одном воплощении антитело проявляет скорость диссоциации примерно 0,20 или 0,24 мин^-1.

Антитело по изобретению также может характеризоваться конкуренцией за связывание или связыванием с тем же самым эпитопом, что и контрольное антитело к варианту 1 или варианту 2 или к обоим вариантам 1 и 2 CD74 человека.

В методе тестирования антитела на конкурентное связывание с контрольным антителом может использоваться, например, внеклеточный домен варианта CD74 (например, конструкции, описанные в примере 1), экспрессирующие CD74 клетки и/или клеточные мембраны, полученные из экспрессирующих CD74 клеток. В типичном методе клетки, экспрессирующие CD74, предварительно инкубируют с тестируемым антителом при различных концентрациях в пределах от 1 до 100 мкг/мл, а затем инкубируют с помеченным флуорофором контрольным антителом при концентрации в 10 мкг/мл. Связывание контрольного антитела определяется методом FACS.

В одном аспекте антитело конкурирует за связывание с вариантами 1 и 2 CD74 человека по меньшей мере с одним антителом, выбранным из:

(a) антител, содержащих область V_H, включающую последовательность SEQ ID NO:7, и область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO:23 [005];

(b) антител, содержащих область V_H, включающую последовательность SEQ ID NO:11, и область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO:26 [006];

(c) антител, содержащих область V_H, включающую последовательность SEQ ID NO:15, и область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO:26 [008]; и

(d) антител, содержащих область V_H, включающую последовательность SEQ ID NO:19, и область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO:26 [011].

В отдельных и особых воплощениях антитело конкурирует с антителом из (а) и (b), (а) и (с), (а) и (d), (b) и (с), (b) и (d), (с) и (d), из по меньшей мере трех от (а) до (d) или же всех (а), (b), (с) и (d).

В одном воплощении антитело связывается с тем же самым эпитопом на CD74 человека, что и по меньшей мере одно из контрольных антител, определенных в (а), (b), (с) и (d). Это можно определить с помощью известных методов определения эпитопов, таких, например, как тестирование связывания антител с вариантами CD74 с различными точечными мутациями, или'методами фагового дисплея (например, см. Binder et al., Cancer Res 2007, 67:3518-3523; Carter JM et al., Curr Protocols hnmunol 2004, Ch 9: Unit 9.4; Hjelm В et al., N Biotechnol 2010, 27:129-137; Rockberg J et al., Curr Protocols hnmunol 2010, Ch 9: Unit 9.9; Benjamin DC et al., Methods 1996, 9:508-515).

Антитело или иммуноглобулин по изобретению также может характеризоваться наличием определенных последовательностей V_H, V_L или CDR либо определенных из них комбинаций.

В одном аспекте антитело или иммуноглобулин содержит участок CDR3 области V_H из любого из числа HuMab-CD 74-005, -006, -008, и -011. Таким образом, изобретением предусмотрено антитело или иммуноглобулин, содержащие участок CDR3 области V_H, включающий или состоящий из последовательности, выбранной из SEQ ID NOs:10, 14, 18 и 22. В одном воплощении антитело или иммуноглобулин включает SEQ ID NO:22.

В одном аспекте антитело или иммуноглобулин содержит область V_L, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO:24, AAS и SEQ ID NO:26, и

a) область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NOS:8, 9 и 10 [005];

b) область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO:12, 13 и 14 [006];

c) область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO:16, 17 и 18 [008];

d) область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO:20, 21 и 22 [011], или

e) вариант любого из данных антител или иммуноглобулинов, причем данный вариант предпочтительно содержит не более 1, 2 или 3 модификаций аминокислот, более предпочтительно замен аминокислот, как то консервативных замен аминокислот в любой из указанных последовательностей.

В одном аспекте антитело содержит область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO:20, 21 и 22, и область V_L, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO:24, AAS и 25, при этом не более 3 модификаций аминокислот по сравнению с исходными последовательностями. В одном воплощении антитело содержит область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO:20, 21 и 22, и область V_L, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 по SEQ ID NO:24, AAS и 25, при этом не более 1 модификации аминокислот. В предпочтительном воплощении (е) вариант включает замену остатка аминокислоты 7 в CDR2 области V_H из (d) типа консервативной замены аминокислоты.

В одном аспекте антитело или иммуноглобулин содержит область V_H, которая:

a) по меньшей мере на 80% идентична, как то по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% либо на 100% идентична последовательности области V_H, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, 11, 15 и 19, или

b) содержит не более 20, как то 15 или 10 или 5, 4, 3, 2 или 1 модификации аминокислот, более предпочтительно замены аминокислот, как то консервативной замены аминокислот по сравнению, с последовательностью области V_H, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, 11, 15 и 19.

В одном аспекте антитело или иммуноглобулин содержит область V_L, которая:

a) по меньшей мере на 80% идентична, как то по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% либо на 100% идентична последовательности области V_L, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO:23 и 26, или

b) содержит не более 20, как то 15 или 10, или 5, 4, 3, 2 или 1 модификации аминокислот, более предпочтительно замены аминокислот, как то консервативной замены аминокислот по сравнению с последовательностью области V_L, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:23 и 26.

В одном воплощении (b) область V_L содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем остатку 36 по SEQ ID NO:23 и 26. В SEQ ID NOs:23 и 26 в этом положении аминокислота представлена F и Y, соответственно.

В отдельных и особых аспектах антитело или иммуноглобулин содержит области V_H и V_L, выбранные из числа следующих комбинаций:

a) область V_H, включающая последовательность SEQ ID NO:7, и область V_L, включающая последовательность SEQ ID NO:23 [005];

b) область V_H, включающая последовательность SEQ ID NO:11, и область V_L, включающая последовательность SEQ ID NO:26 [006];

c) область V_H, включающая последовательность SEQ ID NO:15, и область V_L, включающая последовательность SEQ ID NO:26 [008];

d) область V_H, включающая последовательность SEQ ID NO:19, и область V_L, включающая последовательность SEQ ID NO:26 [011];

e) область V_H, включающая последовательность SEQ ID NO:7, и область V_L, включающая последовательность SEQ ID NO:26 [005/011]; и

f) вариант любого из данных антител или иммуноглобулинов, причем данный вариант предпочтительно содержит не более 1, 2 или 3 модификаций аминокислот, более предпочтительно замен аминокислот, как то консервативных замен аминокислот в любой из указанных последовательностей области V_H и/или V_L.

В одном аспекте изобретения предусмотрено антитело или иммуноглобулин, содержащий область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO:26. В одном воплощении антитело или иммуноглобулин содержит CDR3 области V_H по SEQ ID NO:22. В другом воплощении антитело содержит последовательности CDR1, 2 и 3 области V_H по SEQ ID NO:20, 21 и 22, соответственно.

Антитело по изобретению может характеризоваться одним или несколькими функциональными или структурными признаками вышеописанных аспектов или любой комбинацией выбранных функциональных и структурных признаков. Например, в одном воплощении антитело или иммуноглобулин по изобретению характеризуется любым из следующих признаков:

a) ЕС₅₀ менее 30 нг/мл или же ЕС₅₀ примерно 25 нг/мл или меньше в методе анти-каппа-ЕТА' при определении так, как описано в примере 14;

b) конкурирует с или связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело с последовательностями V_H и V_L по SEQ ID NOs:19 и 26, соответственно;

c) скорость диссоциации (off-rate) в пределах от 0,03 до 0,30 мин^-1 при определении в соответствии с примером 23;

d) CDR3 области V_H включает SEQ ID NO:22;

e) комбинация из (а) и (b);

f) комбинация из (а) и (с);

g) комбинация из (а) и (d);

h) комбинация из (b) и (с);

i) комбинация из (b) и (d);

j) комбинация из (с) и (d); или

k) комбинация из (а), (b), (с) и (d).

Антитела по изобретению предпочтительно являются моноклональными. Моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть получены, например, гибридомным способом, впервые описанным в Kohler et al. (Nature 256, 495 (1975)), или же методами рекомбинантной ДНК. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек антител по методикам, описанным, к примеру, в Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Моноклональные антитела могут быть получены из любого подходящего источника. Так, например, Моноклональные антитела могут быть получены из гибридом, полученных из В-клеток селезенки и лимфатических узлов, выделенных из мышей, иммунизированных данным антигеном, например, в виде клеток, экспрессирующих данный антиген на поверхности, или нуклеиновой кислоты, кодирующей данный антиген. Моноклональные антитела также могут быть получены из гибридом, полученных из экспрессирущих антитела клеток от иммунизированных людей или других млекопитающих, как то крыс, собак, приматов и т.п.

В одном воплощении антитело по изобретению является человеческим антителом. Человеческие моноклональные антитела против CD74 могут быть получены при помощи трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека, а не мыши. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, именуемых здесь мышами HuMAb и мышами KM, соответственно, которые собирательно именуются здесь "трансгенными мышами".

У мышей HuMAb содержится минилокус генов иммуноглобулинов человека, которые кодируют не подвергавшиеся перестройке последовательности тяжелой (μ и γ) и легкой κ-цепи иммуноглобулина человека, а также направленные мутации, которые инактивируют эндогенные локусы μ- и κ-цепи (Lonberg N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Соответственно, мыши проявляют пониженную экспрессию мышиных IgM или κ-цепи мыши и, в ответ на иммунизацию, введенные трансгены тяжелой и легкой цепи человека подвергаются переключению изотипа и соматической мутации с образованием человеческих моноклональных антител IgG,κ с высоким сродством (Lonberg N. et al. (1994), supra; см. обзоры в Lonberg N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994); Lonberg N. and Huszar D., Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995); и Harding F. and Lonberg N., Ann. N.Y. Acad. Sci. 764, 536-546 (1995)). Получение мышей HuMAb описано подробно в Taylor L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992); Chen J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993); Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994); Taylor L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994); Fishwild D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). См. также US 5545806, US 5569825, US 5625126, US 5633425, US 5789650, US 5877397, US 5661016, US 5814318, US 5874299, US 5,770,429, US 5545807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 и WO 01/09187.

У мышей НСо7, НСо12, НСо17 и НСо20 имеется разрыв JKD в эндогенных генах легкой цепи (каппа; κ) (как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), разрыв CMD в эндогенных генах тяжелой цепи (как описано в примере 1 из WO 01/14424), и трансген KCo5 легкой κ-цепи человека (как описано в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)). Кроме того, у мышей Нсо7 имеется трансген НСо7 тяжелой цепи человека (как описано в US 5770429), у мышей НСо12 имеется трансген НСо12 тяжелой цепи человека (как описано в примере 2 из WO 01/14424), у мышей НСо17 имеется трансген НСо17 тяжелой цепи человека (как описано в примере 2 из WO 01/09187) и у мышей НСо20 имеется трансген НСо20 тяжелой цепи человека. Полученные при этом мыши экспрессируют трансгены тяжелой и легкой κ-цепи иммуноглобулина человека на фоне гомозиготности по разрывам эндогенных локусов тяжелой и легкой κ-цепи мыши.

У мышей линии КМ эндогенный ген легкой κ-цепи мыши был гомозиготно разорван, как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993), а эндогенный ген тяжелой цепи мыши был гомозиготно разорван, как описано в примере 1 из WO 01/09187. Эта линия мышей несет трансген KCo5 легкой κ-цепи человека, как описано в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Эта линия мышей также несет трансхромосому тяжелой цепи человека, состоящую из фрагмента hCF (SC20) хромосомы 14, как описано в WO 02/43478. Мыши НСо12-Balb/С могут быть получены путем скрещивания НСо12 с KCo5[J/K]-Balb/C, как описано в WO 097006.

Спленоциты и клетки лимфатических узлов из этих трансгенных мышей можно использовать для получения гибридом, секретирующих человеческие моноклональные антитела, по хорошо известным методикам.

Человеческие моноклональные или поликлональные антитела настоящего изобретения или антитела по настоящему изобретению, происходящие из других видов, также могут быть получены трансгенным способом путем создания другого млекопитающего или растения, трансгенного по данным последовательностям тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, и вырабатывания в них антител в поддающемся выделению виде. Что касается трансгенного получения у млекопитающих, то антитела можно вырабатывать и выделять из молока коз, коров и других млекопитающих. Например, см. US 5827690, US 5756687, US 5750172 и US 5741957.

Кроме того, человеческие антитела настоящего изобретения или антитела по настоящему изобретению из других видов могут быть получены дисплейными методами, включая, без ограничения, фаговый дисплей, ретровирусный дисплей, рибосомный дисплей и другие, используя методики, хорошо известные в данной области, а полученные молекулы можно подвергнуть дополнительному созреванию типа созревания сродства, поскольку такие методы хорошо известны в данной области (например, см. Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (фаговый дисплей), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (фаговый дисплей), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (рибосомный дисплей), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (фаговый дисплей), Scott, TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty, TIBTECH 10, 80-84 (1992), и US 5,733,743)). Если дисплейные методы используются для получения антител, которые не являются человеческими, то такие антитела можно гуманизировать.

Антитела по изобретению могут быть любого изотипа. При выборе изотипа обычно руководствуются желательными эффекторными функциями, такими как индукция ADCC. Примерами изотипов являются IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Можно использовать любые константные области легкой цепи человека - каппа или лямбда. При желании можно переключить изотип CD74-специфичных антител настоящего изобретения известными способами. Например, антитело по настоящему изобретению, которое изначально было IgM, можно переключить на антитело класса IgG настоящего изобретения. Кроме того, методы переключения изотипа можно использовать для преобразования одного подкласса IgG на другой, например, с IgG1 на IgG2. Таким образом, можно изменять эффекторную функцию антител настоящего изобретения путем переключения изотипа, например, на антитела типа IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM для различных терапевтических применений. В одном воплощении антитело по настоящему изобретению представлено антителом типа IgG1, к примеру, IgG1,κ.

В одном воплощении антитело по изобретению представлено полноразмерным антителом.

В одном воплощении полноразмерное антитело представлено антителом типа IgG1, как то антителом типа IgG1,κ.

В другом воплощении полноразмерное антитело представлено антителом типа IgG4.

В предпочтительном воплощении специфичное к CD74 антитело IgG4 является стабилизированным антителом типа IgG4. Примерами подходящих стабилизированных антител IgG4 являются антитела, в которых аргинин в положении 409 в константной области тяжелой цепи IgG4 человека, который приведен в индексе EU по Kabat et al., supra, заменен на лизин, треонин, метионин или лейцин, предпочтительно на лизин (как описано в WO 2006033386), и/или в которых шарнирный участок содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys. Другие подходящие стабилизированные антитела типа IgG4 приведены в WO 2008145142, включенной сюда путем ссылки во всей полноте.

В одном воплощении стабилизированное специфичное к CD74 антитело IgG4 представлено антителом IgG4, содержащим тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит константную область IgG4 человека, содержащую остаток, выбранный из группы, состоящей из Lys, Ala, Thr, Met и Leu, в положении, соответствующем 409, и/или остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Gly, Ile и Leu, в положении, соответствующем 405, и при этом антитело необязательно содержит одну или несколько дополнительных замен, делеций и/или вставок, но не содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys в шарнирной области. Предпочтительно данное антитело содержит остаток Lys или Ala в положении, соответствующем 409, или же область C_H3 антитела была заменена на область C_H3 IgG1 человека, IgG2 человека или IgG3 человека.

В другом воплощении стабилизированное специфичное к CD74 антитело IgG4 представлено антителом IgG4, содержащим тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит константную область IgG4 человека, содержащую остаток, выбранный из группы, состоящей из Lys, Ala, Thr, Met и Leu, в положении, соответствующем 409, и/или остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Gly, Ile и Leu, в положении, соответствующем 405, и при этом антитело необязательно содержит одну или несколько дополнительных замен, делеций и/или вставок, а также содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys в шарнирной области. Предпочтительно данное антитело содержит остаток Lys или Ala в положении, соответствующем 409, или же область C_H3 антитела была заменена на область C_H3 IgG1 человека, IgG2 человека или IgG3 человека.

В другом воплощении специфичное к CD74 антитело представлено антителом другого типа, чем IgG4, например, IgG1, IgG2 или IgG3, которое было подвергнуто мутации с тем, чтобы уменьшить или даже устранить способность к выполнению эффекторных функций типа ADCC. Такие мутации описаны, например, в Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177(2):1129-1138 (2006); и Hezareh M, J Virol. 75(24):12161-12168 (2001).

В одном воплощении соответствующие изотипы и/или последовательности константных (Fc) областей двух тяжелых цепей одинаковы. В другом воплощении соответствующие изотипы и/или последовательности константных (Fc) областей двух тяжелых цепей одного и того же специфичного к CD74 антитела отличаются. Это особенно применимо к мультиспецифическим, например, биспецифическим, специфичным к CD74 антителам, которые описаны более подробно ниже.

В другом аспекте антитело представлено антигенсвязывающим фрагментом. Фрагменты антител могут быть получены стандартными методами, как то путем фрагментирования полноразмерных антител или экспрессирования нуклеиновых кислот, кодирующих фрагменты антитела в рекомбинантных клетках (например, см. Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Затем эти фрагменты можно протестировать или подвергнуть скринингу на их свойства таким же образом, как описано здесь для полноразмерных антител. Далее описаны типичные форматы для специфичных к CD74 антигенсвязывающих фрагментов по изобретению:

F(ab')₂-фрагменты, которые являются бивалентными фрагментами, содержащими два Fab-фрагмента, соединенные дисульфидным мостиком в шарнирном участке. Они могут быть получены, например, при обработке полноразмерных антител пепсином.

Fab'- или Fab-фрагменты являются моновалентными фрагментами, состоящими из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1. Fab-фрагменты могут быть получены, например, при обработке антител типа IgG папаином. Fab'-фрагменты могут быть получены, например, при восстановлении дисульфидных мостиков F(ab')₂-фрагмента с помощью восстанавливающего реагента типа дитиотреитола.

Моновалентные антитела или "половинки молекул антител", которые существуют в водных растворах в виде гетеродимера одной легкой и одной тяжелой цепи, описаны в WO 2007059782 (Genmab A/S).

Fd-фрагменты, которые в основном состоят из доменов V_H и C_H1.

Fv-фрагменты, которые в основном состоят из доменов V_L и V_H одного плеча антитела, и состоящие из них одноцепочечные антитела. Одноцепочечные антитела (также известны как одноцепочечные Fv-антитела (scFv)) представляют собой такие конструкции, в которых домены V_L и V_H Fv-фрагмента соединены рекомбинантными методами с помощью синтетического линкера, что позволяет им экспрессироваться в виде единой белковой цепи, в которой области V_L и V_H подвергаются спариванию с образованием моновалентных молекул (например, см. Bird et al., Science 242, 423-426 (1988); и Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)).

Доменные антитела (их также называют фрагментами dAb), которые состоят в основном из домена V_H (например, см. Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989); Holt et al., Trends Biotechnol. 2003, 21(11):484-90).

Другие примеры форматов включают камелиды или нанотела (например, см. Revets et al., Expert Opin Biol Ther. 2005, 5(1):111-24).

Мультиспецифические форматы антител

В следующем воплощении изобретения предусмотрены мультиспецифические антитела, содержащие первый антигенсвязывающий сайт из молекулы специфичного к CD74 антитела, описанного выше, и по меньшей мере один второй антигенсвязывающий сайт.

В предпочтительном воплощении второй антигенсвязывающий сайт используется для мобилизации механизма уничтожения, такого, к примеру, как связывание антигена на эффекторных клетках человека или связывание цитотоксического средства или второго терапевтического средства. Примеры эффекторных клеток включают Т-клетки, как то, к примеру, цитолитические Т-клетки (CTL), нормальные клетки-киллеры (NK), макрофаги, моноциты, тучные клетки и гранулоциты, как то, к примеру, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Примеры антигенов эффекторных клеток включают, без ограничения, CD1, CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, CD28, CD32, CD40, CD64, CD89, FcεRI и HLA-DR. Подходящие цитотоксические средства и вторые терапевтические средства представлены ниже и включают токсины (типа радиоактивно меченых пептидов), химиотерапевтические средства и пролекарства.

В другом предпочтительном воплощении второй антигенсвязывающий сайт связывается с антигеном на В-клетках человека, таким, например, как CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD46, CD80, CD138 и HLA-DR.

В другом предпочтительном воплощении второй антигенсвязывающий сайт связывается с тканеспецифическим антигеном, способствуя локализации биспецифического антитела в определенной ткани.

В другом предпочтительном воплощении второй антигенсвязывающий сайт связывается с антигеном, расположенным на клетках того же типа, что и экспрессирующие CD74 клетки, как правило, со связанным с опухолью антигеном (ТАА), но обладает другой специфичностью связывания, чем у первого антигенсвязывающего сайта. Такие мульти- или биспецифические антитела могут повысить специфичность связывания опухолевых клеток и/или задействовать несколько эффекторных путей. Примеры TAAs включают карциноэмбриональный антиген (СЕА), специфический антиген предстательной железы (PSA), RAGE (почечный антиген), α-фетопротеин, CAMEL (распознаваемый CTL антиген на меланоме), антигены СТ (как то MAGE-B5, -В6, -С2, -С3 и D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE и SAGE), антигены муцинов (например, MUC1, муцин-СА125 и др.), антигены ганглиозидов, тирозиназу, gp75, c-Met, C-myc, Mart1, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7, Ep-CAM или связанный с раком интегрин, как то интегрин α5β3. С другой стороны, второй антигенсвязывающий сайт может связываться с другим эпитопом CD74. Второй антигенсвязывающий сайт также может связываться с ангиогенным фактором или другим связанным с раком фактором роста, таким как фактор роста сосудистого эндотелия, фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, ангиогенин, или с рецептором любого их них, предпочтительно с рецептором, связанным с прогрессированием рака.

В другом предпочтительном воплощении второй антигенсвязывающий сайт происходит из второго специфичного к CD74 антитела, как то специфичного к CD74 антитела по изобретению.

Типичные форматы для молекул мультиспецифических антител включают, без ограничения, (i) два антитела, перекрестно связанные посредством химической гетероконъюгации, причем одно обладает специфичностью к CD74, а другое - ко второму антигену; (ii) одно антитело, которое содержит два различных антигенсвязывающих участка; (iii) одноцепочечное антитело, которое содержит два различных антигенсвязывающих участка, например, два scFvs соединяются в виде тандема дополнительным пептидным линкером; (iv) антитело с двойным вариабельным доменом (DVD-Ig), в котором каждая легкая цепь и тяжелая цепь содержит по два вариабельных домена в тандеме через короткую пептидную связь (Wu et al., Generation and characterization of a dual variable domain immunoglobulin (DVD-Ig™) molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (v) химически связанный биспецифический (Fab')₂-фрагмент; (vi) Tandab, которое представляет собой слияние двух одноцепочечных диател с образованием тетравалентного биспецифического антитела, содержащего по два сайта связывания для каждого из антигенов-мишеней; (vii) флекситело, которое представляет собой сочетание scFvs с диателом с образованием поливалентной молекулы; (viii) так называемая молекула "dock and lock" на основе "домена димеризации и посадки" в протеинкиназе А, которая, в применении к Fabs, может образовать трехвалентный биспецифичный связывающий белок, состоящий из двух идентичных Fab-фрагментов, соединенных с другим Fab-фрагментом; (ix) так называемая молекула-скорпион, содержащая, например, два scFvs, слитые с обоими концами Fab-плеча человека; и (х) диатело.

Другим типичным форматом для биспецифических антител являются IgG-подобные молекулы с комплементарными доменами C_H3, что вызывает образование гетеродимеров. Такие молекулы могут быть получены известными методами, такими, например, как технологии Triomab/Quadromab (Trion Pharma/Fresenius Biotech), Knob-into-Hole (Genentech), CrossMAb (Roche), электростатическое совмещение (Amgen), LUZ-Y (Genentech), Strand Exchange Engineered Domain body (SEEDbody) (EMD Serono), Biclonic (Merus) и DuoBody (Genmab A/S).

В одном воплощении биспецифические антитела получают путем контролируемого обмена Fab-плечами, обычно по технологии DuoBody. Методы получения биспецифических антител in vitro посредством контролируемого обмена Fab-плечами были описаны в WO 2008119353 и WO 2011131746 (оба на Genmab A/S). В одном типичном методе, описанном в WO 2008119353, биспецифическое антитело образуется при обмене "Fab-плечами" или "половинками молекул" (обменивается тяжелая цепь и соединенная с ней легкая цепь) между двумя моноспецифическими антителами, которые оба содержат IgG4-подобные участки C_H3, при инкубации в восстановительных условиях. Полученный продукт представляет собой биспецифическое антитело, содержащее два Fab-плеча, которые могут иметь различные последовательности. В другом типичном методе, описанном в WO 2011131746, биспецифические антитела настоящего изобретения получают способом, включающим следующие этапы, причем по меньшей мере одно из первого и второго антител является антителом к CD74 по настоящему изобретению:

a) получение первого антитела, содержащего область Fc иммуноглобулина, причем данная область Fc содержит первый участок C_H3;

b) получение второго антитела, содержащего область Fc иммуноглобулина, причем данная область Fc содержит второй участок C_H3;

при этом последовательности первого и второго участка C_H3 отличаются и таковы, что гетеродимерное взаимодействие между первым и вторым участками C_H3 будет сильнее, чем каждое из гомодимерных взаимодействий первого и второго участков C_H3;

c) инкубирование первого антитела вместе со вторым антителом в восстановительных условиях; и

d) получение биспецифического антитела,

при этом первое антитело представляет собой антитело к CD74 по настоящему изобретению, а второе антитело обладает другой специфичностью связывания, либо наоборот.

Восстановительные условия могут быть обеспечены, к примеру, добавлением восстановительного реагента, например, из числа 2-меркаптоэтиламина, дитиотреитола и трис-(2-карбоксиэтил)фосфина. Стадия d) может дополнительно включать возврат к невосстановительным или менее восстановительным условиям, например, посредством удаления восстановительного реагента, например, обессоливанием.

Предпочтительно последовательности первого и второго участка C_H3 отличаются, включая лишь несколько довольно консервативных, асимметрических мутаций с тем, чтобы гетеродимерное взаимодействие между первым и вторым участками C_H3 было сильнее, чем каждое из гомодимерных взаимодействий первого и второго участков C_H3. Более подробно об этих взаимодействиях и как они могут осуществляться изложено в WO 2011131746, включенной сюда путем ссылки во всей полноте. Далее приведены типичные воплощения сочетаний таких асимметрических мутаций, при этом необязательно одна или обе области Fc относятся к изотипу IgG1.

В одном воплощении первая область Fc содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, состоящей из 366, 368, 370, 399, 405, 407 и 409, а вторая область Fc содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, состоящей из 366, 368, 370, 399, 405, 407 и 409, причем первая и вторая области Fc не содержат замен в одинаковых положениях.

В одном воплощении первая область Fc содержит аминокислотную замену в положении 405, а вторая область Fc содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, состоящей из 366, 368,370, 399,407 и 409, необязательно 409.

В одном воплощении первая область Fc содержит аминокислотную замену в положении 409, а вторая область Fc содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, состоящей из 366, 368, 370, 399, 405 и 407, необязательно 405 или 368.

В предпочтительном воплощении первая и вторая области Fc относятся к изотипу IgG1, при этом первая область Fc содержит Leu в положении 405, а вторая область Fc содержит Arg в положении 409.

Конъюгаты

Настоящим изобретением предусмотрены специфичные к CD74 антитела, конъюгированные с терапевтической молекулой, т.е. лекарственным препаратом. Терапевтической молекулой может быть, например, цитотоксин, химиотерапевтическое средство, цитокин, иммунодепрессант, иммуностимулятор, литический пептид или радиоизотоп. Такие конъюгаты именуются здесь "конъюгатами антитело-препарат" или "ADCs".

Соответственно, в одном аспекте антитело по любому из вышеприведенных аспектов или воплощений конъюгировано с терапевтической молекулой. Примеры терапевтических молекул включают цитотоксические молекулы, радиоизотопы, цитокины и литические пептиды.

В одном воплощении антитело способно индуцировать цитотоксичность на клетках Raji при интернализации антитела, конъюгированного или связанного с терапевтической молекулой, в клетках Raji, например, как описано в примере 14 или при аналогичном типе определения. В одном воплощении антитело индуцирует цитотоксичность при интернализации, как описано в примере 14, со значением ЕС₅₀ от 25 нг/мл до 60 нг/мл, как то от 25 нг/мл до 30 нг/мл, или со значением ЕС₅₀ менее 60 нг/мл, как то менее 40 нг/мл или менее 30 нг/мл, при индуцировании гибели клеток Raji при определении методом анти-каппа-ЕТА'. В другом воплощении ADC по настоящему изобретению вызывает цитотоксичность со значением ЕС₅₀ менее 10 нг/мл, как то менее 5 нг/мл, менее 1 нг/мл, менее 0,5 нг/мл или менее 0,1 нг/мл при индуцировании гибели клеток Raji или других экспрессирующих CD74 клеток.

В одном воплощении антитело конъюгировано с цитотоксической молекулой. Цитотоксическая молекула может быть выбрана, к примеру, из группы, состоящей из таксола; цитохалазина В; грамицидина D; бромистого этидия; эметина; митомицина; этопозида; тенопозида; винкристина; винбластина; колхицина; доксорубицина; даунорубицина; дигидроксиантрациндиона; ингибиторов тубулина типа майтансина либо его аналогов или производных; антимитотических средств типа монометилауристатина Е или F либо их аналогов или производных; доластатина-10 или -15 либо их аналогов; иринотекана либо его аналогов; митоксантрона; митрамицина; актиномицина D; 1-дегидротестостерона; глюкокортикоидов; прокаина; тетракаина; лидокаина; пропранолола; пуромицина; калихеамицина либо его аналогов или производных; антиметаболитов типа метотрексата, 6-меркаптопурина, 6-тиогуанина, цитарабина, флударабина, 5-фторурацила, декарбазина, гидроксимочевины, аспарагиназы, гемцитабина или кладрибина; алкилирующих агентов типа мехлорэтамина, тиоэпа, хлорамбуцила, мелфалана, кармустина (BSNU), ломустина (CCNU), циклофосфамида, бусульфана, дибромманнитола, стрептозотоцина, дакарбазина (DTIC), прокарбазина, митомицина С; производных платины типа цисплатина или карбоплатина; дуокармицина А, дуокармицина SA, рахелмицина (СС-1065) либо их аналогов или производных; антибиотиков типа дактиномицина, блеомицина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, митрамицина, митомицина, митоксантрона, пликамицина, антрамицина (АМС)); пирроло[2,1-с][1,4]-бензодиазепинов (PDB); дифтерийного токсина и родственных молекул типа цепи А дифтерийного токсина и ее активных фрагментов и гибридных молекул, рицинового токсина типа рицина А или дегликозилированной цепи А рицинового токсина, холерного токсина, Шига-подобных токсинов типа SLT I, SLT II, SLT IIV, токсина LT, токсина С3, Шига-токсина, коклюшного токсина, столбнячного токсина, соевого ингибитора протеаз Боуман-Бирка, экзотоксина Pseudomonas, алорина, сапорина, модекцина, геланина, цепи А абрина, цепи А модекцина, альфа-сарцина, белков Aleurites fordii, белков диантина, белков Phytolacca americana типа PAPI, PAPII и PAP-S, ингибитора из Momordica charantia, курцина, кротина, ингибитора из Sapaonaria officinalis, токсинов гелонина, митогеллина, рестриктоцина, феномицина и еномицина; рибонуклеазы (РНКазы); ДНКазы I, стафилококкового энтеротоксина А; противовирусного белка лаконоса; дифтерийного токсина; и эндотоксина Pseudomonas.

В одном воплощении антитело конъюгировано с ауристатином или его пептидным аналогом, производным или пролекарством. Было показано, что ауристатины влияют на динамику микротрубочек, гидролиз ГТФ и деление ядер и клеток (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) и обладают противораковой (US 5663149) и противогрибковой активностью (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965). Например, ауристатин Е может реагировать с пара-ацетилбензойной кислотой или бензоилвалериановой кислотой с образованием АЕВ и AEVB, соответственно. Другие типичные производные ауристатинов включают AFP, MMAF (монометилауристатин F) и ММАЕ (монометилауристатин Е). Подходящие ауристатины и аналоги, производные и пролекарства ауристатинов, а также подходящие линкеры для конъюгирования ауристатонов с Abs описаны, например, в U.S. Patent Nos. 5,635,483, 5,780,588 и 6,214,345 и в International patent application publications WO 02088172, WO 2004010957, WO 2005081711, WO 2005084390, WO 2006132670, WO 03026577, WO 200700860, WO 207011968 и WO 205082023.

В одном воплощении антитело конъюгировано с пирроло[2,1-с][1,4]-бензодиазепином (PDB) либо его аналогом, производным или пролекарством. Подходящие PDBs и производные PDB и связанные с ними методы описаны, например, в Hartley J.A. et al., Cancer Res 2010, 70(17):6849-6858; Antonow D. et al., Cancer J 2008, 14(3):154-169; Howard P.W. et al., Bioorg Med Chem Lett 2009, 19:6463-6466; и Sagnou et al., Bioorg Med Chem Lett 2000, 10(18):2083-2086.

В одном воплощении антитело конъюгировано с цитотоксической молекулой, выбранной из группы, состоящей из антрациклина, майтансина, калихеамицина, дуокармицина, рахелмицина (СС-1065), доластатина-10, доластатина-15, иринотекана, монометилауристатина Е, монометилауристатина F, PDB либо их аналогов, производных или пролекарств.

В предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с антрациклином либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с майтансином либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с калихеамицином либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с дуокармицином либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с рахелмицином (СС-1065) либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с дуокармицином либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с доластатином-10 либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с доластатином-15 либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с монометилауристатином Е либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с монометилауристатином F либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с пирроло[2,1-с][1,4]-бензодиазепином либо его аналогом, производным или пролекарством. В другом предпочтительном воплощении антитело конъюгировано с иринотеканом либо его аналогом, производным или пролекарством.

В одном воплощении специфичное к CD74 антитело настоящего изобретения конъюгировано с нуклеиновой кислотой или с молекулой, связанной с нуклеиновой кислотой. В одном таком воплощении конъюгируемая нуклеиновая кислота представлена цитотоксической рибонуклеазой (РНКазой) или дезоксирибонуклеазой (например, ДНКазой I), антисмысловой нуклеиновой кислотой, ингибиторной молекулой РНК (например, молекулой siPHK) или иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой (например, иммуностимулирующей молекулой ДНК, содержащей мотив CpG). В другом воплощении специфичное к CD74 антитело настоящего изобретения конъюгировано с аптамером или рибозимом.

В одном воплощении специфичное к CD74 антитело настоящего изобретения конъюгировано, например, в виде слитого белка, с таким литическим пептидом, как CLIP, магайнин 2, меллитин, цекропин или Р18.

В одном воплощении антитело конъюгировано с цитокином, таким, например, как IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα, IFNβ, IFNγ, GM-CSF, CD40L, лиганд Flt3, фактор стволовых клеток, анцестим или TNFα.

В одном воплощении антитело конъюгировано с радиоизотопом или содержащим радиоизотоп хелатом. Например, антитело может быть конъюгировано с хелаторным линкером, например, DOTA, DTPA или тиуксетаном, что позволяет образование комплекса антитела с радиоизотопом. Антитело также может содержать или же быть конъюгированным с одной или несколькими радиоактивно мечеными аминокислотами или другими радиоактивно мечеными молекулами. Радиоактивно меченое специфичное к CD74 антитело может использоваться для диагностических и терапевтических целей. Неограничивающие примеры радиоизотопов включают ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ²¹³Bi, ²²⁵Ac и ²²⁷Th. Для терапевтических целей можно использовать радиоизотопы, излучающие бета- или альфа-частицы, например, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ²¹¹At, ²¹²Bi, ⁶⁷Cu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re и ²¹²Pb.

В качестве терапевтических молекул, применимых для конъюгации с антителом настоящего изобретения, могут служить и такие терапевтические средства, которые могут вводиться в комбинации со специфичным к CD74 антителом настоящего изобретения, как описано здесь, например, химиотерапевтические средства, противораковые цитокины или хемокины.

Специфичное к CD74 антитело настоящего изобретения также может быть подвергнуто химической модификации путем ковалентной конъюгацией с полимером, например, для увеличения времени полу жизни в кровотоке. Типичные полимеры и способы присоединения их к полипептидам представлены, к примеру, в US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 и US 4,609,546. Дополнительные полимеры включают полиоксиэтилированные полиоли и полиэтиленгликоли (ПЭГ) (например, ПЭГ с молекулярным весом от 1000 до 40000, как то от 2000 до 20000).

Терапевтическое или другое средство можно конъюгировать со специфичным к CD74 антителом настоящего изобретения прямо или косвенно, в соответствии с известными методами. Одним из примеров косвенной конъюгации второго средства является конъюгация через молекулу спейсера с остатком цистеина или лизина у антитела. Терапевтическая или иная молекула также может быть конъюгирована с N-(амино-)концевым или С-(карбокси-)концевым остатком полипептида специфичного к CD74 антитела или его фрагмента (например, тяжелой или легкой цепи специфичного к CD74 антитела) (например, см. Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)). Конъюгированные производные антител также могут быть получены путем конъюгирования по внутренним остаткам или сахарам, где это уместно. Типичные методы также описаны, например, в Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); и Nygren J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982).

В одном воплощении специфичное к CD74 антитело конъюгировано через спейсер или линкер с молекулой пролекарства, которое может активироваться in vivo до терапевтического препарата. Например, молекула пролекарства может присоединяться к антителу посредством линкера через N- или С-конец пептидной или непептидной молекулы препарата. После введения спейсер или линкер расщепляется связанными с раковыми клетками ферментами или другими специфическими для опухоли условиями, при которых образуется активный препарат. Примеры таких технологий пролекарств и линкеров описаны в WO 02083180, WO 2004043493, WO 2007018431, WO 2007089149, WO 2009017394 и WO 201062171 от Syntarga BV et al. (все они включены сюда путем ссылки). Подходящие технологии антитела-пролекарства и аналоги дуокармицина также приведены в U.S. Patent No. 6,989,452 (Medarex) (включенном сюда путем ссылки). Подходящие технологии пролекарств для ауристатинов описаны в WO 03026577 (Seattle Genetics) и в других ссылках по ауристатинам, приведенным выше.

В одном воплощении специфичное к CD74 антитело конъюгируют с терапевтической молекулой или пролекарством через линкер, чувствительный к изменениям рН или восстановительным условиям. Подходящие технологии линкеров известны в данной области и включают те, что описаны, например, в Ducry L and Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21:5-13; Senter P.D., Current Opinion in Chemical Biology 2009, 13:235-244; и Carter P.J. and Senter P.D., The Cancer Journal 2010, 14:154-169.

В некоторых воплощениях линкер расщепляется при внутриклеточных условиях таким образом, что при расщеплении линкера лекарственный препарат высвобождается из антитела во внутриклеточную среду. В некоторых воплощениях линкер расщепляется расщепляющим агентом, находящимся во внутриклеточной среде (например, внутри лизосом или эндосом или кавеол). Линкером может быть, например, пептидильный линкер, который расщепляется внутриклеточным ферментом пептидазой или протеазой, включая, без ограничения, лизосомные или эндосомные протеазы. В некоторых воплощениях длина пептидильного линкера составляет по меньшей мере две аминокислоты или по меньшей мере три аминокислоты. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и D и плазмин, которые все, как известно, гидролизуют дипептидные производные лекарств с высвобождением активного препарата внутри клеток мишени (например, см. Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). В конкретном воплощении пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, представлен линкером Val-Cit (валин-цитруллин) или линкером Phe-Lys (фенилаланин-лизин) (например, см. US6214345, в котором описан синтез доксорубицина с линкером Val-Cit и различные примеры линкеров Phe-Lys). Примеры структур линкеров Val-Cit и Phe-Lys включают, без ограничения, MC-vc-PAB, описанный ниже, MC-vc-GABA, MC-Phe-Lys-PAB или MC-Phe-Lys-GABA, при этом сокращение МС или те означает малеимидокапроил, vc означает Val-Cit, РАВ - п-аминобензилкарбамат, a GABA - γ-аминомасляная кислота. Преимущество внутриклеточного протеолитического высвобождения терапевтического средства состоит в том, что такое средство обычно ослабляется при конъюгации, а стабильность конъюгатов в сыворотке обычно высока.

В следующем воплощении звено линкера не расщепляется, а препарат высвобождается при деградации антитела (например, см. US 2005/0238649). Как правило, такой линкер практически не чувствителен к внеклеточной среде. "Практически не чувствителен к внеклеточной среде" в применении к линкеру означает то, что в образце конъюгата антитело-препарат при нахождении конъюгата во внеклеточной среде (например, в плазме) расщепляется не более 20%, обычно не более 15%, предпочтительно не более 10% и еще более предпочтительно не более 5%, не более 3% или не более 1% линкеров. Будет ли линкер практически не чувствительным к внеклеточной среде, можно определить, к примеру, путем инкубации конъюгата антитело-препарат с плазмой в течение заданного промежутка времени (например, 2, 4, 8, 16 или 24 ч) с последующим количественным определением свободного препарата, присутствующего в плазме.

В одном конкретном воплощении специфичное к CD74 антитело конъюгировано с ММАЕ (формула I):

где волнистой линией обозначено место ковалентного присоединения линкера.

В одном конкретном воплощении специфичное к CD74 антитело конъюгировано с MMAF (формула II):

где волнистой линией обозначено место ковалентного присоединения линкера.

В предпочтительном воплощении линкер присоединяется к ММАЕ или MMAF по сульфгидрильным группам (свободным остаткам цистеина) специфичного к CD74 антитела, полученным при (частичном) восстановлении специфичного к CD74 антитела.

В другом предпочтительном воплощении линкер-ауристатин представлен MC-vc-PAB-MMAF (также обозначается как vcMMAF) или MC-vc-PAB-MMAE (также обозначается как vcMMAE (формула III и IV, соответственно):

где p означает число от 1 до 8, S означает свободный тиол остатка цистеина специфичного к CD74 антитела, a Ab - специфичное к CD74 антитело.

В одном воплощении линкер-ауристатин представлен vcMMAE. Молекула препарата-линкера vcMMAE и способы конъюгации изложены в WO 2004010957, US 7659241, US 7829531, US 7851437 и US 11/833028 (Seattle Genetics, Inc.), которые включены сюда путем ссылки, причем молекулы препарата-линкера vcMMAE можно присоединять к специфичным к CD74 антителам по цистеинам с помощью способа, аналогичного тому, что приведен в них.

В другом предпочтительном воплощении линкер-конъюгат представлен mcMMAF (формула V):

где p означает число от 1 до 8, S означает свободный тиол остатка цистеина специфичного к CD74 антитела, a Ab - специфичное к CD74 антитело.

Молекула препарата-линкера vcMMAF и способы конъюгации изложены в US 7498298, US 11/833954 и WO 2005081711 (Seattle Genetics, Inc.), которые включены сюда путем ссылки, причем молекулы препарата-линкера vcMMAF можно присоединять к специфичным к CD74 антителам по цистеинам с помощью способа, аналогичного тому, что приведен в них.

В одном аспекте изобретения предусмотрены специфичные к CD74 ADCs, включающие антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что и антитело из числа 005, 006, 008 и 011, и препарат, который представлен ауристатином либо его аналогом, производным или пролекарством. В одном воплощении значение ЕС₅₀ У ADC при связывании с внеклеточным доменом CD47v1 составляет менее 0,2 мкг/мл, как то менее 0,1 мкг/мл или менее 0,05 мкг/мл, и необязательно более 0,01 мкг/мл, как то более 0,02 мкг/мл при определении способом, описанным в примере 16. В одном воплощении специфичные к CD74 ADCs индуцируют гибель более 70%, 80% или 90% клеток при измерении на клетках Raji, Daudi или М4А4 способом, описанным в примере 18. В одном воплощении у специфичных к CD74 ADCs значение IC₅₀ при индукции гибели клеток Raji, Daudi или М4А4 составляет менее 0,5 мкг/мл, менее 0,3 мкг/мл, менее 0,2 мкг/мл или менее 0,1 мкг/мл и необязательно более 0,005 мкг/мл или около 0,01 мкг/мл при определении способом, описанным в примере 18. В одном воплощении антитело содержит по меньшей мере CDR3 V_H, как то CDR1 или 2 и 3 V_H, необязательно CDR1, 2 и 3 V_H, и CDR1, 2 и 3 V_L антитела 005, описанные в таблице 3. В одном воплощении антитело содержит по меньшей мере CDR3 V_H, как то CDR1 или 2 и 3 V_H, необязательно CDR1, 2 и 3 V_H, и CDR1, 2 и 3 V_L антитела 006, описанные в таблице 3. В одном воплощении антитело содержит по меньшей мере CDR3 V_H, как то CDR1 или 2 и 3 V_H, необязательно CDR1, 2 и 3 V_H, и CDR1, 2 и 3 V_L антитела 011, описанные в таблице 3. В одном воплощении лекарственный препарат представлен производным монометилауристатина, необязательно выбранным из ММАЕ и MMAF.

В одном аспекте изобретения предусмотрены специфичные к CD74 ADCs, включающие антитело, содержащее последовательности CDR, V_H и/или V_L антитела, выбранного из группы, состоящей из 005, 006 и 011, и препарат, выбранный из ММАЕ и MMAF. В одном воплощении антитело представлено 005. В одном воплощении антитело представлено 006. В одном предпочтительном воплощении антитело представлено 011. В одном предпочтительном воплощении антитело представлено 005, а препарат - ММАЕ, необязательно vcMMAE. В одном предпочтительном воплощении антитело представлено 005, а препарат - MMAF, необязательно mcMMAF. В одном предпочтительном воплощении антитело представлено 006, а препарат - ММАЕ, необязательно vcMMAE. В одном предпочтительном воплощении антитело представлено 006, а препарат - MMAF, необязательно mcMMAF. В одном предпочтительном воплощении антитело представлено 011, а препарат - ММАЕ, необязательно vcMMAE. В одном предпочтительном воплощении антитело представлено 011, а препарат - MMAF, необязательно mcMMAF.

В конкретных и отдельных воплощениях изобретения предусмотрены следующие специфичные к CD74 ADCs: 011-vcMMAE, 006-vcMMAE, 005-vcMMAE, 011-mcMMAF, 006-mcMMAF и 005-mcMMAF.

Нагруженность цитостатическим препаратом представлена p, что означает среднее число молекул цитостатического препарата на антитело в молекуле (также обозначается как соотношение препарата к антителу, DAR). Нагруженность цитостатическим препаратом может составлять от 1 до 20 молекул препарата на антитело и может приходиться на аминокислоты с полезными функциональными группами, такими, без ограничения, как амино- или сульфгидрильные группы, как у лизина или цистеина.

В зависимости от способа конъюгации, p может быть ограничено числом мест прикрепления на антителе, например, при присоединении по тиоловым группам цистеина, т.е. по сульфгидрильным группам. Обычно антитела содержат не много свободных и реактивных тиоловых групп цистеина, т.е. сульфгидрильных групп, по которым могут присоединяться молекулы препарата, так как большинство тиоловых групп цистеина в антителах находится в виде дисульфидных мостиков. Поэтому в некоторых воплощениях антитело можно подвергнуть восстановлению с помощью таких восстановителей, как дитиотреитол (DTT) или трикарбонилэтилфосфин (ТСЕР), при частично или полностью восстановительных условиях, чтобы получить реактивные сульфгидрильные группы. В некоторых воплощениях нагруженность препаратом у ADC по изобретению составляет от 1 до 8, как то от 2 до 5 или от 3 до 5, как то 4. После (частичного) восстановления антитела становятся доступными максимум 8 свободных сульфгидрильных групп (именно 8 цистеинов задействовано в образовании межцепочечных дисульфидных связей).

Экспрессирующие конструкции

В следующих отдельных аспектах изобретение касается нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности антител по изобретению, экспрессирующих векторов, кодирующих последовательности антител по изобретению, клеток хозяина, содержащих такие экспрессирующие векторы, гибридом, продуцирующих антитела по изобретению, и способов получения антител по изобретению путем культивирования таких клеток хозяина или гибридом в соответствующих условиях, при этом вырабатываются антитела, которые необязательно извлекаются.

В одном воплощении изобретения предусмотрен экспрессирующий вектор, содержащий последовательность нуклеотидов, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NOs:7-26. В одном воплощении экспрессирующий вектор содержит одну или несколько последовательностей нуклеотидов, кодирующих одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NOs:7, 11, 15, 19, 23 и 26, или любые комбинации из них. В другом воплощении экспрессирующий вектор содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей CDR3 V_H по SEQ ID NOs:10, 14, 18 или 22. В другом воплощении экспрессирующий вектор содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность V_H, выбранную из SEQ ID NOs:7, 11, 15 и 19. В другом воплощении экспрессирующий вектор содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность V_L, выбранную из SEQ ID NOs:23 и 26. В другом воплощении экспрессирующий вектор дополнительно содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую константную область легкой цепи антител человека, тяжелой цепи антител человека или обеих цепей.

В предпочтительном воплощении экспрессирующий вектор изобретения содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую варианты одной или нескольких вышеприведенных аминокислотных последовательностей, причем эти варианты содержат не более 25 модификаций аминокислот, как то не более 20, как то не более 15, 14, 13, 12 или 11 модификаций аминокислот, как то 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 модификацию аминокислот типа делеций или вставок, предпочтительно замен, как то консервативных замен, или они по меньшей мере на 80% идентичны любой из этих последовательностей, как то по меньшей мере на 85% или на 90% или на 95% идентичны, как то на 96% или на 97% или на 98% или на 99% идентичны любой из вышеприведенных аминокислотных последовательностей.

Экспрессирующим вектором в контексте настоящего изобретения может быть любой подходящий вектор, включая векторы из хромосомной, нехромосомной и синтетической нуклеиновой кислоты (последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей подходящий набор контролирующих экспрессию элементов). Примеры таких векторов включают производные SV40, бактериальные плазмиды, фаговые ДНК, бакуловирусы, дрожжевые плазмиды, векторы, происходящие из комбинации плазмид и фаговой ДНК, и векторы из вирусной нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК). В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая специфичное к CD74 антитело, содержится в векторе из "голой" ДНК или РНК, включая, к примеру, линейные экспрессирующие элементы (как описано, к примеру, в Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), векторы из сжатой нуклеиновой кислоты (как описано, к примеру, в US 6,077, 835 и/или WO 00/70087), плазмидные векторы типа pBR322, pUC 19/18 или pUC 118/119, векторы из нуклеиновой кислоты минимального размера "midge" (как описано, к примеру, в Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), или в виде осажденной векторной конструкции из нуклеиновой кислоты, например, осажденной CaPO₄^- конструкции (как описано, к примеру, в WO 00/46147; Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986); Wigler et al., Cell 14, 725 (1978); и Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Такие векторы из нуклеиновой кислоты и их применение хорошо известны (например, см. US 5589466 и US 5973972).

В одном воплощении вектор подходит для экспрессии специфичных к CD74 антител в бактериальных клетках. Примеры таких векторов включают экспрессирующие векторы типа BlueScript (Stratagene), вектора pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989)), векторы рЕТ (Novagen, Madison WI) и др.

Экспрессирующим вектором также или альтернативно может быть вектор, подходящий для экспрессии в дрожжевой системе. Можно использовать любой вектор, подходящий для экспрессии в дрожжевой системе. Подходящими векторами являются, к примеру, векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы типа альфа-фактора, алкогольоксидазы и PGH (см. обзоры в F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience, New York (1987); и Grant et al., Methods in Enzymol. 153, 516-544 (1987)).

Нуклеиновая кислота и/или вектор также может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность секреции/локализации, которая может направить полипептид, как то возникающую полипептидную цепь, в периплазматическое пространство или в среду клеточной культуры. Такие последовательности известны и включают лидера секреции или сигнальные пептиды, последовательности, направляющие в органеллы (например, последовательности ядерной локализации, сигналы удержания в ER, последовательности транспорта в митохондрии, последовательности транспорта в хлоропласты), последовательности мембранной локализации/ якорные последовательности (например, последовательности остановки переноса, якорные последовательности GPI) и др.

В экспрессирующем векторе изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая специфичное к CD74 антитело, может содержать или быть связана с любым подходящим промотором, энхансером и другими способствующими экспрессии элементами. Примеры таких элементов включают сильные промоторы экспрессии (например, промотор/энхансер IE вируса CMV человека, а также промоторы RSV, SV40, SL3-3, MMTV и LTR вируса HIV), эффективные последовательности терминации поли(А), начало репликации для получения плазмид в Е.coli, гены устойчивости к антибиотикам в качестве селектируемых маркеров и/или удобные сайты клонирования (например, полилинкеры). Нуклеиновые кислоты также могут содержать индуцибельный промотор в отличие от конститутивного промотора типа IE CMV (специалистам должно быть известно, что такие термины фактически служат для описания степени экспрессии генов при определенных условиях).

В одном воплощении экспрессирующий вектор, кодирующий специфичное к CD74 антитело, может располагаться и/или доставляться в клетки хозяина или в организм животного при помощи вирусного вектора.

Такие экспрессирующие векторы могут использоваться для получения рекомбинантных антител по изобретению.

В одном аспекте изобретения предусмотрены рекомбинантные эукариотические или прокариотические клетки хозяина, которые вырабатывают антитела из любых описанных здесь аспектов или воплощений. Соответственно, изобретением предусмотрены рекомбинантные эукариотические или прокариотические клетки хозяина типа трансфектомы, которые вырабатывают приведенные здесь антитела или иммуноглобулины по изобретению. Примеры клеток хозяина включают дрожжевые, бактериальные клетки и клетки млекопитающих, как то клетки СНО или НЕК. Например, в одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены клетки, содержащие нуклеиновую кислоту, стабильно встроенную в клеточный геном и содержащую последовательность, которая кодирует экспрессию специфичного к CD74 антитела по настоящему изобретению. В другом воплощении настоящего изобретения предусмотрены клетки, содержащие не встроенную нуклеиновую кислоту типа плазмиды, космиды, фагемиды или линейного экспрессирующего элемента, которая содержит последовательность, кодирующую экспрессию специфичного к CD74 антитела по изобретению.

В другом аспекте изобретение касается гибридом, вырабатывающих приведенные здесь антитела изобретения. В следующем аспекте изобретение касается трансгенных животных или растений, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь человека, причем животные или растения вырабатывают антитела по изобретению. Получение таких гибридом и трансгенных животных или растений было описано выше, а также описано в примерах.

В следующем аспекте изобретение касается способа получения специфичных к CD74 антител по изобретению, который включает стадии:

a) культивирования гибридомы или клеток хозяина по изобретению, как описано выше, и

b) выделения и/или очистки антител по изобретению из культуральной среды, и необязательно

c) получения ADC из специфичных к CD74 антител.

В следующем аспекте последовательность нуклеотидов, кодирующая последовательность антитела по изобретению, дополнительно кодирует вторую молекулу типа терапевтического полипептида. Примеры терапевтических полипептидов описаны здесь в другом месте. В одном воплощении изобретение касается способа получения слитого белка специфичных к CD74 антител, который включает стадии:

a) культивирования клеток хозяина, содержащих экспрессирующий вектор, включающий такую последовательность нуклеотидов, и

b) выделения и/или очистки слитого белка специфичных к CD74 антител из культуральной среды.

Фармацевтические композиции

В одном аспекте изобретения предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие антитела или ADCs, приведенные в любом из вышеприведенных аспектов и воплощений, и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтические композиции могут быть составлены с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также с любыми другими известными вспомогательными веществами и наполнителями в соответствии со стандартными методами типа тех, что изложены в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.

Фармацевтически приемлемые носители или разбавители, а также любые другие известные вспомогательные вещества и наполнители должны подходить для антител или конъюгатов антител настоящего изобретения и выбранного способа введения. Пригодность для носителей и других компонентов фармацевтических композиций определяется на основании отсутствия значительного отрицательного воздействия на требуемые биологические свойства выбранного соединения или фармацевтической композиции настоящего изобретения (например, не очень значительного воздействия на связывание антигена, как то: относительного ингибирования на 10% или меньше, на 5% или меньше и т.д.).

Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут включать разбавители, заполнители, соли, буфера, детергенты (например, неионные детергенты типа Tween-20 или Tween-80), стабилизаторы (например, сахара или свободные от белка аминокислоты), консерванты, фиксаторы тканей, солюбилизирующие вещества и/или другие материалы, подходящие для включения в фармацевтические композиции.

Фактический, уровень дозы активных ингредиентов в фармацевтических композициях настоящего изобретения может варьироваться с тем, чтобы получить такое количество активного ингредиента, которое будет эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа для определенного пациента, композиции и способа применения, но не будет токсичным для пациента. Выбранный уровень дозы зависит от ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретной используемой композиции настоящего изобретения, способа применения, времени введения, скорости выведения используемого конкретного соединения, продолжительности лечения, других лекарственных препаратов, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с данной композицией, возраста, пола, веса, заболевания, общего состояния здоровья и предыдущей медицинской истории пациента, подлежащего лечению, и других подобных факторов, хорошо известных в области медицины.

Фармацевтические композиции могут вводиться любым подходящим способом. Подходящие способы введения соединений настоящего изобретения in vivo и in vitro хорошо известны и могут быть выбраны рядовым специалистом.

В одном воплощении фармацевтическая композиция настоящего изобретения вводится парентерально.

Выражения "парентеральное введение" и "вводится парентерально" в настоящем изобретении означают другие способы введения, чем энтеральное и топическое, обычно посредством инъекции, и включают эпидермальное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, интракапсулярное, внутриглазничное, внутрисердечное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутрисухожильное, транстрахеальное, подкожное, субкутикулярное, внутрисуставное, субкапсулярное, субарахноидальное, интраспинальное, внутричерепное, внутригрудное, эпидуральное и интрастернальное введение и вливание.

В одном воплощении фармацевтическая композиция вводится посредством внутривенного или подкожного введения или вливания.

Фармацевтически приемлемые носители включают всевозможные подходящие растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, средства поддержания изотоничности, антиоксиданты, замедляющие всасывание средства и др., которые физиологически совместимы с соединениями настоящего изобретения.

Примерами подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях настоящего изобретения, являются вода, физраствор, фосфатно-солевой буфер, этанол, декстроза, полиолы (как то глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и др.) и подходящие их смеси, растительные масла, как то оливковое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло и кунжутное масло, коллоидные растворы карбоксиметилцеллюлозы, трагакантовая камедь и органические эфиры для инъекций типа этилолеата и/или различные буфера. Другие носители хорошо известны в области фармацевтики.

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления ex temporo стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Применение таких сред и веществ для фармацевтически активных субстанций хорошо известно. За исключением тех случаев, когда какая-либо обычная среда или вещество несовместимы с активным соединением, предусматривается их применение в фармацевтических композициях настоящего изобретения.

Надлежащая текучесть может поддерживаться, к примеру, за счет покрывающих материалов, таких как лецитин, выдерживанием требуемого размера частиц в случае дисперсий и использованием поверхностно-активных веществ.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут содержать фармацевтически приемлемые антиоксиданты, например, (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и др.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутиловый гидроксианизол (ВНА), бутиловый гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и др.; и (3) хелаторы металлов, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбитол, винная кислота, фосфорная кислота и др.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут содержать средства поддержания изотоничности, такие как сахара, полиспирты, как то: маннитол, сорбитол, глицерин, или хлористый натрий в композициях.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения также могут содержать одно или несколько вспомогательных веществ, подходящих для выбранного способа применения, таких как консерванты, увлажняющие вещества, эмульгирующие вещества, диспергирующие вещества, консерванты или буфера, которые могут увеличить срок годности или эффективность фармацевтической композиции. Соединения настоящего изобретения могут быть приготовлены с носителями, которые будут предохранять их от быстрого высвобождения, например, составы с контролируемым высвобождением, включая импланты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Такие носители могут включать желатин, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, биоразложимые биосовместимые полимеры типа этиленвинилацетата, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимеры молочной кислоты сами по себе или вместе с воском или другими материалами, хорошо известными в данной области. Способы получения таких составов хорошо известны специалистам. Например, см. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

В одном воплощении соединения настоящего изобретения могут быть заключены в лекарственную форму, обеспечивающую надлежащее распределение in vivo. Фармацевтически приемлемые носители для парентерального введения включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления ех temporo стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Применение таких сред и веществ для фармацевтически активных субстанций известно в данной области. За исключением случаев, когда какая-либо обычная среда или вещество несовместимы с активным соединением, предусматривается их применение в фармацевтических композициях настоящего изобретения. В композиции также могут входить и другие активные или терапевтические соединения.

Фармацевтические композиции для инъекций, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Композиции могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, липосом или других упорядоченных структур, подходящих для высоких концентраций препарата. Носителем может быть водный или неводный растворитель или диспергирующая среда, содержащая, к примеру, воду, этанол, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящие их смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические эфиры для инъекций, например, этилолеат. Надлежащая текучесть может поддерживаться, к примеру, с помощью таких покрытий, как лецитин, выдерживанием требуемого размера частиц в случае дисперсий и применением поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно следует включать в композицию изотонические вещества, к примеру, сахара, полиспирты, как то: глицерин, маннитол, сорбитол, либо хлористый натрий. Пролонгированное всасывание композиций для инъекций может обеспечиваться включением в композицию вещества, замедляющего всасывание, к примеру, соли моностеарата и желатина.

Стерильные растворы для инъекций могут быть получены введением активного соединения в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним или несколькими ингредиентами, перечисленными выше, как потребуется, с последующей стерилизацией микрофильтрованием. Обычно дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие нужные ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций примерами методов получения являются вакуумная сушка и замораживание-высушивание (лиофилизация), дающие порошок активного ингредиента плюс дополнительных нужных ингредиентов из предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать одно антитело или ADC настоящего изобретения, комбинацию из антитела или ADC по изобретению с другим терапевтическим соединением или комбинацию из соединений настоящего изобретения.

Терапевтическое применение

В следующем аспекте изобретение касается антител или ADCs, приведенных в любом аспекте или воплощении изобретения, для применения в качестве лекарств.

Специфичные к CD74 антитела настоящего изобретения могут применяться при лечении или профилактике заболеваний с участием клеток, экспрессирующих CD74. Например, антитела могут вводиться клеткам в культуре, например, in vitro или ex vivo, или же субъектам-людям, например, in vivo, для лечения или профилактики заболеваний с участием клеток, экспрессирующих CD74. В настоящем изобретении термин "субъект" обычно означает человека, который реагирует на специфичное к CD74 антитело или ADC. Субъектами, к примеру, могут быть люди с заболеваниями, которые можно исправить или облегчить путем модулирования функции CD74 или уничтожения клеток, прямо или косвенно.

В одном воплощении изобретения предусмотрен способ модулирования связанной с CD74 передачи сигналов в экспрессирующих CD74 клетках путем контактирования их со специфичным к CD74 антителом. Специфичное к CD74 антитело по изобретению может, к примеру, мешать связыванию MIF с CD74, что является неограничивающим примером того, как антитело по изобретению может модулировать связанную с CD74 передачу сигналов.

В одном воплощении изобретения предусмотрен способ уничтожения экспрессирующих CD74 клеток путем контактирования их со специфичным к CD74 антителом изобретения. Не ограничиваясь теорией, вызванное антителом сшивание или образование кластеров (например, при связывании области Fc связанных с CD74 антител с экспрессирующими FcR клетками) молекул CD74 на поверхности клетки может привести к апоптозу клеток.

В одном воплощении изобретения предусмотрен способ уничтожения экспрессирующих CD74 клеток путем контактирования их со специфичным к CD74 антителом изобретения в присутствии эффекторных клеток, способных вызвать опосредованный Fc ответ эффекторных клеток типа CDC, ADCC или ADCP. В этом воплощении, как правило, антитело является полноразмерным и того изотипа, который вызывает ответ типа CDC или ADCC, такого, например, как изотип IgG1,κ.

Специфичные к CD74 антитела по изобретению характеризуются эффективной интернализацией после связывания с CD74, что делает их пригодными для применения в виде ADCs, как описано в любом из приведенных здесь аспектов или воплощений.

Соответственно, в одном воплощении изобретения предусмотрен способ уничтожения экспрессирующих CD74 клеток путем контактирования их с ADC по изобретению, что требует интернализации и транспорта в лизосомы для специфического (т.е. расщепляемый линкер) или неспецифического (нерасщепляемый линкер) протеолитического расщепления комплекса антитело-линкер-препарат. В другом воплощении изобретения предусмотрен способ уничтожения экспрессирующих CD74 клеток путем контактирования их с ADC по изобретению, при этом специфичное к CD74 антитело соединено с терапевтической молекулой через линкер, способствующий высвобождению препарата после интернализации, например, при изменении рН или при восстановительных условиях. Подходящие технологии линкеров известны в этой области, как описано выше.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы лечения или профилактики заболеваний с участием клеток, экспрессирующих CD74 у субъекта, которые включают введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC по изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Как правило, способ включает введение субъекту специфичного к CD74 антитела или ADC в количестве, эффективном для лечения или профилактики заболевания.

В предпочтительном аспекте специфичные к CD74 антитела или ADCs вводятся профилактически для уменьшения риска возникновения рака, замедления начала прогрессирования рака и/или уменьшения риска рецидива при ремиссии рака и/или после хирургического удаления первичной опухоли. В последнем случае специфичные к CD74 антитела можно вводить, к примеру, в связи с операцией (т.е. до, во время или после нее). Профилактическое введение может быть полезно и таким пациентам, у которых трудно локализовать опухоль, наличие которой известно по другим биологическим факторам.

Особенно хорошей мишенью для специфичных к CD74 антител или ADCs по изобретению являются клетки, суперэкспрессирующие CD74, как то раковые клетки, так как может связаться больше антител или ADCs на 1 клетку. Так, в одном аспекте заболевание с участием клеток, экспрессирующих CD74, представляет собой рак, т.е. онкогенное заболевание, как то заболевание, характеризующееся присутствием раковых клеток, экспрессирующих CD74, включая, к примеру, такие заболевания, при которых клетки происходят из твердой опухоли или гематологической опухоли. Экспрессия CD74 описана, например, при раке молочной железы (Koretz K et al., Int J Cancer 1989, 44:816-822), колоректальном раке (Cuthbert RJ et al., Eur J Cancer 2009, 45:1654-1663), раке эндометрия/ шейки матки (Glew SS et al., Cancer Res 1992, 52:4009-4016), раке желудка (Tamori Y et al., Oncol Rep 2005, 14:873-877), плоскоклеточном раке головы и шеи (SCCHN) (Han J et al., Head Neck Oncol 2009, 1:27), раке легких (McClelland M et al., Am J Pathol 2009, 174:638-646), глиобластоме (Kitange GJ et al., J Neurooncol 2010, 100:177-186), злокачественной лимфоме (Momburg F et al., Int J Cancer 1987, 40:598-603), хронической В-клеточной лимфоцитарной лейкемии (B-CLL) (Narni F et al., Blood 1986, 68:372-377), неходжкинской лимфоме (NHL), моноцитоидной В-клеточной лимфоме (MBCL) (Stroup R et al., Hum Pathol 1992, 23:172-177), волосковоклеточной лейкемии (HCL) (Spiro RC et al., Leuk Res 1984, 8:55-62), злокачественной меланоме (Weeraratna AT et al., Oncogene 2004, 23:2264-2274), раке яичников (Rangel LB et al., Cancer Biol Ther 2004, 3:1021-1027), раке простаты (Meyer-Siegler KL et al., BMC Cancer 2005, 5:73), раке поджелудочной железы (Koide N et al., Clin Cancer Res 2006, 12:2419-2426), раке почек (Saito Т et al., Cancer Lett 1997, 115:121-127), неоплазмах тимусного эпителия (Datta MW et al., Appi Immunohistochem Mol Morphol 2000, 8:210-215), злокачественной фиброзной гистиосаркоме (Lazova R et al., Cancer 1997, 79:2115-2124) и гипофизарной аденоме (Rossi ML et al., Tumori 1990, 76:543-547). CD74 также оказался повышенным, например, в желудочном эпителии при инфекции Н. pylori и язвенном колите (Beswick, World J Gastroenterol. 2009, 15(23):2855-61).

Примеры клеток, экспрессирующих CD74, включают такие раковые клетки, например, как клетки из NHL, множественной миеломы (ММ), рака яичников, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака простаты, рака желудка, колоректального рака и рака печени.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы лечения или профилактики гематологических раковых заболеваний, которые включают введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC по настоящему изобретению нуждающемуся в этом субъекту, при этом гематологическое раковое заболевание выбрано из лимфомы, миеломы и/или лейкемии. В одном воплощении гематологическое раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из злокачественной лимфомы, хронической B-клеточной лимфоцитарной лейкемии (B-CLL), хронической миелоидной лейкемии (CML) в бластной фазе, NHL, MM, MBCL, HCL и Т-клеточной лимфомы.

В одном воплощении гематологическим раковым заболеванием является NHL. Специфичные к CD74 антитела и ADCs по настоящему изобретению можно применять, к примеру, при лечении как вялотекущих, так и агрессивных форм NHL. Примерами В-клеточной NHL являются лимфоматоидный грануломатоз, фолликулярная лимфома, диффузная крупноклеточная В-лимфома, лимфома клеток мантии, первичная эффузионная лимфома, внутрисосудистая крупноклеточная В-лимфома, медиастинальная крупноклеточная В-лимфома, болезни тяжелых цепей (в том числе болезни γ-, μ- и α-цепей), лимфомы, вызванные лечением иммуносупрессивными средствами, такие как вызванная циклоспорином лимфома и вызванная метотрексатом лимфома. В одном воплощении гематологическим раковым заболеванием является множественная миелома, такая, например, как миеломная болезнь легких цепей или моноклональная гаммапатия неустановленного значения (MGUS). В других отдельных и особых воплощениях гематологическим раковым заболеванием является злокачественная лимфома, B-CLL (например, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома; SLL), CML в бластной фазе, MBCL или HCL. В одном воплощении гематологическим раковым заболеванием является Т-клеточная лимфома, как то, например, фунгоидная гранулема, какая-либо периферическая Т-клеточная лимфома, ангиоиммунобластическая Т-клеточная лимфома, анапластическая крупноклеточная лимфома (ALCL), связанная с энтеропатией Т-клеточная лимфома или гепатоспленическая Т-клеточная лимфома. В другом воплощении гематологическим раковым заболеванием является лимфома Ходжкина. В другом воплощении гематологическим раковым заболеванием является макроглобулинемия Вальденстрома. В одном воплощении гематологическим раковым заболеванием является CLL типа B-CLL (например, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома; SLL).

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы лечения или профилактики твердых опухолей, которые включают введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC по настоящему изобретению нуждающемуся в этом субъекту, при этом твердая опухоль представлена меланомой, карциномой, саркомой, аденомой и/или глиомой. В одном воплощении рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы (например, первичного или метастазирующего рака молочной железы), колоректального рака, рака эндометрия/шейки матки, рака желудка, рака головы и шеи (например, SCCHN), печеночно-клеточной карциномы, рака легких (например, мелкоклеточного рака легких или немелкоклеточного рака легких), злокачественной глиомы (например, анапластической астроцитомы и мультиформной глиобластомы), злокачественной меланомы (например, первичной или метастазирующей меланомы), рака яичников (например, серозной, эндометриоидной или светлоклеточной аденокарциномы), рака поджелудочной железы, рака простаты, рака почек, рака мочевого пузыря, рака тимуса (например, карциномы тимуса и инвазивной тимомы), злокачественной фиброзной гистиосаркомы, акустической шванномы, гипофизарной аденомы и опухолей мягких тканей.

В одном воплощении рак представляет собой рак яичников. В другом воплощении рак выбран из первичного или метастазирующего рака молочной железы. В другом воплощении рак представляет собой рак поджелудочной железы, как то: неоперабельный запущенный или метастазирующий рак поджелудочной железы. В другом воплощении рак представляет собой рак простаты. В другом воплощении рак представляет собой рак желудка. В другом воплощении рак представляет собой колоректальную карциному, как то метастазирующую колоректальную карциному. В другом воплощении рак представляет собой печеночно-клеточную карциному. В других отдельных и особых воплощениях рак представляет собой рак эндометрия/шейки матки, рак головы и шеи, рак легких, злокачественную глиому, злокачественную меланому, рак яичников, рак почек, рак тимуса, злокачественную фиброзную гистиосаркому, акустическую шванному, гипофизарную аденому или опухоль мягких тканей.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний, которые включают введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC по настоящему изобретению нуждающемуся в этом субъекту. В одном воплощении аутоиммунное заболевание выбрано из иммунологической тромбоцитопении (как то острой идиопатической тромбоцитопенический пурпуры и хронической идиопатической тромбоцитопенический пурпуры), дерматомиозита, синдрома Шегрена, рассеянного склероза, хореи Сиденхама, миастении гравис, системной красной волчанки, волчаночного нефрита, ревматизма, полигландулярных синдромов, буллезной пузырчатки, сахарного диабета, пурпуры Henoch-Schonlein, стрептококкового нефрита, узловатой эритемы, артериита Такаясу, болезни Аддисона, ревматоидного артрита, саркоидоза, язвенного колита, полиморфной эритемы, IgA-нейропатии, узелкового полиартериита, анкилозирующего спондилита, синдрома Гудпасчура, облитерирующего тромбангиита, первичного билиарного цирроза печени, тиреоидита Хасимото, тиреотоксикоза, склеродермы, хронического активного гепатита, полимиозита/дерматомиозита, полихондрита, обыкновенной пузырчатки, грануломатоза Вегенера, мембранозной нефропатии, бокового амиотрофического склероза, сухотки спинного мозга, гигантоклеточного артериита/полимиалгии, злокачественной анемии, быстро прогрессирующего гломерулонефрита и фиброзного альвеолита.

В одном воплощении аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит. В другом воплощении аутоиммунным заболеванием является системный склероз. В другом воплощении аутоиммунным заболеванием является рассеянный склероз. В другом воплощении аутоиммунным заболеванием является воспалительная болезнь кишечника, например, болезнь Крона или язвенный колит.

В одном воплощении изобретением предусмотрен способ любого из заболеваний из вышеприведенных аспектов и воплощений путем введения нуждающемуся в этом индивиду специфичного к CD74 антитела или ADC по любому из вышеприведенных аспектов и воплощений. Изобретение также касается специфичных к CD74 антител или ADCs по изобретению для применения в качестве лекарств, например, при лечении рака или другого приведенного здесь заболевания.

В одном воплощении отбор пациентов для лечения специфичными к CD74 антителами основывается на уровне экспрессии CD74 в образце, как то в образце, содержащем опухолевые клетки, или на выявлении экспрессирующих CD74 опухолей с помощью меченых специфичных к CD74 антител или фрагментов антител, например, таковых по изобретению. Примеры диагностических способов определения экспрессии CD74 с помощью антител или фрагментов антител к CD74 по изобретению приведены ниже.

Эффективные дозировки и схемы дозировки для специфичных к CD74 антител или ADCs зависят от подлежащего лечению заболевания и могут быть установлены специалистами.

Врач с рядовой квалификацией в данной области может легко установить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач может начать с дозы специфичного к CD74 антитела, используемого в фармацевтической композиции, на меньшем уровне, чем это требуется для получения нужного терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу, пока не будет достигнут требуемый эффект. В общем, подходящая доза композиции настоящего изобретения должна быть такой, чтобы количество соединения составляло самую низкую дозу, достаточную для получения терапевтического эффекта по определенной схеме дозировки. Такая эффективная доза в общем зависит от факторов, описанных выше.

Например, "эффективное количество" для терапевтического применения можно измерить по его способности стабилизировать течение болезни. Способность соединения к подавлению рака можно оценить, к примеру, на модельной системе у животных, прогнозирующей эффективность на опухолях человека. С другой стороны, это свойство композиции можно оценить, исследуя способность соединения ингибировать рост клеток или индуцировать цитотоксичность методами анализа in vitro, известными практикующим специалистам. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размеры опухоли либо иным образом ослаблять симптомы у субъекта. Рядовой специалист сможет определить такое количество, исходя из таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и конкретная композиция или выбранный способ введения.

Типичный, без ограничения, диапазон для терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела настоящего изобретения составляет 0,1-100 мг/кг, как то 0,1-50 мг/кг, например, 0,1-20 мг/кг, как то 0,1-10 мг/кг, например, около 0,5 мг/кг, как то 0,3 или 1 или 3 мг/кг, 5 мг/кг или 8 мг/кг.

Типичный, без ограничения, диапазон для терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 ADC по изобретению составляет 0,02-100 мг/кг, как то 0,02-30 мг/кг, как то 0,05-10 мг/кг или 0,1-3 мг/кг, например, 0,5-2 мг/кг.

Введение может осуществляться, например, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно или подкожно, например, проксимально к местонахождению мишени.

Схемы дозировки в вышеприведенных способах лечения и применения подбираются таким образом, чтобы обеспечить оптимальный требуемый ответ (например, терапевтический ответ). Например, можно вводить болюсом, можно вводить несколько дробных доз за какое-то время либо пропорционально уменьшать или повышать дозу в соответствии с требованиями терапевтической ситуации.

В одном воплощении оптимизируется окошко эффективности-безопасности путем уменьшения специфической токсичности, к примеру, путем снижения соотношения препарат-антитело (DAR) и/или смешивания специфичного к CD74 ADC с немеченым специфичным к CD74 антителом.

В одном воплощении во время терапии отслеживается эффективность лечения, например, в заданные моменты времени. В одном воплощении эффективность отслеживается по измерению уровня CD74 в образцах, содержащих опухолевые клетки, по визуализации пораженного участка или же другими диагностическими методами, изложенными здесь, например, по одному или нескольким снимкам методом РЕТ-СТ, к примеру, с помощью меченого специфичного к CD74 антитела, фрагмента или миниантитела, происходящего из специфичного к CD74 антитела настоящего изобретения.

Если нужно, эффективная суточная доза фармацевтической композиции может вводиться в виде двух, трех, четырех, пяти, шести и больше дробных доз, вводимых по отдельности через соответствующие промежутки в течение суток, необязательно в виде дозовых форм. В другом воплощении специфичные к CD74 антитела вводятся путем медленного непрерывного вливания на протяжении длительного времени, как то: более 24 часов, чтобы уменьшить нежелательные побочные эффекты.

Хотя соединения настоящего изобретения можно вводить и сами по себе, однако предпочтительно они вводятся в виде фармацевтической композиции, как описано выше.

Эффективная доза специфичного к CD74 антитела или ADC по изобретению может вводиться и раз в неделю, раз в 2 недели или раз в 3 недели. Продолжительность введения дозы может ограничиваться, например, 8 неделями, 12 неделями или до тех пор, пока не наступит клиническое улучшение.

Например, в одном воплощении специфичное к CD74 антитело или ADC вводится вливанием раз в неделю в дозе от 10 до 500 мг/м², как то от 200 до 400 мг/м². Такое введение можно повторять, например, от 1 до 8 раз, как то от 3 до 5 раз. Введение может осуществляться путем непрерывного вливания на протяжении от 1 до 24 часов, как то от 1 до 12 часов.

В другом воплощении специфичное к CD74 антитело или ADC вводится вливанием раз в 3 недели в дозе от 10 до 500 мг/м², как то от 50 до 200 мг/м². Такое введение можно повторять, например, от 1 до 8 раз, как то от 3 до 5 раз. Введение может осуществляться путем непрерывного вливания на протяжении от 1 до 24 часов, как то от 1 до 12 часов.

В одном воплощении специфичное к CD74 ADC вводится в виде однократной дозы в 0,1-10 мг/кг, как то 1-3 мг/кг, раз в неделю или раз в 3 недели вплоть до 12 раз, до 8 раз или до клинического улучшения. Введение может осуществляться путем непрерывного вливания на протяжении от 1 до 24 часов, как то от 1 до 12 часов. Такой курс можно повторить один или несколько раз, как потребуется, к примеру, через 6 месяцев или 12 месяцев. Дозировка может определяться или подбираться путем измерения количества соединения настоящего изобретения в крови после введения, например, отбирая биологические образцы и используя антиидиотипические антитела, мишенью которых является антигенсвязывающий участок специфичных к CD74 антител настоящего изобретения.

В одном воплощении специфичные к CD74 антитела вводятся в качестве поддерживающей терапии, к примеру, раз в неделю на протяжении 6 месяцев или больше.

В качестве неограничивающего примера лечение по настоящему изобретению может проводиться при ежедневном введении соединения настоящего изобретения в дозе 0,1-100 мг/кг, как то 0,2, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в день, по меньшей мере в один из дней 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, 38, 39 или 40-й день или же по меньшей мере в одну из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-ю неделю после начала лечения или же в любой их комбинации, используя однократные или дробные дозы через каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 часа или же в любой комбинации.

Парентеральные композиции могут быть составлены в виде стандартных дозовых форм для легкости введения и однородности дозировки. Стандартная дозовая форма в настоящем изобретении означает физически дискретные единицы, пригодные в качестве стандартной дозировки для подлежащих лечению субъектов; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное на получение требуемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных дозовых форм настоящего изобретения определяется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и требуемого конкретного терапевтического эффекта, и (b) ограничений, существующих в области составления рецептур с таким активным соединением для лечения чувствительности у индивидов.

Комбинации

Изобретением также предусмотрено терапевтическое применение, при котором антитело или ADC по изобретению применяется в комбинации по меньшей мере еще с одним терапевтическим средством, уместными для подлежащего лечению заболевания, как описано выше. Такое введение может быть одновременным, раздельным или последовательным. При одновременном введении средства вводятся в виде одной композиции или в виде отдельных композиций, как подойдет.

Соответственно, настоящим изобретением предусмотрены способы лечения заболеваний с участием экспрессирующих CD74 клеток, как описано выше, которые включают введение специфичного к CD74 антитела или ADC по настоящему изобретению в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими средствами. Настоящим изобретением также предусмотрено применение специфичных к CD74 антител или ADCs по настоящему изобретению для получения фармацевтических композиций, предназначенных для введения вместе с по меньшей мере одним химиотерапевтическим средством для лечения таких заболеваний.

Дополнительное терапевтическое средство, как правило, подходит для того заболевания, которое подлежит лечению. Примеры таких терапевтических средств включают другие противораковые антитела или ADCs, цитотоксические средства, химиотерапевтические средства, антиангиогенные средства, противораковые иммуногены, средства, контролирующие клеточный цикл/регулирующие апоптоз, гормональные регулирующие средства и другие средства, описанные ниже.

В одном аспекте дополнительное терапевтическое средство представляет собой по меньшей мере одно второе антитело или ADC, которое связывается с другой мишенью, такой, например, как CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD80, CD126, В7, MUC1, тенасцин, НМ1.24 или HLA-DR. Например, второе антитело может связываться с B-клеточным антигеном, включая, без ограничения, CD20, CD19, CD21, CD23, CD38, CD46, CD80, CD138, HLA-DR, CD22, или с другим эпитопом на CD74. В другом воплощении второе антитело связывается с фактором роста А сосудистого эндотелия (VEGF-A). В отдельных и особых воплощениях дополнительное терапевтическое средство представляет собой специфичное к CD20 или CD138 антитело.

В одном воплощении специфичные к CD74 антитела или ADCs по изобретению предназначаются для применения в комбинации с определенным терапевтическим антителом, таким как велтузумаб, бевацизумаб (Avastin^®), залутумумаб, цетуксимаб (Erbitux^®), панитумумаб (Vectibix™), офатумумаб (Arzerra™), окрелизумаб, занолимумаб, даратумумаб, ранибизумаб (Lucentis^®), Zenapax, Simulect, Remicade, Humira, Tysabri, Xolair, раптива, нимотузумаб, ритуксимаб и/или трастузумаб (Herceptin^®). В одном воплощении специфичное к CD74 антитело или ADC настоящего изобретения вводится в комбинации со специфичным к CD20 антителом, таким, например, как велтузумаб, окрелизумаб или офатумумаб (Arzerra™). В другом воплощении специфичное к CD74 антитело или ADC настоящего изобретения вводится в комбинации с бевацизумабом (Avastin^®).

В одном аспекте изобретения предусмотрены антитела или ADCs по любому из вышеприведенных аспектов или воплощений для лечения заболеваний с участием экспрессирующих CD74 клеток, таких как рак, в сочетании с по меньшей мере одним химиотерапевтическим средством.

В одном воплощении химиотерапевтическое средство выбирают из антиметаболитов, таких как метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флоксуридин (FudR), 3',5'-O-диолеоил-FudR, флударабин, 5-фторурацил, дакарбазин, гидроксимочевина, аспарагиназа, гемцитабин, кладрибин и аналогичных средств.

В одном воплощении химиотерапевтическое средство выбирают из алкилирующих средств, таких как мехлорэтамин, тиоэпа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, дакарбазин (DTIC), прокарбазин, митомицин С, и таких производных платины, как цисплатин и карбоплатин, и аналогичных средств.

В одном воплощении химиотерапевтическое средство выбирают из антимитотических средств типа таксанов, например, доцетакселя, паклитакселя и алкалоидов барвинка, к примеру, виндесина, винкристина, винбластина и винорелбина.

В одном воплощении химиотерапевтическое средство выбирают из ингибиторов топоизомеразы, таких как топотекан или иринотекан.

В одном воплощении химиотерапевтическое средство выбирают из цитостатических препаратов, таких как этопозид и тенипозид.

В одном воплощении химиотерапевтическое средство выбирают из ингибиторов рецепторов факторов роста, как то ингибиторов ErbB1 (EGFR) (таких как иресса, эрбитукс (цетуксимаб), тарцева и аналогичные средства), ингибиторов ErbB2 (Her2/neu) (таких как герцептин и другие подобные средства) и аналогичных средств.

В одном воплощении химиотерапевтическое средство выбирают из ингибиторов тирозинкиназы, таких как иматиниб (Glivec, Gleevec STI571), лапатиниб, PTK787/ ZK222584 и аналогичные средства.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих CD74 у субъекта, как то больного раком, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC настоящего изобретения и по меньшей мере одного ингибитора ангиогенеза, неоваскуляризациии и/или иной васкуляризации нуждающемуся в этом субъекту.

Примерами таких ингибиторов ангиогенеза являются ингибиторы урокиназы, ингибиторы матриксных металлопротеаз (как то маримастат, неовастат, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 и аналогичные средства), ингибиторы миграции и пролиферации эндотелиальных клеток (как то TNP-470, скваламин, 2-метоксиэстрадиол, комбретастатины, эндостатин, ангиостатин, пеницилламин, SCH66336 (Schering-Plough Corp., Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica Inc, Titusville, NJ) и аналогичные средства), антагонисты ангиогенных факторов роста (как то ZD6474, SU6668, антитела против ангиогенных агентов и/или их рецепторов (типа VEGF, bFGF и ангиопоэтина-1), талидомид, аналоги талидомида (как то СС-5013), Sugen 5416, SU5402, антиангиогенные рибозимы (например, ангиозим), интерферон-α (например, интерферон-α2а), сурамин и аналогичные средства), ингибиторы киназы VEGF-R и ингибиторы других ангиогенных тирозинкиназ (например, SU011248), ингибиторы эндотелиального интегрина/сигнального пути выживания (как то витаксин и аналогичные средства), антагонисты/хелаторы меди (как то тетратиомолибдат, каптоприл и аналогичные средства), карбоксиамидо-триазол (CAI), ABT-627, CM101, интерлейкин-12 (IL-12), IM862, PNU145156E, а также нуклеотидные молекулы, ингибирующие ангиогенез (как то антисмысловая кДНК VEGF, кДНК, кодирующая ангиостатин, кДНК, кодирующая р53, и кДНК, кодирующая дефектный рецептор-2 VEGF) и аналогичные средства.

Другими примерами таких ингибиторов ангиогенеза, неоваскуляризации и/или иной васкуляризации являются антиангиогенные производные гепарина и родственные им молекулы (например, гепариназа III), темозоломид, NK4, ингибиторы циклооксигеназы-2, ингибиторы индуцируемого гипоксией фактора 1, антиангиогенные изофлавоны сои, олтипраз, фумагиллин и его аналоги, аналоги соматостатина, пентозанполисульфат, текогалан натрия, дальтепарин, тумстатин, тромбоспондин, NM-3, комбретастатин, канстатин, авастатин, антитела против других соответствующих мишеней (как то mAbs против интегрина α-v/β-3 и против кининостатина) и аналогичные средства.

В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации со специфичным к CD74 антителом или ADC для лечения вышеописанных заболеваний представляет собой противораковый иммуноген, как то раковый антиген/опухолевый антиген (например, молекула адгезии эпителиальных клеток (EpCAM/TACSTD1), муцин 1 (MUC1), карциноэмбриональный антиген (СЕА), опухолевый гликопротеин 72 (TAG-72), gp100, мелан-А, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, связанные с раком вирусные вакцины (например, вакцины от папилломавируса человека), опухолевые белки теплового шока и аналогичные средства. В таком воплощении могут применяться и другие подходящие раковые антигены/опухолевые антигены, известные в данной области,. Противораковые иммуногенные пептиды также включают антиидиотипические "вакцины", как то антиидиотипические антитела к ВЕС2 (митомумаб), CeaVac и родственные им антиидиотипические антитела, антиидиотипическое антитело к антителу MG7 и другие противораковые антиидиотипические антитела (например, см. Birebent et al., Vaccine 21(15), 1601-12 (2003); Li et al., Chin Med J (Engl) 114(9), 962-6 (2001); Schmitt et al., Hybridoma 13(5), 389-96 (1994); Maloney et al., Hybridoma 4(3), 191-209 (1985); Raychardhuri et al., J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986); Pohl et al., Int J Cancer 50(6), 958-67 (1992); Bohlen et al., Cytokines Mol Ther. 2(4), 231-8 (1996); и Maruyama, J Immunol Methods 264(1-2), 121-33 (2002)). Такие антиидиотипические Abs необязательно могут быть конъюгированы с носителем, которым может быть синтетическая (как правило, инертная) молекула носителя, белок (к примеру, гемоцианин моллюска блюдечко (KLH) (например, см. Ochi et al., Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)) или клетки (к примеру, эритроциты - например, см. Wi et al., J Immunol Methods 122(2), 227-34 (1989)).

В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации со специфичным к CD74 антителом или ADC для лечения вышеописанных заболеваний представляет собой цитокин, хемокин или комбинацию цитокин/хемокин со свойствами ингибитора ракового роста. Примеры подходящих цитокинов и факторов роста включают IFNγ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα (например, INFα2b), IFNβ, GM-CSF, CD40L, лиганд Flt3, фактор стволовых клеток, анцестим и TNFα. Подходящими хемокинами могут быть Glu-Leu-Arg (ELR)-отрицательные хемокины, такие как IP-10, МСР-3, MIG и SDF-1α из семейств СХС и С-С хемокинов человека. Подходящие цитокины включают производные цитокинов, варианты цитокинов, фрагменты цитокинов и слитые белки цитокинов. Эти и другие способы или применения с использованием нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды естественного происхождения, могут дополнительно или альтернативно выполняться методами "активации генов" и повышающей регуляции генов путем гомологичной рекомбинации типа тех, что описаны в US 5,968,502, US 6,063,630, US 6,187,305 и ЕР 0505500.

В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации со специфичным к CD74 антителом или ADC для лечения вышеописанных заболеваний представляет собой регулятор контроля клеточного цикла/апоптоза (или "регулирующий агент"). Регуляторы контроля клеточного цикла/апоптоза могут включать молекулы, которые воздействуют на и модулируют регуляторы контроля клеточного цикла/апоптоза, такие как (i) cdc-25 (например, NSC 663284), (ii) циклин-зависимые киназы, которые суперстимулируют клеточный цикл (как то флавопиридолы (L868275, HMR1275), 7-гидроксистауроспорин (UCN-01, KW-2401) и росковитин (R-росковитин, CYC202)), и (iii) модуляторы теломеразы (как то BIBR1532, SOT-095, GRN163 и композиции, описанные, к примеру, в US 6440735 и US 6713055). Неограничивающие примеры молекул, влияющих на апопотозные пути, включают родственный TNF индуцирующий апоптоз лиганд (TRAIL)/апоптозный лиганд-2 (Apo-2L), антитела, активирующие рецепторы TRAIL, IFNs и антисмысловые к Bcl-2.

В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации со специфичным к CD74 антителом или ADC для лечения вышеописанных заболеваний представляет собой гормональное регуляторное средство типа средств, применяемых для антиандрогенной и антиэстрогенной терапии. Примерами таких гормональных регуляторных средств являются тамоксифен, идоксифен, фулвестрант, дролоксифен, торемифен, ралоксифен, диэтилстильбестрол, этинилэстрадиол/эстинил, антиандрогены (такие как флутаминд/эулексин), прогестины (такие как гидроксипрогестерон капроат, медроксипрогестерон/провера, мегестрол ацепат/мегаце), адренокортикостероиды (такие как гидрокортизон, преднизон), рилизинг-гормон лютеинизирующего гормона (и его аналоги и другие агонисты LHRH, такие как бусерелин и госерелин), ингибиторы ароматазы (такие как анастразол/аримидекс, аминоглютетимид/цитраден, экземестан), ингибиторы гормонов (такие как октреотид/сандостатин) и аналогичные средства.

В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации со специфичным к CD74 антителом или ADC для лечения вышеописанных заболеваний представляет собой антианергическое средство (например, соединения небольших молекул, белки, гликопротеины или антитела, устраняющие толерантность к опухолевым и раковым антигенам). Примерами таких соединений являются молекулы, блокирующие активность CTLA-4, как то MDX-010 (ипилимумаб, Yervoy™) (Phan et al., PNAS USA 100, 8372 (2003)).

В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации со специфичным к CD74 антителом или ADC для лечения вышеописанных заболеваний представляет собой нуклеиновую кислоту, содержащую ген супрессора опухолей, или вектор типа дефектного по репликации аденовируса, кодирующего рекомбинантный p53/SCH58500 дикого типа человека, и др.; антисмысловую нуклеиновую кислоту, направленную на онкоген, мутированный или дерегулированный ген; или siRNA, направленную на мутированный или дерегулированный ген. Примеры мишеней для супрессоров опухолей включают, к примеру, BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1 и DCC.

В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации со специфичным к CD74 антителом или ADC для лечения вышеописанных заболеваний представляет собой противораковую нуклеиновую кислоту. Примеры противораковых нуклеиновых кислот включают генасенс (augmerosen/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (инкапсулированный в липосомах антисмысовой олигонуклеотид к c-raf, ISIS-5132), MG98 и другие антисмысловые нуклеиновые кислоты, направленные на PKCα, кластерин, IGFBPs, протеинкиназу А, циклин D1 или Bcl-2h.

В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации со специфичным к CD74 антителом или ADC для лечения вышеописанных заболеваний представляет собой противораковую ингибиторную молекулу РНК (например, см. Lin et al., Curr Cancer Drag Targets 1(3), 241-7 (2001), Erratum in: Curr Cancer Drag Targets 3(3), 237 (2003); Lima et al., Cancer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004); Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004); Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl), S144 (2003); Yang et al., Oncogene 22(36), 5694-701 (2003); и Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78(2003)).

Комбинированные композиции и способы введения по настоящему изобретению также включают введение вакцин из нуклеиновых кислот типа вакцин из "голой" ДНК, кодирующей такие раковые антигены/опухолевые антигены (например, см. US 5589466, US 5593972, US 5703057, US 5879687, US 6235523 и US 6387888). В одном воплощении комбинированный способ введения и/или комбинированная композиция включает композицию аутологичной вакцины. В одном воплощении комбинированный способ введения и/или комбинированная композиция включает вакцину из целых клеток или клеток, экспрессирующих цитокин (например, фибробластов, экспрессирующих рекомбинантный IL-2, дендритных клеток, экспрессирующих рекомбинантные цитокины, и др.) (например, см. Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003); Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002); и Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002)). Другим примером такого подхода с аутологичными клетками, который может быть полезным в комбинированных способах настоящего изобретения, является метод индивидуализированной иммунотерапии MyVax^® (раньше назывался GTOP-99) (Genitope Corporation - Redwood City, CA, США).

В одном воплощении специфичные к CD74 антитела или ADCs по изобретению комбинируются или вводятся совместно с вирусом, вирусными белками и т.п. Полезными компонентами таких композиций и способов могут быть, к примеру, дефектные по репликации вирусы, которые обычно способны только на один или всего лишь несколько циклов репликации in vivo и направлены на опухолевые клетки. Такие вирусные агенты могут содержать или быть связанными с нуклеиновыми кислотами, кодирующими такие иммуностимуляторы, как GM-CSF и/или IL-2. Полезными компонентами таких способов и композиций могут быть как природные онколитические, так и рекомбинантные онколитические вирусы (например, вирусы HSV-1, реовирусы, дефектные по репликации и чувствительные к репликации аденовирусы и др.). Соответственно, в одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены комбинированные композиции и комбинированные способы введения, в которых специфичные к CD74 антитела комбинируются или вводятся совместно с онколитическим вирусом. Примеры таких вирусов включают онколитические аденовирусы и герпесвирусы, которые могут быть или не быть модифицированными вирусами (например, см. Shah et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003); Stiles et al., Surgery 134(2), 357-64 (2003); Sunarmura et al., Pancreas 28(3), 326-9 (2004); Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004); Varghese et al., Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002); Wildner et al., Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999); Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004); и Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).

Комбинированные композиции и комбинированные способы введения настоящего изобретения также могут включать методы "цельноклеточной" и "адоптивной" иммунотерапии. Например, такие способы могут включать инфузию или повторное вливание клеток иммунной системы (к примеру, инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs), как то Т-клеток CD4⁺ и/или CD8⁺ (например, Т-клеток, подвергшихся экспансии под действием опухолевых антигенов и/или генетических усилителей), экспрессирующих антитела В-клеток или других клеток, продуцирующих или презентирующих антитела, дендритных клеток (например, дендритных клеток, культивировавшихся с вызывающим их экспансию агентом типа GM-CSF и/или Flt3-L, и/или связанных с опухолями нагруженных антигеном дендритных клеток), противоопухолевых NK-клеток, так называемых гибридных клеток или их комбинаций. В таких способах и композициях могут быть полезными и клеточные лизаты. Клеточные "вакцины" в клинических испытаниях, которые могут быть полезными в таких аспектах, включают клеточные лизаты Canvaxin™, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics) и Melacine^®. Антигены, выделяющиеся из раковых клеток, и их смеси (например, см. Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol.7, 1882-1887, July 2001), необязательно в смеси с такими адъювантами, как квасцы, тоже могут быть компонентами в таких способах и комбинированных композициях.

В одном воплощении специфичные к CD74 антитела или ADC вводятся пациентам в сочетании с применением способа внутренней вакцинации. Внутренняя вакцинация означает индуцированную гибель опухолевых или раковых клеток, как то вызванную лекарствами или радиацией, криокоагуляцией или радиочастотной коагуляцией гибель опухолевых клеток у пациента, которая, как правило, вызывает иммунный ответ, направленный на (i) опухолевые клетки в целом или (ii) части опухолевых клеток, включая (а) секретируемые белки, гликопротеины или другие продукты, (b) мембраносвязанные белки или гликопротеины или другие компоненты, связанные с мембранами или встроенные в них, и/или (с) внутриклеточные белки или другие внутриклеточные компоненты. Иммунный ответ, индуцируемый при внутренней вакцинации, может быть гуморальным (т.е. опосредованным антителами - комплементом) или опосредованным клетками (например, развитием и/или возрастанием числа эндогенных цитотоксических Т-лимфоцитов, распознающих погибшие внутри опухолевые клетки или их части). Наряду с лучевой терапией, неограничивающими примерами лекарств и средств, которые можно использовать для индуцирования такой гибели опухолевых клеток и внутренней вакцинации, являются стандартные химиотерапевтические средства, ингибиторы клеточного цикла, антиангиогенные препараты, моноклональные антитела, индуцирующие апоптоз вещества и ингибиторы передачи сигналов.

Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапевтических средств для применения в комбинации со специфичными к CD74 антителами или ADC для лечения вышеописанных заболеваний, являются вещества, индуцирующие дифференцировку, аналоги ретиноевой кислоты (такие как полностью транс-ретиноевая кислота, 13-цис-ретиноевая кислота и аналогичные, вещества), аналоги витамина D (такие как сеокальцитол и аналогичные вещества), ингибиторы ErbB3, ErbB4, IGF-IR, инсулиновых рецепторов, PDGFRα, PDGFRβ, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 и аналогичные средства.

Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапевтических средств для применения в комбинации со специфичными к CD74 антителами или ADC для лечения вышеописанных заболеваний, являются катепсин В, модуляторы активности дегидрогеназы катепсина D, глутатион-S-трансферазы (такие как глутацилцистеинсинтетаза и лактатдегидрогеназа) и аналогичные средства.

Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапевтических средств для применения в комбинации со специфичными к CD74 антителами для лечения вышеописанных заболеваний, являются эстрамустин и эпирубицин.

Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапевтических средств для применения в комбинации со специфичными к CD74 антителами для лечения вышеописанных заболеваний, являются ингибиторы HSP90 типа 17-аллиламиногелданамицина, антитела против таких опухолевых антигенов, как PSA, CA125, KSA и др., интегрины типа интегрина β1, ингибиторы VCAM и аналогичные средства.

Примерами других противораковых средств, которые могут быть адекватными в качестве терапевтических средств для применения в комбинации со специфичными к CD74 антителами или ADCs для лечения вышеописанных заболеваний, являются ингибиторы кальцинейрина (такие как вальсподар, PSC 833 и другие ингибиторы MDR-1 или p-гликопротеина), ингибиторы TOR (такие как сиролимус, эверолимус и рапамицин) и ингибиторы механизмов "самонаведения лимфоцитов" (такие как FTY720), а также средства, воздействующие на клеточную сигнализацию, такие как ингибиторы молекул адгезии (например, антитела против LFA и др.).

В одном воплощении специфичные к CD74 антитела или ADCs можно вводить в сочетании с введением одного или нескольких веществ, способствующих доступу специфичного к CD74 антитела или комбинированной композиции внутрь опухоли. Такие способы могут выполняться, к примеру, в сочетании с введением релаксина, который способен расслабить опухоль (например, см. US 6719977). В одном воплощении специфичное к CD74 антитело или ADC может быть соединено с проникающим в клетки пептидом (СРР). Проникающие в клетки пептиды и родственные им пептиды (как то искусственные проникающие в клетки антитела) описаны, к примеру, в Zhao et al., J Immunol Methods 254(1-2), 137-45 (2001); Hong et al., Cancer Res. 60(23), 6551-6 (2000); Lindgren et al., Biochem J. 377(Pt 1), 69-76 (2004); Buerger et al., J Cancer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75 (2003); Pooga et al., FASEB J. 12(1), 67-77 (1998); и Tseng et al., Mol Pharmacol. 62(4), 864-72 (2002).

В следующем воплощении специфичные к CD74 антитела или ADCs вводятся в сочетании с вызывающим повышение уровня CD74 средством, таким, например, как IFNγ или инактивированные клетки Н. pylori.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих CD74 у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC и по меньшей мере одного противовоспалительного средства, иммуносупрессорного и/или иммуномодулирующего средства нуждающемуся в этом субъекту.

В одном воплощении такое противовоспалительное средство может быть выбрано из аспирина и других салицилатов, ингибиторов Сох-2 (таких как рофекоксиб и целекоксиб), NSAIDs (таких как ибупрофен, фенопрофен, напроксен, сулиндак, диклофенак, пироксикам, кетопрофен, дифлунисал, набуметон, этодолак, оксапрозин и индометацин), антител против IL6R, антител против IL-8 (например, антител, описанных в WO 2004058797, например, 10F8), антител против IL-15 (например, антител, описанных в WO 03017935 и WO 2004076620), антител против рецептора IL-15, антител против CD4 (например, занолимумаб), антител против CD11a (например, эфализумаб), антител против α4/β1-интегрина (VLA4) (например, натализумаб), CTLA4-Ig для лечения воспалительных заболеваний, преднизолона, преднизона, модифицирующих заболевания противоревматических препаратов (DMARDs) типа метотрексата, гидроксихлорохина, сульфасалазина, ингибиторов синтеза пиримидинов (например, лефлуномид), блокаторов рецептора IL-1 (таких как анакинра), блокаторов TNF-α (таких как этанерсепт, инфликсимаб и адалимумаб) и аналогичных средств.

В одном воплощении такое иммуносупрессорное и/или иммуномодулирующее средство может быть выбрано из циклоспорина, азатиоприна, микофеноловой кислоты, микофенолата мофетила, кортикостероидов типа преднизона, метотрексата, солей золота, сульфасалазина, противомалярийных препаратов, бреквинара, лефлуномида, мизорибина, 15-дезоксиспергуалина, 6-меркаптопурина, циклофосфамида, рапамицина, такролимуса (FK-506), тимопентина, тимозина-α и аналогичных средств.

В одном воплощении такое иммуносупрессорное и/или иммуномодулирующее средство может быть выбрано из иммуносупрессорных антител, как. то антител, связывающихся с р75 рецептора IL-2, антител против CD25 (например, описанных в WO 2004045512 типа АВ1, АВ7, АВ11 и АВ12), антител против глобулина тимоцитов или антител, связывающихся, к примеру, с МНС, CD2, CD3 (например, OKT3), CD4, CD7, CD28, В7, CD40, CD45, IFNγ, TNFα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, CD11a или CD58, либо антител, связывающихся с их рецепторами или лигандами.

В одном воплощении такое иммуносупрессорное и/или иммуномодулирующее средство может быть выбрано из растворимых молекул IL-15R, IL-10R, В7 (В7-1, В7-2, их вариантов и фрагментов), ICOS и OX40, ингибиторов отрицательного регулятора Т-клеток (как то антител против CTLA4) и аналогичных средств.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих CD74 у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC и антитела против C3b(i) нуждающемуся в этом субъекту.

В одном воплощении терапевтическое средство для применения в комбинации со специфичными к CD74 антителами или ADCs для лечения вышеописанных заболеваний может быть выбрано из ингибиторов деацетилаз гистонов (к примеру, фенилбутирата) и/или агентов репарации ДНК (к примеру, ферментов репарации ДНК и аналогичных композиций типа димерицина).

Способы настоящего изобретения для лечения вышеописанных заболеваний, включающие введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC, также могут включать противораковую фотодинамическую терапию (например, противораковую лазерную терапию - которая необязательно может осуществляться с применением фотосенсибилизирующего средства, например, см. Zhang et al., J Control Release 93(2), 141-50 (2003)), противораковую звуковолновую и ударноволновую терапию (например, см. Kambe et al., Hum Cell 10(1), 87-94 (1997)) и/или противораковую нутрицевтическую терапию (например, см. Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34(1), 249-69, viii (2004); и Rafi, Nutrition 20(1), 78-82 (2004). Кроме того, специфичные к CD74 антитела могут применяться для получения фармацевтических композиций для лечения заболеваний, как описано выше, которые должны применяться с противораковой фотодинамической терапией (например, противораковой лазерной терапией - которая необязательно может осуществляться с применением фотосенсибилизирующего средства, противораковой звуковолновой и ударноволновой терапией и/или противораковой нутрицевтической терапией.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих CD74 у субъекта, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC по настоящему изобретению и назначение радиотерапии нуждающемуся в этом субъекту.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или профилактики рака, который включает введение терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC по настоящему изобретению и назначение радиотерапии нуждающемуся в этом субъекту.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрено применение специфичных к CD74 антител или ADCs настоящего изобретения для получения фармацевтической композиции для лечения рака, которая должна применяться в комбинации с радиотерапией.

Радиотерапия может включать облучение или связанное с ним введение пациенту радиоактивных фармпрепаратов. Источник излучения может быть либо внешним, либо внутренним по отношению к подлежащему лечению пациенту (облучение, к примеру, может проводиться в виде наружной лучевой терапии (EBRT) или брахитерапии (ВТ)). Радиоактивные элементы, которые можно использовать при выполнении таких способов, включают, например, радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод-123, йод-131 и индий-111.

В следующем воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или профилактики рака, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества специфичного к CD74 антитела или ADC по настоящему изобретению в сочетании с хирургией.

Как описано выше, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться при комбинированной терапии, т.е. в сочетании с одним или несколькими средствами, адекватными для подлежащего лечению заболевания, либо в виде отдельных фармацевтических композиций, либо вместе с соединением настоящего изобретения, составленным вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, как описано выше. Такая комбинированная терапия может потребовать меньших доз соединения настоящего изобретения и/или вводимых вместе с ним средств, что позволяет избежать токсичности или осложнений, связанных с различными монотерапиями.

В одном воплощении дополнительное терапевтическое средство для конкретного терапевтического применения выбирается из следующего:

- специфичных к CD20 антител, в особенности для лечения гематологических раковых заболеваний, таких, например, как B-CLL или фолликулярная лимфома;

- специфичных к CD138 антител, в особенности для лечения гематологических раковых заболеваний, таких, например, как миелома;

- специфичных к CD38 антител, в особенности для лечения гематологических раковых заболеваний, таких, например, как миелома или CLL;

- мелфалана (или мелфалана гидрохлорида) для лечения гематологических раковых заболеваний, таких, например, как миелома;

- антител против VEGF-A, таких, например, как бевацизумаб, в особенности для лечения такого рака, например, как рак молочной железы;

- леналидомида или бортезомиба, в особенности для лечения гематологических раковых заболеваний, таких, например, как миелома;

- фторурацила или гемцитабина, в особенности для лечения такого рака, например, как рак поджелудочной железы;

- иринотекана, в особенности для лечения такого рака, например, как колоректальный рак; и

- цисплатина или другого производного платины, в особенности для лечения такого рака, например, как SCCHN.

Диагностическое применение

Специфичные к CD74 антитела по изобретению также могут применяться и для диагностических целей, с использованием композиций, содержащих описанные здесь специфичные к CD74 антитела. Соответственно, изобретением предусмотрены способы диагностики и композиции с использованием описанных здесь специфичных к CD74 антител. Такие способы и композиции могут применяться для чисто диагностических целей, таких как выявление или идентификация заболеваний с участием экспрессирующих CD74 клеток, а также для мониторинга прогресса терапевтического лечения, мониторинга течения заболевания, оценки состояния после лечения, отслеживания рецидивов заболевания, определения риска возникновения заболевания и др.

В одном аспекте специфичные к CD74 антитела настоящего изобретения применяются ex vivo, как то при диагностике заболеваний, при которых экспрессирующие CD74 клетки указывают на заболевание или задействованы в патогенезе, путем детектирования уровня CD74 или уровня клеток, экспрессирующих CD74 на своей поверхности, в образцах, взятых у пациентов. Это может осуществляться, к примеру, контактированием исследуемого образца, необязательно вместе с контрольным образцом, со специфичным к CD74 антителом в условиях, способствующих связыванию антитела с CD74. Затем детектируется образование комплекса (например, методом ELISA). При использовании контрольного образца вместе с исследуемым образцом проводится анализ уровня специфичного к CD74 антитела и комплекса специфичного к CD74 антитела с CD74 в обоих образцах, при этом статистически значимое повышение уровня специфичного к CD74 антитела или комплекса специфичного к CD74 антитела с CD74 в исследуемом образце означает повышение уровня CD74 в исследуемом образце по сравнению с контрольным образцом.

Примеры стандартных иммунологических методов, в которых можно использовать специфичные к CD74 антитела настоящего изобретения, включают, без ограничения, методы ELISA, RIA, FACS, плазменного резонанса, хроматографические методы, методы иммуногистохимии тканей, western-блота и/или иммунопреципитации.

В одном воплощении изобретение касается способа выявления наличия антигена CD74 или экспрессирующих CD74 клеток в образце, который включает:

- контактирование образца со специфичным к CD74 антителом по изобретению в условиях, способствующих связыванию специфичного к CD74 антитела с CD74 в образце; и

- анализ образовавшегося комплекса.

Как правило, образец представлен биологическим образцом.

В одном воплощении образец представлен образцом ткани, причем известно или предполагается, что он содержит антиген CD74 и/или клетки, экспрессирующие CD74. Например, может осуществляться детектирование экспрессии CD74 in situ путем взятия гистологических образцов у пациентов и применения антител настоящего изобретения к таким образцам. Антитела могут применяться путем нанесения или наложения антител на образец, который затем подвергается детектированию подходящими способами. При этом можно определить не только наличие CD74 или клеток, экспрессирующих CD74, но также и распределение CD74 или клеток, экспрессирующих CD74, в исследуемой ткани (например, при оценке распространения раковых клеток). При применении настоящего изобретения рядовые специалисты в данной области должны хорошо понимать, что для осуществления такого детектирования in situ можно модифицировать любые методики из широкого спектра гистологических методов (как то методики окрашивания).

В вышеприведенных методах специфичное к CD74 антитело можно пометить детектируемой меткой, способствующей детектированию связанных с CD74 антител. С другой стороны, можно детектировать связывание специфичного к CD74 антитела (первичного) с помощью вторичного антитела, помеченного детектируемой меткой и связывающегося с первичным антителом.

Уровень CD74 в образцах также можно определить методом конкурентного иммуноанализа с использованием стандартов CD74, помеченных детектируемой меткой, и немеченого специфичного к CD74 антитела. При таком анализе биологический образец, меченый стандарт CD74 и специфичное к CD74 антитело смешивают и определяют количество меченого стандарта CD74, связавшегося с немеченым специфичным к CD74 антителом. Количество CD74 в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта CD74, связавшегося со специфичным к CD74 антителом.

Подходящими метками для специфичных к CD74 антител, вторичных антител и/или стандартов CD74, используемых в методах диагностики in vitro, являются, без ограничения, различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов - пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза и ацетилхолинэстераза; примеры подходящих комплексов простетических групп - стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ - умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин-изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинофлуоресцеин, дансилхлорид и фикоэритрин; примеры подходящих люминесцентных веществ - люминол; и примеры подходящих радиоактивных веществ - ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S и ³H.

В одном аспекте специфичные к CD74 антитела по изобретению применяются при визуализации in vivo экспрессирующих CD74 тканей типа опухолей. Для методов in vivo особенно подходят фрагменты антител, такие, например, как фрагменты (Fab')₂, Fab и Fab' вследствие их быстрой кинетики распределения.

Визуализация in vivo может проводиться любым подходящим методом. Например, можно использовать специфичное к CD74 антитело (например, его фрагмент), помеченное ⁹⁹Tc, ¹³¹I, ¹¹¹In или другим изотопом, дающим гамма-излучение, чтобы визуализировать накопление или распределение специфичного к CD74 антитела в экспрессирующих CD74 тканях типа опухолей с помощью гамма-сцинтилляционной камеры (например, установки Elscint Apex 409ECT), как правило, с использованием низкоэнергетического коллиматора с высоким разрешением или низкоэнергетического универсального коллиматора. С другой стороны, можно использовать мечение ⁸⁹Zr, ⁷⁶Br, ¹⁸F или другим излучающим позитроны радионуклидом для распределения специфичного к CD74 антитела или его фрагмента в опухолях методом позитрон-эмиссионной томографии (PET). Полученные с применением таких методов снимки можно использовать для оценки биораспределения CD74 у пациентов, млекопитающих или в тканях, например, при использовании CD74 в качестве биомаркера на присутствие раковых клеток. Варианты такого метода могут включать применение магнитно-резонансной томографии (MRI) для улучшения изображений по сравнению, с методом гамма-камеры. Стандартные, методы и принципы иммуносцинтиграфии описаны, например, в Srivastava (ed.) Radiolabeled Monoclonal Antibodies for Imaging and Therapy (Plenum Press, 1988); Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al. (eds.), pp.624-652 (Mack Publishing Co., 1990); и Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in Biotechnology and Pharmacy 227-49, Pezzuto et al. (eds.) (Chapman & Hall, 1993). Более того, такие снимки также могут служить основанием для хирургических методов удаления опухолей. Кроме того, такие методы визуализации in vivo могут способствовать идентификации и локализации опухолей в ситуации, когда у пациента установлена опухоль (по наличию других биомаркеров, метастазов и т.д.), но ее невозможно идентифицировать обычными аналитическими методами. Все эти способы являются предметом настоящего изобретения.

Визуализация in vivo и другие способы диагностики, предусмотренные настоящим изобретением, особенно применимы при выявлении микрометастазов у больных людей (например, тех, кому ранее не был поставлен диагноз рака или в период выздоровления/ ремиссии от рака).

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен способ визуализации in vivo, в котором специфичное к CD74 антитело настоящего изобретения конъюгируют со способствующим детектированию рентгеноконтрастным веществом, конъюгированное антитело вводят в организм посредством инъекции в кровоток и определяют наличие и локализацию меченого антитела в организме. По этой методике и другими способами диагностики, представленными здесь, настоящим изобретением предусмотрен способ скрининга на наличие связанных с болезнью клеток у больных или в биологических образцах, взятых у больных людей, и/или оценки распределения специфичных к CD74 антител перед терапией специфичным к CD74 ADC.

Для диагностической визуализации радиоизотопы могут быть связаны со специфичными к CD74 антителами как непосредственно, так и косвенно через промежуточную функциональную группу. Полезными промежуточными функциональными группами являются хелаторы, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота и диэтилентриаминпентауксусная кислота (например, см. US 5,057,313).

Наряду с радиоизотопами и рентгеноконтрастными веществами, способы диагностики могут выполняться с помощью специфичных к CD74 антител, конъюгированных с красителями (например, с комплексом биотин-стрептавидин), контрастными веществами, флуоресцентными соединениями или молекулами и усиливающими веществами (например, парамагнитными ионами) для магнитно-резонансной томографии (MRI) (например, см. US Pat. No. 6,331,175, в котором описаны методы MRI и получение антител, конъюгированных с усиливающим средством для MRI). Такие диагностические/детектирующие вещества могут быть выбраны из веществ, предназначенных для MRI, и флуоресцентных соединений. Для того, чтобы нагрузить специфичные к CD74 антитела радиоактивными металлами или парамагнитными ионами, может потребоваться подвергнуть их реакции с реагентом, имеющим длинный "хвост", к которому прикрепляется множество хелатирующих групп для связывания ионов. Таким хвостом может быть полимер типа полилизина, полисахарид или другая функционализированная цепь с подвешенными группами, с которыми могут связываться хелатирующие группы, такие, например, как порфирины, полиамины, краун-эфиры, бистиосемикарбазоны, полиоксимы и подобные группы, применимые для этой цели. Хелаты можно конъюгировать со специфичными к CD74 антителами с помощью стандартных химических методов.

Итак, настоящим изобретением предусмотрены диагностические специфичные к CD74 антитела, при этом специфичные к CD74 антитела конъюгированы с контрастным веществом (как то для магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии или с усилителем контрастности ультразвука) или радионуклидом, который может быть представлен, к примеру, изотопом, дающим гамма-, бета-, альфа-излучение или излучающим электроны Оже или позитроны.

В следующем аспекте изобретение касается наборов для выявления наличия антигена CD74 или экспрессирующих CD74 клеток в образце, которые включают:

- специфичное к CD74 антитело или ADC по изобретению; и

- инструкции по применению набора.

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен набор для диагностики рака, включающий контейнер, содержащий специфичное к CD74 антитело и один или несколько реагентов для детектирования связывания специфичного к CD74 антитела с CD74. Реагенты могут включать, к примеру, флуоресцентные метки, ферментные метки или другие детектируемые метки. Реагенты также могут включать вторичные или третичные антитела или реагенты для ферментативных реакций, причем ферментативные реакции дают продукт, который можно визуализировать. В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрен диагностический набор, содержащий одно или несколько специфичных к CD74 антител по настоящему изобретению в меченом или немеченом виде в подходящем контейнере, реагенты для инкубации при непрямом определении и субстраты или функционализирующие реагенты для детектирования при таком определении, в зависимости от природы метки. Также могут входить контрольные реагенты и инструкции по применению.

Диагностические наборы также могут поставляться для применения со специфичным к CD74 антителом, как то конъюгированным/меченым специфичным к CD74 антителом, для детектирования присутствия CD74 в образцах ткани или в организме. В таких диагностических наборах, а также наборах для терапевтического применения, тоже описанных здесь, специфичные к CD74 антитела обычно предоставляются в лиофилизированном виде в контейнере, либо сами по себе, либо в сочетании с другими антителами, специфичными для клеток или пептида мишени. Как правило, сюда же входит и фармацевтически приемлемый носитель (например, инертный разбавитель) и/или его компоненты, такие как трис-буфер, фосфатный или карбонатный буфер, стабилизаторы, консерванты, биоциды, инертные белки, например, сывороточный альбумин и др. (обычно в отдельном контейнере для смешивания) и дополнительные реагенты (также обычно в отдельном контейнере). В некоторые наборы также входит вторичное антитело, способное связываться со специфичным к CD74 антителом, которое, как правило, находится в отдельном контейнере. Второе антитело обычно конъюгировано с меткой и составлено таким же образом, как и специфичное к CD74 антитело настоящего изобретения. При помощи способов, описанных выше и далее здесь, специфичные к CD74 антитела могут применяться для определения подгрупп раковых/опухолевых клеток и характеристики таких клеток и родственных им опухолевых тканей.

Антиидиотипические антитела

В следующем аспекте изобретение касается антиидиотипических антител, которые связываются с описанными здесь специфичными к CD74 антителами по изобретению.

Антиидиотипическое (Id) антитело представляет собой такое антитело, которое распознает уникальные детерминанты, обычно связанные с антигенсвязывающим сайтом какого-либо антитела. Антиидиотипическое антитело может быть получено путем иммунизации животного того же вида и генетического типа, что и источник специфичного к CD74 моноклонального антитела, тем моноклональным антителом, против которого нужно получить анти-Id антитело. Как правило, иммунизированное животное распознает и реагирует на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела тем, что оно вырабатывает антитело к этим идиотипическим детерминантам (анти-Id антитело). Такие антитела описаны, к примеру, в US 4,699,880. Такие антитела тоже являются предметом настоящего изобретения.

Анти-Id антитела также можно использовать в качестве "иммуногена" для индуцирования иммунного ответа у другого животного, получая так называемые антитела против анти-Id антитела. Антитело против анти-Id антитела по эпитопу может быть идентично исходному mAb, индуцировавшему анти-Id антитело. Таким образом, при использовании антител к идиотипическим детерминантам одного mAb можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела с такой же специфичностью. Анти-Id антитела можно подвергать изменениям (получая при этом варианты анти-Id антител) и/или дериватизировать любым подходящим методом типа тех, что описаны здесь в отношении специфичных к CD74 антител настоящего изобретения. Например, моноклональное анти-Id антитело можно конъюгировать с носителем типа гемоцианина моллюска блюдечко (KLH) и использовать для иммунизации мышей BALB/c. Сыворотка из таких мышей, как правило, содержит антитела против анти-Id антитела, которые обладают свойствами связывания, близкими, если не идентичными исходному специфичному к CD74 антителу.

Далее настоящее изобретение раскрывается на следующих примерах, которые не следует воспринимать как дополнительные ограничения.

Примеры

Пример 1. Конструирование экспрессирующих векторов CD74v1 и -v2, His-CD74v1 и -v2 и CD74del2-36v1 и -v2

Кодирующие последовательности для варианта 1 CD74 человека (CD74v1) (идентична последовательности NP_001020330 в Genbank) и варианта 2 CD74 человека (CD74v2) (идентична последовательности AAV383110330 в Genbank) получали путем синтеза и подвергали полной оптимизации кодонов (GeneArt, Regensburg, Germany). Конструкции клонировали в экспрессирующий вектор для млекопитающих рЕЕ13.4 (Lonza Biologies, Slough, UK). Эти конструкции были названы pEE13.4CD74v1 и pEE13.4CD74v2. Для повышения уровня экспрессии CD74 на поверхности клеток удаляли сигнал цитоплазматического удержания в ER (а.к. 2-36), как описано (Khalil H et al., J Cell Sci 2005, 118:4679-4687). Для этого создавали новые конструкции путем амплификации кодирующих CD74 участков из pEE13.4CD74v1 и pEE13.4CD74v2 и удаления при этом кодирующих (а.к. 2-36) участков. Эти ПЦР-фрагменты повторно клонировали в рЕЕ13.4 и полностью секвенировали для проверки, правильности новых конструкций. Эти экспрессирующие векторы были названы pEE13.4CD74v1del2-36 и pEE13.4CD74v2del2-36.

Кодирующие участки для внеклеточных доменов CD74v1 (а.к. 73-296) и -v2 (а.к. 73-232) амплифицировали методом ПЦР из pEE13.4CD74v1 и pEE13.4CD74v2, при этом вводили кодирующий участок для гексамерного N-концевого His-тега. ПЦР-фрагменты клонировали в экспрессирующий вектор для млекопитающих рЕЕ12.4 (Lonza Biologies), содержащий кодирующий участок эффективного сигнального пептида НММ38 (Barash S et al., Biochem Biophys Res Commun 2002, 294:835-842). Экспрессирующие векторы были полностью просеквенированы и названы pEE12.4SPHisCD74v1 и pEE12.4SPHisCD74v2. Полученные белки были названы HisCD74v1 и HisCD74v2.

Белковые последовательности вариантов CD74 представлены на фиг.1.

Пример 2. Кратковременная экспрессия в клетках HEK-293F и CHO-S

Клетки Freestyle™ 293-F (субклон HEK-293, адаптированный для культивирования в суспензии в химически определенной среде Freestyle; HEK-293F) получали от Invitrogen и трансфецировали плазмидой pEE13.4CD74v1, pEE13.4CD74v2, pEE13.4CD74del2.36v1, pEE13.4CD74del2-36v2, pEE12.4SPHisCD74v1 или pEE12.4SPHisCD74v2 с помощью 293 фектина (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя.

В случае pEE12.4SPHisCD74v1 или pEE12.4CD74v2 собирали супернатанты клеточных культур и очищали растворимый HisCD74v1 или HisCD74v2 методом металлоаффинной хроматографии, как описано ниже.

В случае pEE13.4CD74v1, pEE13.4CD74v2, pEE13.4CD74v1del2-36 или pEE13.4CD74v2del2-36 собирали клетки через 1-2 дня после трансфекции и использовали при последующих анализах. Эти клетки были названы TH2013-CD74v1, TH2013-CD74v2, TH2013-CD74v1del2-36 и TH2013-CD74v2del2-36.

Адаптированные для суспензии клетки линии CHO-K1SV (CHO-S, Invitrogen) трансфецировали плазмидой pEE13.4CD74v1, pEE13.4CD74v2, pEE13.4CD74v1del2-36 или pEE13.4CD74v2del2-36 по методике производителя с помощью реагента СНО-Мах (Invitrogen). Трансфецированные клетки CHO-S собирали через 1-2 дня после трансфекции и использовали при последующих анализах. Эти клетки были названы TC2013-CD74v1, TC2013-CD74v2, TC2013.CD74v1del2.36 и TC2013-CD74v2del2-36.

При экспрессии антител соответствующие векторы тяжелой цепи и легкой цепи, описанные в примере 9, совместно экспрессировали в клетках HEK-293F, как описано выше.

Пример 3. Стабильная экспрессия в клетках NSO

Плазмиду pEE13.4CD74v1del2-36 трансфецировали в клетки NSO (Lonza Biologies). Клетки подвергали отбору на стабильное встраивание экспрессирующего вектора путем культивирования в лишенной глутамина культуральной среде в присутствии 25 мкМ метилсульфоксимина (MSX), как описано (Bebbington CR et al., Biotechnology (N Y) 1992, 10:169-175). Клетки, экспрессирующие CD74, объединяли и использовали в качестве полустабильной популяции или же отбирали и использованы отдельные стабильные клоны. Эти клетки были названы N2013del-v1-012.

Пример 4. Очистка CD74 с His-тегом

HisCD74v1 и HisCD74v2 экспрессировали в клетках HEK-293F. His-тег в белках позволяет проводить очистку методом аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом. При этом хелатор фиксирован на хроматографической смоле и заряжен катионами Со²⁺. Содержащий CD74ECDHis супернатант инкубировали со смолой в режиме batch (т.е. в растворе). Белок с His-тегом прочно связывается с шариками смолы, тогда как другие белки, находящиеся в супернатанте культуры, связываются не прочно. После инкубации шарики извлекали из супернатанта и набивали в колонку. Колонку промывали для удаления слабо связанных белков. Затем прочно связанные белки CD74ECDHis элюировали буфером, содержащим имидазол, который конкурирует со связыванием His с Со²⁺. Элюент удаляли из белка заменой буфера на обессоливающей колонке.

Пример 5. Процедура иммунизации трансгенных мышей

Антитела HuMab-CD 74-005, -006, -008 и -011 получали при иммунизации мышей HCo17 HuMAb (человеческое моноклональное антитело; Medarex Inc., San Jose, CA, USA), содержащих четыре генетические модификации. Эти мыши были трансгенными по тяжелой цепи Ig человека и по легкой каппа-цепи Ig человека и с двойным нокаутом по локусам тяжелой и легкой каппа-цепи мыши. Эти нарушения предотвращают экспрессию любых полностью мышиных антител. Использовали различные линии: НСо12, НСо12-BALB/c, HCo17 и НСо20. Они отличаются по количеству генов V_H (вариабельная область тяжелой цепи) и V_L (вариабельная область легкой цепи) человека. Мышей HCo12-BALB/c получали при перекрестном скрещивании с мышами KCo5-BALB/c (трансгенными по легкой каппа-цепи).

Для иммунизации использовали шесть разных иммуногенов: TH2013-CD74v1del2-36, TH2013-CD74v2del2-36, N2013del-v1-012, клетки SU-DHL-4 (линия клеток B-клеточной лимфомы человека) и HisCD74v1 или HisCD74v2, конъюгированные с белком-носителем KLH (гемоцианин моллюска блюдечко). Мышей иммунизировали через каждые 2 недели, поочередно при 5×10⁶ клеток или при 15 мкг белка. В общей сложности проводили 8 иммунизации, четыре внутрибрюшинно (ip) и четыре подкожно (sc).

Антитела -005, -006 и -008 получали при иммунизации мышей HCo17 с помощью 5×10⁶ клеток TH2013-CD74v1_Ldel2-36 ip, чередуясь с 15 мкг HisCD74v2 sc. Первую иммунизацию проводили ip, используя клетки в полном адъюванте Фрейнда (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), а последующие иммунизации - в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) (белок, sc) или в PBS (клетки, ip).

Антитело -011 получали при иммунизации мышей HCo17 с помощью 5×10⁶ клеток TH2013-CD74v1del2-36 ip, чередуясь с 15 мкг HisCD74v1 SC. Первую иммунизацию проводили, используя белок в CFA (ip), а последующие иммунизации - в IFA (белок, sc) или PBS (клетки, ip).

Когда титры в сыворотке оказывались достаточными (разведение сыворотки 1/50 или меньше давало положительную реакцию при антигенспецифичном скрининге, как описано в примере 6, по меньшей мере при двух последовательных, раз в две недели, случаях скрининга), мышам дополнительно дважды вводили внутривенно (iv) 10 мкг белка HisCD74 в 100 мкл PBS за 4 и 3 дня до слияния.

Пример 6. Гомогенный антигенспецифинный метод скрининга

Сыворотки мышей и супернатанты гибридом анализировали на наличие антител против CD74 высокопроизводительным методом скрининига (HTS) по технологии флуорометрического анализа в микрообъеме (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). В этом методе для выявления человеческих антител против CD74 использовали клетки TC2013-CD74v1del2-36 и TC2013-CD74v2del2-36. Для измерения неспецифического связывания использовали клетки CHO-S дикого типа. К клеткам добавляли образцы, вызывая связывание с CD74. После этого детектировали связывание HuMab с помощью флуоресцентного конъюгата (козье антитело против IgG человека с Су5; Jackson ImmunoResearch). В качестве положительного контроля использовали антитело мыши против CD74 человека (Becton Dickinson; IgG2a, κ; клон М-В741), помеченное Alexa-647, как описано ниже, а в качестве отрицательного контроля -антитело chrompure мыши (Jackson Immunoresearch), помеченное Alexa-647.

Антитела метили красителем Alexa Fluor^® 647 (Molecular Probes), в дальнейшем "Alexa-647", по следующей методике.

Готовили растворы антител в 1 мг/мл IgG в буфере из 0,1 М карбоната натрия рН 9,0 (NaHCO₃, Riedel de Haen, кат. №31437). Alexa-647 готовили свежим путем добавления 100 мкл DMSO (Sigma, кат. № D2438) и 900 мкл 0,1 М карбоната натрия рН 9,0 в один флакон сукцинимидилового эфира карбоновой кислоты Alexa Fluor^® 647 (1 мг/флакон, Molecular Probes, Leiden, Нидерланды, кат. № А-20006). В раствор IgG добавляли 5-кратный молярный избыток Alexa-647, рассчитанный как указано ниже, и инкубировали, с вращением, в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч. После мечения несвязавшийся Alexa-647 удаляли на колонке PD-10 (Amersham Biosciences, кат. №17-0851-01), заполненной трис-буфером рН 8,0 (50 мМ трис-основания [Trizma base, Sigma, кат. № Т-6066], 100 мМ NaCl [Riedel de Haen, кат. №31437], 0,01% азида натрия [NaN₃, Riedel de Haen, кат. №13412]). Количество Alexa-647, добавляемое в раствор IgG, рассчитывали по формуле:

добавляемый объем Alexa-647 (в мкл) = (конц. IgG (мг/мл)/м.в. IgG (Да) × соотношение × объем × м.в. Alexa-647 × 1000,

где: м.в. IgG = 150000 Да; соотношение означает молярный избыток Alexa-647; объем = объем подвергаемого мечению образца (в мл); м.в. Alexa-647 = 1250 Да.

Концентрацию белка (IgG) и степень включения метки (D.O.L.) определяли путем измерения OD при 280 нм и 650 нм на Ultrospec 2100 Pro (Amersham Biosciences). Концентрацию IgG (мг/мл) рассчитывали по формуле:

концентрация IgG=[A₂₈₀-(0,03×A₆₅₀)]/коэффициент экстинкции IgG,

а D.O.L. рассчитывали по формуле:

D.O.L.=А₆₅₀/239000/[А₂₈₀-(0,03×А₆₅₀)/(коэффициент экстинкции IgG×м.в. IgG)],

где: 239000 - коэффициент экстинкции Alexa-647 при λ_max в см^-1⋅M^-1; а 0,03 - поправочный коэффициент (A₂₈₀ свободного красителя/A_max свободного красителя) (оба предоставлены производителем).

Бычий сывороточный альбумин (BSA; Sigma, кат. № А 2934) добавляли из 10% масс. раствора до конечной концентрации в 0,1% масс., а меченые антитела хранили при 5°С.

В некоторых случаях при скрининге на слияние, наряду с конъюгатом против IgG человека с Су5.5 для выявления человеческих антител, использовали меченый Су 5.5 конъюгат против IgG мыши для выявления определенных химерных антител. Образцы сканировали на установке Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System (8200 CDS) и считывали показания в виде 'отсчет × флуоресценция'.

Пример 7. Получение гибридом для HuMab

Мышей HuMab при появлении достаточного (определяли как и выше) антигенспецифичного титра забивали и извлекали селезенку и лимфатические узлы, окружающие брюшную аорту и полую вену. Слияние спленоцитов и клеток лимфатических узлов с клетками миеломы мыши проводили методом электрослияния на установке CEEF 50 Electrofusion System (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, США), в основном следуя инструкциям производителя. Слитые клетки высеивали в среду для слияния, содержащую 10% эмбриональной бычьей сыворотки клона I (Perbio), 1 мМ пирувата натрия (Cambrex), 0,5 Е/мл пенициллина, 0,5 Е/мл стрептомицина (Cambrex), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (Invitrogen), 600 нг/мл интерлейкина-б (IL-6) (Strathmann), 1×НАТ (Sigma) и 0,5 мг/мл канамицина (Invitrogen) в HyQ mADCF-Mab (Perbio). Через 10 дней собирали супернатанты, а клетки обновляли средой выделения, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки клона I, 0,5 Е/мл пенициллина, 0,5 Е/мл стрептомицина, 600 нг/мл IL-6 и 1×proHT (Cambrex) в HyQ mADCF-Mab. Супернатанты культур гибридом подвергали скринингу методом первичного скрининга FMAT на клетках TC2013-CD74v1del2-36 и клетках TC2013-CD74v2del2-36 для выявления гибридом, продуцирующих человеческие (или химерные) антитела против CD74, как описано выше. Высеивали 60 самых лучших первичных лунок в полутвердую среду, состоящую из 40% CloneMedia (Genetix, Hampshire, UK) и 60% полной среды 2×HyQ (Hyclone, Waltham, USA). Из каждой первичной лунки засеивали две лунки черного 6-луночного планшета Genetix. Из каждой лунки отбирали 33 субклона, используя установку ClonePix (Genetix): Субклоны отбирали в среду выделения. Через 7 дней супернатанты субклонов снова подвергали скринингу на специфическое связывание со специфичным к CD74 IgG человека и измеряли концентрацию IgG человека с помощью Octet (Fortebio, Menlo Park, USA). Из каждой первичной лунки самый лучший субклон размножали в среде для размножения, содержащей только 600 нг/мл IL-6, 0,5 Е/мл пенициллина, 0,5 Е/мл стрептомицина и 1×proHT. Субклоны размножали из одной лунки 96-луночного планшета в одну лунку 24-луночного планшета, затем в четыре лунки 24-луночного планшета и в шесть лунок 6-луночного планшета, а затем в колбу Hyperflask (мелкомасштабная продукция). Супернатанты из колб Hyperflask подвергали скринингу на связывание со специфичным к CD74 IgG человека. Полученные при этом клоны были обозначены РС2013.

Пример 8. Масс-спектрометрия очищенных антител

Небольшие порции по 0,8 мл содержащих антитела супернатантов из 6-луночной стадии или стадии Hyperflask подвергали очистке на колонках PhyTip, содержащих смолу с белком G (PhyNexus Inc., San Jose, USA) на рабочей станции Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences, Hopkinton, USA). Колонки PhyTip использовали в соответствии с инструкциями производителя, но буфера поменяли. В качестве буфера для связывания использовали PBS (B. Braun, Medical B.V., Oss, Нидерланды), а в качества элюирующего буфера - 0,1М глицин-HCl рН 2,7 (Fluka Riedel-de Haen, Buchs, Germany). После очистки образцы нейтрализировали 2М трис-HCl рН 9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Нидерланды). Кроме того, в некоторых случаях большие объемы супернатантов культур подвергали очистке методом аффинной хроматографической на колонках с белком А.

После очистки образцы наносили на 384-луночный планшет (Waters, квадратные лунки на 100 мкл, №186002631). Образцы подвергали дегликозилированию с помощью N-гликозидазы F (Roche, кат. №11365177001) в течение ночи при 37°С. Добавляли (1 мкл на лунку) DTT (15 мг/мл) и инкубировали 1 час при 37°С. Образцы (5 или 6 мкл) обессоливали на установке Acquity UPLC™ (Waters, Milford, США) с колонкой ВЕН300 С18, 1,7 мкм, 2,1×50 мм при 60°С. В качестве элюентов А и В использовали воду MQ и ацетонитрил класса LC-MS (Biosolve, кат. №01204101, Valkenswaard, Нидерланды), соответственно, в обоих случаях с 0,1% муравьиной кислоты (Fluka, кат. №56302, Buchs, Германия). Времяпролетные масс-спектры при ионизации электрораспылением регистрировали онлайн на масс-спектрометре micrOTOF™ (Bruker, Bremen, Германия), работающем в режиме положительных ионов. Перед анализом проводили калибровку в интервале 900-3000 m/z с помощью настроечной смеси ES (Agilent Technologies, Santa Clara, США). Масс-спектры подвергали деконволюции с помощью программы DataAnalysis™ v3.4 (Bruker), используя поисковый алгоритм Maximal Entropy для молекулярных весов от 5 до 80 кДа.

После деконволюции полученные массы тяжелой и легкой цепи для всех образцов сопоставляли с целью поиска дубликатов антител. При сравнении тяжелых цепей учитывали возможное присутствие вариантов C-концевого лизина. В результате получили список уникальных антител, где уникальность определяется как уникальная комбинация тяжелых и легких цепей. При обнаружении дубликатов антител использовали результаты других тестов, чтобы решить, какой материал следует использовать для продолжения экспериментов.

При масс-спектрометрическом анализе молекулярных весов тяжелых и легких цепей 41 гибридомы против CD74 получили 18 уникальных антител (уникальных комбинаций тяжелой цепи и легкой цепи).

Пример 9. Анализ последовательности вариабельных доменов специфичных к CD74 HuMab и клонирование их в экспрессирущих векторах

Выделяли тотальную РНК антител HuMab против CD74 из 5×10⁶ гибридомных клеток и получали комплементарную ДНК (кДНК) методом 5'-RACE- из 100 нг тотальной РНК с помощью набора SMART RACE cDNA Amplification kit (Clontech) согласно инструкциям производителя. Кодирующие участки V_H (вариабельной области тяжелой цепи) и V_L (вариабельной области легкой цепи) амплифицировали методом ПЦР. Амплифицированные ПЦР-продукты антител 006, 008 и 011 клонировали в вектор pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) с помощью набора для клонирования Zero Blunt PCR (Invitrogen).

Амплифицированные ПЦР-продукты V_H и V_L антитела 005 клонировали в вектор pcDNA3.3 (Invitrogen), кодирующий G1f и константные каппа-домены. Для каждого HuMab секвенировали 16 клонов V_L и 8 клонов V_H. Клоны с ожидаемой массой тяжелой и легкой цепи в соответствии с массой полученного из гибридомы материала из того же антитела (при определении методом масс-спектрометрии) отбирали для дальнейшего изучения и экспрессирования. Полученные последовательности представлены в перечне последовательностей и на фиг.2.

В таблице 1 и таблице 2 (ниже) приведена сводка информации о последовательностях антител и наиболее гомологичных гаметных последовательностях.

Таблица 1
Гомология тяжелых цепей
Ab	Ген V и его аллель	Идентичность по V-области, % (нт)	Ген J и его аллель	Ген D и его аллель	Длина CDR-IMGT
005	IGHV3-30-3*01	100,0 (288/288 нт)	IGHJ4-02	IGHD3-10*01	8.8.17
006	IGHV3-30-3*01	98,6 (284/288 нт)	IGHJ4*02	IGHD3-16*02	8.8.17
008	IGHV3-30-3*01	100,0 (288/288 нт)	IGHJ4*02	IGHD3-16*02	8.8.17
011	IGHV3-33*01	99,7 (287/288 нт)	IGHJ6*02	IGHD3-10*01	8.8.16

Таблица 2
Гомология легких цепей
Ab	Ген V и его аллель	Идентичность по V-области, % (нт)	Ген J и его аллель	Длина CDR-IMGT
005	IGKV1D-16*01	99,6 (278/279 нт)	IGKJ4*01	6.3.9
006	IGKV1D-16*01	100,0 (279/279 нт)	IGKJ4*01	6.3.9
008	IGKV1D-16*01	100,0 (279/279 нт)	IGKJ4*01	6.3.9
011	IGKV1D-16*01	100,0 (279/279 нт)	IGKJ4*01	6.3.9

Таблица 3
Ссылки на перечень последовательностей
VH-область
SEQ ID No:7	VH 005
SEQ ID No:8	VH 005, CDR1
SEQ ID No:9	VH 005, CDR2
SEQ ID No:10	VH 005, CDR3
SEQ ID No:11	VH 006
SEQ ID No:12	VH 006, CDR1
SEQ ID No:13	VH 006, CDR2
SEQ ID No:14	VH 006, CDR3
SEQ ID No:15	VH 008
SEQ ID No:16	VH 008, CDR1
SEQ ID No:17	VH 008, CDR2
SEQ ID No:18	VH 008, CDR3
SEQ ID No:19	VH 011
SEQ ID No:20	VH 011, CDR1
SEQ ID No:21	VH 011, CDR2
SEQ ID No:22	VH 011, CDR3
VL-область
SEQ ID No:23	VL 005
SEQ ID No:24	VL 005, CDR1 (=VL 011, VL 006, и VL 008 CDR1)
AAS	VL 005, CDR2 (=VL 011, VL 006, и VL 008 CDR2)
SEQ ID No:25	VL 005, CDR3 (=VL 011, VL 006, и VL 008 CDR3)
SEQ ID No:26	VL 006 = VL 008 = VL 011

Пример 10. Очистка антител

Супернатанты из культур фильтровали через накладные фильтры на 0,2 мкм и наносили на колонки с 5 мл белка A (rProtein A FF, Amersham Bioscience) и элюировали 0,1 М лимонной кислотой-NaOH, рН 3. Элюат немедленно нейтрализировали 2М трис-HCl, рН 9 и диализировали в течение ночи до 12,6 мМ NaH₂PO₄, 140 мМ NaCl, pH 7,4 (B. Braun). После диализа образцы стерилизовали фильтрованием через накладные фильтры на 0,2 мкм. Чистоту определяли методом SDS-PAGE, а концентрацию измеряли по нефелометрии и поглощению при 280 нм. Очищенные антитела разделяли на порции и хранили при -80°С. После оттаивания порции очищенных антител хранили при 4°С. Молекулярную массу тяжелых и легких цепей антител, экспрессируемых гибридомами, определяли методом масс-спектрометрии, как описано в примере 9.

Пример 11. Связывание специфичных к CD74 антител HuMab с рекомбинантным внеклеточным доменом двух изоформ CD74 при определении методом ELISA и с клеточным CD74 на клетках Raji при определении методом FACS

Измеряли связывание антител HuMab против CD74 с двумя изоформами CD74 методом ELISA (фиксировали рекомбинантный внеклеточный домен CD74) и с клеточным CD74 на клетках Raji (ATCC, Manassas, VA) методом FACS.

Планшеты для ELISA (Greiner BioOne) в течение ночи при 4°С покрывали при 2 мкг/мл, по 100 мкл на лунку, рекомбинантным CD74V_L или CD74v2 в PBS (В. Braun Melsungen AG). Последовательности и получение изоформ описаны выше. Лунки для ELISA промывали три раза PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (PBST), сливали, блокировали 1% масс. BSA фракции V (Roche) в PBS при комнатной температуре в течение 1 ч со встряхиванием (300 об/мин) и сливали. После этого добавляли по 100 мкл антител HuMab против CD74 в виде серийных разведении в 0,2% масс. BSA фракции V в PBST (буфер для определения) и инкубировали со встряхиванием при комнатной температуре в течение 90 мин. Планшеты для ELISA промывали три раза PBST, сливали и выявляли связанные антитела HuMab с помощью конъюгированных с HRP козьих антител против IgG человека (100 мкл; 1:5000; Peroxidase Affinipure Goat anti-human IgG, F(ab')₂ Fragment Specific [min X Bov,Hrs,Ms Sr Prot]; Jackson ImmunoResearch) в буфере для определения при инкубировании со встряхиванием при комнатной температуре в течение 90 мин. Планшеты промывали три раза PBST, сливали и инкубировали со 100 мкл раствора ABTS (50 мл буфера ABTS [Roche] и одна таблетка ABTS [50 мг; Roche]). После инкубации в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин реакцию останавливали добавлением 100 мкл на лунку щавелевой кислоты (2% масс.). Планшеты измеряли по OD при 405 нм на считывающем устройстве для ELISA (Biotek Instruments, EL808 Absorbance Microplate Reader).

Для анализа методом FACS высеивали по 10⁵ клеток на лунку в 100 мкл буфера FACS (PBS с добавлением 0,1% BSA и 0,02% азида натрия) в круглодонные 96-луночные планшеты. Клетки центрифугировали (1200 об/мин, 4°С, 5 мин) и отбрасывали супернатант. Добавляли серийные разведения антител HuMab против CD74 (100 мкл) и инкубировали на льду в течение 1 ч. Клетки промывали буфером FACS, супернатанты отбрасывали и добавляли 100 мкл меченных R-фикоэритрином козьих антител против IgG человека (R-Phycoerythrin AffiniPure F(ab')₂ Frag Gt Anti-Human IgG, Fcγ Frag Spec [min X Bov,Hrs,Ms Sr Prot]; Jackson ImmunoResearch), разведенных 1:100 в буфере FACS. После 1 часа на льду (в темноте) клетки промывали один раз в буфере FACS, отбрасывали супернатант и выявляли специфическое связывание антител HuMab методом проточной цитометрии на установке FACS Canto II (BD Biosciences).

В качестве отрицательного контроля использовали контроль на изотип - Ab IgG1-b12. Кривые связывания анализировали методом нелинейной регрессии (сигмоидные кривые доза-эффект с переменным наклоном) с помощью программы GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Как видно из фиг.3, HuMab-CD74-006 и -011 связываются с высоким сродством (значения ЕС₅₀ от 210 до 344 нг/мл) с обеими изоформами внеклеточного домена CD74. HuMab-CD74-008 связывается с промежуточным сродством (ЕС₅₀ от 759 до 1391 нг/мл) с обеими изоформами.

Как видно из фиг.4, HuMab-CD74-006 и -011 также связываются с высоким сродством (ЕС₅₀ от 150 до 200 нг/мл) с клеточным CD74, экспрессированным на клетках Raji. HuMab-CD74-008 и -005 связываются с клеточным CD74 с промежуточным сродством (значения ЕС₅₀ было невозможно определить, так как не достигалось максимальное связывание).

В таблице 4 представлены значения ЕС₅₀ специфичных к CD74 антител HuMab для связывания с внеклеточным доменом CD74v1 и CD74v2 методом ELISA и с клеточным CD74 методом FACS на клетках Raji.

Таблица 4
Сводка значений ЕС50 для связывания специфичных к CD74 антител HuMab с внеклеточным доменом CD74v1 и CD74v2 при определении методом ELISA и с клеточным CD74 на клетках Raji при определении методом FACS. Все антитела HuMab получали при кратковременной совместной трансфекции клеток HEK293F соответствующими векторами, экспрессирующими тяжелые и легкие цепи (как описано выше).
HuMab-CD74-	EC50 (ELISA)	EC50 (FACS)
CD74v1	CD74v2
005	н/о	н/о	н/р
006	321	210	196
008	1391	759	н/р
011	344	245	151
Значения EC50 приведены в нг/мл
н/р - не поддается расчету
н/о - не определяли.

Пример 12. Перекрестная реактивность антител HuMab против CD74 к тканям макаки

Способность специфичных к CD74 антител HuMab к связыванию с CD74 макаки тестировали по иммуногистохимии. Иммуногистохимию с антителами HuMab против CD74 проводили на замороженных миндалинах человека и ткани лимфатических узлов макаки, при этом ожидается экспрессия CD74 на (фолликулярных) В-лимфоцитах и макрофагах. Делали срезы замороженной ткани (толщиной 4-6 мкм) и фиксировали в ацетоне. Антитела HuMab образовали комплекс с флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) при инкубации с конъюгированным с FITC козьим антителом против IgG(Fc) человека (Fab) (Protos) (при соотношении 1:1 с Humab). Перед окрашиванием с HuMab (1 мкг/мл) ткани блокировали по эндогенному биотину, пероксидазе (РО) и иммуноглобулинам. Комплекс HuMab-Fab-FITC выявляли при последующей инкубации с кроличьим антителом против FITC (Invitrogen) (разведение 1:1000) и конъюгированным с РО козьим антителом против IgG кролика (Powervision, [rb IgG]-PO; неразведенное). Активность РО визуализировали с аминоэтилкарбазолом (АЕС) в качестве субстрата, дающим красную окраску, а ядра визуализировали с гематоксилином (синий). Окрашивание тканей изучали методом световой микроскопии (Axioskop-2 plus), преобразовывали в цифровые снимки с помощью камеры Axiocam и хранили в виде цифровых снимков.

Как видно из фиг.5, HuMab-CD74-006 и -011 проявляли перекрестную реактивность с CD74 макаки, о чем свидетельствует окрашивание макрофагов и фолликулярных В-клеток (окрашивание на контрольный изотип отрицательно). Степень перекрестной реактивности с CD74 макаки была меньше у HuMab-CD74-006, чем у -011, о чем свидетельствует менее интенсивное окрашивание ткани макаки по сравнению с тканью человека.

Пример 13. Индуцирование ADCC и CDC

Индуцирование ADCC специфичными к CD74 антителами HuMab тестировали методом высвобождения ^5lCr. Вкратце, клетки Raji метили с помощью 100 μCi ^5lCr и использовали в качестве клеток-мишеней. В качестве эффекторных клеток использовали мононуклеары периферической крови, выделенные из лейкоцитарных пленок. Клетки-мишени преинкубировали с антителами HuMab против CD74 (комнатная температура, 30 мин) и добавляли эффекторные клетки, при этом соотношение эффектор-мишень составляло 100:1, и инкубировали при 37°С, 5% CO₂, в течение ночи. Высвобождение ⁵¹Cr в супернатанте измеряли на гамма-счетчике. Никакой существенной индукции ADCC антителами HuMab против CD74 не было обнаружено.

Индуцирование CDC антителами HuMab против CD74 тестировали с помощью пропидия йодида. Вкратце, клетки Raji преинкубировали с антителами HuMab против CD74 (комнатная температура, 15 мин), добавляли нормальную сыворотку человека до конечной концентрации в 20%, и инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 45 мин. Для остановки реакции планшеты ставили на лед. Добавляли пропидия йодид и анализировали клетки методом FACS. Никакой существенной индукции CDC антителами HuMab против CD74 не было обнаружено.

Пример 14. Опосредованная антителами интернализация и гибель клеток, вызванная антителами HuMab против CD74 при анализе с помощью анти-каппа-ЕТА'

Чтобы оценить пригодность антител HuMab против CD74 для подхода типа конъюгатов антитело-препарат, разработали обобщенный метод измерения гибели клеток in vitro с использованием направленного на каппа-цепь экзотоксина A Pseudomonas (анти-каппа-ЕТА'). В этом методе используется конструкция, состоящая из высокоаффинного доменного антитела против легкой каппа-цепи человека и укороченной формы экзотоксина A Pseudomonas, а также удерживающего мотива KDEL. После интернализации конструкция из доменного антитела против каппа с ЕТА' подвергается протеолизу и восстановлению дисульфидных связей с отделением каталитического и связывающего домена. Каталитический домен переносится из системы Гольджи в эндоплазматический ретикулум через удерживающий мотив KDEL, а затем перемещается в цитозоль, где он ингибирует синтез белка и индуцирует апоптоз (Kreitman RJ., BioDrugs 2009, 23(1):1-13).

Опосредованную антителами интернализацию и вызванную токсином гибель клеток тестировали для различных антител HuMab против CD74 на клетках Raji. Число молекул CD74, экспрессированных на поверхности клеток Raji, составляет 10⁴ молекул на клетку по методике с набором QIFIKIT^® (Dako, Glostrup, Дания). Высеивали по 10⁴ клеток на лунку в среде для клеточных культур в 96-луночные планшеты для тканевых культур (Greiner BioOne). Планшеты инкубировали 1 ч при 37°С, чтобы дать клеткам прикрепиться. Для идентификации антител HuMab против CD74, способствующих интернализации и уничтожению клеток токсином, анти-каппа-ЕТА' перед добавлением к клеткам проинкубировали при фиксированной концентрации (конечная концентрация 1 мкг/мл в лунках), не вызывающей неспецифической гибели клеток в отсутствие антител, в течение 30 мин с оттитрованным количеством антител HuMab против CD74. Через 3 дня определяли содержание жизнеспособных клеток с помощью AlamarBlue (BioSource International, San Francisco, США), который добавляли по 10 мкл на лунку, в соответствии с инструкциями производителя. После инкубации при 37°С в течение 4 ч регистрировали флуоресценцию на считывающем устройстве En Vision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Turku, Финляндия) при стандартных настройках для AlamarBlue. В качестве отрицательного контроля использовали контроль на изотип - антитело IgG1-b12, проинкубированное с анти-каппа-ЕТА'. В качестве контроля для определения фонового сигнала использовали стауроспорин (Sigma-Aldrich), который добавляли к клеткам при конечной концентрации в 1 мкг/мл.

Степень жизнеспособности рассчитывали следующим образом:

(FL_опыт-FL_фон)/(FL_{контроль}-FL_фон)×100%,

где: FL_{контроль} = флуоресценция в необработанных лунках, а FL_фон = флуоресценция в обработанных стауроспорином лунках.

Как видно из фиг.6 и таблицы 5, все проинкубированные с анти-каппа-ЕТА' антитела HuMab против CD74 вызывали гибель клеток Raji дозо-зависимым образом. Проинкубированные с анти-каппа-ЕТА' HuMab-CD74-006, -011, -005 и -008 эффективно вызывали гибель клеток (ЕС₅₀ от 25 до 250 мкг/мл, а минимальная степень жизнеспособности составляла от 0 до 15%). Преинкубированное с анти-каппа-ЕТА' контрольное mAb IgG1-b12 не вызывало гибели клеток.

Таблица 5
Сводка значений EC50 и степени жизнеспособности клеток после обработки клеток Raji антителами HuMab против CD74, проинкубированными с анти-каппа-ЕТА'. Данные представлены в виде значений ЕС50 (в мкг/мл) и минимальной степени жизнеспособности клеток Raji, обработанных антителами HuMab против CD74, проинкубированными с анти-каппа-ЕТА', полученных в одном репрезентативном эксперименте.
Антитело (HuMab-CD74-)	Жизнеспособность (%)	EC50 (мкг/мл)
005	3,24	120
006	1,50	57
008	14,65	247
011	0,47	25
IgG1-b12	85,89	н/рa
а) не поддается расчету

Пример 15. Получение специфичных к CD74 ADCs

HuMab-CD74-005, HuMab-CD74-006, HuMab-CD74-011 и отрицательный контроль IgG1-b12 продуцировали кратковременно в клетках HEK-293F. Антитела очищали методом хроматографии с белком А по стандартной методике, получая в конечном счете примерно 263 мг очищенного HuMab-CD74-005, 165 мг HuMab-CD74-006 и 720 мг HuMab-CD74-011. Количество полученных конъюгированных антител приведено в таблице 6. Препарат-линкер vcMMAE или mcMMAF подвергали алкилированию по цистеинам восстановленных антител по описанным в литературе методикам (Sun et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16:1282-1290; McDonagh et al. (2006) Protein Eng. Design Sel. 19:299-307; Alley et al. (2008) Bioconjugate Chem. 19:759-765). Реакцию останавливали добавлением избытка N-ацетилцистеина. Остаток неконъюгированного препарата удаляли диафильтрацией, и конечные конъюгаты специфичных к CD74 антител с препаратами переводили в PBS.

После этого конъюгаты специфичных к CD74 антител с препаратами подвергали анализу на концентрацию (по поглощению при 280 нм), соотношение препарат-антитело ('DAR') методом обратнофазовой хроматографии (RP-HPLC) и гидрофобной хроматографии (HIC), содержание неконъюгированного препарата (методом обратнофазовой хроматографии), степень агрегации (методом эксклюзионной хроматографии, SEC-HPLC) и уровень эндотоксина (тестом на эндотоксин с лизатом амебоцитов Limulus (LAL)). Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 6
Количество полученных ADCs
Антитело HuMab-CD74-	Линкер-препарат	Количество ADC (мг)
005	vcMMAE	94
005	mcMMAF	91
006	vcMMAE	63
006	mcMMAF	60
011	vcMMAE	276
011	mcMMAF	293
b12	vcMMAE	174
b12	mcMMAF	245

Таблица 7
Анализ конъюгатов антитело-препарат
Определение	HuMab-CD74-005	HuMab-CD74-006	HuMab-CD74-011	IgG1-b12
vcMMAE	mcMMAF	vcMMAE	mcMMAF	vcMMAE	mcMMAF	vcMMAE	mcMMAF
Концентрация (мг/мл)	7,2	6,4	6,4	6,2	8,2	8,1	6,6	9,1
DAR по RP-HPLC	3,9	3,9	4,0	3,7	3,8	-*	3,2	3,9
DAR по HIC	4,0	4,0	4,0	4,1	3,9	3,9	3,3	4,0
Неконъюгированный препарат (%)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Агрегаты по SEC-HPLC (%)	1,3	1,2	0,7	0,3	0,7	0,3	0,8	1,0
Эндотоксин (ЕЭ/мг)	0,199	0,152	0,101	0,085	0,200	0,083	0,078	0,104
* DAR не поддается определению вследствие наложения пиков

Пример 16. Связывание ADCs против CD74 с рекомбинантным внеклеточным доменом CD74v1 при определении методом ELISA

Измеряли связывание специфичных к CD74 ADCs с CD74 методом ELISA (фиксировали рекомбинантный внеклеточный домен CD74v1) и сравнивали со связыванием неконъюгированных специфичных к CD74 антител HuMab.

Планшеты для ELISA (Greiner BioOne) в течение ночи при 4°С покрывали при 2 мкг/мл, по 100 мкл на лунку, рекомбинантным CD74ECDHis в PBS (В. Braun Melsungen AG). Планшеты сливали и блокировали по 200 мкл/лунку PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (PBST) со встряхиванием (300 об/мин), при комнатной температуре в течение 1 ч, промывали три раза по 300 мкл PBST и сливали. После этого добавляли по 100 мкл ADCs против CD74 или неконъюгированных специфичных к CD74 антител HuMab в виде серийных разведении в PBST и инкубировали со встряхиванием при комнатной температуре в течение 2 ч. Связанные ADCs против CD74 и неконъюгированные антитела HuMab выявляли добавлением конъюгированного с HRP мышиного антитела против IgG1 человека (100 мкл; 0,015 мкг/мл; Sanquin; # M1328) в PBST и инкубировали со встряхиванием при комнатной температуре в течение 2 ч. Планшеты промывали три раза PBST, сливали и инкубировали со 100 мкл раствора ABTS (50 мл буфера ABTS [Roche] и одна таблетка ABTS [50 мг; Roche]). После инкубации в темноте со встряхиванием при комнатной температуре в течение 30 мин реакцию останавливали добавлением 100 мкл на лунку щавелевой кислоты (2% масс., Riedel de Haen) в темноте со встряхиванием на 10 мин. Планшеты измеряли при OD 405 нм на считывающем устройстве для ELISA (Biotek Instruments, EL808 Absorbance Microplate Reader).

В качестве отрицательного контроля использовали антитело IgG1-b12, которое связывается с посторонним антигеном (как не конъюгированное, так и в формате ADC). Кривые связывания анализировали методом нелинейной регрессии (сигмоидные кривые доза-эффект с переменным наклоном) с помощью программы GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Все антитела HuMab и ADCs против CD74 связывались в аналогичном диапазоне с внеклеточным доменом CD74v1 при ELISA (значения ЕС₅₀ от 0,02 до 0,04 мкг/мл), о чем свидетельствуют кривые связывания на фиг.7. В таблице 8 представлены значения ECso специфичных к CD74 антител HuMab и ADCs для связывания с внеклеточным доменом CD74.

Таблица 8
Сводка значений ЕС50 для связывания специфичных к CD74 антител HuMab и ADCs с внеклеточным доменом CD74v1 при определении методом ELISA. Значения ЕС50 приведены в мкг/мл. Данные представлены в виде средних значений EC50, рассчитанных из четырех независимых экспериментов.
HuMab-CD74-	EC50 (ELISA)
Неконъюгированное	vcMMAE	mcMMAF
005	0,03	0,04	0,04
006	0,02	0,03	0,02
011	0,02	0,03	0,02

Пример 17. Связывание специфичных к CD74 ADCs с экспрессированным на поверхности CD74 при определении методом FACS на клетках Daudi

Измеряли связывание ADCs против CD74 с экспрессированным на поверхности CD74 методом FACS на клетках Daudi и сравнивали со связыванием неконъюгированных антител HuMab против CD74.

Высеивали по 1×10⁵ клеток Daudi на лунку в 100 мкл PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Roche, кат. №10735086001) и 0,02% азида натрия (Sigma-Aldrich, кат. №13412) (буфер FACS), в круглодонные 96-луночные планшеты (Greiner BioOne, кат. №650101). Клетки центрифугировали (1200 об/мин, 4°С, 3 мин) и отбрасывали супернатанты. Добавляли серийные разведения антител HuMab или ADCs против CD74 (100 мкл) и инкубировали на льду в течение 30 мин. Клетки промывали дважды 150 мкл буфера FACS и добавляли 100 мкл кроличьих антител против IgG человека с FITC (Dako, кат. № F0185), разведенных 1:100 в буфере FACS. После 30 мин на льду (в темноте) клетки промывали дважды 150 мкл буфера FACS и выявляли специфическое связывание антител HuMab и ADCs методом проточной цитометрии на установке FACS Canto II (BD Biosciences).

В качестве отрицательного контроля использовали контроль на изотип - антитело IgG1-b12, которое связывается с посторонним антигеном (как не конъюгированное, так и в виде ADC). Кривые связывания анализировали методом нелинейной регрессии (сигмоидные кривые доза-эффект с переменным наклоном) с помощью программы GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

На фиг.8 представлены кривые связывания, а в таблицах 9 и 10 приведены значения ЕС₅₀ и средние значения максимальной интенсивности флуоресценции для связывания антител HuMab и ADCs против CD74 с экспрессированным на поверхности CD74. Все конъюгированные антитела HuMab против CD74, кроме одного, связывались с экспрессированным на поверхности CD74 на клетках Daudi со сродством, близким к соответствующим неконъюгированным антителам HuMab. Конъюгат vcMMAE с HuMab-CD74-005 связывался с большим сродством (меньшее значение EC₅₀), чем неконъюгированное HuMab. HuMab-CD74-005 и его конъюгат с mcMMAF связывались с меньшим сродством, чем HuMab-CD74-006 и -011 и их конъюгаты. Максимальное связывание было меньше у конъюгированных с vcMMAE HuMab-CD74-006 и -011, чем у соответствующих неконъюгированных антител HuMab.

Таблица 9
Сводка значений ЕС50 для связывания специфичных к CD74 антител HuMab и ADCs с экспрессированным на поверхности CD74 при определении методом FACS на клетках Daudi. Значения ЕС50 приведены в мкг/мл. Данные представлены в виде средних значений ЕС50, рассчитанных из трех независимых экспериментов.
HuMab-CD74-	EC50 (FACS)
Неконъюгированное	vcMMAE	mcMMAF
005	1,27	0,26	1,05
006	0,04	0,03	0,03
011	0,05	0,05	0,05

Таблица 10

Сводка средних значений интенсивности флуоресценции при 10 мкг/мл специфичных к CD74 антител HuMab и ADCs при определении методом FACS на клетках Daudi. Данные представлены в виде средних значений максимальной MFI при измерении при 10 мкг/мл mAbs HuMab-CD74 и ADCs. Средние значения максимальной MFI рассчитывали из трех независимых экспериментов.
HuMab-CD74-	Максимальное связывание (FACS)
Неконъюгированное	vcMMAE	mcMMAF
005	2784	2863	2526
006	4599	3277	4050
011	5782	3791	5330

Пример 18. Опосредованная антителами интернализация и гибель клеток, вызванная ADCs против CD74 при анализе на клетках in vitro

Для определения способности ADCs против CD74 индуцировать цитотоксичность проводили анализ гибели клеток in vitro.

Тестировали гибель клеток из 4 клеточных линий для различных ADCs против CD74. Все линии клеток получали из American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA): Raji (кат. № CCL-86), Daudi (кат. № CCL-213), M4A4 (кат. № CRL-2914; происходят из линии клеток человека MDA MB 435) и клетки NCI-H747 (кат. № CCL-252, происходят из метастаза колоректальной аденокарциномы). Клетки высеивали при оптимальной концентрации (Raji: 1×10⁴ клеток/лунку; Daudi: 1×10³ клеток/лунку, M4A4: 2×10³ клеток/лунку, NCI-H747: 3×10³ клеток/лунку) в 100 мкл среды культивирования клеток (для Daudi и Raji: RPMI 1640 [Lonza, кат. № BE12-115F] с добавлением 10% телячьей сыворотки Cosmic [Perbio Science Nederland B.V., кат. № SH30087.04], 2 мМ L-глутамина [Lonza, кат. № BE17-605F] и 1 мМ пирувата натрия [Lonza, кат. № ВЕ13-115Е]; для NCI-H747: RPMI 1640 с добавлением 10% телячьей сыворотки Cosmic, 1 мМ пирувата натрия, 0,15% бикарбоната натрия [Lonza, кат. № ВЕ17-613Е] и 0,5% глюкозы [Sigma, кат. № G8769]; и для M4A4: DMEM [Lonza, кат. № BE12-709F] с добавлением 10% телячьей сыворотки Cosmic) в 96-луночные планшеты для тканевых культур (Greiner BioOne) и давали им прикрепиться. Добавляли серийные разведения ADCs против CD74 и инкубировали при 37°С в течение трех (Raji, Daudi) или пяти (M4A4, NCI-H747) дней. Количество жизнеспособных клеток определяли с помощью AlamarBlue (кат. № DAL1100, BioSource International, San Francisco, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресценцию регистрировали на считывающем устройстве En Vision 2101 Multilabel reader (PerkinElmer, Turku, Финляндия) при стандартных настройках для AlamarBlue. В качестве отрицательного контроля использовали ADCs антитела IgG1-b12, которое связывается с посторонним антигеном. Для индуцирования максимальной гибели клеток использовали стауроспорин (Sigma, # S6942). Количество молекул CD74 на клетках определяли с помощью набора QIFIKIT^® (Dako, Glostrup, Дания) в соответствии с инструкциями производителя, используя мышиный IgG1 против CD74 (клон Ву2; Santa Cruz, кат. № SC-20062) и контроль на изотип - антитело CLB (кат. № M1415). Оба антитела использовали при концентрации в 10 мкг/мл. Было установлено, что клетки Raji и Daudi экспрессируют ~20000, а клетки М4А4 ~11000 молекул CD74 на поверхности клеток.

Как видно из фиг.9 и таблицы 11, все ADCs против CD74 способны вызвать гибель клеток Raji, Daudi и М4А4 дозо-зависимым образом. Значения IC₅₀ для всех конъюгатов были в 5-12 раз выше на клетках М4А4 (т.е. меньшая эффективность), экспрессирующих CD74 на примерно в 6 раз меньшем уровне. Клетки NCI-H747 погибали только при самой высокой дозе ADCs (10 мкг/мл). Для HuMab-CD74-006 и -011 конъюгаты с mcMMAF немного более эффективно вызывали гибель клеток Daudi и Raji, чем конъюгаты с vcMMEA (-006: значения IC₅₀ в три раза меньше на клетках Daudi и в пять раз меньше на клетках Raji; -011: значения IC₅₀ в два раза меньше на клетках Daudi и в четыре раза меньше на клетках Raji).

Таблица 11
Сводка значений IC50 и степени гибели клеток, вызванной ADCs против CD74. Данные представлены в виде средних значений Юзо (в мкг/мл) и средних значений максимальной гибели клеток (при концентрации в 10 мкг/мл) указанных линий клеток, обработанных ADCs против CD74. Данные рассчитывали из трех независимых экспериментов. Степень гибели клеток (% погибших клеток) рассчитывали следующим образом: (MFIнеобработанные-MFIобработанные ADC против CD74)/(MFIнеобработанные-MFIобработанные стауроспорином)×100%.
ADC	Ragi	Daudi	М4А4	NCI-H747
Гибель	IC50	Гибель	IC50	Гибель	IC50	Гибель	IC50
005-vcMMAE	88	0,11	85	0,08	100	0,56	41	7,48
005-mcMMAF	92	0,05	90	0,03	97	0,38	5	н/оa)
006-vcMMAE	90	0,05	85	0,03	100	0,28	49	6,12
006-mcMMAF	93	0,01	93	0,01	97	0,12	21	н/оa)
011-vcMMAE	89	0,04	86	0,02	100	0,32	40	7,91
011-mcMMAF	92	0,01	92	0,01	96	0,10	17	н/оa)
b12-vcMMAE			н/оa	0	Н/0a	н/оa	0	н/оa
b12-mcMMAF			н/оa	0	Н/0a	н/оa	0	н/оa
a) не поддается расчету, так как не достигается уровень плато на кривой

Пример 19. Терапевтическое лечение привитых опухолей Daudi у мышей SCID специфичными к CD74 ADCs

Эффективность ADCs HuMab-CD74-011 in vivo определяли на привитых внутривенно (i.v.) опухолях-ксенотрансплантатах Daudi (лимфома Беркитта) у мышей SCID.

Клетки Daudi трансфецировали методом электропорации люциферазой gWIZ (Aldevron, Fargo, ND, USA) и вектором pPur (BD Biosciences, Alphen a/d Rijn, Нидерланды) в соотношении 4:1. Через 48 ч добавляли пуромицин для отбора стабильно трансфецированных клонов (Daudi-luc). Клетки Daudi-luc #1Е3 культивировали в RPMI с добавлением 10% телячьей сыворотки Cosmic (кат. № SH30087.04, Hyclone), 1% пенициллина/стрептомицина (кат. № DE 17-603, Cambrex, Германия), 1% пирувата натрия и 1 мкг/мл пуромицина (кат. № Р-8833, Sigma, Zwijndrecht, Нидерланды). Самкам мышей SCID вводили i.v. 2,5×10⁶ раковых клеток Daudi-luc в 100 мкл PBS в хвостовую вену. Мышей подвергали томографии сразу же после инокуляции опухолей, а затем с недельными интервалами, начиная с 14-го дня. Для томографии мышей анестезировали с помощью изофлурана, а затем вводили внутрибрюшинно (i.p.) 2,5 мг D-люциферина (в виде кислоты, кат. № ВТ11-1000; Biothema, Haninge, Швеция) в 200 мкл 10 мг/мл трис (кат. № T60666-1kg, Sigma). Биолюминесцентную томографию (BLI), со спины (дорзальный вид), начинали через 10 мин после введения D-люциферина, время экспозиции - 5 мин, на Biospace Imager. Делали черно-белые снимки для анатомической привязки. Мышам два раза в неделю вводили по 60 мкг (~3 мг/кг) HuMab-CD74-011 и контрольного антитела (IgG1-b12), то и другое как в виде ADC, так и неконъюгированного IgG1, в 100 мкл PBS, начиная с 21-го дня после инокуляции опухоли, в общей сложности 4 раза. Перед обработкой мышей разделяли на группы по семь мышей, причем все группы имели в среднем одинаковые сигналы BLI и одинаковые дисперсии.

Из фиг.10 видно, что и HuMab-CD74-011-vcMMAE, и -mcMMAF эффективно уменьшали размеры i.v. опухолей Daudi-luc. Как видно из фиг.10, проявлялась тенденция к более сильному подавлению роста опухолей в случае неконъюгированного HuMab-CD74-011 по сравнению с группой контрольного антитела, хотя эти отличия не были значимы.

Пример 20. Терапевтическое лечение привитых опухолей Raji у мышей SCID с помощью ADCs против CD74

Эффективность ADCs против CD74 in vivo также определяли на модели внутривенных (i.v.) опухолей-ксенотрансплантатов Raji у мышей SCID.

Клетки Raji трансфецировали методом электропорации люциферазой gWIZ (Aldevron, Fargo, ND, USA) и вектором pPur (BD Biosciences, Alphen a/d Rijn, Нидерланды) в соотношении 4:1. Через 48 ч добавляли пуромицин для отбора стабильно трансфецированных клонов (Raji-luc). Клетки Raji-luc #2D1 культивировали в RPMI с 10% телячьей сыворотки Cosmic (кат. № SH30087.04, Hyclone), 1% пенициллина/стрептомицина (кат. № DE17-603, Cambrex, Германия), 1% пирувата натрия и 1 мкг/мл пуромицина (кат. № Р-8833, Sigma, Zwijndrecht, Нидерланды). Самкам мышей SCID вводили i.v. 2,5×10⁶ раковых клеток Raji-luc в 100 мкл PBS в хвостовую вену. Мышей подвергали томографии сразу же после инокуляции опухолей, а затем с недельными интервалами, начиная с 7-го дня. Для томографии мышей анестезировали с помощью изофлурана, а затем вводили внутрибрюшинно (i.p.) 2,5 мг D-люциферина (в виде кислоты, кат. № ВТ11-1000; Biothema, Haninge, Швеция) в 200 мкл 10 мг/мл трис (кат. № Т60666-1kg, Sigma). Биолюминесцентную томографию (BLI), со спины (дорзальный вид), начинали через 10 мин после введения D-люциферина, время экспозиции - 5 мин, на Biospace Imager. Делали черно-белые снимки для анатомической привязки. Мышам два раза в неделю вводили по 60 мкг (~3 мг/кг) HuMab-CD74-011 и контрольного антитела (IgG1-b12), то и другое как в виде ADC, так и неконъюгированного IgG1, в 100 мкл PBS, начиная с 11-го дня после инокуляции опухолей, в общей сложности 4 раза. Перед обработкой мышей разделяли на группы по семь мышей, причем все группы имели в среднем одинаковые сигналы BLI и одинаковые дисперсии.

Из фиг.11 видно, что и HuMab-CD74-011-vcMMAE, и -mcMMAF устраняли практически все опухоли Raji-luc. Как видно из фиг.11, проявлялась тенденция к более сильному подавлению роста опухолей в случае неконъюгированного HuMab-CD74-011 по сравнению с группой контрольного антитела, хотя эти отличия не были значимы.

Пример 21. Терапевтическое лечение привитых опухолей Raji у мышей SCID с помощью ADCs против CD74

Эффективность ADCs против CD74 in vivo также определяли на привитых подкожно (s.c.) опухолях-ксенотрансплантатах Raji (лимфома Беркитта) у мышей SCID.

Самкам мышей SCID вводили s.c. 5×10⁶ опухолевых клеток Raji-luc #2D1 (полученных, как описано в примере 20) в 200 мкл PBS в правый бок, с последующими двумя инъекциями ADCs против CD74 или контроля (IgG1-b12; то и другое как в виде ADC, так и неконъюгированного IgG1), первый раз тогда, когда размеры опухолей составляли в среднем ~400 мм³, на 17 день, а второй раз четырьмя днями позже, на 21 день (по 60 мкг/мышь, ~3 мг/кг, в 100 мкл, внутрибрюшинно). Перед первой обработкой мышей с растущими опухолями разделяли на группы с одинаковым распределением объема опухолей. Объем опухолей определяли по меньшей мере два раза в неделю. Объем опухолей (мм³) рассчитывали по измерениям кронциркулем (PLEXX) как: 0,52 × (длина) × (ширина)².

Как видно из фиг.12, все ADCs против CD74 эффективно уменьшали размеры привитых s.c. опухолей Raji-luc. У мышей, обработанных IgG1-b12, как в виде ADC, так и в неконъюгированном виде, опухоли продолжали расти.

Пример 22. Терапевтическое лечение привитых опухолей М4А4 у мышей SCID с помощью ADCs против CD74

Эффективность ADCs против CD74 in vivo также определяли на привитых подкожно (s.c.) опухолях-ксенотрансплантатах М4А4 у мышей SCID. Клетки меланомы М4А4 (кат. № CRL-2914; American Tissue Culture Collection, ATCC; происходят из линии клеток человека MDA-MB-435) культивировали в DMEM (кат. № BE12-709F, Cambrex, Германия), содержащей 10% телячьей сыворотки Cosmic (кат. № SH30087.04, Hyclone, Нидерланды) и 1% пенициллина/стрептомицина (кат. № DE17-603, Cambrex, Германия). Самкам мышей SCID вводили s.c. 10⁷ опухолевых клеток М4А4 в 200 мкл PBS в правый бок, с последующими двумя инъекциями ADCs против CD74 или контроля (IgG1-b12; то и другое как в виде ADC, так и неконъюгированного IgG1), начиная по достижении размера опухолей ~200 мм³: на 11 день, 14 день, 18 день и 21 день (по 60 мкг/мышь, ~3 мг/кг, в 100 мкл, внутрибрюшинно). Перед первой обработкой мышей разделяли на группы с одинаковым средним объемом опухолей и одинаковой дисперсией объема опухолей. Объем опухолей определяли по меньшей мере два раза в неделю. Объем опухолей (мм³) рассчитывали по измерениям кронциркулем (PLEXX) как: 0,52 × (длина) × (ширина)².

Из фиг.13 видно, что хотя все ADCs против CD74 подавляют рост привитых s.c. опухолей М4А4, однако конъюгаты с vcMMAE сильно уменьшают размер опухолей. По сравнению с неконъюгированным IgG1-b12, ADCs IgG1-b12 слегка подавляют рост опухолей.

Пример 23. Определение скорости диссоциации антител HuMab против CD74 на клетках Daudi

В этом примере описано определение скорости диссоциации (off-rate) антител HuMab против CD74 при связывании с клетками Daudi.

Антитела метили красителем Alexa Fluor^® 488 (Molecular Probes), в дальнейшем "Alexa-488", по следующей методике.

Готовили растворы антител в 1 мг/мл IgG в буфере из 0,1 М карбоната натрия рН 9,0 (NaHCO₃, Riedel de Haen, кат. №31437). Alexa-488 готовили свежим путем добавления 100 мкл DMSO (Sigma, кат. № D2438) в один флакон сукцинимидилового эфира карбоновой кислоты Alexa Fluor^® 488 (1 мг/флакон, Molecular Probes, Leiden, Нидерланды, кат. № А-20000). В раствор IgG добавляли 25-кратный молярный избыток Alexa-488, рассчитанный как указано ниже, и инкубировали, с вращением, в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч. После мечения несвязавшийся Alexa-488 удаляли на колонке PD-10 (Amersham Biosciences, кат. № 17-0851-01), заполненной трис-буфером рН 8,0 (50 мМ трис-основания [Trizma base, Sigma, кат. № T-6066], 100 мМ NaCl [Riedel de Haen, кат. № 31437], 0,01% азида натрия [NaN₃, Riedel de Haen, кат. № 13412]). Количество Alexa-488, добавляемое в раствор IgG, рассчитывали по формуле:

добавляемый объем Alexa-488 (в мкл) = (конц. IgG (мг/мл)/м.в. IgG (Да) × соотношение × объем × м.в. Alexa-488 × 100,

где м.в. IgG=150000 Да; соотношение означает молярный избыток Alexa-488; объем = объем подвергаемого мечению образца (в мл); м.в. А1еха-488 = 643 Да.

Концентрацию белка (IgG) и степень включения метки (D.O.L.) определяли путем измерения OD при 280 нм и 495 нм на Ultrospec 2100 Pro (Amersham Biosciences). Концентрацию IgG (мг/мл) рассчитывали по формуле:

концентрация IgG=[А₂₈₀-(0,11×А₄₉₅)]/коэффициент экстинкции IgG,

а D.O.L. рассчитывали по формуле:

D.O.L.=A₄₉₅/71000/[А₂₈₀-(0,11×А₄₉₅)/(коэффициент экстинкции IgG × м.в. IgG)],

где 71000 - коэффициент экстинкции Alexa-488 при λ_max в см^-1⋅М^-1; а 0,11 - поправочный коэффициент (А₂₈₀ свободного красителя/A_max свободного красителя) (оба предоставлены производителем).

Бычий сывороточный альбумин (BSA; Sigma, кат. № А 2934) добавляли из 10% масс. раствора до конечной концентрации в 0,1% масс., а меченые антитела хранили при 5°С.

Клетки Daudi инкубировали с меченными Alexa-488 антителами HuMab против CD74. Клетки Daudi дважды промывали ледяным PBS. Высеивали по 10⁵ клеток на лунку в ледяном буфере FACS в 96-луночные круглодонные планшеты для тканевых культур (Greiner BioOne). Добавляли 0,5 мкг/мл (HuMab-CD74-006 и -011; конечная концентрация) или 1 мкг/мл (HuMab-CD74-008; конечная концентрация) меченного Alexa-488 HuMab против CD74 в ледяном буфере FACS. После инкубации на льду в течение 30 мин добавляли 50 мкг/мл (HuMab-CD74-006 и -011; конечная концентрация) или 100 мкг/мл (HuMab-CD74-008; конечная концентрация) немеченого HuMab против CD74 и инкубировали на льду в течение различных промежутков времени от 15 до 180 мин. Общее время инкубации с немеченым антителом указано под графиками. Для определения максимального связывания клетки Daudi инкубировали с меченными Alexa-488 антителами HuMab на льду в течение 30 мин. В качестве отрицательного контроля клетки инкубировали с контролем на изотип - антителом IgG1-b12 (конечная концентрация 0,5 мкг/мл), а затем с немеченым IgG1-b12 (конечная концентрация 50 мкг/мл). После инкубации с антителами клетки отмывали один раз в буфере FACS и детектировали связанные меченные Alexa антитела HuMab против CD74 методом проточной цитометрии на установке FACS Canto II (BD Biosciences).

Из фиг.14 видно, что скорости диссоциации (off-rates) у HuMab-CD74-006 и -008, измеренные при 0°С, были довольно быстрыми (половина связанных меченных Alexa-488 антител замещалась немечеными антителами в течение ~3 и ~4 мин при 0°С, а значения K составили 0,24 и 0,20 мин^-1 [K=k_off]); тогда как у -011 скорость диссоциации, измеренная при 0°С, была несколько медленнее (половина связанных меченных Alexa-488 антител замещалась немечеными антителами в течение ~10 мин при 0°С, значение K составило 0,07 мин^-1).

Пример 24. Интернализация и накопление антител HuMab против CD74

Для того, чтобы выяснить, подходят ли антитела HuMab против CD74 для подхода типа конъюгатов антитело-препарат, исследовали интернализацию и накопление антител методом FACS после инкубации различных антител HuMab против CD74 с клетками Daudi. Высеивали по 10⁵ клеток на лунку в культуральной среде в 96-луночные круглодонные планшеты для тканевых культур (Greiner BioOne). В различные моменты времени добавляли 10 мкг/мл (конечная концентрация) меченных Alexa-488 антител HuMab против CD74 и инкубировали при 4°С (для измерения связывания с экспрессированным на поверхности клеток CD74) или при 37°С (для измерения связывания и интернализации). Общее время инкубации с антителами указано под графиками. Интернализацию и накопление при 37°С также проверяли на клетках Raji и М4А4 при конечной концентрации 3 мкг/мл меченных Alexa-488 антител HuMab против CD74. После инкубации с антителами клетки ставили на лед и планшеты дважды промывали буфером FACS. Связанные с клетками меченые антитела детектировали методом проточной цитометрии на установке FACS Canto II (BD Biosciences).

Из фиг.15А видно, что после инкубации при 4°С обнаруживался лишь низкий уровень связывания меченных Alexa-488 антител HuMab против CD74 с поверхностью клеток Daudi в любые моменты времени. Таким образом, наблюдаемая интенсивность флуоресценции, измеренная после инкубации при 37°С, представляет интернализированные антитела. Из фиг.15B видно, что все исследованные антитела HuMab против CD74 подвергались интернализации, но с различной эффективностью. Интернализация была самой быстрой у HuMab-CD74-011, более медленной у HuMab-CD74-006 и самой медленной у HuMab-CD74-008. To же самое наблюдалось и при интернализации и накоплении в клетках Raji (15C) и клетках М4А4 (15D).

Пример 25. Профилактическое лечение привитых опухолей Daudi у мышей SCID с помощью антител HuMab против CD74

Эффективность антител HuMab против CD74 in vivo определяли на модели внутривенных (i.v.) опухолей-ксенотрансплантатов Daudi (лимфома Беркитта) у мышей SCID. Клетки Daudi трансфецировали методом электропорации люциферазой gWIZ (Aldevron, Fargo, ND, USA) и вектором pPur (BD Biosciences, Alphen a/d Rijn, Нидерланды) в соотношении 4:1. Через 48 ч добавляли пуромицин для отбора стабильно трансфецированных клонов (Daudi-luc). Клетки Daudi-luc #1E3 культивировали в RPMI с добавлением 10% телячьей сыворотки Cosmic (кат. № SH30087.04, Hyclone), 1% пенициллина/стрептомицина (кат. № DE 17-603, Cambrex, Германия), 1% пирувата натрия и 1 мкг/мл пуромицина (кат. № Р-8833, Sigma, Zwijndrecht, Нидерланды). Самкам мышей SCID (по 7 мышей на группу) вводили i.v. 2,5×10⁶ раковых клеток Daudi-luc в 100 мкл PBS в хвостовую вену. В день инокуляции опухолей мышам вводили внутрибрюшинно (i.p.) 100 мкг (~5 мг/кг) HuMab-CD74-005, -006 или -011 или контрольного антитела (IgG1-b12) в 200 мкл PBS. Мышей подвергали томографии сразу же после инокуляции опухолей, а затем с недельными интервалами, начиная с 14-го дня. Для томографии мышей анестезировали с помощью изофлурана, а затем вводили i.p.2,5 мг D-люциферина (в виде кислоты, кат. № ВТ 11-1000; Biothema, Haninge, Швеция) в 200 мкл 10 мг/мл трис (кат. № T60666-1kg, Sigma). Биолюминесцентную томографию (BLI), со спины (дорзальный вид), начинали через 10 мин после введения D-люциферина, время экспозиции - 5 мин, на Biospace Imager. Делали черно-белые снимки для анатомической привязки.

Из фиг.16 видно, что все исследованные антитела HuMab против CD74 почти полностью предотвращали рост привитых i.v. опухолей Daudi-luc.

Эквиваленты

Специалистам в данной области должны быть известны или они сами смогут установить только лишь путем простого экспериментирования многие эквиваленты описанных здесь конкретных воплощений изобретения. Такие эквиваленты должны быть охвачены прилагаемой формулой изобретения. В рамки изобретения также входят всевозможные комбинации воплощений, изложенных в зависимых пунктах формулы.

1. Выделенное антитело, которое связывается с вариантами 1 и 2 CD74 человека и включает область V_L, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 24, AAS и SEQ ID NO: 25, и

a) область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 20, 21 и 22;

b) область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 8, 9 и 10;

c) область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 12, 13 и 14; или

d) область V_H, включающую последовательности CDR1, 2 и 3 SEQ ID NO: 16, 17 и 18.

2. Антитело по п.1, которое:

(а) связывается с внеклеточным доменом варианта 1 CD74 со значением ЕС₅₀ менее 500 нг/мл, менее 400 нг/мл, менее 350 нг/мл или менее 330 нг/мл;

b) связывается с внеклеточным доменом варианта 2 CD74 со значением ЕС₅₀ менее 400 нг/мл, менее 300 нг/мл, менее 250 нг/мл или менее 220 нг/мл; либо

(с) то и другое - и (а), и (b),

при определении так, как описано в примере 11.

3. Антитело по п.1, которое связывается с CD74 на клетках Raji со значением ЕС₅₀ менее 400 нг/мл, менее 300 нг/мл, менее 250 нг/мл или менее 200 нг/мл при определении так, как описано в примере 11.

4. Антитело по п.1, которое связывается с CD74 яванской макаки.

5. Антитело по п.1, которое интернализируется после связывания с CD74, экспрессированным на поверхности клетки.

6. Антитело по п.5, где клетки представляют собой клетки Raji.

7. Антитело по п.1, у которого значение ЕС₅₀ составляет менее 60 нг/мл, менее 40 нг/мл, менее 30 нг/мл или же 25 нг/мл или меньше при индуцировании гибели клеток Raji методом анти-каппа-ЕТА', при определении так, как описано в примере 14.

8. Антитело по п.1, которое проявляет скорость диссоциации (off-rate) при 0°С от 0,02 до 1,0 мин^-1, от 0,03 до 0,30 мин^-1, от 0,04 до 0,10 или от 0,15 до 0,30 мин^-1.

9. Антитело по п.1, содержащее область V_H, которая:

a) по меньшей мере на 80% идентична, предпочительно по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% либо на 100% идентична последовательности области V_H, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 11, 15 и 19, или

b) содержит не более 20, предпочительно 15 или 10 или 5, 4, 3, 2 или 1 модификации аминокислот, более предпочтительно замены аминокислот, предпочительно консервативной замены аминокислот по сравнению с последовательностью области V_H, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 11, 15 и 19.

10. Антитело по п.1, содержащее область V_L, которая:

a) по меньшей мере на 80% идентична, предпочительно по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% либо на 100% идентична последовательности области V_L, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 23 и 26, или

b) содержит не более 20, предпочительно 15 или 10, или 5, 4, 3, 2 или 1 модификации аминокислот, более предпочтительно замены аминокислот, предпочительно консервативной замены аминокислот по сравнению с последовательностью области V_L, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23 и 26.

11. Антитело, которое связывается с вариантами 1 и 2 CD74 и содержит:

а) область V_H, включающую последовательность SEQ ID NO: 19, и область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO: 26;

b) область V_H, включающую последовательность SEQ ID NO: 7, и область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO: 26;

c) область V_H, включающую последовательность SEQ ID NO: 7, и область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO: 23;

d) область V_H, включающую последовательность SEQ ID NO: 11, и область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO:26; или

e) область V_H, включающую последовательность SEQ ID NO: 15, и область V_L, включающую последовательность SEQ ID NO: 26.

12. Антитело по п.11, которое представляет собой человеческое моноклональное антитело.

13. Антитело по п.11, которое имеет изотип, выбранный из IgG1 и IgG4.

14. Антитело по п.11, которое конъюгировано с терапевтической молекулой.

15. Антитело по п.14, которое конъюгировано с терапевтической молекулой через линкер, присоединенный по сульфгидрильным группам антитела, полученным при хотя бы частичном восстановлении антитела.

16. Антитело по п.14, в котором терапевтическая молекула представляет собой цитотоксическую молекулу, радиоизотоп, химиотерапевтическое средство, литический пептид или цитокин.

17. Антитело по п.16, которое конъюгировано с цитотоксической молекулой.

18. Антитело по п.17, в котором цитотоксическая молекула выбрана из группы, состоящей из таксола; цитохалазина В; грамицидина D; бромистого этидия; эметина; митомицина; этопозида; тенопозида; винкристина; винбластина; колхицина; доксорубицина; даунорубицина; дигидроксиантрациндиона; майтансина либо его аналогов или производных; ауристатина либо его функциональных пептидных аналогов или производных типа монометилауристатина Е (ММАЕ) или F (MMAF); доластатина-10 или -15 либо их аналогов; иринотекана либо его аналогов; митоксантрона; митрамицина; актиномицина D; 1-дегидротестостерона; глюкокортикоидов; прокаина; тетракаина; лидокаина; пропранолола; пуромицина; калихеамицина либо его аналогов или производных; антиметаболитов типа метотрексата, 6-меркаптопурина, 6-тиогуанина, цитарабина, флударабина, 5-фторурацила, декарбазина, гидроксимочевины, аспарагиназы, гемцитабина или кладрибина; алкилирующих агентов типа мехлорэтамина, тиоэпа, хлорамбуцила, мелфалана, кармустина (BSNU), ломустина (CCNU), циклофосфамида, бусульфана, дибромманнитола, стрептозотоцина, дакарбазина (DTIC), прокарбазина, митомицина С; производных платины типа цисплатина или карбоплатина; дуокармицина А, дуокармицина SA, рахелмицина (СС-1065) либо их аналогов или производных; антибиотиков типа дактиномицина, блеомицина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, митрамицина, митомицина, митоксантрона, пликамицина, антрамицина (АМС)); пирроло[2,1-с][1,4]-бензодиазепинов (PDB); дифтерийного токсина и родственных молекул типа цепи А дифтерийного токсина и ее активных фрагментов и гибридных молекул, рицинового токсина типа рицина А или дегликозилированной цепи А рицинового токсина, холерного токсина, Шига-подобных токсинов типа SLT I, SLT II, SLT IIV, токсина LT, токсина С3, Шига-токсина, коклюшного токсина, столбнячного токсина, соевого ингибитора протеаз Боуман-Бирка, экзотоксина Pseudomonas, алорина, сапорина, модекцина, геланина, цепи А абрина, цепи А модекцина, альфа-сарцина, белков Aleurites fordii, белков диантина, белков Phytolacca americana типа PAPI, PAPII и PAP-S, ингибитора из Momordica charantia, курцина, кротина, ингибитора из Sapaonaria officinalis, токсинов гелонина, митогеллина, рестриктоцина, феномицина и еномицина; рибонуклеазы (РНКазы); ДНКазы I, стафилококкового энтеротоксина А; противовирусного белка лаконоса; дифтерийного токсина; и эндотоксина Pseudomonas.

19. Антитело по п.17, которое конъюгировано с цитотоксической молекулой, выбранной из группы, состоящей из антрациклина, пирроло[2,1-с][1,4]-бензодиазепина, майтансина, калихеамицина, дуокармицина, рахелмицина (СС-1065), доластатина-10 или -15, иринотекана либо их аналогов, производных или пролекарств.

20. Антитело по п.17, в котором цитотоксической молекулой является ауристатин либо его функциональный пептидный аналог или производное, необязательно конъюгированный с антителом через линкер, присоединенный по одному или нескольким остаткам цистеина у антитела.

21. Антитело по п.14, у которого значение IC₅₀ составляет менее 0,5 мкг/мл, менее 0,3 мкг/мл, менее 0,2 мкг/мл или менее 0,1 мкг/мл при индуцировании гибели клеток Raji, Daudi или М4А4, при определении так, как описано в примере 18.

22. Антитело по п.16, которое конъюгировано с цитокином, выбранным из группы, состоящей из IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα, IFNβ, IFNγ, GM-CSF, CD40L, лиганда Flt3, фактора стволовых клеток, анцестима и TNFα.

23. Антитело по п.1, которое представляет собой мультиспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий участок из антитела, приведенного в любом из предыдущих пунктов, и по меньшей мере один второй антигенсвязывающий участок, обладающий другой специфичностью связывания.

24. Антитело по п.23, которое представляет собой биспецифическое антитело, где необязательно второй антигенсвязывающий участок обладает специфичностью связывания к антигену на эффекторных клетках человека типа Т-клеток человека.

25. Антитело по п.23, которое представляет собой биспецифическое антитело, где:

первый антигенсвязывающий участок соединяется с первой областью Fc, содержащей аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, состоящей из 366, 368, 370, 399, 405, 407 и 409, а второй антигенсвязывающий участок соединяется со второй областью Fc, содержащей аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, состоящей из 366, 368, 370, 399, 405, 407 и 409, причем

первая и вторая области Fc не содержат замен в одинаковых положениях.

26. Экспрессирующий вектор, содержащий последовательность нуклеотидов, кодирующую одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 7, 11, 15, 19, 23 и 26, или любые их комбинации.

27. Экспрессирующий вектор по п.26, дополнительно содержащий последовательность нуклеотидов, кодирующую константную область легкой цепи антител человека, тяжелой цепи антител человека или обеих цепей.

28. Рекомбинантная клетка-хозяин, которая вырабатывает антитело по любому из пп.1-14 или 16-25.

29. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.28, которая является эукариотической клеткой-хозяином.

30. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.28, которая является прокариотической клеткой-хозяином.

31. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая антитело по любому из пп.1-25 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

32. Фармацевтическая композиция для профилактики рака, содержащая антитело по любому из пп.1-25 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

33. Антитело по п.1 в качестве медикамента.

34. Антитело по п.1 для лечения рака.

35. Антитело по п.1 для профилактики рака.

36. Антитело по п.35, где профилактика рака включает одно или несколько из уменьшения риска возникновения рака, уменьшения риска прогрессирования рака и/или уменьшения риска рецидива при ремиссии рака.

37. Антитело по п.34, где рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака эндометрия /шейки матки, рака желудка, рака головы и шеи, рака легких, злокачественной глиомы, злокачественной меланомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака простаты, рака почек, рака печени, рака тимуса, злокачественной фиброзной гистиосаркомы, акустической шванномы, гипофизарной аденомы и аденомы.

38. Антитело по п.34, где рак выбран из группы, состоящей из злокачественной лимфомы, В-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемии (B-CLL), хронической миелоидной лейкемии (CML) в бластной фазе, неходжкинской лимфомы (NHL), множественной миеломы (ММ), моноцитоидной В-клеточной лимфомы (MBCL), волосковоклеточной лейкемии (HCL) и Т-клеточной лимфомы.

39. Антитело по п.38, где рак представляет собой NHL.

40. Антитело по п.38, где рак представляет собой ММ.

41. Антитело по п.37, где рак представляет собой рак яичников.

42. Антитело по п.37, где рак представляет собой рак молочной железы.

43. Антитело по п.37, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.

44. Антитело по п.37, где рак выбран из рака простаты, рака желудка и колоректального рака.

45. Антитело по п.33 для лечения аутоиммунных заболеваний.

46. Антитело по любому из пп.33-45 в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим средством.

47. Антитело по п.46, где по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство выбрано из второго антитела или ADC; химиотерапевтического средства; ингибитора ангиогенеза, неоваскуляризациии и/или иной васкуляризации; противоракового иммуногена; цитокина или хемокина; регулятора контроля клеточного цикла или апоптоза; гормонального регуляторного средства; антианергического средства; содержащей ген супрессора опухолей нуклеиновой кислоты или вектора; противораковой нуклеиновой кислоты; вируса или вирусных белков; клеток иммунной системы; средства, вызывающего дифференцировку; средства, повышающего уровень CD74; и противовоспалительного, иммуносупрессорного и/или иммуномодулирующего средства; либо комбинации любых из них.

48. Антитело по п.47, где по меньшей мере одно терапевтическое средство выбрано из специфичного к CD20 антитела, специфичного к CD138 антитела, специфичного к CD38 антитела, антитела против VEGF-A, мелфалана, леналидомида, бортезомиба, фторурацила, гемцитабина, иринотекана, цисплатина либо их производных или аналогов.

49. Применение антитела по любому из пп.1-25 для изготовления медикамента для лечения рака.

50. Применение по п.49, включающее дополнительные признаки любого из пп.31-48.

51. Способ индуцирования клеточной смерти, клеток, экспрессирующих CD74, который включает введение антитела по любому из пп.1-25.

52. Способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей CD74, включающий введение антитела по любому из пп.1-25.

53. Способ ингибирования пролиферации клетки, экспрессирующей CD74, включающий введение антитела по любому из пп.1-25.

54. Способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом индивиду эффективного количества антитела по любому из пп.1-25, необязательно в комбинации с дополнительным терапевтическим средством по любому из пп.47 и 48.

55. Способ профилактики рака, включающий введение нуждающемуся в этом индивиду эффективного количества антитела по любому из пп.1-25.