Способ прогнозирования течения острого панкреатита

Изобретение относится к области медицины. Способ прогнозирования течения острого панкреатита включает забор венозной крови, получение сыворотки, затем сыворотку крови дважды экстрагируют этилацетатом, экстракты объединяют, упаривают досуха в токе инертного газа, а остаток растворяют в метаноле, полученный метанольный экстракт образца сыворотки крови подвергают хроматографическому анализу с одновременным спектральным анализом хроматографических пиков в ультрафиолетовой области на 8 длинах волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм, далее на полученной хроматограмме проводят разметку хроматографических пиков, определяют их спектральные отношения и объемы удерживания, после чего проверяют наличие в образце патологических пиков из таблицы 1, и при обнаружении 2 и более патологических пиков из таблицы 1 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания с возможностью развития некроза. Технический результат: повышение точности и сокращение длительности способа. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в хирургии для прогнозирования течения острого панкреатита после установленного диагноза.

Прогнозирование течения острого панкреатита является одним из ведущих факторов, определяющих выбор тактики лечения. Особенно важен прогноз течения острого панкреатита в первые трое суток заболевания, когда реализуется «патологическая программа» острого панкреатита, в дальнейшем клиницисту приходится бороться уже с его последствиями (Buchler М., Uhl W., Malfertheiner P. Sarr H. Diseases of the pancreas. - Heidelberg: Karger, 2004. - 212p.; Толстой А.Д., Панов В.П., Красногоров В.Б., Вашетко Р.В., Скородумов А.В. Парапанкреатит. - СПб., 2003. - 256 с.).

Известен способ прогнозирования течения острого панкреатита путем исследования сыворотки крови, которую предварительно высушивают и суспензируют в вазелиновом масле, а затем проводят инфракрасную спектроскопию образца с регистрацией спектров поглощения в области 1200-1000 см^-1 и регистрируют высоты пиков полос поглощения с максимумами при 1170, 1165, 1150, 1140, 1130, 1100, 1070, и 1025 см^-1, вычисляют отношение каждого предыдущего пика к последующему, затем определяют значение показателя S - отношение высоты пика с максимумом при 1100 см^-1 к среднему значению всех частных и при значениях показателя S больше 0,66 прогнозируют тяжелое течение острого панкреатита, при значениях показателя S, равных или меньше 0,66, прогнозируют легкое течение заболевания (патент RU 2284034 C2, опубл. 20.09.2006).

Недостатками известного способа являются трудоемкость и длительность.

Известен способ прогнозирования исхода острого деструктивного панкреатита, заключающийся в том, что из сыворотки крови больного готовят образец для анализа, затем проводят инфракрасную спектроскопию образца с регистрацией спектров поглощения в области 1200-1000 см^-1, регистрируют высоты пиков полос поглощения с максимумами при 1170; 1165; 1150; 1140; 1130; 1100; 1070; 1025 см^-1. Вычисляют отношение каждого предыдущего пика к последующему, определяют М - наибольшее полученное частное, m - наименьшее полученное частное, D - разность М и m, С - среднее значение всех частных, Z - отношение высоты пика с максимумом при 1170 см^-1 к высоте пика с максимумом при 1165 см^-1, R - отношение высоты пика с максимумом при 1165 см^-1 к высоте пика с максимумом при 1070 см^-1, K - отношение величины Z к величине R, X - отношение высоты пика с максимумом при 1130 см^-1 к С - среднему значению величины высот пиков, Q - отношение высоты пика с максимумом при 1070 см^-1 к С и S - отношение высоты пика с максимумом при 1100 см^-1 также к С. На основании полученных значений показателей М, m, D, С, Z, R, K, X, Q и S по уравнению логистической регрессионной модели прогноза исхода деструктивного панкреатита определяют вероятность неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита (Y). При Y<0,5 прогнозируют благоприятный исход деструктивного панкреатита, при Y≥0,5 - неблагоприятный исход (патент RU 2277243 С1, опубл. 27.05.2006).

Недостатками известного способа являются трудоемкость и длительность.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ дифференциальной диагностики злокачественных новообразований и соматических незлокачественных заболеваний, заключающийся в том, что предварительно проводят подготовку образца сыворотки венозной крови путем ее высушивания, размельчения и приготовления водно-метанольного экстракта, затем выполняют высокоэффективную жидкостную хроматографию водно-метанольного экстракта материала образца, определяют наличие характеристических комплексов хроматографических пиков полос поглощения с определенными объемами удерживания и в зависимости от выявленного характеристического комплекса дифференцируют органную локализацию очагов злокачественных новообразований, в том числе в поджелудочной железе, и органную локализацию соматических незлокачественных заболеваний, в частности, диагноз злокачественного новообразования поджелудочной железы выставляют при наличии характеристического комплекса хроматографических пиков полос поглощения образца сыворотки крови с объемами удерживания 1340, 1775, 1815, 1890, 2975 мкл (патент RU 2335768 C1, опубл. 10.10.2008).

Недостатками известного способа являются длительность, поскольку подготовку сыворотки крови к анализу осуществляют методом высушивания, длящимся две недели, а также недостаточная точность способа, так как характеристику диагностических пиков определяют только по значению объема удерживания, что недостаточно для однозначного определения пика вещества на хроматограмме. Многие вещества характеризуются одинаковыми параметрами объема удерживания, однако при этом имеют различные спектры поглощения в ультрафиолетовой (УФ) области (190-380 нм), то есть являются разными веществами. Таким образом, использование для определения диагностического признака только значения объема удерживания может привести к ложноположительным результатам.

Задачей изобретения является разработка более точного и менее длительного способа прогнозирования течения острого панкреатита путем хроматографического анализа сыворотки крови.

Технический результат: повышение точности и сокращение длительности способа.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Сыворотку крови больного (500 мкл) с установленным диагнозом острый панкреатит дважды экстрагируют этилацетатом, экстракты объединяют, упаривают досуха в токе инертного газа, а остаток растворяют в метаноле. Полученный метанольный экстракт образца сыворотки крови подвергают хроматографическому анализу с одновременным спектральным анализом хроматографических пиков в ультрафиолетовой области спектра на 8 длинах волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм.

В результате получают обзорную хроматограмму сыворотки крови на 8 длинах волн. На хроматограмме вручную или в автоматическом режиме проводят разметку хроматографических пиков, минимальная высота которых составляет не менее 0,02 единиц оптической плотности (е.о.п.), а объем удерживания не менее 600 мкл.

Каждый метаболит характеризуется объемом удерживания и спектральными отношениями. При этом спектральные отношения (характеристика ультрафиолетового спектра поглощения веществом) рассчитывают как отношение поглощения света на измеренной длине по отношению к опорной длине волны. Применительно к хроматографическому пику спектральное отношение рассчитывают как отношение площадей пика на двух длинах волн - исследуемой и опорной. В качестве опорной принята длина волны 210 нм. Спектральное отношение величина безразмерная, которая зависит только от химической структуры вещества и не зависит от его концентрации в линейном диапазоне измерений.

После разметки хроматографических пиков метаболитов и определения их спектральных отношений и объема удерживания, проверяют наличие в образце патологических пиков из таблицы 1, в которой представлены характеристики пиков патологических метаболитов, соответствующих неблагоприятному прогнозу развития острого панкреатита, где: Vr - объем удерживания пика в мкл, А_220/210 - спектральное отношение (отношение площади пика на 220 нм к площади пика на 210 нм).

Если на хроматограмме исследуемой сыворотки крови обнаружено 2 и более патологических пика из таблицы 1, то прогнозируют неблагоприятное течение заболевания (возможно развитие некроза).

Предварительно, для определения и обоснования диагностической значимости пиков патологических метаболитов было проведено исследование 81 пробы сыворотки крови заявленным методом и сформирована таблица 1, в которой представлены характеристики пиков патологических метаболитов, соответствующих неблагоприятному прогнозу развития острого панкреатита. Среди исследованных проб 25 человек - здоровые доноры крови, 27 человек - больные острым панкреатитом в нетяжелой форме, 29 человек - больные острым панкреатитом с тяжелым течением заболевания. У каждого из 29 больных тяжелой формой панкреатита на хроматограмме сыворотки крови были найдены пики из таблицы 1. При этом патологические пики из таблицы отстутствовали как у здоровых людей, так и у больных нетяжелой формой.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1) Для подготовки образца сыворотки крови к анализу, последнюю дважды экстрагируют этилацетатом, экстракты объединяют, упаривают досуха в токе инертного газа, а остаток растворяют в метаноле, что позволяет существенно сократить длительность пробоподготовки образца с двух недель до одного часа.

2) Полученный метанольный экстракт образца сыворотки крови подвергают хроматографическому анализу с одновременным спектральным анализом хроматографических пиков в ультрафиолетовой области на 8 длинах волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм, затем на полученной хроматограмме проводят разметку хроматографических пиков, определяют их спектральные отношения и объемы удерживания, после чего проверяют наличие в образце патологических пиков из таблицы 1 и при обнаружении 2 и более патологических пиков в таблице 1 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания, что позволяет повысить точность способа за счет использования спектральных отношений для идентификации патологических пиков.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Больной Н., 56 л., поступил с жалобами на боли в эпигастрии и мезогастрии с иррадиацией в поясничную область, тошноту, слабость, повышение температуры тела до 38,4°С, сухость во рту. При поступлении больному проведен комплекс лабораторных и инструментальных методов исследования. По данным OAK лейкоцитоз 16,8×10¹²/л с нейтрофильным сдвигом влево (палочкоядерные нейтрофилы 12%), тромбоцитопения 122×10⁹/л; по данным биохимического анализа крови: амилаземия 1343 ед/л, СРБ 234 мг/мл; ПКТ≥0.5. При поступлении произведена интегральная оценка тяжести состояния больного: по Ranson 3 балла, по APACHE II 14 баллов.

В условиях реанимационного отделения начата интенсивная терапия, динамический контроль внутрибрюшного давления (ВБД) каждые 4 часа по методике Kron et al. (2004 г), при поступлении ВБД составило 16 мм рт.ст. В динамике на 2-е сутки отмечалось отсутствие эффекта от проводимой консервативной терапии, нарастание балльных оценок по шкале Ranson до 6 баллов, по шкале APACHE II до 17 баллов, прогрессирование ВБД до максимальных значений 21 мм рт.ст.

В связи с неэффективностью проводимого лечения, прогрессированием течения заболевания, установлены показания к оперативному вмешательству. Перед проведением оперативного вмешательства больному провели прогнозирование течения острого панкреатита заявляемым способом.

Для этого 500 мкл сыворотки крови больного поместили в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, в сыворотку добавили раствор хлорида калия до достижения концентрации 0,2 М и хлорную кислоту до достижения концентрации 0,1 М, после добавления пробирку встряхивали 5 минут, в процессе образовался осадок. К подкисленной сыворотке добавили 500 мкл этилацетата и встряхивали 10 минут на автоматическом встряхивателе. После этого пробирку центрифугировали при 14000g в течение 10 минут, верхний слой экстракта отобрали в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Процедуру экстракции этилацетатом повторили еще раз, экстракты объединили. Полученный экстракт упарили досуха в токе гелия. Остаток растворили в 50 мкл метанола и использовали для хроматографического анализа.

Анализ проводили на хроматографе Милихром А-02 в режиме градиентной элюции с использованием колонки длиной 150 мм, диаметром 2 мм с сорбентом Prontosil 120-5-С18 AQ.

В качестве элюента А использовали водный раствор перхлората лития с концентрацией 0,2 М и хлорной кислоты 0,005 М. В качестве элюента Б использовали ацетонитрил. Элюцию проводили в режиме градиента от 5% до 100% Б за 4000 мкл, далее следует домывка 100% Б объемом 300 мкл. Температура термостата колонки 50°C, скорость потока 150 мкл в минуту. Для спектрального анализа использовали проточную спектрофотометрическую ячейку с одновременной детекцией поглощения в УФ-диапазоне на 8 длинах волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм.

На хроматограмме вручную разметили пики. Полученные пики сравнили с пиками из таблицы 1 и выявили наличие 4-х патологических пиков №3, №6, №7, №11, в связи с чем сделали прогноз о неблагоприятном течении острого панкреатита.

Больному выполнена срединная лапаротомия. В послеоперационном периоде состояние больного постепенно стабилизировалось, регрессировали явления органной недостаточности, уменьшилась балльная оценка по шкале APACHE II до 11 баллов, стабилизировалось ВБД в пределах 8-12 мм рт.ст., снизились показатели СРБ до 180 мг/мл.

Пример 2

Больной К., 41 г., поступил в клинику по поводу деструктивного панкреатита. При поступлении по данным OAK лейкоцитоз 14,1×10¹²/л с нейтрофильным сдвигом влево (палочкоядерные нейтрофилы 8%); биохимии крови: амилаземия 354 ед/л, СРБ 347 мг/мл; ПКТ≥10.0. Интегральная оценка при поступлении по APACHE II 16 баллов. ВБД при поступлении 19 мм рт.ст.

Больному провели прогнозирование течения заболевания заявляемым способом.

Подготовку образца сыворотки крови для анализа провели аналогично примеру 1. Анализ проводили на хроматографе Милихром А-02 в режиме градиентной элюции с использованием колонки длиной 150 мм, диаметром 2 мм с сорбентом Prontosil 120-5-С18 AQ.

В качестве элюента А использовали водный раствор перхлората лития с концентрацией 0,2 М и хлорной кислоты 0,005 М. В качестве элюента Б использовали ацетонитрил. Элюцию проводили в режиме градиента от 5% до 100% Б за 4000 мкл, далее следует домывка 100% Б объемом 300 мкл. Температура термостата колонки 50°C, скорость потока 150 мкл в минуту. Для спектрального анализа использовали проточную спектрофотометрическую ячейку с одновременной детекцией поглощения в УФ-диапазоне на 8 длинах волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм.

На хроматограмме автоматически разметили пики. Полученные пики сравнили с пиками из таблицы 1 и выявили наличие 5-ти патологических пиков №2, №3, №7, №10, №11, в связи с чем был сделан прогноз о неблагоприятном течении острого панкреатита.

Больной был экстренно прооперирован. Выполнена срединная лапаротомия. В последующем потребовалось 4 этапных санационных ревизий и 8 перевязок под наркозом. Перед каждой санационной ревизией проводился анализ сыворотки крови заявляемым способом с получением достоверного результата о неблагоприятном течении острого панкреатита.

Больной выписан на 43 день после операции в удовлетворительном состоянии.

Предлагаемый способ является простым, дешевым, доступным для использования в условиях практического здравоохранения, не требует дорогого оборудования. Время проведения анализа с момента забора крови больного до составления прогноза тяжести течения острого панкреатита составляет 50-60 минут.

1. Способ прогнозирования течения острого панкреатита, включающий забор венозной крови, получение сыворотки крови, подготовку образца сыворотки крови для анализа, высокоэффективную жидкостную хроматографию материала образца, анализ хроматографических пиков с определением объемов удерживания и выявлением на хроматограмме наличия патологических пиков образца сыворотки крови, отличающийся тем, что сыворотку крови дважды экстрагируют этилацетатом, экстракты объединяют, упаривают досуха в токе инертного газа, а остаток растворяют в метаноле, полученный метанольный экстракт образца сыворотки крови подвергают хроматографическому анализу с одновременным спектральным анализом хроматографических пиков в ультрафиолетовой области спектра на восьми длинах волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм, затем на полученной хроматограмме проводят разметку хроматографических пиков, определяют их спектральные отношения и объемы удерживания, после чего проверяют наличие в образце патологических пиков из таблицы 1, где Vr - объем удерживания пика, в мкл, А_220/210, А_230/210, A_240/210, A_250/210, А_260/210, A_280/210, A_300/210 - спектральные отношения (отношения площадей пиков на длинах волн 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм к площади пика на длине волны 210 нм), и при обнаружении 2 и более патологических пиков из таблицы 1 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания с возможностью развития некроза.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед экстракцией этилацетатом сыворотку крови подкисляют путем добавления раствора хлорида калия до достижения концентрации 0,2 М и хлорной кислоты до достижения концентрации 0,1 М.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хроматографический анализ проводят на хроматографе Милихром А-02 в режиме градиентной элюции.