Способ определения стадии грибовидного микоза

Способ определения стадии грибовидного микоза относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может быть использован для определения стадии грибовидного микоза - наиболее часто встречаемой нозологической разновидности первичных кожных лимфом. Сущность способа: у больного берут биопсию кожи из очага поражения, затем проводят иммуногистохимические исследования с использованием моноклональных антител CD3, CD4 и Ki67 путем компьютерной морфометрии. Затем усредняют данные показатели и рассчитывают суммарную удельную значимость иммунопозитивности указанных моноклональных антител по формуле: F=1,75*Х1+2,03*Х2+12,81*Х3+0,22, где: F - суммарная удельная значимость иммунопозитивности моноклональных антител CD3, CD4 и Ki67; X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3; Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4; Х3 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67; 1,7; 2,03; 12,81 и 0,22 - поправочные коэффициенты. При значении F от 0,220 до 1,535 диагностируют эритематозно-пятнистую стадию, при значении F от 1,536 до 2,888 диагностируют инфильтративно-бляшечную стадию, а при значении F от 2,889 до 4,700 - опухолевую стадию грибовидного микоза. Изобретение обеспечивает повышение объективности и точности диагностирования стадии грибовидного микоза. 8 ил., 4 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может быть использовано для определения стадии грибовидного микоза - наиболее часто встречаемой нозологической разновидности первичных кожных лимфом.

Грибовидный микоз (ГМ) - форма первичной эпидермотропной Т-клеточной лимфомы кожи, характеризующаяся пролиферацией малых и средних Т-лимфоцитов с наличием церебриформных ядер, сопровождающаяся этапностью клинических проявлений в виде пятен, бляшек и опухолей. Выделяют 3 клинические стадии развития классического варианта течения ГМ: I стадию - пятнисто-эритематозную, II стадию - инфильтративно-бляшечную и III стадию - опухолевую [1, 2, 3].

Своевременная диагностика и правильное установление стадии развития ГМ являются приоритетными задачами дерматовенеролога и гематолога (онколога), поскольку имеют решающее значение при выборе оптимальной тактики лечения больного и определяют долгосрочный прогноз заболевания. Так, терапия ранних стадий ГМ (пятнисто-эритематозная и инфильтративно-бляшечная) предусматривает консервативный подход с постепенным наращиванием потенциала лечебных методов и технологий от тактики «наблюдай и жди» и наружной терапии топическими глюкокортикостероидами до применения ретиноидов, интерферона-α, метотрексата, ультрафиолетового облучения спектра В (311 нм), ПУВА-терапии и локальной лучевой терапии, тогда как осуществление специализированной медицинской помощи больным с поздних стадиями ГМ в учреждениях онкогематологического профиля предусматривает уже «агрессивный» подход с применением арсенала системной химиотерапии, биологических препаратов, электронно-лучевой терапии и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [1, 2, 4].

Диагностический процесс при ГМ предусматривает ряд логически связанных этапов, сочетающих оценку анамнеза и клинических проявлений заболевания, анализ данных морфологических и иммуногистохимических (ИГХ) исследований, фиксирующих наличие злокачественной лимфоидной (клональной) пролиферации в коже. При этом иммуногистохимические исследования биоптата кожи считаются «золотым стандартом» диагностики ГМ, на что указывают клинические рекомендации Европейских стран и России [1, 2, 4].

Анализ результатов иммуногистохимических исследований биоптата кожи в диагностике ГМ проводится на основании оценки позитивности маркеров опухолевых клеток - антигенов кластеров дифференцировки (CD) на поверхности лимфоцитов. При этом врач - патоморфолог, анализирующий иммуногистохимические реакции, использует описательные и качественные приемы оценки выраженности окрашивания маркеров с применением критериев «отрицательная/положительная реакция».

Тем не менее, в литературе встречаются и усовершенствованные методики, направленные на объективизацию способа оценки иммуногистохимических маркеров с использованием критериев и балльной шкалы в зависимости от процента окрашивания опухолевых клеток (полуколичественные методы). Методика с использованием критериев предполагает следующие условные (субъективные) оценки: «0» - отсутствие окрашивания или окрашивание менее 10% опухолевых клеток с любой интенсивностью; «1+» - слабое неполное мембранное окрашивание более 10% опухолевых клеток; «2+» - от слабого до умеренного окрашивания всей цитоплазматической мембраны более 10% опухолевых клеток; «3+» - сильное окрашивание всей цитоплазматической мембраны более 10% опухолевых клеток [5].

Из числа полуколичественных методов оценки ИГХ-маркеров одним из наиболее широко применяемых в онкомаммологии и гинекологии является расчет диагностических баллов по Allred D.C. Данная методика суммарной бальной оценки состоит из двух разделов, где раздел «а» - доля окрашенных опухолевых клеток от 0 до 5 баллов (0 баллов - отсутствие окрашивания; 1 балл - количество окрашенных клеток >0, но меньше 1/100; 2 балла - от >1/100 до 1/10; 3 балла - от >1/10 до 1/3; 4 балла - от >1/3 до 2/3; 5 баллов - от >2/3 до 1); раздел «б» - оценка интенсивности окраски опухолевых клеток (от 0 до 3 баллов). Далее вычисляется суммарный балл, состоящий из доли и интенсивности окраски изучаемых клеток, однако определение процента и интенсивности окрашивания ИГХ-маркеров также продолжает основываться на субъективной оценке исследователя [6, 7].

В отечественной практике Сыдиковым А.А., Заславским Д.В. и соавторами для анализа результатов иммуногистохимических реакций был использован полуколичественный метод, где экспрессия исследуемого маркера расценивалась как слабая «+» при наличии окрашенных гранул в 1-50-ти клетках, умеренная «++» - в 51-100 клетках и резко выраженная «+++» - в 101 и более клетках, в четырех полях зрения, также основанный на субъективной оценке данных врачом-патоморфологом [8].

Известен патент на изобретение, выполненный Поповым Ю.В., Бурыкиной П.Н. и соавторами в 2015 году, где для оценки результатов иммуногистохимических реакций у пациенток с миомой матки был использован 6-бальный полуколичественный метод: отсутствие иммуноокрашенных клеток - 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток - 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток - 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток - 4 балла; и более 40% окрашенных клеток - 6 баллов [9].

Описанные качественные и полуколичественные приемы оценки выраженности окрашивания маркеров не лишены субъективной составляющей врача-патоморфолога, в связи с этим, использование методов количественной оценки результатов иммунофенотипирования клеток позволит объективизировать диагностический процесс, что соотносится с современными критериями доказательной медицины, своевременностью и точностью верификации диагноза.

Наиболее близким по существу к рассматриваемой проблеме является метод количественной оценки пролиферативной активности лимфоцитов в коже больных грибовидным микозом, разработанный Жуковым А.С., Белоусовой И.Э., Хайрутдиновым В.Р. и соавторами, с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из светооптического микроскопа, цифровой камеры и персонального компьютера с интегрированным программным обеспечением «Морфология 5.2» [10].

Указанный метод был использован для оценки пролиферативной активности лимфоцитов в коже у 18 больных ГМ, группу которых составили 9 больных с I стадией, 7 больных - со II стадией и 2 больных - с III стадией заболевания. В каждом случае проводился анализ по 3 полям зрения при увеличении 200, выбранных с учетом наибольшей позитивности исследуемых клеток. Данный метод позволил авторам получить статистически значимые различия в относительной площади экспрессии CD3 и Ki67 клеток в дерме у больных ГМ в зависимости от стадии заболевания (7,16±0,31 и 18,8±0,61 - при ГМ I стадии, 0,39±0,21 и 0,89±0,18 - при ГМ II+III стадии соответственно).

Недостатками указанного метода является следующее:

- в проведенных авторами исследованиях были объединены в одну группу больные со II и III стадиями ГМ, тогда как именно нахождение статистических различий в позитивности лимфоцитов кожи при II и III стадиях развития онкопроцесса имеет принципиальное значение для определения дальнейшей тактики лечения больного и прогноза заболевания;

- в данной работе был использован автоматизированный анализ позитивной окраски лишь двух иммуномаркеров CD3 и Ki67, то есть была проведена оценка только общей популяции всех зрелых Т-лимфоцитов и их пролиферативной активности, тогда как при развитии первичных лимфом кожи патогенетически значимым является изучение дисбаланса между пролиферирующими лимфоцитами и процессами их апоптоза, в чем участвуют CD8 цитотоксические клетки, в том числе с продукцией Granzyme В,

- не были изучены субпопуляции Т-лимфоцитов в дерме, а именно Т-хелперная субпопуляция лимфоцитов (CD4+), соотношение хелперно-индукторной субпопуляции лимфоцитов и супрессорно-цитотоксической (CD4+/CD8+),

- данный метод применим для научного изучения диагностической значимости пролиферативной активности лимфоцитов эпидермиса и дермы у больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом, тогда как дифференциальная диагностика между стадиями ГМ важна в практическом смысле и определяет подходы к терапии и степень ее «агрессивности».

Задачей изобретения является разработка способа определения стадии грибовидного микоза на основании оценки позитивности иммуногистохимических маркеров биоптата кожи.

Технический результат, который будет достигнут от использования данного изобретения, заключается в повышении объективности и точности диагностирования стадии грибовидного микоза.

Технический результат достигается тем, что в способе определения стадии грибовидного микоза, включающем забор у больного биопсии кожи из очага поражения, проведение иммуногистохимических исследований с использованием моноклональных антител CD3 и Ki67, их количественную оценку и установление на этом основании стадии заболевания, для исследований дополнительно используют моноклональное антитело CD4, определяют значения объемных долей позитивного окрашивания моноклональнми антителами CD3, CD4 и Ki67 путем компьютерной морфометрии, затем усредняют данные показатели и рассчитывают суммарную удельную значимость иммунопозитивности данных антител по формуле:

F=1,75*Х1+2,03*Х2+12,81*Х3+0,22,

где: F - суммарная удельная значимость иммунопозитивности моноклональных антител CD3, CD4 и Ki67;

X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3;

Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4;

Х3 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67;

1,75; 2,03; 12,81 и 0,22 - поправочные коэффициенты.

При значении F от 0,220 до 1,535 диагностируют эритематозно-пятнистую стадию, при значении F от 1,536 до 2,888 диагностируют инфильтративно-бляшечную стадию, а при значении F от 2,889 до 4,700 - опухолевую стадию грибовидного микоза.

Сущность изобретения состоит в статистически выверенном и реализованном в формуле подходе к диагностике стадий грибовидного микоза, учитывающем объективизированный вклад каждого из оцениваемых показателей в общую результирующую диагностику.

Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемой совокупности используемых моноклональных антител CD3, CD4 и Ki67 для оценки стадии грибовидного микоза по предлагаемой формуле нами не выявлено, что позволяет сделать выводы о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

В клинике ГБУ СО «УрНИИДВиИ» с целью улучшения процесса диагностики ГМ и объективизации результатов иммуногистохимических исследований были изучены имиджи биоптатов кожи 30 больных ГМ I, II и III стадий. Диагноз ГМ у каждого больного был установлен на основании анамнеза, клинической картины, результатов патоморфологического, иммуногистохимического и морфометрического методов исследования.

Иммунофенотипирование объектов исследования проводили в стандартных условиях на аппарате для иммуногистохимии Bond-maX LEICA (Германия) с использованием парафиновых срезов толщиной 4 мкм.

Патоморфологические и морфометрические исследования выполнены с использованием аппаратно-программного комплекса, состоящего из светового микроскопа для медико-биологических исследований Axio Imager М2, цифровой камеры AxioCam MRc 5 и специальной программы ZEN 2012 для ввода изображений, проведения измерений и документирования (ZEISS, Германия). Также в составе данного комплекса использованы персональный компьютер Intel Core i5-3570 3.4 GHz и автоматизированная система анализа изображений «SIAMS Photolab» (Россия, свидетельство об утверждении типа средства измерений RU.C.31.058.A №40862 от 28.07.2015 г., срок действия до 28.07.2020 г.).

Обработка изображений в системе «SIAMS Photolab» производится в цепочке взаимосвязанных ячеек, содержащих исходный имидж, результаты промежуточных этапов обработки, конечное обработанное изображение и результаты измерений в виде чисел, графиков и гистограмм. В системе предусмотрена генерация отчетов формата MS Word и экспорт изображений, числовых и текстовых данных в наиболее распространенные форматы.

Использование модуля колорометрической оценки результатов иммуногистохимических реакций системы анализа изображений «SIAMS Photolab» позволило получить квантифицированную оценку площади иммунопозитивности маркеров и объективизировать процесс диагностики ГМ.

В дерме больных ГМ на стандартной площади срезов кожи нами изучены параметры позитивности моноклональных антител (МКА) CD3, CD4, CD8, Ki67 и Granzyme В. Для данных исследований использованы по 5 имиджей в каждом наблюдении.

Результаты исследований поясняются следующими фигурами, где:

на фиг. 1 показаны исходные оцифрованные изображения биоптата кожи больного ГМ с наличием позитивного окрашивания CD3, CD4 и CD8 МКА;

на фиг. 2 - изображения иммунофенотипирования биоптата кожи больного ГМ после автоматизированной компьютерной обработки с точным выделением объектов;

на фиг. 3 - распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD3 у всех групп больных;

на фиг. 4 - распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD4 у всех групп больных;

на фиг. 5 - распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера Ki67 у всех групп больных;

на фиг. 6 - пятна на коже левой подмышечной области;

на фиг. 7 - пятна и бляшки на коже туловища;

на фиг. 8 - пятна, бляшки и единичные опухоли на коже.

Примеры исходных оцифрованных изображений биоптата кожи больного ГМ с наличием позитивного окрашивания CD3, CD4 и CD8 МКА (выявляются активированные Т-лимфоциты (коричневый цвет) в дерме, увеличение 400) представлены на фиг. 1.

Обработка оцифрованных изображений иммуногистохимических реакций у больных ГМ в системе анализа изображений «SIAMS Photolab» проводилась в несколько этапов: 1 - предобработка и первичное выделение маски, 2 - разделение масок, 3 - пороговая сегментация, 4 - измерение исследуемых объектов.

На завершающем этапе обработки изображений предусматривалось их контрастирование и более точное выделение определенным цветом измеряемых иммунопозитивных объектов с помощью функции пороговой сегментации (выделены активированные CD3, CD4 и CD8 Т-лимфоциты (зеленый цвет) в дерме, увеличение 400, фиг. 2).

В результате автоматизированных измерений выделенных на изображениях объектов по каждому из 5 исследуемых имиджей определялись следующие параметры (в мкм²):

1. Проанализированная площадь гистологического среза кожи.

2. Занимаемая площадь позитивного окрашивания иммуномаркером.

3. Объемная доля позитивного окрашивания иммуномаркером.

На основании обработки 5 имиджей формируется заключительный отчет по выполненному исследованию, содержащий гистограмму распределения объемных долей и таблицу формата MS Word с включением следующих данных:

1. Число проанализированных полей.

2. Проанализированная площадь гистологического среза кожи (мкм²).

3. Занимаемая площадь позитивного окрашивания иммуномаркером (мкм²).

4. Объемная доля позитивного окрашивания иммуномаркером.

5. Средняя объемная доля позитивного окрашивания иммуномаркером.

6. Среднеквадратичное отклонение объемной доли позитивного окрашивания иммуномаркером.

Предварительный анализ данных показал значительную вариабельность площади позитивной окраски иммуномаркерами в дерме у больных при стадийном развитии ГМ.

Для построения модели определения стадии заболевания исходными данными являлись значения площади позитивной окраски иммуномаркерами в дерме у больных ГМ. На основании фактических данных, полученных в результате заполнения стандартизованных карт, была создана электронная база данных в формате таблиц программы Microsoft Excel.

Дальнейшая разработка модели определения стадии ГМ осуществлялась в несколько этапов.

На первом этапе методом вероятностного анализа было проведено выявление нетипичных представителей для каждой из групп исследуемых больных ГМ, присутствие которых в выборке могло существенным образом исказить результаты анализа [11].

Произведен пересчет полученных фактических данных площади позитивной окраски иммуномаркерами в дерме у больных ГМ в безразмерные величины (доля площади иммуномаркеров x_i). Для этого находилось отношение площади иммуномаркера S_им данного вида к общей площади среза S_ср по формуле: x_i=S_им/S_ср.

Далее определяли основные статистические характеристики значений доли площади иммуномаркеров: среднее значение , среднеквадратичное отклонение (СКО) S_x, ошибка выборки данных Δx для одного больного и одного иммуномаркера. Расчет производится по стандартным формулам статистической математики:

, , Δx=t⋅S_x,

где: x_i - доля площади иммуномаркера в выборке данных данного пациента с определенной стадией заболевания, N - количество срезов одного иммуномаркера у данного пациента, t - коэффициент Стьюдента.

Вычисления проводились при уровне значимости р=0,001 и р=0,01.

При обобщении полученных данных таблицы 1 было отмечено, что изучение иммуноморфологических характеристик клеток дермального инфильтрата в биоптате кожи у больных ГМ продемонстрировало закономерные изменения их популяционного состава в динамике прогрессирования заболевания. Как видно из представленной таблицы 1, в группе больных с III (опухолевой) стадией ГМ наблюдалось достоверное увеличение количества всех зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) и Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов (CD4+), хелперно-индукторной субпопуляции лимфоцитов над супрессорно-цитотоксической (CD4+/CD8+) при сопоставлении с аналогичными показателями дермального инфильтрата у больных I (пятнисто-эритематозной) и II (инфильтративно-бляшечной) стадиями заболевания. Кроме этого, было обнаружено, что у больных ГМ в III стадии показатель объемной доли позитивности Ki67 (0,083±0,030), отражающий факт высокой пролиферативной активности исследованных клеток дермального инфильтрата, в 4,8 и в 1,9 раз соответственно, также превышал аналогичные показатели у больных в I и во II стадии заболевания. В исследуемых группах больных отмечалась недостоверная тенденция к увеличению объемной доли позитивности экспрессии Granzyme В+ на клетках инфильтрата и к снижению количества Т-цитотоксической субпопуляции лимфоцитов (CD8+) при развитии последующих стадий заболевания.

На втором этапе нами был проведен расчет коэффициентов корреляций изучаемых клинико-лабораторных показателей у всех больных ГМ для выявления разнонаправленных векторов у пациентов, входящих в одну группу. Были выявлены разнонаправленные векторы значений площади позитивного окрашивания иммуномаркерами у больных ГМ (таблица 2).

В соответствии с данными таблицы 2, у больных ГМ обнаружены сильные положительные корреляционные параллели между количеством CD3 и CD4, CD3 и Ki67, CD4 и Ki67. Согласно методам статистической математики обнаружена линейная зависимость между CD4 и Ki67. Обратную зависимость демонстрировали показатели CD3 и CD8, CD4 и CD8, Ki67 и CD8, Granzyme В и CD8. Количество Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов (CD4) и показатель пролиферативной активности исследованных клеток дермального инфильтрата (Ki67) не имели существенной корреляционной связи с маркером апоптоза (Granzyme В).

Методами нелинейной динамики [12, 13] определялись пороговые значения объемной доли позитивности ИГХ маркеров биоптата кожи у больных ГМ в зависимости от стадии заболевания (таблица 3).

На третьем этапе все отобранные информативные признаки приняли участие в выработке «решающих правил» диагностики. При помощи процедуры пошагового отбора переменных удалось снизить размерность «решающего правила» при сохранении максимальной правильности распознавания образов. Согласно таблицам 2 и 3 выделены три базисных показателя (CD3, CD4 и Ki67), которые максимально характеризуют векторную динамику стадийного развития заболевания.

Методом наименьших квадратов с учетом пороговых значений показателей были построены линейные функции F от объемной доли позитивной окраски иммуномаркерами CD3, CD4 и Ki67 у больных ГМ (фиг. 3-5).

На фиг. 3. показано распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD3 у всех групп больных (точками обозначены данные по CD3 из таблицы 1).

На фиг. 4 показано распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера CD4 у всех групп больных (точками обозначены данные по CD4 из таблицы 1).

На фиг. 5 показано распределение значений функции F от значений доли позитивной окраски иммуномаркера Ki67 у всех групп больных (точками обозначены данные по Ki67 из таблицы 1).

Регрессионным анализом и методом наименьших квадратов с учетом пороговых значений показателей была построена результирующая линейная функция F от объемной доли позитивной окраски иммуномаркерами (моноклональными антителами) CD3, CD4 и Ki67 у больных ГМ для определения стадии заболевания:

F=1,75*Х1+2,03*Х2+12,81*Х3+0,22,

где

F - суммарная удельная значимость иммунопозитивности указанных моноклональных антител;

X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3,

Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4,

Х3 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67,

1,75; 2,03; 12,81 и 0,22 - поправочные коэффициенты.

Поправочные коэффициенты удельной значимости перед переменными X1, Х2 и Х3 и коэффициент 0,22 в функции F были подобраны экспериментальным путем.

В результате для каждой стадии ГМ были получены следующие значения функции F:

ГМ I (эритематозно-пятнистая стадия): 0,220≤F≤1,535;

ГМ II (инфильтративно-бляшечная стадия): 1,536≤F≤2,888;

ГМ III (опухолевая стадия): 2,889≤F≤4,700.

Данные значения интервалов были получены с уровнем значимости р<0,05.

Способ осуществляется следующим образом:

1. После подписания больным информированного согласия на исследование проводится инцизионная биопсия кожи на участке с наиболее выраженными клиническими проявлениями дерматоза.

2. По стандартным методикам изготавливаются парафиновые блоки и гистопрепараты кожи, выполняется ИФТ с использованием панели МКА, рекомендованной для диагностики ГМ [1].

3. Выполняется оцифровка изображений и отбор 5 имиджей для количественных исследований по критерию максимального содержания в них иммунопозитивных лимфоцитов.

4. Проводится автоматизированная обработка каждого из 5 исследуемых изображений в системе «SIAMS Photolab» с вычислением значений средних объемных долей позитивного окрашивания моноклональных антител CD3, CD4 и Ki67.

5. Для определения стадии ГМ у больного рассчитывается суммарная удельная значимость и значение каждого из исследуемых иммуномаркеров, подставив в уравнение значения соответствующих признаков по формуле:

F=1,75*Х1+2,03*Х2+12,81*Х3+0,22,

где X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3, Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4, Х3 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67.

6. Сравнив между собой полученное значение переменной F у конкретного больного и пороговые значения обучающей выборки, делается заключение о наличии у больного соответствующей стадии ГМ.

Клинико-диагностическая апробация заявленного способа определения стадии ГМ:

Описываемый способ определения стадии ГМ нами был применен в клинике ГБУ СО «УрНИИДВиИ» у 30 больных. В таблице 4 приведены данные сопоставления правильности определения стадии заболевания у больных ГМ заявленным способом с экспертной оценкой и патоморфологической верификацией.

Как следует из представленной таблицы 4, совпадение результатов проведенных тестов на обучающей выборке с экспертной оценкой и патоморфологической верификацией диагноза у больных свидетельствует о специфичности разработанного нами способа определения стадии ГМ.

Достоверность подобного разделения больных ГМ на стадии заболевания составила в среднем 94,58%, причем наибольшая достоверность была зафиксирована у больных с опухолевой стадией, наименьшая - в начальной стадии заболевания.

В качестве иллюстрации применения способа определения стадии ГМ у больных приводим собственные клинические наблюдения.

Больная З., 1959 года рождения, поступила в отделение хронических дерматозов ГБУ СО «УрНИИДВиИ» с жалобами на распространенные пятна и бляшки на коже верхних конечностей, груди, живота и спины, сопровождающиеся периодическим зудом, покалыванием, стягиванием и шелушением кожи.

Считает себя больной в течение 10-11 лет, когда без видимой причины на коже левой подмышечной области, груди и паховой области появились единичные пятна, без зуда и шелушения. На протяжении последующих нескольких лет на фоне инсоляции в летний период года отмечала исчезновение пятен на коже, и только в 2012 г. при появлении кожного зуда и увеличении размеров и цвета очагов поражения кожи пациентка была вынуждена впервые обратиться к дерматовенерологу. За период с 2012 по 2015 гг. с целью верификации диагноза дважды проводились диагностические биопсии кожи, больная ежегодно находилась на стационарном лечении с диагнозом парапсориаз, где ей назначались Н1-антигистаминные средства, десенсибилизирующая терапия, селективное УФО, ПУВА-ванны с 0,3% р-ром аммифурина, наружно - топические глюкокортикостероиды. В результате проводимой терапии достигались умеренные периоды клинической ремиссии.

За предыдущие 6-7 месяцев отметила ухудшение течения заболевания - усиление кожного зуда и появление новых пятен, в связи с чем была госпитализирована в отделение хронических дерматозов ГБУ СО «УрНИИДВиИ».

Анамнез жизни, аллергоанамнез и профессиональный маршрут у больной без особенностей. Наследственность по кожным заболеваниям и онкопатологии не отягощена.

Объективно: больная среднего роста, правильного телосложения, удовлетворительного питания. В легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. Тоны сердца ясные, ритмичные, АД 120/80 мм рт.ст., ЧСС 76 в минуту. Живот мягкий, безболезненный при пальпации, печень и селезенка не увеличены. Лимфатические узлы мягкие, безболезненные и подвижные при пальпации. Физиологические отправления в норме.

Локальный статус: непораженные участки кожных покровов физиологической окраски, нормальной влажности и тургора. Видимые слизистые влажные, физиологической окраски. Кожный процесс имеет распространенный и симметричный характер, поражены боковые поверхности шеи, грудь, плечи, подмышечные области, предплечья и боковые поверхности живота. Представлен буровато-розовыми пятнами, диаметром до 5,5 см, с четкими границами и шероховатой поверхностью. На коже живота и подмышечных областей присутствуют единичные пятна буроватого цвета, диаметром до 3,5 см, с умеренной инфильтацией и незначительным шелушением в центральной части. На поверхности пятен отсутствует рост волос, имеются единичные экскориации с точечными геморрагическими корочками, дермографизм белый (фиг. 6).

Лабораторные данные. Общий анализ крови: Hb - 130 г/л, эр. - 4,2×10¹²/л, лейк. - 5,1×10⁹/л, нейтр. - 2,9×10⁹/л, эоз. - 0,1×10⁹/л, лимф. - 1,7×10⁹/л, мон. - 0,4×10⁹/л, СОЭ - 10 мм/ч. В общем анализе мочи и биохимической гепатограмме отклонений не выявлено. Комплекс серологических реакций к Treponema pallidum отрицательный. Антитела к ВИЧ, гепатитам В и С не обнаружены.

Проведенное гистологическое исследование биоптата кожи выявило наличие в верхних отделах дермы умеренно выраженного очагового лимфоцитарного инфильтрата с признаками эпидермотропизма.

Иммуногистохимические препараты кожи больной нами были подвергнуты автоматизированной морфометрии с использованием компьютерной программы «SIAMS-Photolab», вычисленные показатели составили: среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3=0,21188, среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4=0,1014447, среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67=0,02525.

Для определения стадии ГМ указанным способом в уравнение были подставлены значения соответствующих признаков:

F=1,75*0,21188+2,03*0,1014447+12,81*0,02525+0,22

При сравнении с обучающей выборкой полученное значение F=1,13246 у данной больной имело числовые параметры, характерные для I стадии ГМ (0,220≤F≤1,535). На основании результатов патоморфологического, иммуногистохимического исследования биоптата кожи с использованием способа определения стадии заболевания у больной был установлен диагноз: первичная кожная лимфома: грибовидный микоз, эритематозно-пятнистая стадия.

Больной Р., 1980 г. рождения, поступил в клинику ГБУ СО «УрНИИДВиИ» для уточнения диагноза. Болен в течение 6 лет, когда впервые заметил появление пятна на коже левой лопаточной области. Сезонности обострений не отмечал, наблюдал усиление окраски пятна и появление кратковременного зуда на фоне инсоляции. При появлении пятен на других участках кожного покрова в ноябре 2014 г. впервые обратился к дерматологу по месту жительства. Лечение у дерматолога с диагнозом парапсориаз? и использованием Н1-антигистаминных препаратов, топических глюкокортикостероидов давало лишь кратковременный эффект.

За предыдущие 2-3 месяца отметил прогрессирование заболевания, усиление окраски пятен и появление новых элементов на коже, сопровождающихся интенсивным зудом.

Анамнез жизни, аллергоанамнез и профессиональный маршрут у больного без особенностей. Наследственность по кожным заболеваниям и онкопатологии не отягощена. При общем осмотре патологических отклонений по системам и органам не выявлено. Лимфатические узлы мягкие, безболезненные и подвижные при пальпации. Физиологические отправления в норме.

Локальный статус: кожный процесс имеет распространенный характер. На коже левой лопаточной области, левой половины груди, левой подмышечной области и правого бедра присутствуют буровато-розовые пятна и умеренно инфильтрированные бляшки диаметром до 7 см, овальной формы, с четкими границами и шероховатой поверхностью. На поверхности пятен и бляшек отсутствует рост волос, имеются экскориации с геморрагическими корочками, дермографизм белый (фиг 7).

Лабораторные данные. Общий анализ крови: Hb - 156 г/л, эр. - 5,16×10¹²/л, лейк. - 7,6×10⁹/л, нейтр. - 5,4×10⁹/л, эоз. - 0,3×10⁹/л, лимф. - 1,5×10⁹/л, мон. - 0,3×10⁹/л, СОЭ - 2 мм/ч. В общем анализе мочи и иммунограмме отклонений не выявлено. В биохимической гепатограмме - повышение общего билирубина до 23,0 мкмоль/л. Комплекс серологических реакций к Treponema pallidum отрицательный. Антитела к ВИЧ, гепатитам В и С не обнаружены.

Патоморфологическое исследование биоптата кожи больного: в верхних отделах дермы присутствует неравномерно выраженный, диффузно-очаговый, эпидермотропный инфильтрат из лимфоидных клеток малого и среднего размера, местами «размывающий» дермо-эпидермальную границу с формированием в эпидермисе небольших скоплений типа микроабсцессов Потрие.

Иммуногистохимическое исследование биоптата кожи больного: опухолевые клетки экспрессируют CD3, CD4 и CD8; В-лимфоциты (CD20) в виде единичных скоплений среди опухолевых клеток; определяются единичные Т-лимфоциты, экспрессирующие CD7, CD8 и Granzyme В.

Иммуногистохимические препараты биоптата кожи больного были подвергнуты морфометрии с использованием компьютерной программы «SIAMS-Photolab», вычисленные показатели составили: среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3=0,51, среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4=0,131, среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67=0,059437.

Для определения у данного больного стадии ГМ указанным способом в уравнение были подставлены значения соответствующих признаков:

F=1,75*0,51+2,03*0,131+12,81*0,059437+0,22

При сравнении с обучающей выборкой полученное значение F=2,13981 у данного больного имело числовые параметры, характерные для II стадии ГМ (1,536≤F≤2,888).

На основании данных гистологического и иммуногистохимического методов исследования биоптата кожи и результатов, полученных заявленным способом, больному был установлен диагноз: первичная лимфома кожи, грибовидный микоз, инфильтративно-бляшечная стадия.

Больной В., 1955 г. рождения, поступил в клинику ГБУ СО «УрНИИДВиИ» с жалобами на распространенные высыпания на коже туловища и верхних конечностей, сопровождающиеся периодическим интенсивным зудом, шелушением и стягиванием кожи. Болеет в течение 4 лет, когда впервые возникло пятно на коже тыльной поверхности правой кисти. В течение последующих нескольких месяцев обратил внимание на появление аналогичных пятен на коже туловища. Наблюдался у дерматовенеролога по месту жительства (г. Тюмень) с диагнозом крупнобляшечный парапсориаз, на фоне наружного применения топических глюкокортикостероидов отмечалось кратковременное улучшение.

Анамнез жизни, аллергоанамнез и профессиональный маршрут у больного без особенностей. Наследственность по кожным заболеваниям и онкопатологии не отягощена. При общем осмотре патологических отклонений по системам и органам не выявлено. Лимфатические узлы мягкие, безболезненные и подвижные при пальпации. Физиологические отправления в норме.

Локальный статус: непораженные участки кожных покровов физиологической окраски, нормальной влажности и тургора. Видимые слизистые влажные, физиологической окраски. Кожный процесс имеет распространенный характер, поражены - грудь, живот, поясничная область, плечи, предплечья и тыльные поверхности кистей, представлен пятнами, бляшками и единичными опухолевыми элементами. На коже груди, живота, предплечий и поясничной области имеются многочисленные пятна розового и бледно-красного цвета, диаметром до 8-9 см, с четкими границами, без шелушения и экскориаций. На коже правой подлопаточной области, разгибательной поверхности левого предплечья и поясничной области присутствуют округлые бляшки, кирпично-красного цвета, диаметром до 7 см, с точечными геморрагическими корочками в местах экскориаций. На поверхности пятен и бляшек отсутствует рост волос, имеются единичные трещинки в местах физиологических складок кожи, незначительное мелкопластинчатое шелушение. На коже правой подмышечной области отмечены 2 опухолевидных элемента, округлой формы, диаметром 0,8 см и 1,5 см, ярко-красного цвета, с гладкой поверхностью, дермографизм белый (фиг. 8).

Лабораторные данные. Общий анализ крови: Hb - 137 г/л, эр. - 4,89×10¹²/л, лейк. - 5,1×10⁹/л, нейтр. - 2,8×10⁹/л, эоз. - 0,4×10⁹/л, лимф. - 1,3×10⁹/л, мон. - 0,5×10⁹/л, СОЭ - 4 мм/ч. В общем анализе мочи и иммунограмме отклонений не выявлено. В биохимической гепатограмме - повышение холестерина до 5,77 ммоль/л. Комплекс серологических реакций к Treponema pallidum отрицательный. Антитела к ВИЧ, гепатитам В и С не обнаружены.

Патоморфологическое исследование биоптата кожи больного: в верхних и средних отделах дермы присутствует плотный, полосовидный, эпидермотропный инфильтрат из лимфоидных клеток разных размеров, «размывающий» дермо-эпидермальную границу и проникающий в эпидермис, в котором прослеживается очаговая деструкция. Определяются множественные микроабсцессы Потрие. Митотическая активность достаточно высокая.

Иммуногистохимические препараты биоптата кожи больного были подвергнуты морфометрии с использованием компьютерной программы «SIAMS-Photolab», вычисленные показатели составили: среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3=0,713, среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4=0,581, среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67=0,0487.

Для определения у данного больного стадии ГМ указанным способом в уравнение были подставлены значения соответствующих признаков:

F=1,75*0,781+2,03*0,476+12,81*0,117+0,22

При сравнении с обучающей выборкой полученное значение F=4,05 у данного больного имело числовые параметры, характерные для III стадии ГМ (2,889≤F≤4,700).

На основании результатов патоморфологического, иммуногистохимического и морфометрического методов исследования биоптата кожи и данных, полученных заявленным способом, больному В. был установлен диагноз: первичная лимфома кожи, грибовидный микоз, опухолевая стадия.

Использованная литература

1. Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем. - 5-е изд., перераб. и доп. - М. Деловой экспресс, 2016. - 768 с.

2. Малишевская Н.П., Кохан М.М., Соколова А.В., Куклин И.А. и соавт. Дерматоонкология (злокачественные новообразования кожи, первичные лимфомы кожи): Атлас / Под общ. ред. Н.В. Кунгурова. - Екатеринбург: Изд-во Урал. Ун-та, 2016. - 168 с.

3. Вольф К., Голдсмит Л.А., Кац С.И. Дерматология Фицпатрика в клинической практике. Пер. с англ. М.: Изд. Панфилова. БИНОМ; 2012.-Т. 2. - С. 1514-1531.

4. Willemze R. Primary cutaneous lymphoma: ESMO Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and follow-up / R. Willemze, M. Dreyling // Annals of Oncology. - 2009. - Vol. 20. - P. 115-118.

5. Сафонова Г.Д. Оптимизация диагностики и перспективы патогенетических исследований первичных лимфом кожи (обзор литературы) / Г.Д. Сафонова, М.М. Кохан, Н.В. Зильберберг, О.Г. Римар, И.А. Куклин // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014. - №12. - С. 264-268.

6. Qureshi A. Allred scoring for ER reporting and it's impact in clearly distinguishing ER negative from ER positive breast cancers / A. Qureshi, S. Pervez // Journal Pakistan Medical Association. - 2010. - Vol. 60 (5). - P. 350-353.

7. Allred D.C. Assessment of prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemistry // Connection. - 2005. - Vol. 9. - P. 4-5.

8. Сыдиков А.А. Иммуногистохимические критерии диагностики мелкобляшечного парапсориаза, крупнобляшечного парапсориаза и грибовидного микоза / А.А. Сыдиков, Д.В. Заславский, B.C. Зайцев, Р.А. Насыров // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - №6. - С. 568-575.

9. https://findpatent.ru/patent/255/2553340.html.

10. Жуков А.С. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов при грибовидном микозе и бляшечном псориазе / Жуков А.С., Белоусова И.Э., Хайрутдинов В.Р. и соавт.// Вестник дерматологии и венерологии. - 2014. - №1. - С. 30-36.

11. Арнольд В.И. Математические методы классической механики. - 5-е изд., стереот. - М.: Едиториал УРСС, 2003. - 416 с.

12. Самарский А.А., Курдюмов С.П., Ахромеева Т.С., Малинецкий Г.Г. // Информатика и научно-технический прогресс.- М.: Наука, 1987. - С. 69-91.

13. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. // Математическая статистика в клинических исследованиях. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - 256 с.

Способ определения стадии грибовидного микоза, включающий проведение у больного биопсии кожи из очага поражения, проведение иммуногистохимических исследований с использованием моноклональных антител CD3 и Ki67, их количественную оценку и установление на этом основании стадии заболевания, отличающийся тем, что для исследований дополнительно используют моноклональное антитело CD4, определяют значения объемных долей позитивного окрашивания моноклональными антителами CD3, CD4 и Ki67 путем компьютерной морфометрии, затем усредняют данные показатели и рассчитывают суммарную удельную значимость иммунопозитивности указанных моноклональных антител по формуле:

F=1,75*Х1+2,03*Х2+12,81*Х3+0,22,

где: F - суммарная удельная значимость иммунопозитивности моноклональных антител CD3, CD4 и Ki67;

X1 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD3;

Х2 - среднее значение объемной доли позитивной окраски CD4;

Х3 - среднее значение объемной доли позитивной окраски Ki67;

1,7; 2,03; 12,81 и 0,22 - поправочные коэффициенты,

и при значении F от 0,220 до 1,535 диагностируют эритематозно-пятнистую стадию, при значении F от 1,536 до 2,888 диагностируют инфильтративно-бляшечную стадию, а при значении F от 2,889 до 4,700 - опухолевую стадию грибовидного микоза.