Способы и средство модификации растительного генома в нуклеотидной последовательности, широко используемой в геномной инженерии растений

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу введения молекулы чужеродной ДНК в предварительно определенный сайт в геноме трансгенной растительной клетки путем индукции разрыва двухцепочечной ДНК посредством введения не встречающейся в природе одноцепочечной мегануклеазы или пары не встречающихся в природе мегануклеаз, а также к применению вышеуказанного способа для получения клетки растения или для получения растения. Также раскрыто применение не встречающейся в природе мегануклеазы или пары не встречающейся в природе мегануклеаз для введения разрыва двухцепочечной ДНК в кодирующую область bar в геноме трансгенной растительной клетки. Изобретение позволяет эффективно вводить молекулу чужеродной ДНК в геном растительной клетки. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 5 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к области агрономии. Более конкретно, изобретение предоставляет способы и средство для введения намеченной модификации, включая вставку, делецию или замену, в точно локализованную нуклеотидную последовательность в геноме трансгенного растения, в котором нуклеотидная последовательность содержится внутри элемента или фрагмента ДНК, часто используемого в трансгенезе растения, такого как широко используемый селектируемый маркерный ген. Модификации запускают на первой стадии посредством индуцирования двухцепочечного разрыва в нуклеотидной последовательности узнавания, используя мегануклеазы, происходящие от встречающихся в природе мегануклеаз, которые были переконструированы для распознавания сайта узнавания и его расщепления.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Необходимость для введения намеченных модификаций в растительные геномы, включая управление положением интеграции чужеродной ДНК в растениях, становится все более и более важной, и для удовлетворения данной потребности было разработано несколько способов (для обзора см. Kumar and Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, pp. 155-159). Данные способы большей частью основываются на первоначальном введении разрыва двухцепочечной ДНК в намеченную область.

Активация намеченного локуса и/или репарированной или донорской ДНК посредством индукции разрывов двухцепочечной ДНК с помощью редко расщепляющих эндонуклеаз, таких как I-SceI., как было показано, увеличивает частоту гомологичной рекомбинации на несколько порядков величины. (Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, pp5055-5060; Chilton and Que, Plant Physiol, 2003; D'Halluin et al. 2008 Plant Biotechnol. J. 6, 93-102).

WO 96/14408 описывает изолированную ДНК, кодирующую фермент I-SceI. Данная последовательность ДНК может быть инкорпорирована в векторы клонирования и экспрессии, трансформированные клеточные линии и трансгенные животные. Векторы являются пригодными в генном картировании и сайт-направленной вставке генов.

WO 00/46386 описывает способы модифицирования, репарации, аттенуирования и инактивирования гена или другой хромосомной ДНК в клетке посредством I-SceI-индуцированного разрыва двойной цепи. Также раскрыты способы лечения или профилактики генетического заболевания у нуждающегося в этом индивида. Дополнительно раскрыты химерные эндонуклеазы рестрикции.

В дополнение, описаны способы, которые предоставляют возможность конструирования редко расщепляющих эндонуклеаз для изменения специфичности ферментов к субстрату или последовательности, обеспечивая таким образом индуцирование двухцепочечного разрыва в интересующем локусе вне зависимости от наличия сайта узнавания для какой-либо из природных редко расщепляющих эндонуклеаз. Кратко, химерные ферменты рестрикции могут быть получены с использованием гибридов между доменом «цинковые пальцы», сконструированным для узнавания специфической нуклеотидной последовательности, и доменом расщепления неспецифической ДНК из природного фермента рестрикции, такого как Fokl. Подобные способы описаны, например, в WO 03/080809, WO 94/18313 или WO 95/09233 и у Isalan et al. 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). Еще один путь получения специально сконструированных мегануклеаз, посредством отбора из библиотеки вариантов, описан в WO 2004/067736. Специально сконструированные мегануклеазы или переконструированные мегануклеазы с измененной специфичностью последовательностей и афинностью связывания ДНК также могут быть получены посредством рационального конструирования, как описано в WO 2007/047859.

WO 2007/049095 описывает "LADGLIDADG" варианты хоуминг-эндонуклеазы, имеющие мутации в двух отдельных субдоменах, каждый из которых связывает определенную часть намеченного полусайта модифицированной ДНК таким образом, чтобы вариант эндонуклеазы был способен к расщеплению намеченной последовательности химерной ДНК, содержащей нуклеотиды, связанные каждым субдоменом.

WO 2007/049156 и WO 2007/093836 описывают варианты хоуминг-эндонуклеазы I-CreI, имеющие новую специфичность расщепления и их применение.

WO 2007/047859 описывает рационально сконструированные мегануклеазы с измененной специфичностью последовательностей и афинностью связывания ДНК.

WO 2006/105946 описывает способ точного обмена в растительных клетках и растениях намеченной последовательности ДНК для интересующей последовательности ДНК с помощью гомологичной рекомбинации, посредством которой селектируемый или скринируемый маркер, используемый во время фазы гомологичной рекомбинации для временного отбора явлений замены гена, может впоследствии быть удален без оставления следа и без обращения к культуре in vitro в процессе стадии удаления, применение описанного в нем способа для удаления выбранной ДНК посредством специфической для микроспор экспрессии двухцепочечного разрыва, индуцирующего редко расщепляющую эндонуклеазу.

Предварительная патентная заявка США 60/828042 и европейская патентная заявка 06020370.0 и WO 2008/037436 описывают варианты способов и средство WO 2006/105946, в котором стадия удаления выбранного фрагмента ДНК, индуцированная двухцепочечным разрывом, индуцирующим редко расщепляющую эндонуклеазу, находится под управлением гамет-специфического промотора. Другие варианты осуществления способа опираются на негомологичное соединение концов на одном конце репаративной ДНК и гомологичную рекомбинацию на другом конце.

Gao et al. 2009, The Plant Journal, pp. 1-11 описывают наследственный намеченный мутагенез у кукурузы с использованием переконструированной эндонуклеазы.

Поскольку переконструированные мегануклеазы происходят от встречающихся в природе эндонуклеаз, доступные потенциальные сайты узнавания не являются совсем случайными, но, по-видимому, имеют некоторую степень сходства с нуклеотидной последовательностью первоначально распознанной встречающейся в природе эндонуклеазой, на которой основана переконструированная мегануклеаза. Как установлено Gao et al., 2009 (supra) основанный на структуре способ конструирования белков для модифицирования ДНК-связывающих характеристик I-CreI основан на визуальном наблюдении за ко-кристаллической структурой I-CreI-ДНК, приводя к прогнозу большого количества аминокислотных подмен, которые изменяют основное преимущество I-CreI в конкретных позициях в его сайте узнавания. Экспериментально оценивали замещения отдельных аминокислот, и те, которые давали необходимое изменение основного преимущества, добавляли в базу данных мутаций, которые могут быть "смешаны и совмещены" для создания производных I-CreI, которые распознают высокодивергентные сайты ДНК. В теории, комбинационное разнообразие, способное к использованию текущей базы данных мутаций, является достаточным для того, чтобы устанавливать сконструированную эндонуклеазу приблизительно каждые 1000 т.н. в произвольной последовательности ДНК.

Соответственно, все еще остается необходимость в функциональных переконструированных мегануклеазах, которые могут распознавать сайт узнавания в элементе или области ДНК, предварительно введенной в трансгенное растение в качестве широко используемой части трансгена, и с достаточной эффективностью индуцировать разрыв двухцепочечной ДНК в данной области, запуская посредством этого события, требуемые, например, для вставки чужеродной ДНК, делеции или замены гомологичной рекомбинацией или негомологичным соединением концов в сайте двухцепочечного разрыва. Идентификация подобной пары сайта узнавания и переконструированной мегануклеазы, усовершенствует доступные инструменты для модифицирования растительного генома намеченным образом, за счет предоставления возможности вставки, делеции или замены ДНК вблизи от индуцированного разрыва двухцепочечной ДНК в месте ранее интродуцированного трансгена, без необходимости обращения к наличию исторически интродуцированных сайтов узнавания для редко расщепляющих эндонуклеаз, таких как, например, I-SceI (которая не встречается в природе в растительных клетках).

Данные и другие проблемы решены, как описано далее в различных подробных вариантах осуществления изобретения, а также в формуле изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен способ введения молекулы чужеродной ДНК в предварительно определенный сайт в геноме клетки трансгенного растения, включающий стадии:

a. индуцирования разрыва двухцепочечной ДНК в предварительно определенном сайте;

b. введения молекулы чужеродной ДНК в растительную клетку;

c. отбора растительной клетки, в которой чужеродная ДНК введена в предварительно определенный сайт; и

d. необязательно регенерации растительной клетки в растение,

отличающийся тем, что предварительно определенный сайт представляет собой нуклеотидную последовательность, отличающуюся от сайта узнавания для встречающейся в природе мегануклеазы и что предварительно определенный сайт представляет собой нуклеотидную последовательность, обычно вводимую в виде части трансгена в трансгенное растение, и при этом разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения не встречающейся в природе одноцепочечной мегануклеазы или пары не встречающихся в природе мегануклеаз, которая узнает или совместно узнают предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют двухцепочечный разрыв.

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ введения молекулы чужеродной ДНК в предварительно определенный сайт в геноме растительной клетки, включающий стадии:

a. индуцирования разрыва двухцепочечной ДНК в предварительно определенном сайте;

b. введения молекулы чужеродной ДНК в растительную клетку;

c. отбора растительной клетки, в которой чужеродная ДНК введена в предварительно определенный сайт; и

d. необязательно регенерации растительной клетки в растение,

отличающийся тем, что предварительно определенный сайт содержится внутри фосфинотрицинацетилтрансферазы, кодирующей область из S. hygroscopicus (кодирующую область bar), которая может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, и что разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения одноцепочечной мегануклеазы или пары мегануклеаз, которая узнает или совместно узнают предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют двухцепочечный разрыв. Предварительно определенный сайт может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

В еще одном варианте осуществления, предоставлен способ введения молекулы чужеродной ДНК в предварительно определенный сайт в геноме растительной клетки, включающий стадии:

a. индуцирования разрыва двухцепочечной ДНК в предварительно определенном сайте;

b. введения молекулы чужеродной ДНК в растительную клетку;

c. отбора растительной клетки, в которой чужеродная ДНК введена в предварительно определенный сайт;

d. необязательно регенерации растительной клетки в растение,

отличающийся тем, что предварительно определенный сайт содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и что разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения одноцепочечной мегануклеазы или пары мегануклеаз, которая узнает или совместно узнают предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют двухцепочечный разрыв, например, мегануклеаза или пара мегануклеаз происходит/происходят из I-CreI (представленной SEQ ID NO: 16), и при этом следующие аминокислоты находятся в одной из субъединиц: - S в позиции 32; Y в позиции 33; E в позиции 38; R в позиции 40; K в позиции 66; Q в позиции 80; T в позиции 42; R в позиции 77; R в позиции 68; R в позиции 70; Q в позиции 44; I в позиции 24; S в позиции 26; S в позиции 28 и R в позиции 30 или R в позиции 70; T в позиции 44; I в позиции 24; S в позиции 26; S в позиции 28; N в позиции 30; S в позиции 32; R в позиции 33; Q в позиции 38; Q в позиции 80; R в позиции 40; K в позиции 66; T в позиции 42; R в позиции 77 и R в позиции 68 (позиции, соответствующие аминокислотной последовательности I-Cre-I). Примерами подобных мегануклеаз являются белки, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно, кодируемые нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 от нуклеотидной позиции 2004 до нуклеотидной позиции 2525 или до 2522, или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 от нуклеотидной позиции 4885 до нуклеотидной позиции 5405 или до 5403. одноцепочечные мегануклеазы, согласно изобретению, могут представлять собой белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, кодированную нуклеотидной последовательностью, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17 от нуклеотидной позиции 1267 до 1605 и от 1795 до 2541, или белком, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 от аминокислотной позиции 1 до 167 и от 208 до 362, кодируемую нуклеотидной последовательностью, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17 от нуклеотидной позиции 1267 до 1605, 1795 до 1956 и 2071 до 2541.

В любом из вариантов осуществления, чужеродная ДНК может содержаться внутри репаративной ДНК, причем репаративная ДНК, содержит по меньшей мере одну фланкирующую нуклеотидную последовательность, гомологичную расположенной до или после последовательности нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. чужеродная ДНК может содержать селектируемый маркерный ген и/или интересующий экспрессируемый растением ген, такой как ген толерантности к гербицидам, ген резистентности к насекомым, ген резистентности к заболеваниям, ген резистентности к абиотическому стрессу, фермент, задействованный в биосинтезе масел, биосинтезе углеводов, фермент, связанный с прочностью волокон или длиной волокон, фермент, задействованный в биосинтезе вторичных метаболитов. Чужеродная ДНК может также быть интегрирована как таковая, т.е. без фланкирующих последовательностей с гомологией к области вокруг предварительно определенного сайта-мишени (без любой дополнительной ДНК), для интегрирования посредством негомологичного соединения концов.

Мегануклеаза или пара мегануклеаз могут быть экспрессированы из химерного гена или пары химерных генов, каждый из которых содержит экспрессируемый растением промотор, функционально связанный с кодирующей областью, кодирующей мегануклеазу или одну из пары мегануклеаз, и дополнительно функционально связанный с областью ДНК, вовлеченной в терминацию транскрипции и функциональное полиаденилирование в растительной клетке.

Изобретение дополнительно предоставляет, растительные клетки и растения и семена или репродуктивные части, в которых чужеродная ДНК была введена в предварительно определенный сайт, который был получен посредством способов, предоставленных в данном описании.

Изобретение также предоставляет способ выращивания растения, в котором чужеродная ДНК была введена в предварительно определенный сайт, который был получен посредством способов, предоставленных в данном описании, включающий стадию нанесения химического вещества на растение или субстрат, в котором выращивают растение.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к способу получения растения, содержащего чужеродную ДНК, интегрированную в кодирующую область bar, включающий стадию скрещивания растения, состоящего по существу из клеток растения полученных посредством способов изобретения, с другим растением или с самим собой и необязательно сбора семян.

Изобретение также относится к способу, включающему стадию нанесения химического соединения на растение или семена растения, в котором чужеродная ДНК была введена в предварительно определенный сайт, который был получен посредством способов, предоставленных в данном описании.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к применению мегануклеазы или пары мегануклеаз, как описано в данной заявке, для введения чужеродной ДНК в кодирующую область bar в растительной клетке.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к применению специально сконструированной мегануклеазы для введения интересующей чужеродной ДНК в предварительно определенный сайт в растительной клетке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Схематичное представление сайта узнавания и взаимодействия с аминокислотами различных мономерных звеньев BAY 39 и BAY40 мегануклеазы.

Фигура 2: аминокислотная последовательность мономерного звена 2 ("40") BAY 39/40 (необходимо заметить, что аминокислотная последовательность содержит сигнал внутриядерной локализации SV40 (аминокислоты 1-10)).

Фигура 3: аминокислотная последовательность мономерного звена 1 ("39") BAY 39/40 (необходимо заметить, что аминокислотная последовательность содержит сигнал внутриядерной локализации SV40 (аминокислоты 1-10)).

Фигура 4: аминокислотная последовательность одноцепочечной мегануклеазы BAY 39/40 (необходимо заметить, что аминокислотная последовательность содержит сигнал внутриядерной локализации SV40 (аминокислоты 1-12) и линкерной области (аминокислоты 168-205)).

Фигура 5: Выравнивание нуклеотидной последовательности ПЦР ампликонов вокруг сайта узнавания кодирующей области bar, в чувствительных к фосфинотрицину линиях, происходящих из трансгенного растения, содержащего экспрессируемый растением ген bar и экспрессируемые растением гены для мономерных звеньев BAY39/40. 1. нуклеотидная последовательность контрольного образца; 2. нуклеотидная последовательность толерантной к фосфинотрицину линии; 3-9: нуклеотидные последовательности чувствительных к фосфинотрицину линий.

ОПИСАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на наблюдении, что могут быть получены функциональные переконструированные мегануклеазы, которые специфически узнают и расщепляют нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 - Фигура 1), которая может быть обнаружена в нуклеотидной последовательности кодирующей области гена фосфинотрицин ацетилтрансферазы Streptomyces hygroscopicus (ген bar) (Thompson, C, Mowa, R. Tizard, R. Crameri, R. Davies, J. Lauwereys, M. ans Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal 6: 2519-2523 (Accession X05822), нуклеотидная последовательность которого присутствует в широко используемом селектируемом маркерном гене в трансгенезе растения.

SEQ ID NO: 3 представляет нуклеотидную последовательность гена bar. Комплемент сайта узнавания SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2) соответствует нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 от нуклеотида 132 до 153. Таким образом, описанные в данной заявке мегануклеазы способны узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность в трансгенных растениях, содержащих экспрессируемый растением ген, который имеет экспрессируемый растением промотор, функционально связанный с областью ДНК, кодирующей ген фосфинотрицин ацетилтрансферазы Streptomyces hygroscopicus (bar), и за которой следует функциональная в растениях область 3' терминации транскрипции и полиаденилирования, кодирующая область bar, содержащая нуклеотидную последовательность, которая является комплементом нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, такой как SEQ ID NO: 3.

Кодирующая область bar была инкорпорирована в ряде трансгенных растений, которые были коммерционализированы, коммерцианализируются или будут коммерционализированы, включая растения, содержащие следующее объекты:

Цикорий (Cichorium intybus):

- объекты RM3-3, RM3-4, RM3-6, которые описаны в регламентирующем документе 97-148-01p

Масличный рапс (Brassica napus)

- Объект MSI, который описан в регламентирующих документах DD95-04 (CA) или 98-278-01p (США)

- Объект MS8, который описан в регламентирующих документах DD96-17 (CA) или 98-278-01p (США) или WO 2001/041558

- Объект RF1, который описан в регламентирующих документах DD95-04 (CA) или 98-278-01p (США)

- Объект RF2, который описан в регламентирующих документах DD95-04 (CA) или 98-278-01p (США)

- Объект RF3, который описан в регламентирующих документах DD96-17 (CA) или 98-278-01p (США) или WO 2001/041558

- объекты PHY 14, PHY35, PHY36, которые описаны в Японских дерегламентирующих документах

Хлопок (Gossypium hirsutum)

Объект LLcotton 25, который описан в регламентирующих документах 02-042-01p (США) или WO 2003/013224

- Объект T303-40, который описан в WO2008/122406

- Объект GHB119, который описан в регламентирующем документе 08-340-01p (США) или WO2008/151780

Кукуруза (Zea mays)

- Объект TC-6275 (=DAS-06275-8), который описан в регламентирующем документе 03-181-01p (США)

- Объект Bt176, который описан в регламентирующем документе 94-319-01p (США)

- Объект B16 (=DLL25), который описан в дерегламентирующем документе США 95-145-01p или WO9506128

- Объект DBT418, который описан в дерегламентирующем документе США 96-291-01p (США)

- Объект ZMA101

- Объект CBH351, который описан в дерегламентирующем документе США 97-265-01p (США)

- Объект MS3, который описан в дерегламентирующем документе США 95-228-01p (США)

- Объект MS6, который описан в дерегламентирующем документе США 98-349-01p (США)

Рис (Oryza sativa)

- Объект LLRice62, который описан в дерегламентирующем документе США 98-329-01p или WO 2001/083818

- Объект LLRice601, который описан в дерегламентирующем документе США 06-234-01p или патентной заявке США 2008289060

Соя (Glycine max)

- объекты W62 и W98, описанные в регламентирующем документе 96-068-01p (США)

Трансгенные растения, заключающие в себе данные объекты, вследствие этого содержат последовательность узнавания для мегануклеаз, описанных в данной заявке, и являются подходящими объектами для способов изобретения. Кроме того, экспрессируемый растением ген bar используется, как правило, в качестве селектируемого маркера, и было получено множество трансгенных растений, которые также являются подходящими объектами для способов изобретения.

Соответственно, в одном варианте осуществления, изобретение относится к способу введения молекулы чужеродной ДНК в предварительно определенный или предварительно выбранный сайт в (ядерном) геноме клетки трансгенного растения, включающему стадии:

a. индуцирования разрыва двухцепочечной ДНК в предварительно определенном сайте;

b. введения молекулы чужеродной ДНК в указанную клетку растения; и

c. отбора растительной клетки, в которой чужеродная ДНК введена в предварительно определенный сайт;

при этом предварительно определенный сайт представляет собой нуклеотидную последовательность, отличающуюся от сайта узнавания для встречающейся в природе мегануклеазы, и представляет собой нуклеотидную последовательность, обычно вводимую в виде части трансгена в трансгенное растение, и при этом разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения не встречающейся в природе одноцепочечной мегануклеазы или пары мономерных звеньев не встречающейся в природе мегануклеазы, которая узнает или вместе узнают предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют двухцепочечный разрыв.

В том смысле, в котором используется в данном описании, "нуклеотидная последовательность, обычно вводимая в виде части трансгена в растения", относится к нуклеотидной последовательности области ДНК, которая была использована ранее в виде элемента химерного гена, интродуцированного в растения, посредством которого трансгенные растения являются легко доступными, в частности посредством которого трансгенные растения были коммерционализированы, коммерцианализируются или будут коммерционализированы, и для которых применимы разрешения контролирующих органов и которые являются общедоступными. Доступны несколько баз данных, которые обобщают и предоставляют информацию по заявкам на разрешения контролирующих органов, включая базу данных генетически модифицированных сельскохозяйственных культур Центра по оценка риска для окружающей среды, к которым можно обращаться за онлайн консультацией (http://www.cera-gmc.org/?action=gm_crop_database&), или сводная ведомость заявок на нерегулируемый статус, выданный или находящийся на рассмотрении в APHIS, доступная онлайн на http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html.

Области ДНК, обычно вводимые в виде части трансгена в растения, содержат промоторные области, такие как 35S промотор CaMV 35S транскрипта (Odell et al. (1985), Nature 313: 810-812); FMV 35S промотор (Richins R.D. Scholthof H.B. Shepherd R.J. (1987) последовательность вируса мозаики норичника (группа каулимовирусов). Nucleic Acids Research 15: 8451-8466); промотор небольшой субъединицы гена Arabidopsis thaliana Rubisco (Krebbers E. Seurinck J. Herdies L. Cashmore A. R. Timko M. P. (1988). Четыре гена в двух разветвленных подсемействах кодируют небольшие субъединичные полипептиды рибулоза-1,5-бифосфат карбоксилазы Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, 11, 745-759); промотор Вируса мозаики жилки маниоки (Verdaguer et al (1996) Plant Mol. Biol. 31 : 1129 или Verdaguer et al (1998) Plant Mol. Biol. 37: 1055); промотор Actin2 из Arabidopsis (An Y.Q. McDowell J.M. Huang S. McKinney E.C. Chambliss S. Meagher R.B. (1996) Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. The Plant Journal 10: 107-121) или риса (McElroy D. Zhang W. Cao J. Wu R. (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transfomation. The Plant Cell 2: 163-171); промотор гистона H3 или промотор гистона H4 (Chaboute M, Chaubet N, Philipps G, Ehling M and Gigot C (1987) Genomic organization и nucleotide sequences of two histone H3 and two histone H4 genes of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 8: 179-191); промотор гена ubiquitin-1 кукурузы (Zea mays) (Christensen et al (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675); 5' UTR лидерные последовательности, такая как лидерная последовательность cab22L (Harpster M, Townsend J, Jones J, Bedbrook J and Dunsmuir P.(1988) Relative strengths of the 35S cauliflower mosaic virus, 1’, 2' and nopaline synthase promoters in transformed tobacco, sugarbeet and oilseed rape callus tissue. Mol Gen Genet. 212: 182-190); или 5' tev (Carrington J and Freed D (1990) Cap-independent enhancement of translation by a plant potyvirus 5' nontranslated region. J Virol 64(4): 1590-1597); конец 3’ гена нопалин-синтазы (Depicker A. Stachel S. Dhaese P. Zambryski P. Goodman H.M. (1982). Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular and Applied Genetics 1, 561-573); конец 3’ гена октопин синтазы (De Greve H. Dhaese P. Seurinck J. Lemmers M. Van Montagu M. Schell J. (1982). Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene. Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 499-511); терминатор CaMV35S (Sanfacon et al (1991) Gene Dev. 5: 141) transcription termination and polyadenylation region of gene 7 of the octopine type T-DNA vector (D'Haese et al, 1983, EMBO Journal, 2, 419-426) и селектируемые маркеры, такие как bar (Thompson, C, Mowa, R. Tizard, R. Crameri, R. Davies, J. Lauwereys, M. ans Botterman, J. (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal 6: 2519-2523 (Accession X05822)); pat (Wohlleben,W. Arnold, W. Broer,L, Hillemann,D. Strauch, E. И Puhler, A. Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu494 and its expression in Nicotiana tabacum. Gene 70 (1), 25-37 (1988)); 2mepsps (последовательность 4 из патента US6566587 или EMBL номер AR337832); CP4 (Padgette S.R. Re D. Barry G. Eichholtz D. Delannay X. Fuchs R.L. Kishore G.M. Fraley R.T. (1996). New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready gene. In Herbicide-Resistant Crops: Agricultural, Environmental, Econ.... neo Accession V00618; Beck et al (1982) Gene 19(3) p 327-336); или hpt (Kaster et al. (1983), NAR 11, 6895-6911).

Предпочтительной областью ДНК в контексте данного изобретения является нуклеотидная последовательность кодирующей области гена bar, которая упоминается выше.

Переконструированные мегануклеазы, описанные в данном документе, основаны на встречающейся в природе мегануклеазе I-CreI для использования в качестве каркаса. I-CreI представляет собой хоминг-эндонуклеазу, обнаруженную в хлоропластах Chlamydomonas rheinhardti (Thompson et al. 1992, Gene 119, 247-251). Данная эндонуклеаза представляет собой гомодимер, который узнает псевдопалиндромный сайт ДНК 22 т.н. В гене 23SrРНК и создает разрыв двухцепочечной ДНК, который используется для введения интрона. I-CreI представляет собой звено группы эндонуклеаз, несущее единственный мотив LAGLIDADG. Ферменты LAGLIDADG заключают в себе одну или две копии консенсусного мотива. Ферменты с единственным мотивом, такие как I-CreI, функционируют в качестве гомодимеров, тогда как ферменты с двумя мотивами представляют собой мономеры с двумя отдельными доменами. Соответственно, при переконструировании мегануклеаз, полученных из каркаса I-CreI для узнавания интересующей нуклеотидной последовательности 22 bp, конструируют два мономерных звена, каждое из которых узнает часть сайта узнавания 22 bp, которые необходимы совместно для индуцирования двухцепочечного разрыва в сайте узнавания 22 т.н. (WO2007/047859). Согласованного действия можно добиться посредством связывания двух мономерных звеньев в одну одноцепочечную мегануклеазу или также можно добиться посредством стимулирования образования гетеродимеров, которые описаны например, в WO2007/047859.

Аминокислотная последовательность встречающегося в природе мономера I-CreI предоставлена в виде SEQ ID NO: 16. Для переконструирования мономерных звеньев I-CreI таким образом, чтобы их гетеродимеры узнавали нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 и/или 2, в упомянутых позициях находятся следующие аминокислоты:

1. В мегануклеазном звене 1:

a. S в позиции 32;

b. Y в позиции 33;

c. E в позиции 38;

d. R в позиции 40;

e. K в позиции 66;

f. Q в позиции 80;

g. T в позиции 42;

h. R в позиции 77;

i. R в позиции 68;

j. R в позиции 70;

k. Q в позиции 44;

l. I в позиции 24;

m. S в позиции 26;

n. S в позиции 28;

o. R в позиции 30.

2. В мегануклеазном звене 2:

P. R в позиции 70;

q. T в позиции 44;

r. I в позиции 24;

s. S в позиции 26;

t. S в позиции 28;

u. N в позиции 30;

V. S в позиции 32;

w. R в позиции 33;

х. Q в позиции 38;

y. Q в позиции 80;

z. R в позиции 40;

aa. K в позиции 66;

bb. T в позиции 42;

cc. R в позиции 77;

dd. R в позиции 68.

На фигуре 1 предоставлена его схематичное представление.

Переконструированный фермент, индуцирующий двухцепочечный разрыв, может содержать, но без необходимости содержать, сигнал внутриядерной локализации (NLS), такой как NLS большого T-антигена SV40 [Raikhel, Plant Physiol. 100: 1627-1632 (1992) и ссылки на него] [Kalderon et al. Cell 39: 499-509 (1984)]. Сигнал внутриядерной локализации может быть локализован в белке где угодно, но обычно локализован на N-терминальном конце белка. Сигнал внутриядерной локализации может заменять одну или более аминокислот фермента, индуцирующего двухцепочечный разрыв. Необходимо заметить, что если переконструированная мегануклеаза снабжена NLS на N-конце белка, например, 10 или 12 аминокислотным NLS SV40, позиции аминокислот будут, соответственно, сдвинуты (увеличены). Аналогичным образом, в случае, когда два мономерных звена связаны в одноцепочечную мегануклеазу, позиция второго звена также будет сдвинута. Позиции соответствующих аминокислот относительно аминокислотной последовательности I-CreI также могут быть идентифицированы посредством определения оптимального выравнивания, которое описано ниже. Необходимо понимать, что в одноцепочечной переконструированной мегануклеазе порядок звеньев не имеет значения, т.е. находится ли упомянутое выше звено 1 и 2 в самом деле внутри данного порядка в единственной аминокислотной цепи или звено 2 предшествует звену один в единственной аминокислотной цепи не имеет значения для того, чтобы два объединенных звена были в состоянии узнавать намеченную последовательность.

Переконструированные мегануклеазы, подходящие для изобретения, могут содержать аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 5 и 6 (мономерные звенья, которые могут расщеплять сайт узнавания в виде гетеродимера) или могут содержать аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 18 (одноцепочечная мегануклеаза, содержащая два звена, представленные аминокислотами от 1 до 167 и от 208 до 362, соответственно, связанные линкерной последовательностью, представленной аминокислотами от 168 до 205), или могут содержать аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 от 1 до 167 и от 206 до 362 (соответственно звено 1 и 2 одноцепочечной мегануклеазы без линкера).

Общепризнанно, переконструированная мегануклеаза (мегануклеазы) может быть предоставлена посредством экспрессии экспрессируемого растением рекомбинантного гена (генов), кодирующего подобную мегануклеазу (мегануклеазы). С этой целью, область ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую переконструированную мегануклеазу или мономерное звено мегануклеазы, может быть функционально связана с экспрессируемым растением промотором и областью ДНК, вовлеченных в терминацию транскрипции и полиаденилирование, и интродуцированных в растение или растительные клетки. Рекомбинантный ген (гены), кодирующий переконструированную мегануклеазу (мегануклеазы), может быть интродуцирован временно или стабильно.

Для целей изобретения, термин "действующий в растении промотор" и "экспрессируемый растением промотор" подразумевает промотор, который в состоянии управлять транскрипцией в растении, растительной ткани, органе растения, части растения или растительной клетке. Он включает в себя любой промотор растительного происхождения, но также любой промотор нерастительного происхождения, который в состоянии управлять транскрипцией в растительной клетке.

Промоторами, которые могут быть использованы в данном аспекте, являются конститутивные промоторы, такие как промотор 35S транскрипта вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (Hapster et al.1988, Mol. Gen. Genet. 212: 182-190), 19S промотор CaMV (Патент США NO: 5352605; WO 84/02913; Benfey et al. 1989, EMBO J. 8:2195-2202), промотор № 4 или № 7 вируса клевера подземного (WO 96/06932), небольшой субъединичный промотор Rubisco (Патент США № 4962028), убиквитиновый промотор (Holtorf et al. 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-649), промоторы гена T-ДНК, такие как промоторы октопин-синтазы (OCS) и нопалин-синтазы (NOS) из Agrobacterium, и дополнительные промоторы генов, конститутивная экспрессия которых в растениях известна квалифицированным специалистам в данной области.

Дополнительными промоторами, которые могут быть использованы в данном аспекте, являются ткань-специфические или орган-специфические промоторы, предпочтительно семена-специфические промоторы, такие как промотор 2S альбумина (Joseffson et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:12196-12201), промотор фазеолина (Патент США № 5504200; Bustos et al. 1989, Plant Cell l.(9):839-53), промотор легумина (Shirsat et al. 1989, Mol. Gen. Genet. 215(2):326-331), промотор "неизвестного белка семян" (USP) (Baumlein et al. 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3):459-67), промотор напина (Патент США № 5608152; Stalberg et al. 1996, Planta 199:515-519), промотор олеозина Arabidopsis (WO 98/45461), Brassica Bce4 промотор (WO 91/13980) и дополнительные промоторы генов, семена-специфическая экспрессия которых в растениях известна квалифицированным специалистам в данной области.

Другими промоторами, которые могут быть использованы, являются ткань-специфические или орган-специфические промоторы, наподобие специфических для примордия промоторов (An et al. 1996, Plant Cell 8: 15-30), специфических для стеблей промоторов (Keller et al. 1988, EMBO J. 7(12): 3625-3633), специфических для листьев промоторов (Hudspeth et al. 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589), мезофил-специфических промоторов (таких как светоиндуцируемые промоторы Rubisco), специфических для корней промоторов (Keller et al. 1989, Genes Dev. 3: 1639-1646), специфических для клубней промоторов (Keil et al. 1989, EMBO J. 8(5): 1323-1330), специфических для сосудистой ткани промоторов (Peleman et al. 1989, Gene 84: 359-369), специфических для тычинок промоторов (WO 89/10396, WO 92/13956), специфических для растрескиваемой зоны промоторов (WO 97/13865) и тому подобное.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие переконструированные мегануклеазы, подходящие для изобретения, могут содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 от нуклеотидной позиции 2004 до нуклеотидной позиции 2525 или 2522 или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 от нуклеотидной позиции 4885 до нуклеотидной позиции 5405 или 5403. Для облегчения клонирования и других технологий рекомбинантных ДНК, может быть предпочтительным включение функционального для растений интрона в область, кодирующую мегануклеазу, в частности одноцепочечную мегануклеазу. Подобный интрон может, например, содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17 от nt позиции 1606 до 1794.

Область ДНК, кодирующая переконструированную мегануклеазу, может быть оптимизирована для экспрессии в растении посредством адаптации содержимого GC, частоты использования кодона, устранения нежелательных нуклеотидных последовательностей. кодирующая область может быть дополнительно оптимизирована для экспрессии в растениях, и синтетическая кодирующая область может иметь нуклеотидную последовательность, которая была сконструирована с возможностью соответствия следующим критериям:

a) нуклеотидная последовательность кодирует функциональную переконструированную хоминг-эндонуклеазу, как описано в данной заявке;

b) нуклеотидная последовательность имеет содержимое GC, составляющее от приблизительно 50% до приблизительно 60%;

c) нуклеотидная последовательность не содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA и CATAAA;

d) нуклеотид не содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из CCAAT, ATTGG, GCAAT и ATTGC;

e) нуклеотидная последовательность не содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA или GCAGG;

f) нуклеотидная последовательность не содержит GC удлинение, состоящее из 7 последовательных нуклеотидов, выбранных из группы G или C;

g) нуклеотидная последовательность не содержит AT удлинение, состоящее из 5 последовательных нуклеотидов, выбранных из группы A или T; и

h) нуклеотидная последовательность не содержит кодоны, кодирующие Leu, Ile, Val, Ser, Pro, Thr, Ala, которые содержат TA или CG дуплеты в позициях 2 и 3 (т.е. нуклеотидная последовательность не содержит кодоны TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG и GCG).

Пример подобной оптимизированной последовательности представлен с помощью SEQ ID NO: 17 от nt позиции 1267 до 1605 и от nt позиции 1795 до 2541 (при этом нуклеотидная последовательность, кодирующая линкер, присутствующий между двумя звеньями мегануклеазы, представлен с помощью nt от 1957 до 2070).

Также необходимо учитывать, что термины, использованные для описания способа, такие как "введение фрагмента ДНК", а также "регенерация растения из клетки", не означают, что подобный фрагмент ДНК обязательно необходимо должен быть интродуцирован с помощью методик трансформации. В самом деле, квалифицированный в данной области специалист сразу поймет, что интересующая молекула ДНК также может быть интродуцирована из одного растения в другое с помощью методик селекции или скрещивания.

Однако необходимо понимать, что интересующая молекула ДНК может быть интродуцирована в растительные клетки с помощью любого способа, известного в данной области, включая Agrobacterium-опосредованную трансформацию, но также посредством способов прямого переноса ДНК. Трансформированная молекула ДНК может быть перенесена в растительные клетки с использованием любого общепризнанного способа, включая, но без ограничения, способ прямого переноса ДНК. В том смысле, в котором используется в данном описании, "прямым переносом ДНК" является любой способ введения ДНК в растительные клетки, который не включает использование природных Agrobacterium spp. И который в состоянии вводить ДНК в растительные клетки. Он включает способы, хорошо известные в данной области, такие как введение ДНК в протопласты с помощью электропорации, введение ДНК с помощью электропорации в нетронутые растительные клетки или частично пораженные ткани или растительные клетки, введение ДНК посредством действия агентов, таких как PEG и тому подобное, в протопласты, использования силиконовых нитей и бомбардировки покрытыми ДНК микрочастицами.

Способность индуцирования двухцепочечного разрыва в предварительно выбранном сайте открывает несколько потенциальных вариантов применения. Интересующая чужеродная ДНК может быть интродуцирована в предварительно выбранный сайт либо посредством гомологичной рекомбинации, либо в процессе негомологичного соединения концов. Двухцепочечный разрыв также может быть использован для индуцирования образования небольших делеций или вставок в предварительно выбранном сайте, потенциально инактивируя посредством этого химерный ген, содержащий нуклеотидную последовательность предварительно выбранного сайта. Двухцепочечный разрыв в предварительно выбранном сайте также должен облегчить замену области ДНК поблизости от данного сайта, например, для интересующей области ДНК, как описано в WO 06/105946, WO08/037436 или WO08/148559.

Для вставки чужеродной ДНК посредством гомологичной рекомбинации в предварительно выбранный сайт, чужеродная ДНК может содержаться внутри репаративной ДНК, при этом чужеродная ДНК фланкирована по меньшей мере одной фланкирующей областью ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, которая аналогична нуклеотидной последовательности области ДНК спереди или сзади предварительно выбранного сайта. Репаративная ДНК может содержать чужеродную ДНК, которая должна быть вставлена с фланкированием двумя фланкирующими областями ДНК, спереди и сзади чужеродной ДНК, и которые являются аналогичными нуклеотидной последовательности областей ДНК спереди или сзади предварительно выбранных сайтов. В качестве альтернативы, чужеродная ДНК может быть интегрирована сама по себе, т.е. без фланкирующих последовательностей с гомологией к области вокруг предварительно определенного намеченного сайта (без какой-либо дополнительной ДНК), для интегрирования посредством негомологичного соединения концов.

В том смысле, в котором используется в данном описании "фланкирующая область ДНК" представляет собой ДНК с нуклеотидными последовательностями, имеющими гомологию с областями ДНК соответственно спереди или сзади намеченной ДНК последовательности или предварительно выбранного сайта. Это позволяет лучше управлять вставкой интересующей чужеродной ДНК или молекулы ДНК. В самом деле, интеграция посредством гомологичной рекомбинации будет позволять точное объединение фрагмента чужеродной ДНК с ядерным геномом растения до нуклеотидного уровня.

Фланкирующие области ДНК могут варьировать по длине и должны составлять по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов в длину. Однако, фланкирующая область может быть настолько длинной, насколько практически возможно (например, до приблизительно 100-150 т.н., как например, полные искусственные хромосомы бактерий (BACs)).

Предпочтительно, фланкирующая область будет составлять от приблизительно 50 т.н. До приблизительно 2000 т.н. Кроме того, нет необходимость, чтобы области, фланкирующие интересующую чужеродную ДНК, были идентичны областям ДНК, фланкирующим предварительно выбранный сайт, при этом они могут иметь идентичность последовательности между приблизительно 80% и приблизительно 100%, предпочтительно между приблизительно 95% и приблизительно 100% идентичности последовательности с областями ДНК, фланкирующими предварительно выбранный сайт. Чем длиннее фланкирующая область, тем менее строгое требование к гомологии. кроме того, предпочтительно, чтобы идентичность последовательности поблизости от места точной вставки чужеродной ДНК была настолько высокой, насколько практически возможно. кроме того, для достижения обмена намеченной последовательности ДНК без изменения ДНК последовательности соседних последовательностей ДНК, фланкирующие последовательности ДНК должны быть предпочтительно идентичны областям ДНК, фланкирующим предварительно выбранный сайт.

Кроме того, нет необходимости, чтобы области, фланкирующие интересующую чужеродную ДНК, имели гомологию с областями, непосредственно фланкирующими предварительно выбранный сайт, но они могут иметь гомологию с областью ДНК ядерного генома, дополнительно удаленной от данного предварительно выбранного сайта. Тогда вставка чужеродной ДНК будет приводить к удалению намеченной ДНК между предварительно выбранным сайтом вставки и гомологичной областью ДНК. Другими словами, намеченная ДНК, локализованная между гомологичными областями, будет замещаться на интересующую чужеродную ДНК. Таким образом, посредством выбора подходящей конфигурации чужеродной ДНК для репарации разрыва двухцепочечной ДНК, за счет введения молекулы чужеродной ДНК согласно способам изобретения, в дополнение к вставкам, также можно выполнять нацеленные замены или нацеленные делеции геномной области, локализованной между гомологичными областями.

Чужеродная ДНК, которая должна быть вставлена, может также содержать селектируемый или скринируемый маркер, который может или не может быть удален после вставки.

"Селектируемые или скринируемые маркеры" в том смысле, в котором используется в данном описании, имеют свое обычное значение для данной области и включают, но без ограничения, экспрессируемую растением фосфинотрицин ацетилтрансферазу, неомицин фосфотрансферазу, глифосат оксидазу, глифосат толерантный к EPSP фермент, ген нитрилазы, мутантный ген ацетолактат синтазы или ацетогидроксиацид синтазы, β-глюкоронидазу (GUS), R-локусные гены, зеленый флюоресцентный белок и тому подобное.

Отбор растительной клетки или растения, в котором селектируемый или скринируемый маркер и оставшаяся часть молекулы чужеродной ДНК были введены посредством гомологичной рекомбинации через фланкирующие области ДНК, например, может быть обеспечен посредством скринирования отсутствия последовательностей, присутствующих в трансформирующей ДНК, но локализованных за пределами фланкирующих областей ДНК. В самом деле, наличие последовательностей из трансформирующей ДНК за пределами фланкирующих областей ДНК должно обозначать, что происхождение трансформированных растительных клеток обусловлено случайной вставкой ДНК. С этой целью, селектируемые или скринируемые маркеры могут быть включены в трансформирующую молекулу ДНК за пределами фланкирующих областей ДНК, которые затем могут быть использованы для идентификации тех растительных клеток, которые не имеют селектируемых или скринируемых маркеров, локализованных за пределами трансформирующей ДНК, и которые могут появляться посредством гомологичной рекомбинации через фланкирующие области ДНК. В качестве альтернативы, трансформирующая молекула ДНК может заключать в себе селектируемые маркеры за пределами фланкирующих областей ДНК, которые предоставляют возможность отбора на отсутствие подобных генов (отрицательно селектируемые маркерные гены).

Необходимо понимать, что способы согласно изобретению предоставляют возможность вставки любой интересующей ДНК, включая ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность с конкретной сигнатурой нуклеотидной последовательности, например, для последующей идентификации. Интересующей ДНК также может быть один или более экспрессируемый растением ген (генов), включая, но без ограничения, ген толерантности к гербицидам, ген резистентности к насекомым, ген резистентности к заболеваниям, ген резистентности к абиотическому стрессу, фермент, вовлеченный в биосинтез масел или углеводный биосинтез, фермент, связанный с прочностью и/или длиной волокон, фермент, вовлеченный в биосинтез вторичных метаболитов.

Гены толерантности к гербицидам включают ген, кодирующий фермент 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазу (EPSPS). Примерами подобных генов EPSPS являются ген AroA (мутант CT7) бактерии Salmonella typhimurium (Comai et al. 1983, Science 221, 370-371), ген CP4 бактерии Agrobacterium sp. (Barry et al. 1992, Curr. Topics Plant Physiol. 7, 139-145), гены, кодирующие Petunia EPSPS (Shah et al. 1986, Science 233, 478-481), Tomato EPSPS (Gasser et al. 1988, J. Biol. Chem. 263, 4280-4289) или Eleusine EPSPS (WO 01/66704). Также это может быть мутантная EPSPS, которая описана, например, в EP 0837944, WO 00/66746, WO 00/66747 или WO02/26995.

Толерантные к глифосату растения также могут быть получены посредством экспрессии гена, который кодирует фермент глифосат оксидоредуктазу, который описан в Патентах США №№ 5776760 и 5463175. Толерантные к глифосату растения также могут быть получены посредством экспрессии гена, который кодирует фермент глифосат ацетилтрансферазу, которая описана, например, в WO 02/36782, WO 03/092360, WO 05/012515 и WO 07/024782. Толерантные к глифосату растения также могут быть получены посредством отбора растений, содержащих встречающиеся в природе мутации упомянутых выше генов, которые описаны, например, в WO 01/024615 или WO 03/013226. гены EPSPS, которые придают толерантность к глифосату, описаны, например, в Патентных заявках США №№ 11/517991, 10/739610, 12/139408, 12/352532, 11/312866, 11/315678, 12/421292, 11/400598, 11/651752, 11/681285, 11/605824, 12/468205, 11/760570, 11/762526, 11/769327, 11/769255, 11/943801 или 12/362774. Другие гены, которые придают толерантность к глифосату, такие как гены декарбоксилазы, описаны, например, в Патентных заявках США №№ 11/588811, 11/185342, 12/364724, 11/185560 или 12/423926.

Другие гены толерантности к гербицидам могут кодировать фермент, обезвреживающий гербицид или мутантный фермент глютамин синтазы, который является устойчивым к ингибированию, например, описанному в Патентной Заявке США № 11/760602. Одним подобным эффективным обезвреживающим ферментом является фермент, кодирующий фосфинотрицин ацетилтрансферазу (такой как белок bar или pat из Streptomyces species). Фосфинотрицин ацетилтрансферазы описаны, например, в Патентах США №№ 5561236; 5648477; 5646024; 5273894; 5637489; 5276268; 5739082; 5908810 и 7112665.

Толерантные к гербицидам гены также могут придавать толерантность к гербицидам, ингибируя фермент гидроксифенилпируватдиоксигеназу (HPPD). Гидроксифенилпируватдиоксигеназы представляют собой ферменты, которые катализируют реакцию, в которой пара-гидроксифенилпируват (HPP) трансформируется в гомогентисат. Растения, толерантные к ингибиторам HPPD, могут быть трансформированы геном, кодирующим встречающийся в природе устойчивый фермент HPPD, или геном, кодирующим мутантный или химерный фермент HPPD, который описан в WO 96/38567, WO 99/24585 и WO 99/24586, WO 2009/144079, WO 2002/046387 или US 6768044. Толерантность к ингибиторам HPPD также может быть получена посредством трансформации растений генами, кодирующими некоторые ферменты, обеспечивающие возможность образования гомогентисата несмотря на ингибирование нативного фермента HPPD ингибитором HPPD. Подобные растения и гены описаны в WO 99/34008 и WO 02/36787. Толерантность растений к ингибиторам HPPD также может быть повышена посредством трансформации растений геном, кодирующим фермент, имеющий активность префенатдегидроксигеназы (PDH), в дополнение к гену, кодирующему толерантный к HPPD фермент, который описан в WO 2004/024928. Кроме того, растения могут быть сделаны более толерантными к гербицидам ингибиторам HPPD за счет добавления в их геном гена, кодирующего фермент, способный метаболизировать или разлагать ингибиторы HPPD, такой как ферменты CYP450, показанные в WO 2007/103567 и WO 2008/150473.

Кроме того, гены толерантности к гербицидам кодируют вариант ферментов ALS (также известных, как ацетогидроксиацид синтаза, AHAS), который описан, например, у Tranel и Wright (2002, Weed Science 50:700-712), но также в Патентах США №№ 5605011, 5378824, 5141870, и 5013659. Получение толерантных к сульфонилмочевине растений и толерантных к имидазолинону растений описано в патентах США №№ 5605011; 5013659; 5141870; 5767361; 5731180; 5304732; 4761373; 5331107; 5928937 и 5378824; и международной публикации WO 96/33270. Другие толерантные к имидазолинону гены описаны также, например, в WO 2004/040012, WO 2004/106529, WO 2005/020673, WO 2005/093093, WO 2006/007373, WO 2006/015376, WO 2006/024351 и WO 2006/060634. Дополнительные толерантные к сульфонилмочевине и имидазолинону гены описаны, например, в WO 07/024782 и патентной заявке США № 61/288958.

Ген резистентности к насекомым может содержать кодирующую последовательность, кодирующую:

1) инсектицидный кристаллический белок из Bacillus thuringiensis или его инсектицидный участок, такой как инсектицидные кристаллические белки, перечисленные у Crickmore et al. (1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 807-813), обновленные Crickmore et al. (2005) в перечне токсинов Bacillus thuringiensis, в Интернете на: http://www.lifesci.sussex.ac.uk Home/Neil_Crickmore/Bt/), или его инсектицидные участки, например, белки классов белков Cry Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1F, Cry2Ab, Cry3Aa или Cry3Bb или его инсектицидные участки (например, EP 1999141 и WO 2007/107302), или подобные белки, закодированные синтетическими генами, например, описанными в Патентной заявке США № 12/249016; или

2) кристаллический белок из Bacillus thuringiensis или его участок, который является инсектицидным в присутствии второго другого кристаллического белка из Bacillus thuringiensis или его участка, такой как двойной токсин, составленный из кристаллических белков Cry34 и Cry35 (Moellenbeck et al. 2001, Nat. Biotechnol. 19: 668-72; Schnepf et al. 2006, Applied Environm. Microbiol. 71, 1765-1774) или двойной токсин, составленный из белков Cry1A или Cry1F и белков Cry2Aa или Cry2Ab или Cry2Ae (Патентная заявка США № 12/214022 и EP 08010791.5); или

3) гибридный инсектицидный белок, содержащий части различных инсектицидных кристаллических белков из Bacillus thuringiensis, таких как гибрид белков 1) выше или гибрид белков 2) выше, например, белок Cry1A.105, полученный с помощью объекта MON89034 кукурузы (WO 2007/027777); или

4) белок из любого одного из 1)-3) выше, в котором некоторые аминокислоты, особенно 1-10, были заменены другой аминокислотой для получения более высокой инсектицидной активности для намеченных видов насекомых, и/или для расширения диапазона намеченных поражаемых видов насекомых, и/или в результате изменений, введенных в кодирующую ДНК в процессе клонирования или трансформации, такой как белок Cry3Bb1 в объектах MON863 или MON88017 кукурузы, или белок Cry3A в объекте MIR604 кукурузы; или

5) инсектицидный секретируемый белок из Bacillus thuringiensis или Bacillus cereus, или его инсектицидный участок, такой как растительные инсектицидные (VIP) белки, перечисленные на: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, например, белки из класса белков VIP3Aa; или

6) секретируемый белок из Bacillus thuringiensis или Bacillus cereus, который является инсектицидным в присутствии второго секретируемого белка из Bacillus thuringiensis или B. cereus, такой как двойной токсин, составленный из белков VIP1A и VIP2A (WO 94/21795); или

7) гибридный инсектицидный белок, содержащий части из различныхе секретируемых белков из Bacillus thuringiensis или Bacillus cereus, такой как гибрид белков в 1) выше или гибрид белков в 2) выше; или

8) белок любого одного из 5)-7) выше, в котором некоторые аминокислоты, в частности 1-10, были заменены другой аминокислотой для получения более высокой инсектицидной активности для намеченных видов насекомых, и/или для расширения диапазона намеченных поражаемых видов насекомых, и/или в результате изменений, введенных в кодирующую ДНК в процессе клонирования или трансформации (все также кодируя инсектицидный белок), такой как белок VIP3Aa в объекте COT 102 хлопка; или

9) секретируемый белок из Bacillus thuringiensis или Bacillus cereus, который является инсектицидным в присутствии кристаллического белка из Bacillus thuringiensis, такой как двойной токсин, составленный из VIP3 и Cry1A или Cry1F (Патентные заявки США №№ 61/126083 и 61/195019), или двойной токсин, составленный из белка VIP3 и белков Cry2Aa или Cry2Ab или Cry2Ae (Патентная заявка США № 12/214022 и EP 08010791.5);

10) белок из 9) выше, в котором некоторые аминокислоты, в частности 1-10, были заменены другой аминокислотой для получения более высокой инсектицидной активности для намеченных видов насекомых, и/или для расширения диапазона намеченных поражаемых видов насекомых, и/или в результате изменений, введенных в кодирующую ДНК в процессе клонирования или трансформации (все также кодируя инсектицидный белок).

«Ген устойчивости к насекомым» в том смысле, в котором используется в данном описании, дополнительно содержит трансгены содержащие последовательность, получающуюся при экспрессии двухцепочечной РНК, которая при поглощении насекомым-вредителем растений ингибирует рост данного насекомого-вредителя, которые описаны, например, в WO 2007/080126, WO 2006/129204, WO 2007/074405, WO 2007/080127 и WO 2007/035650.

Гены толерантности к абиотическому стрессу включают:

1) трансген, способный понижать экспрессию и/или активность гена поли(АДФ-рибоза) полимеразы (PARP) в растительных клетках или растениях, который описан в WO 00/04173, WO/2006/045633, EP 04077984.5 или EP 06009836.5;

2) трансген, способный понижать экспрессию и/или активность генов растений или растительных клеток, кодирующих PARG, которые описаны например, в WO 2004/090140;

3) трансген, кодирующий функциональный в растении фермент реутилизационного пути синтеза никотинамидадениндинуклеотида, включая никотинамидазу, никотинат фосфорибосилтрансферазу, мононуклеотидаденилтрансферазу никотиновой кислоты, никотинамид аденин динуклеотид синтетазу или никотинамид фосфорибосилтрансферазу, которые описаны, например, в EP 04077624.7, WO 2006/133827, PCT/EP07/002433, EP 1999263 или WO 2007/107326.

Ферменты, вовлеченные в углеводный биосинтез, включают ферменты, описанные, например, в EP 0571427, WO 95/04826, EP 0719338, WO 96/15248, WO 96/19581, WO 96/27674, WO 97/11188, WO 97/26362, WO 97/32985, WO 97/42328, WO 97/44472, WO 97/45545, WO 98/27212, WO 98/40503, W099/58688, WO 99/58690, WO 99/58654, WO 00/08184, WO 00/08185, WO 00/08175, WO 00/28052, WO 00/77229, WO 01/12782, WO 01/12826, WO 02/101059, WO 03/071860, WO 2004/056999, WO 2005/030942, WO 2005/030941, WO 2005/095632, WO 2005/095617, WO 2005/095619, WO 2005/095618, WO 2005/123927, WO 2006/018319, WO 2006/103107, WO 2006/108702, WO 2007/009823, WO 00/22140, WO 2006/063862, WO 2006/072603, WO 02/034923, EP 06090134.5, EP 06090228.5, EP 06090227.7, EP 07090007.1, EP 07090009.7, WO 01/14569, WO 02/79410, WO 03/33540, WO 2004/078983, WO 01/19975, WO 95/26407, WO 96/34968, WO 98/20145, WO 99/12950, WO 99/66050, WO 99/53072, US 6,734,341, WO 00/11192, WO 98/22604, WO 98/32326, WO 01/98509, WO 01/98509, WO 2005/002359, US 5824790, US 6013861, WO 94/04693, WO 94/09144, WO 94/11520, WO 95/35026 или WO 97/20936, или ферменты, вовлеченные в продуцирование полифруктозы, особенно инулина и типа левана, как раскрыто в EP 0663956, WO 96/01904, WO 96/21023, WO 98/39460 и WO 99/24593, продуцирование альфа- 1,4-глюканов, как раскрыто в WO 95/31553, US 2002031826, US 6284479, US 5712107, WO 97/47806, WO 97/47807, WO 97/47808 и WO 00/14249, продуцирование альфа-1,6 разветвленных альфа-1,4-глюканов, как раскрыто в WO 00/73422, продуцирование альтернана, как раскрыто, например, в WO 00/47727, WO 00/73422, EP 06077301.7, US 5908975 и EP 0728213, продуцирование гиалуронана, как например, раскрыто в WO 2006/032538, WO 2007/039314, WO 2007/039315, WO 2007/039316, JP 2006304779 и WO 2005/012529.

Изобретение также предоставляет способ введения делеции в предварительно определенный или предварительно выбранный сайт в (ядерном) геноме клетки трансгенного растения, включающий стадии:

a. индуцирования разрыва двухцепочечной ДНК в предварительно определенном сайте; и

b. отбора растительной клетки, имеющей делецию в указанном предварительно определенном сайте;

при этом предварительно определенный сайт представляет собой нуклеотидную последовательность, отличающуюся от сайта узнавания для встречающейся в природе мегануклеазы, и представляет собой нуклеотидную последовательность, обычно вводимую в виде части трансгена в трансгенное растение, и при этом разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения не встречающейся в природе одноцепочечной мегануклеазы или пары мономерных звеньев не встречающейся в природе мегануклеазы, который узнает или вместе узнают предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют двухцепочечный разрыв.

Также имеется вариант осуществления изобретения для предоставления химерных генов, кодирующих переконструированные мегануклеазы, которые описаны в данной заявке, при этом химерные гены содержат экспрессируемый растением промотор, функционально связанный с областью ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности I-CreI, в качестве каркаса содержащей S в позиции 32; Y в позиции 33; E в позиции 38; R в позиции 40; K в позиции 66; Q в позиции 80; T в позиции 42; R в позиции 77; R в позиции 68; R в позиции 70; Q в позиции 44; I в позиции 24; S в позиции 26; S в позиции 28 и R в позиции 30 или R в позиции 70; T в позиции 44; I в позиции 24; S в позиции 26; S в позиции 28; N в позиции 30; S в позиции 32; R в позиции 33; Q в позиции 38; Q в позиции 80; R в позиции 40; K в позиции 66; T в позиции 42; R в позиции 77 и R в позиции 68 (позиции относительно аминокислотной последовательности I-CreI, соответствующие позициям аминокислот в переконструированных мегануклеазах, могут быть определены с помощью выравнивания), такой как белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, или белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 от позиции 1 до 167 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 от позиции 206 до 362.

Следует учитывать, что средство и способы изобретения могут быть использованы в любом растении, включая кукурузу, табак, злаковые растения, включая пшеницу, овес, ячмень, рожь, рис, газонную траву, сорго, просо или растения сахарного тростника. Способы изобретения также могут быть применены для любого растения (покрытосеменного или голосемянного), включая, но без ограничения, хлопок, канолу, масличный рапс, сою, овощи, картофели, виды Лемна, виды табака, арабидопсис, люцерну, ячмень, фасоль, кукурузу, хлопок, лен, горох, рапс, рис, рожь, сафлору, сорго, сою, подсолнечник, табак, пшеницу, аспарагус, свеклу и сахарную свеклу, брокколи, капусту, морковь, цветную капусту, сельдерей, огурец, баклажан, салат-латук, лук, масличный рапс, перец, картофель, тыкву, редис, шпинат, крупноплодную столовую тыкву, томат, цукини, миндаль, яблоко, абрикос, банан, ежевику, чернику, какао, вишню, кокос, клюкву, финик, виноград, грэйпфрут, гуаву, киви, лемон, лайм, манго, дыню, нектарин, апельсин, папайю, маракуйю, персик, арахис, грушу, ананас, фисташку, сливу, малину, клубнику, мандарин, грецкий орех и арбуз.

Также целью изобретения является предоставление растительных клеток и растений, полученных согласно способам изобретения. Гаметы, семена, зародыши, либо зиготические, либо соматические, потомство или гибриды растений, содержащих объекты вставки ДНК, которые получают с помощью традиционных методов скрещивания, также находятся в пределах объема правовых притязаний представленного изобретения. Подобные растения могут заключать в себе гетерологичную или чужеродную последовательность ДНК, вставленную в намеченную последовательность или вместо нее, и будут отличаться от своих растений-предшественников только наличием данной гетерологичной ДНК или последовательности ДНК после обмена.

Растения, полученные посредством способов, описанных в данном документе, можно дополнительно скрещивать посредством традиционных методик скрещивания с другими растениями для получения потомства растений, содержащего объекты вставки намеченной ДНК, полученной согласно представленному изобретению.

Растения и семена согласно изобретению могут быть дополнительно обработаны химическим соединением, таким как химическое соединение, выбранное из следующих списков:

гербициды для овощей/фруктов: атразин, бромацил, диурон, глифосат, линурон, метрибузин, симазин, трифлюралин, флюазифоп, глюфосинат, галосульфурон Гован, параквиат, пропизамид, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, индазифлам;

инсектициды для овощей/фруктов: алдикарб, Bacillus thuriengiensis, карбарил, карбофуран, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, цифлутрин/бета-цифлутрин, эсфенвалерат, лямбда-цигалотрин, ацеквиноцил, бифеназат, метоксифенозид, новалурон, хромафенозид, тиаклоприд, динотефуран, флюакрипирим, спиродиклофен, гамма-цигалотрин, спиромесифен, спинозад, ринаксипир, циазипир, трифлюмурон,спиротетрамат, имидаклоприд, флюбендиамид, тиодикарб, метафлюмизон, сульфоксафлор, цифлуметофен, цианопирафен, клотианидин, тиаметоксам, спиноторам, тиодикарб, флоникамид, метиокарб, эмамектин-бензоат, индоксакарб, фенамифом, пирипроксифен, фенбутатин-оксид;

фунгициды для овощей/фруктов: аметоктрадин, азоксистробин, бентиаваликарб, боскалид, каптан, карбендазим, хлороталонил, купер, циазофамид, цифлуфенамид, цимоксанил, ципроконазол, ципродинил, дифеноконазол, диметоморф, дитианон, фенамидон, фенгексамид, флюазинам, флюдиоксонил, флюопиколид, флюопирам, флюоксастробин, флюксапироксад, фолпет, фосетил, ипродион, ипроваликарб, изопиразам, крезоксим-метил, манкозеб, мандипропамид, металаксил/мефеноксам, метирам, метрафенон, миклобутанил, пенконазол, пентиопирад, пикоксистробин, пропамокарб, пропиконазол, пропинеб, проквиназид, протиоконазол, пираклостробин, пириметанил, квиноксифен, спироксамин, сульфур, тебуконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин;

гербициды для злаковых: 2.4-D, амидосульфурон, бромоксинил, карфентразон-e, хлортолурон, хлорсульфурон, клодинафоп-p, клопиралид, дикамба, диклофоп-m, дифлуфеникан, феноксапроп, флорасулам, флюкарбазон-на, флюфенацет, флюпирсульфурон-m, флюроксипир, флюртамон, глифосат, йодсульфурон, иоксинил, изопротурон, mcpa, мезосульфурон, метсульфурон, пендиметалин, пиноксаден, пропоксикарбозон, просульфокарб, пироксулам, сульфосульфурон, тифенсульфурон, тралкоксидим, триасульфурон, трибенурон, трифлюралин, тритосульфурон;

фунгициды для злаковых: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлороталонил, цифлуфенамид, ципроконазол, ципродинил, димоксистробин, эпоксиконазол, фенпропидин, фенпропиморф, флюопирам, флюоксастробин, флюквиинконазол, флюксапироксад, изопиразам, крезоксим-метил, метконазол, метрафенон, пентиопирад, пикоксистробин, прохлораз, пропиконазол, проквиназид, протиоконазол, пираклостробин, квииноксифен, спироксамин, тебуконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин;

инсектициды для злаковых: диметоат, лямбда-цигалтрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, β-цифлутрин, бифентрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, хлорфирифос, пиримикарб, метиокарб, сульфоксафлор;

гербициды для кукурузы: атразин, алахлор, бромоксинил, ацетохлор, дикамба, клопиралид, (S-)диметенамид, глюфосинат, глифосат, изоксафлутол, (S-)метолахлор, мезотрион, никосульфурон, примисульфурон, римсульфурон, сулкотрион, форамсульфурон, топрамезон, темботрион, сафлуфенацил, триенкарбазон, флюфенацет, пироксасульфон;

инсектициды для кукурузы: карбофуран, хлорпирифос, бифентрин, фипронил, имидаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тиаметоксам, клотианидин, спиромесифен, флюбендиамид, трифлюмурон, ринаксипир, дельтаметрин, тиодикарб, β-цифлутрин, циперметрин, бифентрин, люфенурон, тебупиримфос, этипрол, циазипир, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, авермектин;

фунгициды для кукурузы: азоксистробин, биксафен, боскалид, ципроконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, фенитропан, флюопирам, флюоксастробин, флюксапироксад, изопиразам, метконазол, пентиопирад, пикоксистробин, пропиконазол, протиоконазол, пираклостробин, тебуконазол, трифлоксистробин;

гербициды для риса: бутахлор, пропанил, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, Даймурон, фентразамид, имазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, пиразосульфурон, пирибутикарб, квинклорак, тиобенкарб, инданофан, флюфенацет, фентразамид, галосульфурон, оксазикломефон, бензобициклон, пирифталид, пенокссулам, биспирибак, оксадиаргил, этоксисульфурон, петрилахлор, мезотрион, тефурилтрион, оксадиазон, феноксапроп, пиримисульфан;

инсектициды для риса: диазинон, фенобукарб, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фипронил, имидаклоприд, изопрокарб, тиаклоприд, хромафенозид, клотианидин, этипрол, флюбендиамид, ринаксипир, дельтаметрин, ацетамиприд, тиаметоксам, циазипир, спинозад, спиноторам, эмамектин-бензоат, циперметрин, хлорпирифос, этофенпрокс, карбофуран, бенфуракарб, сульфоксафлор;

фунгициды для риса: азоксистробин, карбендазим, карпропамид, диклоцимет, дифеноконазол, эдифенфос, феримзон, гентамицин, гексаконазол, гимексазол, ипробенфос (IBP), изопротиолан, изотианил, касугамицин, манкозеб, метоминостробин, орисастробин, пенкикурон, пробеназол, пропиконазол, пропинеб, пироквилон, тебуконазол, тиофанат-метил, тиадинил, трициклазол, трифлоксистробин, валидамицин;

гербициды для хлопка: диурон, флюометурон, MSMA, оксифторфен, прометрин, трифлюралин, карфентразон, клетодим, флюазифоп-бутил, глифосат, норфлуразон, пендиметалин, пиритиобак-натрия, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глюфосинат, флюмиоксазин, тидиазурон;

инсектициды для хлопка: ацефат, алдикарб, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, ацетамиприд, эмамектин бензоат, имидаклоприд, индоксакарб, лямбда-цигалотрин, спинозад, тиодикарб, гамма-цигалотрин, спиромесифен, пиридалил, флоникамид флюбендиамид, трифлюмурон, ринаксипир, бета-цифлутрин, спиротетрамат;

клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, динетоиуран, флюбендиамид, циазипир, спинозад, спиноторам, гамма цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, тиодикарб, авермектин, флоникамид, пиридалил, спиромесифен, сульфоксафлор;

фунгициды для хлопка: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлороталонил, купер, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, фенамидон, флюазинам, флюопирам, флюоксастробин, флюксапироксад, ипродион, изопиразам, изотианил, манкозеб, манеб, метоминостробин, пентиопирад, пикоксистробин, пропинеб, протиоконазол, пираклостробин, квинтозен, тебуконазол, тетраконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин;

гербициды для сои: алахлор, бентазон, трифлюралин, хлоримурон-этил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флюазифоп, глифосат, имазамокс, имазаквин, имазетапир, (S-)метолахлор, метрибузин, пендиметалин, тепралоксидим, глюфосинат;

инсектициды для сои: лямбда-цигалотрин, метомил, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетоиуран, флюбендиамид, ринаксипир, циазипир, спинозад, спиноторам, эмамектин-бензоат, фипронил, этипрол, дельтаметрин, β-цифлутрин, гамма и лямбда цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, спиротетрамат, спинодиклофен, трифлюмурон, флоникамид, тиодикарб, бета-цифлутрин;

фунгициды для сои: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлороталонил, купер, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, флюазинам, флюопирам, флюоксастробин, флютриафол, флюксапироксад, изопиразам, ипродион, изотианил, манкозеб, манеб, метконазол, метоминостробин, миклобутанил, пентиопирад, пикоксистробин, пропиконазол, пропинеб, протиоконазол, пираклостробин, тебуконазол, тетраконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин;

гербициды для сахарной свеклы: хлоридазон, десмедифам, этофумезат, фенмедифам, триаллат, клопиралид, флюазифоп, ленацил, метамитрон, квинмерак, циклоксидим, трифлюсульфурон, тепралоксидим, квизалофоп;

инсектициды для сахарной свеклы: имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофииран, дельтаметрин, β-цифлутрин, гамма/лямбда цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, тефлутрин, Ринаксипир, циаксипир, фипронил, карбофуран;

гербициды для канолы: клопиралид, диклофоп, флюазифоп, глюфосинат, глифосат, метазахлор, трифлюралин этаметсульфурон, квинмерак, квизалофоп, клетодим, тепралоксидим;

фунгициды для канолы: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, флюазинам, флюопирам, флюоксастробин, флюсилазол, флюксапироксад, ипродион, изопиразам, мепикватхлорид, метконазол, метоминостробин, паклобутразол, пентиопирад. Пикоксистробин, прохлораз, протиоконазол, пираклостробин, тебуконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин, винклозолин;

инсектициды для канолы: карбофуран, тиаклоприд, дельтаметрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, ацетамиприд, динетофииран, β-цифлутрин, гамма и лямбда цигалотрин, тау-флювалериат, этипрол, спинозад, спиноторам, флюбендиамид, ринаксипир, циазипир, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он.

В том смысле, в котором используется в данном описании "содержащий" необходимо интерпретировать, как определение наличия сформулированных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, которое ссылается, но не исключает наличия или дополнения одного или более признаков, целых чисел, стадий или компонентов, или их групп. Таким образом, например, нуклеиновая кислота или белок, содержащие последовательность нуклеотидов или аминокислот, могут содержать больше нуклеотидов или аминокислот, чем фактически изложено, т.е. могут быть заключены в более большую нуклеиновую кислоту или белок. Химерный ген, содержащий область ДНК, которая ограничена функционально или структурно, может содержать дополнительные области ДНК и т.д. В том смысле, в котором используется в данном описании, "часть растения" включает любой орган растения или ткань растения, включая но без ограничения плоды, семена, зародыши, меристемные области, каллусную ткань, листья, корни, побеги, цветы, гаметофиты, спорофиты, пыльцу и микроспоры.

Для целей данного изобретения, "идентичность последовательности" двух связанных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, выраженная в виде процентного отношения, относится к количеству позиций в двух оптимально выровненных последовательностях, которые имеют идентичные остатки (x100), разделенному на сравниваемое количество позиций. Пробел, т.е. Позиция в выравнивании, где остаток присутствует в одной последовательности, но не в другой, рассматривается как позиция с неидентичными остатками. Выравнивание двух последовательностей выполняют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch 1970). Проводимое с помощью компьютера выравнивание последовательностей выше, может быть выполнено общепризнанным образом с использованием стандартного программного обеспечения, такого как GAP, которое является частью Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA), с использованием по умолчанию матрицы замен со штрафом за создание пробела, равным 50, и штрафом за протяженность пробела, равным 3.

Необходимо понимать, что всегда, когда нуклеотидные последовательности молекул РНК определяются посредством ссылки на нуклеотидную последовательность соответствующих молекул ДНК, тимин (T) в нуклеотидной последовательности должен быть заменен на урацил (U). Делается ли ссылка на молекулы РНК или ДНК будет понятно из контекста заявки.

Следующие неограничивающие примеры описывают использование переконструированных мегануклеаз для модификации растений в сайте кодирующей области bar, уже присутствующей в растительном геноме.

Если в примерах не указано иное, все технологии рекомбинантных ДНК выполняются согласно стандартным протоколам, которые описаны в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY и в Томах 1 и 2 Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Стандартные материалы и способы для молекулярной работы с растениями описаны в Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy, опубликованной одновременно BIOS Scientific Publications Ltd (UK) и Blackwell Scientific Publications, UK. Другие ссылки на стандартные технологии молекулярной биологии включают Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Тома I и II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK). Стандартные материалы и способы для полимеразных цепных реакций могут быть обнаружены в Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, и в McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany.

Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые в данном документе, включены в данное описание посредством ссылки, во всей своей полноте, для всех целей.

По всему описанию и примерам, ссылка сделана на следующие последовательности:

SEQ ID NO: 1: нуклеотидная последовательность сайта узнавания переконструированных мегануклеаз BAY 39/BAY40

SEQ ID NO: 2: нуклеотидная последовательность комплемента сайта узнавания переконструированных мегануклеаз BAY 39/BAY40

SEQ ID NO: 3: нуклеотидная последовательность кодирующей области гена bar

SEQ ID NO: 4: нуклеотидная последовательность вектора pCV177, экспрессирующего пару мегануклеаз BAY 39 и BAY40 гетеродимера

SEQ ID NO: 5: аминокислотная последовательность мономерного звена 2 мегануклеазы BAY39/40 ("40")

SEQ ID NO: 6: аминокислотная последовательность мономерного звена 1 мегануклеазы BAY39/40 ("39")

SEQ ID NO: 7: нуклеотидная последовательность ПЦР ампликона кодирующей области bar вокруг сайта узнавания BAY39/40 (контроль)

SEQ ID NO: 8: нуклеотидная последовательность ПЦР ампликона кодирующей области bar вокруг сайта узнавания BAY39/40 (толерантная к PPT линия)

SEQ ID NO: 9: нуклеотидная последовательность ПЦР ампликона кодирующей области bar вокруг сайта узнавания BAY39/40 (чувствительная к PPT линия 1)

SEQ ID NO: 10: нуклеотидная последовательность ПЦР ампликона кодирующей области bar вокруг сайта узнавания BAY39/40 (чувствительная к PPT линия 2)

SEQ ID NO: 11: нуклеотидная последовательность ПЦР ампликона кодирующей области bar вокруг сайта узнавания BAY39/40 (чувствительная к PPT линия 3)

SEQ ID NO: 12: нуклеотидная последовательность ПЦР ампликона кодирующей области bar вокруг сайта узнавания BAY39/40 (чувствительная к PPT линия 4)

SEQ ID NO: 13: нуклеотидная последовательность ПЦР ампликона кодирующей области bar вокруг сайта узнавания BAY39/40 (чувствительная к PPT линия 5)

SEQ ID NO: 14: нуклеотидная последовательность ПЦР ампликона кодирующей области bar вокруг сайта узнавания BAY39/40 (чувствительная к PPT линия 6)

SEQ ID NO: 15: нуклеотидная последовательность ПЦР ампликона кодирующей области bar вокруг сайта узнавания BAY39/40 (чувствительная к PPT линия 7)

SEQ ID NO: 16: аминокислотная последовательность естественного варианта I-CreI (мономер)

SEQ ID NO: 17: нуклеотидная последовательность вектора pCV170, экспрессирующего одноцепочечную мегануклеазу BAY39/BAY40

SEQ ID NO: 18: аминокислотная последовательность одноцепочечной мегануклеазы BAY39/40

ПРИМЕРЫ

Все переконструированные мегануклеазы, описанные в данном документе, были сконструированы Precision Biosciences Inc. 104 T.W. Alexander Drive, Research Triyron Park, NC27713.

Пример 1: Описание векторов T-ДНК, кодирующих переконструированные мегануклеазы согласно изобретению

Используя общепризнанные технологии рекомбинантных ДНК, сконструировали химерный ген, кодирующий пару переконструированных мегануклеазных мономеров, которые в виде гетеродимера узнают нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 (hd BAY39/40), содержащий следующие функционально связанные фрагменты ДНК:

- область ДНК, кодирующую промотор CaMV35S (SEQ ID NO: 6 от nt позиции 1516 до nt позиции 1933, такая как SEQ ID NO: 4 от nt позиции 1516 до nt позиции 1997)

- область ДНК, содержащую мономерное звено 2 BAY 39/40, кодирующее область, функционально связанную с SV40 NLS на N-конце (SEQ ID NO: 4 от nt позиции 2004 до 2525, включая терминирующий кодон, или до 2522, исключая терминирующий кодон)

- область ДНК, включенную в конец 3’ терминации транскрипции и полиаденилирования из гена нопалин-синтазы (SEQ ID NO: 4 от nt позиции 2530 до 2783)

- область ДНК, кодирующую промотор CaMV35S (SEQ ID NO: 4 от nt позиции 4397 до nt позиции 4814, такую как SEQ ID NO: 4 от nt позиции 4397 до nt позиции 4878)

- область ДНК, содержащую мономерное звено 1 BAY 39/40, функционально связанное с SV40 NLS на N-конце (SEQ ID NO: 4 от nt позиции 4885 до 5405, включая терминирующий кодон, или до 5403, исключая терминирующий кодон)

- область ДНК, вовлеченную в конец 3’ терминации транскрипции и полиаденилирования из гена нопалин-синтазы (SEQ ID NO: 4 от nt позиции 5411 до 5664).

В SEQ ID NO: 4 представлена нуклеотидная последовательность полученной в результате плазмиды.

Используя общепризнанные технологии рекомбинантных ДНК, сконструировали химерный ген, кодирующий одноцепочечную переконструированную мегануклеазу, которая узнает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 (sc BAY39/40), содержащий следующие функционально связанные фрагменты ДНК:

- область ДНК, кодирующую промотор CaMV35S (SEQ ID NO: 17 от nt позиции 691 до nt позиции 1223)

- лидерную последовательность из гена rbcS ATS1A Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO: 17 от nt позиции 1224 до nt позиции 1266; Krebbers et al. 1988 Plant Molecular Biology 11:745-759)

- область ДНК, кодирующую N-терминальную область одноцепочечной мегануклеазы BAY 39/40, функционально связанную с SV40 NLS на N-конце, оптимизированную для экспрессии в табаке (SEQ ID NO: 17 от nt позиции 1267 до 1605)

- область ДНК, кодирующую второй интрон светоиндуцируемого ткань-специфического гена ST-LS1 картофеля(SEQ ID NO: 17 от nt позиции 1606 до 1794; X04753; Eckes et al. 1986 Mol. Gen. Genet. 205, 14-22)

- область ДНК, кодирующую C-терминальную область одноцепочечной мегануклеазы BAY 39/40 (SEQ ID NO: 17 от nt позиции 1795 до 1798, включая терминирующий кодон, или до 2541, исключая терминирующий кодон), включая область ДНК, кодирующую линкерную последовательность (SEQ ID NO: 17 от nt позиции 1757 до 2070), оптимизированную для экспрессии в табаке.

- область ДНК, включенную в конец 3’ терминации транскрипции и полиаденилирования, из гена 35S (SEQ ID NO: 17 от nt позиции 2545 до 2678).

Нуклеотидная последовательность полученной в результате плазмиды представлена в SEQ ID NO: 17.

Пример 2: Описание намеченной линии табака и анализ

Для того чтобы разработать испытание индуцирования разрыва двухцепочечной ДНК, выбрали толерантную к фосфинотрицину (PPT) линию трансгенного растения табака, которая содержала кодирующую область bar под управлением экспрессируемого растением промотора.

Данную трансгенную линию использовали в качестве первоначального материала для трансформации, в котором химерные гены, кодирующие мегануклеазы hd BAY39/40, были интродуцированы либо стабильно, либо временно вместе с экспрессируемым растением химерным геном, содержащим гигромицинфосфотрансферазу, придавая устойчивость к гигромицину.

После индуцирования разрыва двухцепочечной ДНК в сайте узнавания в кодирующей области bar посредством экспрессирования экспрессируемых растением химерных генов, кодирующих гетеродимер BAY39/40, разрыв может быть репарирован посредством негомологичного соединения концов в отсутствии репаративной ДНК, результатом чего является делеция или вставка одной или более пар основания, разрушая посредством этого кодирующую область bar, результатом чего является чувствительность к фосфинотрицину.

Выбрали несколько линий растений, демонстрирующих чувствительность к фосфинотрицину и устойчивость к гигромицину. Из данных линий растений с помощью ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК, используя праймеры, расположенные с каждой стороны сайта узнавания (SEQ ID NO: 1 или 2) в кодирующей области bar, и определили нуклеотидную последовательность ампликонов. На фигуре 5 представлено выравнивание различных нуклеотидных последовательностей.

Ясно, что у чувствительных к PPT линий растений (3-9), сайт узнавания для BAY39/40 был изменен за счет делеции (3-8) или вставки (9), тогда как у устойчивых к PPT линий (2) растений изменение обнаружено не было.

Таким образом, из данных экспериментов может быть сделано заключение, что hdBAY39/40 демонстрирует расщепляющую активность в предварительно выбранном сайте.

Пример 3: Намеченная вставка посредством негомологичного соединения концов

Совместная доставка pCV177, содержащей химерные гены, кодирующие мегануклеазы hd BAY39/40, или pCV170, содержащей химерный ген, кодирующий sc BAY39/40, с репаративной ДНК, содержащий селектируемый маркер, такой как экспрессируемый растением химерный ген, содержащий кодирующую область 2mepsp (без дополнительной гомологии с намеченной областью), в растительные клетки, содержащие экспрессируемый растением химерный ген bar, интегрированный в их геном, и отбор чувствительных к фосфинотрицину растений, толерантных к селективному соединению, такому как глифосат, предоставляет возможность идентификации растительных клеток, в которых последовательности репаративной ДНК интегированы в кодирующую область bar.

Пример 4: Намеченная вставка посредством гомологичного соединения концов

Совместная доставка либо pCV177, содержащей химерные гены, кодирующие мегануклеазы hd BAY39/40, либо pCV170, содержащей химерный ген, кодирующий sc BAY39/40, с репаративной ДНК содержащей селектируемый маркер, такой как экспрессируемый растением химерный ген, содержащий кодирующую область 2mepsp, фланкированную спереди фланкирующими последовательностями, содержащими нуклеотидную последовательность со сходством последовательности с кодирующей областью bar SEQ ID NO: 3 от нуклеотида 1 до нуклеотида 132, и фланкированную сзади фланкирующими последовательностями, содержащими нуклеотидную последовательность со сходством последовательности с кодирующей областью bar SEQ ID NO: 3 от нуклеотида 154 до нуклеотида 552, в растительные клетки, содержащие экспрессируемый растением химерный ген bar, интегрированный в их геном, и отбор чувствительных к фосфинотрицину растений, толерантных к селективному соединению, такому как глифосат, предоставляет возможность идентификации растительных клеток, в которых репаративная ДНК интегрирована в кодирующую область bar.

Пример 5: Индуцирование намеченного разрыва двухцепочечной ДНК, используя одноцепочечную BAY39/40 и гетеродимерную мегануклеазу в хлопке

Эмбриогенные каллусы из устойчивых к PPT растений хлопчатника, заключающих в себе химерный ген, содержащий ген bar под управлением промотора CSVMV, выращивали на субстрате M100 (соли MS, витамины B5, MES 0,5 г/л, MgCl₂.6H₂0 0,94 г/л, гельрит 2 г/л, глюкоза 30 г/л, pH 5,8) с 2 г/л активированного угля. Данные каллусы подвергали бомбардировке микрочастицами, используя систему биолистической доставки частиц BioRAD PPS_1000/He, которая по существу описана Sanford et al. 1992, посредством которой частицы покрывали либо вектором pCV177, кодирующим гетеродимерную мегануклеазу BAY39/40, либо вектором pCV170, кодирующим одноцепочечную мегануклеазу BAY39/40. осуществляли совместную доставку вектора мегануклеазы с вектором, заключающим в себе ген 2mEPSPS, под управлением экспрессируемого растением промотора, придавая толерантность к глифосату в качестве селектируемого маркерного гена. После бомбардировки, каллусы переносили в среду, содержащую в себе 1 мМ глифосата, результатом чего было приблизительно 3000 устойчивых к глифосфату эмбриогенных каллусов. Из них, 85 объектов представлялись чувствительными к PPT, из которых 79 объектов дополнительно анализировали на молекулярном уровне. генотип данных 79 объектов исследовали с помощью ПЦР, используя праймеры, фланкирующие сайт-мишень, и последующее секвенирование продукта ПЦР. отсутствие продукта ПЦР является показателем большой делеции вокруг сайта-мишени (таблица 1).

Таблица 1 Характеристика чувствительных к PPT устойчивых к глифосату случаев трансформации
pCV170 (sc) получаемый продукт ПЦР	# случаев	изменение в сайте-мишени	# случаев
нет	11	большая делеция	11
да	8	нет мутации	6
		замена/вставка	1
		делеция	1
нет	33	большая делеция	33
да	27	нет мутации	19
		вставка	4
		делеция	4

Таблица 1:.

Таким образом, данные результаты демонстрируют, что как одноцепочечная, так и гетеродимерная мегануклеаза BAY39/40 способны индуцировать намеченный разрыв двухцепочечной ДНК в необходимом положении и что намеченные объекты делеции, замены и вставки могут достигаться при использовании данных мегануклеаз в хлопке.

1. Способ введения молекулы чужеродной ДНК в предварительно определенный сайт в геноме трансгенной растительной клетки, содержащей в своем геноме область ДНК, кодирующую фосфинотрицин ацетилтрансферазу, которая кодируется Streptomyces hygroscopicus (кодирующая область bar), включающий стадии:

a. индуцирования разрыва двухцепочечной ДНК в указанном предварительно определенном сайте;

b. введения указанной молекулы чужеродной ДНК в указанную клетку растения; и

c. отбора растительной клетки, в которой указанная чужеродная ДНК введена в указанный предварительно определенный сайт;

отличающийся тем, что указанный предварительно определенный сайт представляет собой нуклеотидную последовательность, которая отличается от сайта узнавания для встречающейся в природе мегануклеазы, и содержится в пределах области ДНК, кодирующей фосфинотрицин ацетилтрансферазу, которая кодируется Streptomyces hygroscopicus (кодирующая область bar), и указанный разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения не встречающейся в природе одноцепочечной мегануклеазы или пары не встречающихся в природе мегануклеаз, которая узнает или которые совместно узнают указанный предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют указанный двухцепочечный разрыв.

2. Способ по п. 1, в котором указанный предварительно определенный сайт содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

3. Способ по п. 1, в котором указанная кодирующая область bar включает в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.

4. Способ введения молекулы чужеродной ДНК в предварительно определенный сайт в геноме трансгенной растительной клетки, содержащей в своем геноме нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, включающий стадии:

a. индуцирования разрыва двухцепочечной ДНК в указанном предварительно определенном сайте;

b. введения указанной молекулы чужеродной ДНК в указанную клетку растения; и

c. отбора растительной клетки, в которой указанная чужеродная ДНК введена в указанный предварительно определенный сайт;

отличающийся тем, что указанный предварительно определенный сайт содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, и указанный разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения одноцепочечной мегануклеазы или пары мегануклеаз, которая узнает или совместно узнают указанный предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют указанный двухцепочечный разрыв.

5. Способ по п. 1 или 4, где мегануклеаза или пара мегануклеаз происходит/происходят из I-Crel.

6. Способ по п. 1 или 4, в котором указанная мегануклеаза или указанная пара мегануклеаз происходит/происходят из I-CreI, и в котором следующие аминокислоты находятся в мегануклеазном звене 1:

a. S в позиции 32;

b. Y в позиции 33;

c. Ев позиции 38;

d. R в позиции 40;

e. K в позиции 66;

f. Q в позиции 80;

g. Т в позиции 42;

h. R в позиции 77;

i. R в позиции 68;

j. R в позиции 70;

k. Q в позиции 44;

l. I в позиции 24;

m. S в позиции 26;

n. S в позиции 28;

o. R в позиции 30;

и в котором следующие аминокислоты находятся в мегануклеазном звене 2:

p. R в позиции 70;

q. Т в позиции 44;

r. I в позиции 24;

s. S в позиции 26;

t. S в позиции 28;

u. N в позиции 30;

v. S в позиции 32;

w. R в позиции 33;

х. Q в позиции 38;

y. Q в позиции 80;

z. R в позиции 40;

aa. K в позиции 66;

bb. Т в позиции 42;

cc. R в позиции 77;

dd. R в позиции 68.

7. Способ по п. 1 или 4, в котором указанная пара мегануклеаз облигатно образует гетеродимеры, или в котором указанная мегануклеаза представляет собой одноцепочечную мегануклеазу, содержащую два домена, происходящие из I-CreI, ковалентно связанные линкером.

8. Способ по п. 1 или 4, в котором указанная пара мегануклеаз содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно, или в котором указанная пара мегануклеаз закодирована нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 от нуклеотидной позиции 2004 до нуклеотидной позиции 2525 или до 2522 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 от нуклеотидной позиции 4885 до нуклеотидной позиции 5406 или до 5403, или в котором указанная одноцепочечная мегануклеаза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 от позиции 1 до 167 и от позиции 206 до 362, или в котором указанная одноцепочечная мегануклеаза закодирована молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17 от нуклеотидной позиции 1267 до 1605 и от 1796 до 1956 и от 2071 до 2541, или указанная одноцепочечная мегануклеаза закодирована молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17 от нуклеотидной позиции 1267 до 1605 и от 1796 до 2544 или 2541.

9. Способ по п. 1 или 4, в котором указанная чужеродная ДНК содержится внутри репаративной ДНК, при этом указанная репаративная ДНК содержит по меньшей мере одну фланкирующую нуклеотидную последовательность, гомологичную расположенной до или после последовательности нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.

10. Способ по п. 1 или 4, в котором указанную мегануклеазу или указанную пару мегануклеаз экспрессируют из химерного гена или пары химерных генов, каждый из которых содержит экспрессируемый растением промотор, функционально связанный с кодирующей областью, кодирующей указанную мегануклеазу или одну из указанной пары мегануклеаз, и дополнительно функционально связанный с областью ДНК, вовлеченной в терминацию транскрипции и функциональное полиаденилирование в растительной клетке.

11. Способ по п. 1 или 4, в котором указанная чужеродная ДНК содержит селектируемый маркерный ген.

12. Способ по п. 1 или 4, в котором указанная чужеродная ДНК содержит интересующий экспрессируемый растением ген, при этом указанный интересующий ген необязательно выбирают из гена толерантности к гербицидам, гена резистентности к насекомым, гена резистентности к заболеваниям, гена резистентности к абиотическому стрессу, фермента, вовлеченного в биосинтез масел, углеводный биосинтез, фермента, связанного с прочностью волокон или длиной волокон, фермента, вовлеченного в биосинтез вторичных метаболитов.

13. Способ по п. 1 или 4, в котором указанную клетку растения дополнительно регенерируют в растение.

14. Применение способа по п. 1 или 4 для получения клетки растения, в которой чужеродная молекула ДНК была введена в предварительно определенный сайт, где предварительно определенный сайт представляет собой нуклеотидную последовательность, которая отличается от сайта узнавания для встречающейся в природе мпегануклеазы, и содержится в пределах области ДНК, кодирующей фосфинотрицин ацетилтрансферазу, которая кодируется Streptomyces hygroscopicus (кодирующая область bar), и указанный разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения не встречающейся в природе одноцепочечной мегануклеазы или пары не встречающихся в природе мегануклеаз, которая узнает или которые совместно узнают указанный предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют указанный двухцепочечный разрыв.

15. Применение способа по п. 13 для получения растения, в котором чужеродная молекула ДНК была введена в предварительно определенный сайт, где предварительно определенный сайт представляет собой нуклеотидную последовательность, которая отличается от сайта узнавания для встречающейся в природе мпегануклеазы, и содержится в пределах области ДНК, кодирующей фосфинотрицин ацетилтрансферазу, которая кодируется Streptomyces hygroscopicus (кодирующая область bar) и указанный разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения не встречающейся в природе одноцепочечной мегануклеазы или пары не встречающихся в природе мегануклеаз, которая узнает или которые совместно узнают указанный предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют указанный двухцепочечный разрыв.

16. Применение по п. 15 для получения семени, в котором указанная чужеродная ДНК была введена в указанный предварительно определенный сайт.

17. Применение не встречающейся в природе мегануклеазы или пары не встречающейся в природе мегануклеаз для введения разрыва двухцепочечной ДНК в кодирующую область bar в геноме трансгенной растительной клетки, где указанная мегануклеаза или пара мегануклеаз распознает(ют) и игдуцирует(ют) разрыв двухцепочечной ДНК в предварительно определенном сайте, где предварительно определенный сайт представляет собой нуклеотидную последовательность, которая отличается от сайта узнавания для встречающейся в природе мегануклеазы, и содержится в пределах области ДНК, кодирующей фосфинотрицин ацетилтрансферазу, которая кодируется Streptomyces hygroscopicus (кодирующая область bar).

18. Применение не встречающейся в природе мегануклеазы для введения разрыва двухцепочечной ДНК в предварительно определенный сайт в растительной клетке, содержащий нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, где указанный предварительно определенный сайт представляет собой нуклеотидную последовательность, которая отличается от сайта узнавания для встречающейся в природе мегануклеазы и представляет собой нуклеотидную последовательность, обычно вводимую в виде части трансгена в трансгенное растение, где указанный разрыв двухцепочечной ДНК индуцируют посредством введения не встречающейся в природе одноцепочечной мегануклеазы или пары не встречающихся в природе мегануклеаз, которая узнает или которые совместно узнают указанный предварительно определенный сайт и индуцирует или индуцируют указанный двухцепочечный разрыв.

19. Применение по пп. 17 и 18, где мегануклеаза или пара мегануклеаз происходит/происходят из I-Crel.