Способ производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты

Изобретение относится к производству формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты. Способ предусматривает получение субстрата гиалуроновой кислоты, растворенной в первой жидкой среде, которая представляет собой водный раствор, без какого-либо сшивания, осаждение субстрата гиалуроновой кислоты, подвергая его воздействию второй жидкой среды, содержащей один или более первых водорастворимых органических растворителей в количестве, обеспечивающем условия осаждения гиалуроновой кислоты без какого-либо сшивания. Причем на этих стадиях придают субстрату гиалуроновой кислоты желаемую форму в виде частиц, волокон, ленты, нити, сетки, пленки, диска или гранул. После чего подвергают осажденный субстрат несшитой гиалуроновой кислоты в желаемой форме единственной стадии сшивания в третьей жидкой среде в условиях, подходящих для получения осажденного формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты. Третья жидкая среда имеет рН 11,5 или выше и содержит один или более полифункциональных сшивающих агентов и количество одного или более вторых органических растворителей, обеспечивающих условия осаждения гиалуроновой кислоты. Также предложены формованные продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, водная композиция, содержащая один из этих продуктов, и применение формованного продукта или водной композиции в косметической хирургической операции. Изобретение позволяет получить формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты с высокой устойчивостью к деформации. 5 н. и 26 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 табл., 13 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области полисахаридов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым способам сшивания гиалуроновой кислоты и изготовления формованных продуктов из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты.

Предшествующий уровень техники

Одним из наиболее широко используемых биосовместимых полимеров для медицинского применения является гиалуроновая кислота. Это природный полисахарид, принадлежащий к группе гликозаминогликанов (ГАГ). Гиалуроновая кислота и другие ГАГ представляют собой отрицательно заряженные гетерополисахаридные цепи, которые имеют способность поглощать большое количество воды. Гиалуроновая кислота и продукты, полученные из гиалуроновой кислоты, широко используются в биомедицинских и косметических областях, например в вискохирургии, и в качестве дермального наполнителя.

Водопоглощающие гели или гидрогели широко используются в области биомедицины. Их обычно получают путем химического сшивания полимеров в бесконечные сети. В то время как природная гиалуроновая кислота и определенные продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты поглощают воду до тех пор, пока они полностью не растворятся, гели из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, как правило, поглощают определенное количество воды до тех пор, пока они не станут насыщенными, то есть они имеют конечную способность удерживать жидкость или степень набухания.

При получении гелей из биосовместимых полимеров целесообразно обеспечить низкую степень сшивки для поддержания высокой биологической совместимости. Однако часто требуется, чтобы более плотный гель имел надлежащий биомедицинский эффект, и в таком случае биосовместимость часто будет утрачена.

Поскольку гиалуроновая кислота идентичной химической структуры, за исключением ее молекулярной массы, присутствует в большинстве живых организмов, она индуцирует минимум нежелательных реакций, что позволяет ее использовать для передовых медицинских применений. Сшивание и/или другие модификации молекулы гиалуроновой кислоты необходимы для улучшения ее устойчивости к разложению или времени существования in vivo. Кроме того, такие модификации влияют на способность молекулы гиалуроновой кислоты удерживать жидкость. Как следствие, гиалуроновая кислота была предметом многих попыток модификации.

Поскольку гелевые продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты являются очень сложными химическими структурами, они, как правило, характеризуются сочетанием их химических структур и их физических свойств. Отклонения в химической структуре от немодифицированной гиалуроновой кислоты, как правило, характеризуются как степень модификации, модифицикационная степень, степень сшивки, показатель сшивки или химическая модификация, все из которых связаны с количеством сшивающего агента, ковалентно связанного с гиалуроновой кислотой. В данном описании будет использоваться термин «степень модификации». Наиболее релевантные физические свойства гелевого продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты - это объем жидкости, который может поглощать гель, и реологические свойства геля. Эти оба свойства описывают структурную стабильность геля, которую часто называют прочностью геля или твердостью геля, но, хотя поглощение жидкости может быть определено для сухого геля, реологические свойства должны быть измерены на геле, который находится в набухшем состоянии до требуемой концентрации. Традиционными понятиями, отражающими поглощение жидкости, являются набухание, способность к набуханию, способность удерживать жидкость, степень набухания, степень набухания, максимальное поглощение жидкости и максимальное набухание. На протяжении всего этого описания будет использоваться термин «степень набухания». Относительно реологических свойств гелевых продуктов из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты можно отметить, что вращательная реометрия полезна только для определения реологических свойств жидкостей, в то время как для определения реологии гелей необходима осциллирующая реометрия. Измерение дает сопротивление геля деформации в виде модуля упругости и модуля вязкости. Высокая прочность геля обеспечит большую устойчивость к деформации гелевого продукта, набухшего до требуемой концентрации.

В US 2007/0066816 раскрыт способ получения дважды поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, включающий сшивание субстрата гиалуроновой кислоты в две стадии с использованием эпоксида и карбодиимида, соответственно.

В EP 2199308 A1 описано сшивание порошка гиалуронана, который диспергирован в жидкой среде, содержащей этанол. Полученные продукты имеют слабо контролируемую форму.

US 2012/0034462 A1 предполагает без экспериментального подтверждения, что тонкие нити сшитого геля ГК можно получить пропусканием твердой массы сшитого геля ГК через сито или сетку.

Несмотря на успехи в данной области, сохраняется потребность в альтернативных способах производства формованных продуктов из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющих подходящую способность удерживать жидкость и пригодный профиль разложения с сохраненной биосовместимостью. В частности, желательно свести к минимуму степень модификации, которая необходима для получения формованного продукта на основе геля гиалуроновой кислоты, имеющего желаемую прочность геля, которая, например, может быть измерена в виде способности удерживать жидкость.

Некоторые известные способы наращивания мягких тканей, включающие имплантаты, иногда имеют недостаток, который заключается в том, что имплантат или его часть мигрирует от желаемого места обработки. Еще одна проблема некоторых известных способов наращивания тканей, включающих имплантаты, заключается в том, что имплантат смещается с желаемого места обработки. Миграция и смещение имплантата неблагоприятны для пациента, так как это может ухудшить косметический и/или терапевтический результат лечения, и может препятствовать удалению имплантата, если это желательно. Очень полезно поддерживать целостность и расположение имплантата в течение требуемого времени. Для того чтобы избежать указанных выше проблем, гель должен иметь определенную прочность для противодействия деформации. Это свойство может быть измерено с помощью реометрии в осциллирующем режиме.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является предложение способа производства продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющего желаемую форму. Особой задачей настоящего изобретения является предложение способа производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющего форму, которая ограничивает возможность миграции продукта после имплантации субъекту.

Другой задачей настоящего изобретения является предложение способа производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющего высокую биосовместимость, то есть сохраняющего высокую биосовместимость гиалуроновой кислоты после того, как ей придали желаемую и полезную форму.

Для решения этих основных задач и/или других задач, которые очевидны из данного описания, было понятно, что основная задача настоящего изобретения заключается в разработке способа производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющего степень модификации от низкой до умеренной и в то же время высокую прочность геля, которая характеризуется от низкой до умеренной способностью удерживать жидкость или степенью набухания.

Еще одной задачей настоящего изобретения является разработка способа производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, в котором можно регулировать способность удерживать жидкость или влиять на нее другими параметрами, а не степенью модификации гиалуроновой кислоты.

Еще одной задачей настоящего изобретения является разработка способа производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, в котором высокая доля связанного сшивающего агента (агентов) соединена (по меньшей мере) двумя концами, то есть для достижения высокой степени сшивки.

Еще задачей настоящего изобретения является разработка способа производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющего степень модификации от низкой до умеренной и в то же время способность удерживать жидкость или степень набухания от низкой до умеренной.

Задачей настоящего изобретения также является предложение формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет высокую устойчивость к деформации.

Для решения этих и других задач, которые будут очевидны из данного описания, настоящее изобретение предлагает в соответствии с первым аспектом способ производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, включающий стадии:

(i) получения субстрата гиалуроновой кислоты, растворенной в первой жидкой среде, который представляет собой водный раствор, без какого-либо сшивания;

(ii) осаждения субстрата гиалуроновой кислоты, подвергая его воздействию второй жидкой средой, содержащей количество одного или более первых водорастворимых органических растворителей, которые обеспечивают условия осаждения гиалуроновой кислоты без какого-либо сшивания;

причем стадия (i) и/или стадия (ii) дополнительно включает придание субстрату гиалуроновой кислоты желаемой формы; и

(iii) подвергания осажденного субстрата несшитой гиалуроновой кислоты в желаемой форме единственной стадии сшивания в третьей жидкой среде, имеющей pH 11,5 или выше и содержащей один или более полифункциональных сшивающих агентов и количество одного или более вторых органических растворителей, обеспечивающих условия осаждения гиалуроновой кислоты в условиях, подходящих для получения осажденного формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты.

Было обнаружено, что этот способ успешно позволяет изготавливать формованные продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющие весьма желательные свойства. Этот способ обеспечивает хороший контроль сшивания, поскольку оно происходит только в твердой (осажденной) фазе, а не в растворенной фазе и/или между стадиями способа. Полученный продукт уникален тем, что он представляет собой гель с низкой степенью набухания, несмотря на низкую степень модификации гиалуроновой кислоты. Весьма удивительно, что гелевый продукт, имеющий ограниченную степень набухания, вообще может быть получен с такой низкой степенью модификации. Удивительно также то, что способ с единственной реакцией сшивания позволяет получить такие продукты с желаемыми свойствами. Среди многих применений, этот способ позволяет изготавливать продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющие заранее заданную форму, которая сохраняется в процессе производства. Этот способ также позволяет изготавливать биосовместимые формованные продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты.

В конкретном варианте осуществления первые две стадии (i) и (ii) осуществляют в отсутствие сшивающего агента, а полифункциональный сшивающий агент добавляют на третьей стадии (iii) сшивания. Это гарантирует то, что количество сшивающего агента строго контролируют, поскольку на предыдущих стадиях сшивающий агент не вступает в реакцию или не теряется, например, во время стадии осаждения.

В одном варианте осуществления изобретения стадия (i) дополнительно включает придание раствору субстрата гиалуроновой кислоты желаемой формы на гидрофобной поверхности; и осаждение формованного субстрата гиалуроновой кислоты на стадии (ii) на указанной гидрофобной поверхности. Это выгодно для устранения загрязнения структур и сохранения их формы. Гидрофобную поверхность предпочтительно выбирают из фторуглеродов, полипропилена (ПП), полиэтилентерефталата, модифицированного гликолем (ПЭТГ), полиэтилена (ПЭ) и политетрафторэтилена (ПТФЭ).

В некоторых вариантах осуществления водный раствор на стадии (i) содержит 40-100 об. % воды и 0-60 об. % низших алкильных спиртов. Таким образом, может быть получена запутанная структура, которая, вероятно, будет выгодна для получения гелевого продукта с заданными свойствами.

В определенных вариантах осуществления изобретения вторая жидкая среда на стадии (ii) содержит 0-30 об. % воды и 70-100 об. % первого водорастворимого органического растворителя (растворителей). В некоторых вариантах осуществления вторая жидкая среда на стадии (ii) содержит 0-10 об. % воды и 90-100 об. % первого водорастворимого органического растворителя (растворителей). Полагают, что высокая концентрация первого водорастворимого органического растворителя (растворителей) выгодна для достижения быстрого осаждения. Таким образом, может быть получена запутанная структура, которая, вероятно, будет выгодна для получения гелевого продукта с заданными свойствами.

В некоторых вариантах осуществления первый водорастворимый органический растворитель (растворители) на стадии (ii) представляет собой один или более низших алкильных спиртов. В некоторых вариантах осуществления низший алкильный спирт представляет собой этанол. Эти органические растворители обеспечивают быстрое осаждение.

Стадия (i) и/или стадия (ii) дополнительно включает придание субстрату гиалуроновой кислоты желаемой формы. Понятие "форма" и "желаемая форма" означает заранее заданную структуру, которая является полезной в конечном продукте, т.е. не просто лиофилизированный или осажденный порошок гиалуронана.

В некоторых вариантах осуществления форму выбирают из группы, состоящей из частицы, волокна, ленты, нити, сетки, пленки, диска и гранулы, которые предпочтительно имеют протяженность по меньшей мере 0,5 мм, предпочтительно более 1 мм, более предпочтительно более 5 мм, по меньшей мере в одном измерении. В некоторых вариантах осуществления форма субстрата имеет протяженность менее 5 мм, предпочтительно менее 1 мм, по меньшей мере в одном измерении. Это облегчает доступ сшивающего агента к большому количеству доступных мест связывания осажденных продуктов гиалуроновой кислоты в последующих стадиях сшивания. В некоторых вариантах осуществления форма субстрата вытянута в продольном направлении и имеет соотношение ее продольной длины к ее наибольшей поперечной длине 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже.

В определенных вариантах осуществления изобретения стадия (ii) включает экструдирование субстрата гиалуроновой кислоты во вторую жидкую среду, содержащую количество первого водорастворимого органического растворителя (растворителей), обеспечивающего условия осаждения гиалуроновой кислоты, посредством чего экструдированный субстрат гиалуроновой кислоты образует осажденное волокно во второй жидкой среде.

В некоторых вариантах осуществления изобретения третья жидкая среда на стадии (iii) содержит 0-35 об. % воды, 65-100 об. % вторых органических растворителей, и один или более полифункциональных сшивающих агентов. В определенных вариантах осуществления изобретения вторые органические растворители на стадии (iii) представляют собой один или более низших алкильных спиртов. В некоторых вариантах осуществления изобретения низший алкильный спирт представляет собой этанол.

В определенных вариантах осуществления изобретения третья жидкая среда на стадии (iii) имеет pH 13 или выше. Неожиданно было обнаружено, что выполнение сшивания осажденного формованного субстрата при повышенном значении pH обеспечивает получение формованных гелевых продуктов с эффективной сшивкой, т.е. низкая степень модификации обеспечивает прочный гель с низкой степенью набухания.

В определенных вариантах осуществления изобретения полифункциональные сшивающие агенты индивидуально выбирают из группы, состоящей из дивинилсульфона, полиэпоксидов и диэпоксидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения полифункциональные сшивающие агенты индивидуально выбирают из группы, состоящей из 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидилового эфира (EDDE) и диэпоксиоктана. В определенных вариантах осуществления изобретения полифункциональный сшивающий агент представляет собой 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE).

В определенных вариантах осуществления изобретения один или более полифункциональных сшивающих агентов обеспечивают поперечные сшивки одного типа. В определенных вариантах осуществления изобретения один или более полифункциональных сшивающих агентов обеспечивают поперечные сшивки в виде простых эфирных связей, которые являются стабильными. Способ согласно изобретению обеспечивает получение гелевых продуктов из однократно поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, которые являются стабильными и могут быть легко стерилизованы, например, в автоклаве.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает следующие стадии:

(iv) подвергание осажденного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты воздействию неосаждающих условий; и

(v) выделения продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты в неосажденной форме.

В определенных вариантах осуществления изобретения стадия (v) дополнительно включает стерилизацию продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение предлагает формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющий степень модификации, составляющую 1-40 фрагментов сшивающего агента на 1000 дисахаридных звеньев, и степень набухания, составляющую 4-300 мл на грамм гиалуроновой кислоты. Этот формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты имеет весьма полезные свойства, включая уникальную комбинацию степени модификации от низкой до умеренной и в то же время степени набухания или способности удерживать жидкость от низкой до умеренной. Таким образом, можно получить прочный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты желаемой формы при сохранении биосовместимости природной гиалуроновой кислоты. Продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты в соответствии с изобретением имеют заранее определенную форму или структуру.

В определенных вариантах осуществления изобретения степень набухания составляет 15-180 мл на грамм гиалуроновой кислоты.

Эффективность модификации (MoE) является мерой соотношения между минимальной концентрацией ГК (C_min) или жесткостью/прочностью геля и степенью его химической модификации с помощью сшивающего агента (агентов). В конкретных вариантах осуществления эффективность модификации составляет 10 или выше. В некоторых вариантах осуществления эффективность модификации составляет 20-190 или 20-150. Продукты с эффективностью модификации 10 или выше, например в диапазоне 20-190 или 20-150, объединяют, в первую очередь, степень модификации от низкой до умеренной и в то же время степень набухания или способность удерживать жидкость от низкой до умеренной. Таким образом, можно обеспечить прочный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты желаемой формы, который является биосовместимым и который имеет высокую стойкость к деформации.

В некоторых вариантах осуществления отношение сшивающего агента, которое характеризует долю сшивающего агента от всего связанного сшивающего агента, который связан с двумя (или более) дисахаридами, составляет 35% или выше. В конкретных вариантах осуществления соотношение сшивающего агента составляет 40% или выше, а в некоторых вариантах даже 50% или выше. Эти формованные продукты, следовательно, имеют низкое количество сшивающих агентов, которые не обеспечивают эффективные поперечные связи в продукте. Высокое соотношение сшивающего агента позволяют использовать удивительно низкую общую степень модификации относительно степени набухания от низкой до умеренной, комбинации, которая является выгодной с точки зрения биосовместимости, но достаточной для поддержания желаемой формы.

В определенных вариантах осуществления изобретения формованный продукт из гиалуроновой кислоты является поперечно сшитым с помощью одного или более полифункциональных сшивающих агентов, индивидуально выбранных из группы, состоящей из дивинилсульфона, полиэпоксидов и диэпоксидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения полифункциональные сшивающие агенты индивидуально выбирают из группы, состоящей из 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидилового эфира (EDDE) и диэпоксиоктана. В определенных вариантах осуществления изобретения полифункциональный сшивающий агент представляет собой 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE).

В определенных вариантах осуществления изобретения формованный продукт из гиалуроновой кислоты является поперечно сшитым однократно. Выгодно, что формованный продукт с одним типом поперечных сшивок проявляет такие желаемые свойства. В некоторых вариантах осуществления формованный продукт из гиалуроновой кислоты представляет собой многократно сшитый продукт. В конкретных вариантах осуществления формованный продукт из гиалуроновой кислоты является сшитым простыми эфирными связями. Формованные сшитые простыми эфирными связями гелевые продукты из гиалуроновой кислоты в соответствии с изобретением являются стабильными и легко могут быть стерилизованы, например, в автоклаве.

В определенных вариантах осуществления продукт из гиалуроновой кислоты имеет форму, выбранную из группы, состоящей из частицы, волокна, ленты, нити, сетки, пленки, диска и гранулы. В некоторых вариантах осуществления продукт из гиалуроновой кислоты является полым или имеет несколько слоев. В некоторых вариантах осуществления форма является удлиненной в продольном направлении и имеет соотношение ее продольной длины к ее наибольшей поперечной длине 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже. Могут быть разработаны сшитые продукты, удлиненные в продольном направлении, чтобы устранить или снизить миграцию/смещение in vivo, но которые остаются легко инъецируемыми. В конкретных вариантах осуществления продукт из гиалуроновой кислоты является волокном, а соотношение между его длиной и шириной, например его средним диаметром, составляет 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже.

В некоторых вариантах осуществления изобретения формованный продукт из гиалуроновой кислоты представлен в полностью набухшем состоянии. В полностью набухшем состоянии предпочтительно, чтобы продукт имел удлиненную в продольном направлении форму, а его наибольший поперечный размер составлял менее 5 мм, например, менее 1 мм, 0,5 и предпочтительно менее 0,2 мм. Удлиненный в продольном направлении сшитый продукт с наибольшим поперечным размером менее 5 мм или даже ниже является легко инъецируемым. В полностью набухшем состоянии еще более предпочтительно, чтобы продукт имел удлиненную в продольном направлении форму и его продольная длина составляла более 2 мм, например более 25 мм, например более 500 мм. Удлиненный в продольном направлении сшитый продукт с продольной длиной 2 мм или более является предпочтительным, поскольку он позволяет устранить или снизить миграцию/смещение in vivo, в других вариантах осуществления формованный продукт гиалуроновой кислоты присутствует в частично набухшем или ненабухшем состоянии in vivo.

В других вариантах осуществления формованный продукт из гиалуроновой кислоты присутствует в частично набухшем или ненабухшем состоянии.

В конкретных вариантах осуществления формованный продукт из гиалуроновой кислоты можно обрабатывать в автоклаве. В других конкретных вариантах осуществления формованный продукт из гиалуроновой кислоты является обработанным в автоклаве.

Одним из предпочтительных способов производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению является способ в соответствии с изобретением.

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение предлагает водную композицию, содержащую формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению и, возможно, буферный агент.

В некоторых вариантах осуществления изобретения формованный продукт из гиалуроновой кислоты согласно изобретению или водная композиция в соответствии с изобретением являются полезными в качестве лекарственного средства или медицинского устройства в медицинских или хирургических способах.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к применению формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению или водной композиции в соответствии с изобретением в косметической или медицинской хирургической операции. Иными словами, настоящее изобретение предлагает формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению или водную композицию в соответствии с изобретением для применения в косметической или медицинской хирургической операции.

В некоторых вариантах осуществления применение является применением в косметической хирургической операции, выбранной из дермального наполнения и контурной пластики тела. В некоторых других вариантах осуществления применение является применением в качестве лекарственного средства в лечении и/или в медицинской хирургической операции, выбранной из дермального наполнения, контурной пластики тела, предотвращения адгезии тканей, формирования каналов, лечения недержания и ортопедических применений.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение предлагает применение формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению или водную композицию в соответствии с изобретением для доставки лекарств. В альтернативных терминах, настоящее изобретение предлагает формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению или водную композицию в соответствии с изобретением для применения в доставке лекарств.

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение предлагает предварительно заполненный шприц, который предварительно заполнен стерилизованным формованным продуктом из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению или стерилизованной водной композицией в соответствии с изобретением.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение предлагает способ лечения субъекта, подвергающегося косметической или медицинской хирургической операции, включающий введение формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению или водной композиции в соответствии с изобретением субъекту, нуждающемуся в этом.

В определенных вариантах осуществления субъект подвергается косметической хирургической операции, выбранной из дермального наполнения и контурной пластики тела. В некоторых других вариантах осуществления субъект подвергается медицинской хирургической операции или медицинскому лечению в связи с состоянием, выбранным из дермального наполнения, контурной пластики тела, предотвращения адгезии тканей, формирования каналов, лечения недержания и ортопедических применений.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана полностью набухшая сеть поперечно-сшитой ГК.

На фиг. 2 показаны ¹H ЯМР спектры при 400 МГц двух ферментативно расщепленных гелевых композиций ГК.

На фиг. 3 показаны фотографии с микроскопа волокон геля поперечно-сшитой ГК.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий изменение степени набухания (SwD) в г/г при хранении в течение 14 дней при 60°C.

На фиг. 5 показаны фотографии с микроскопа порошка поперечно-сшитой ГК (сравнительный пример) и продукта согласно изобретению.

На фиг. 6 показаны фотографии с микроскопа волокон геля поперечно-сшитой ГК.

На фиг. 7 показаны фотографии с микроскопа геля поперечно-сшитой ГК, пропущенного один раз через сита (сравнительный пример).

Подробное описание изобретения

Согласно одному аспекту настоящее изобретение предлагает способ производства. Этот способ является способом производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты из субстрата гиалуроновой кислоты.

Если не предусмотрено иное, термин "гиалуроновая кислота" охватывает все варианты и комбинации вариантов гиалуроновой кислоты, гиалуроната или гиалуронана с различной длиной цепи и различных заряженных состояний, а также различные химические модификации. То есть этот термин охватывает также различные гиалуронатные соли гиалуроновой кислоты, такие как гиалуронат натрия. Различные модификации гиалуроновой кислоты также охватываются термином, таким как окисление, например окисление групп -CH₂OH в группы -COOH; окисление периодатом вицинальных гидроксильных групп, необязательно с последующим восстановлением или образованием иминов и т.п.; восстановление, например восстановление -COOH в -CH₂OH; сульфатирование; дезамидирование, необязательно с последующим дезаминированием или образованием амидов с новыми кислотами; этерификация; замещение различными соединениями, например, с использованием сшивающего агента или карбодиимида; включая конденсацию различных молекул, таких как белки, пептиды и активные лекарственные компоненты, с гиалуроновой кислотой; и дезацетилирование. Специалисту в данной области хорошо известно, что различные формы гиалуроновой кислоты имеют различные химические свойства, которые должны быть учтены при химической модификации и во время анализа. Например, если желательно получить раствор гиалуроновой кислоты, имеющей определенное pH, на конечное pH раствора будут влиять кислотность материала, подлежащего растворению, кислотность растворяющей жидкости и любая буферная емкость.

Предпочтительно, чтобы субстрат гиалуроновой кислоты представлял собой гиалуроновую кислоту или гиалуронатную соль без химических модификаций, т.е. которая не была подвергнута сшиванию или другим модификациям перед настоящим способом производства.

Гиалуроновая кислота может быть получена из различных источников животного и неживотного происхождения. Источники неживотного происхождения включают дрожжи и предпочтительно бактерии. Молекулярная масса одной молекулы гиалуроновой кислоты, как правило, составляет 1,5-3 МДа, но другие молекулярные массы также возможны, например 0,5-10 МДа.

Продукт, изготовленный этим способом, представляет собой формованную поперечно-сшитую гиалуроновую кислоту. Этот способ обеспечивает поперечные сшивки между цепями гиалуроновой кислоты, когда они организованы в желаемую форму, что создает непрерывную формованную сеть молекул гиалуроновой кислоты, которая удерживается ковалентными поперечными связями, физическим перепутыванием цепей гиалуроновой кислоты и различными взаимодействиями, такими как водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и электростатические взаимодействия. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению является гелем или гидрогелем. То есть его можно рассматривать как нерастворимую в воде, но по существу разбавленную поперечно-сшитую систему молекул гиалуроновой кислоты при воздействии на него жидкости, обычно водной жидкости.

Конечный формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты предпочтительно является биосовместимым. Это означает, что отсутствует или имеется только очень слабый иммунный ответ у обработанного человека. В примерах представлен способ определения биосовместимости продукта из гиалуроновой кислоты, а также представлены результаты тестирования биосовместимости продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению на крысах.

Способ в соответствии с изобретением включает по меньшей мере три стадии: стадию получения, стадию осаждения и стадию сшивания. В некоторых вариантах осуществления способ состоит из этих трех стадий.

На первой стадии способа получают субстрат гиалуроновой кислоты. Как указано выше, понятие "субстрат гиалуроновой кислоты" охватывает все варианты и комбинации вариантов гиалуроновой кислоты или гиалуронана с различной длиной цепи и различных заряженных состояний, а также различные химические модификации. Предпочтительно гиалуроновая кислота представляет собой химически немодифицированную гиалуроновую кислоту или гиалуронатную соль, предпочтительно гиалуронат натрия, имеющую среднюю молекулярную массу 0,5-10 МДа, предпочтительно 0,8-5 МДа, более предпочтительно 1,5-3 МДа или 2-3 МДа. Предпочтительно, чтобы гиалуроновая кислота была неживотного происхождения, предпочтительно бактериального.

Субстрат гиалуроновой кислоты растворяют в первой жидкой среде, которая представляет собой водный раствор. Под терминами "растворенный" и "раствор" понимают, что субстрат гиалуроновой кислоты находится в однородной смеси с жидкостью, причем в этой смеси имеют место энергетически выгодные взаимодействия. Добавление жидкости в раствор снижает концентрацию растворенного субстрата гиалуроновой кислоты. Раствор является водным, т.е. он содержит воду. Водный раствор может просто состоять из субстрата гиалуроновой кислоты, растворенного в воде. Предпочтительно водный раствор содержит 40-100 об. % воды и 0-60 об. % низших алкильных спиртов. Термин "низший алкильный спирт" включает первичные, вторичные и третичные алкильные спирты, имеющие от одного до шести атомов углерода, т.е. C_1-6 алкильные спирты. Конкретные примеры низших алкильных спиртов включают метанол, этанол, денатурированный спирт, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол и трет-бутанол. Предпочтительными низшими алкильными спиртами являются метанол и этанол, в частности этанол, из-за цены, доступности и удобства в обращении. Концентрация низшего алкильного спирта предпочтительно составляет 0-40%, например 0-20%, 10-30% или 20-40% этанола, с соответствующим количеством водного компонента. pH этого водного раствора соответственно составляет 6 или выше, например 9 или выше.

При необходимости, первая стадия способа дополнительно включает придание субстрату гиалуроновой кислоты желаемой формы, такой как частица, волокно, лента, нить, сетка, пленка, диск и гранула, которые могут быть полыми или содержать различные слои материала. Это может быть достигнуто различными способами, например литьем и экструзией. Экструзия субстрата гиалуроновой кислоты обычно включает прессование раствора субстрата гиалуроновой кислоты через отверстие нужного размера. Экструдированный субстрат гиалуроновой кислоты самопроизвольно образует осажденное волокно, ленту или нить. Размеры, например толщину волокна, ленты или нити можно контролировать, изменяя размер или тип отверстия, например, с использованием различных диаметров отверстий в диапазоне 0,1-2 мм или 14-30 G, давление экструзии, скорость экструзии и/или концентрацию гиалуроновой кислоты. При использовании других типов отверстий и щелей можно получить различные формы или структуры. Например, гиалуроновая кислота может быть осаждена в виде пленки, сетки, дисков или гранул.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения раствору субстрата гиалуроновой кислоты придают желаемую форму на гидрофобной поверхности, и последующее осаждение сформованного субстрата гиалуроновой кислоты осуществляют на указанной гидрофобной поверхности. Это выгодно для устранения загрязнения формованных структур и сохранения желаемой формы, пока она не зафиксирована путем последующей стадии сшивания. Подходящие гидрофобные поверхности хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, фторуглероды, полипропилен (ПП), полиэтилентерефталат, модифицированный гликолем (ПЭТГ), полиэтилен (ПЭ) и политетрафторэтилен (ПТФЭ).

Эта форма может сохраняться в течение всего способа производства и в конечном продукте. Предпочтительно, чтобы форма имела протяженность менее 5 мм, предпочтительно менее 1 мм, например менее 0,5 мм или даже менее 0,2 мм, по меньшей мере в одном измерении, когда субстрат гиалуроновой кислоты находится в осажденной форме. Это облегчает доступ для сшивающего агента (агентов) к большому количеству доступных мест связывания осажденных продуктов гиалуроновой кислоты на последующей стадии сшивания. Предпочтительно также, чтобы форма была вытянута в продольном направлении и имела соотношение ее продольной длины к ее наибольшей поперечной длине 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и возможно 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже. Поскольку вытянутая в продольном направлении форма сохраняется в течение всего способа и в полученном продукте, может быть разработан сшитый продукт, с которым устраняется или снижается миграция/смещение in vivo, но который остается легко инъецируемым. Подходящим примером такой формы является волокно, а соотношение между его длиной и шириной составляет 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже. Предпочтительная композиция содержит продукты в виде нитей/волокон из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению, где более 50% продуктов имеют соотношение между их продольным размером и наибольшим поперечным размером 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже.

В качестве примера можно привести продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению, имеющий форму одиночной нити или волокна, заполняющий шприц на 20 мл, который может иметь толщину 1 мм и длину 25 м в набухшем состоянии, т.е. соотношение между его продольным размером и его наибольшим поперечным размером составляет 25000:1. Пример предпочтительной композиции содержит продукты согласно изобретению из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты в форме нити/волокна, где более 50% продуктов имеют продольный размер более 2 мм и наибольший поперечный размер менее 0,2 мм, то есть соотношение 10:1 или выше.

Первую стадию способа осуществляют без сшивания, и это может быть достигнуто путем неиспользования сшивающих агентов на этой стадии и/или путем обеспечения условий, которые не подходят для сшивания. Важно гарантировать, что сшивание не происходит до тех пор, пока не будет получена предпочтительная форма. Это дает преимущества для получения и сохранения требуемой формы конечного продукта, поскольку придание субстрату формы не ограничивается уже существующими сшивками, и все поперечные связи, полученные на третьей стадии, направлены на поддержание требуемой формы продукта. Предпочтительно, чтобы первую стадию осуществляли в отсутствие сшивающего агента. Это обеспечивает хороший контроль того, что сшивание не происходит в растворенной фазе и/или между стадиями способа. Это также гарантирует, что количество сшивающего агента строго контролируется и что полученные продукты являются однородными по качеству, так как сшивающий агент не вступает в реакцию или не теряется на предыдущих стадиях. Устранение сшивания и особенно добавления сшивающего агента на этой стадии полезно для обеспечения способа производства, который подходит для масштабирования до промышленных объемов и для получения продуктов однородного качества.

На второй стадии способа субстрат гиалуроновой кислоты осаждают за счет уменьшения растворимости субстрата гиалуроновой кислоты. Это достигается путем воздействия на субстрат гиалуроновой кислоты второй жидкой средой, в которой он нерастворим. Вторая жидкая среда содержит количество одного или более первых водорастворимых органических растворителей, обеспечивающих условия осаждения гиалуроновой кислоты. Полученный осадок твердого вещества выпадает из фазы растворенного вещества и, как правило, может быть отделен от оставшейся жидкости фильтрацией, декантацией, центрифугированием или вручную с помощью пинцета или тому подобного. В одном предпочтительном варианте осажденный субстрат гиалуроновой кислоты также удаляют из среды и сушат. Осадок также можно поддерживать в виде суспензии во второй жидкой среде. Таким образом, в другом предпочтительном варианте осажденный субстрат гиалуроновой кислоты не подвергают сушке. Предпочтительно обеспечить осаждение субстрата гиалуроновой кислоты быстрым путем, например путем экструзии или погружения субстрата гиалуроновой кислоты во вторую жидкую среду, в которой он нерастворим.

Органические растворители, используемые в соответствии с изобретением, являются углеродсодержащими растворителями и могут проявлять различную степень полярности. Хотя используется термин "растворители", следует понимать, что эти органические растворители используются для уравновешивания и смещения растворимости гиалуроновой кислоты при осуществлении способа производства. Гиалуроновая кислота может быть очень хорошо растворима в органическом растворителе при определенном интервале концентраций органического растворителя, но выпадает и образует осадок при увеличении концентрации органического растворителя. Например, гиалуроновая кислота может быть растворена в смеси органического растворителя 50/50 (об./об.), например смеси низшего алкильного спирта и воды, но выпадает и образует осадок в смеси 90/10 (об./об.). При воздействии неосаждающих условий, например, смеси 50/50 или 0/100, гиалуроновая кислота возвращается в неосажденное, растворенное состояние. Специалисту в данной области хорошо известно, что другие факторы могут оказывать влияние на предельную концентрацию органического растворителя (растворителей) для осаждения гиалуроновой кислоты, такие как температура, pH, ионная сила и тип органических растворителей. Предельная концентрация для осаждения гиалуроновой кислоты в определенных условиях хорошо известна или может быть легко определена специалистом в данной области. Например, предельная концентрация для осаждения гиалуроновой кислоты (в смеси воды и этанола) составляет приблизительно 70% этанола.

Органические растворители согласно изобретению могут быть выбраны из группы (без ограничения этим), состоящей из пентана, гексана, циклогексана, 1,4-диоксана, N,N-диметилформамида, N,N-диметилацетамида, этилацетата, ацетамида, диэтилового эфира, тетрагидрофурана, ацетонитрила, метилэтилкетона, ацетона, низших алкильных спиртов, например метанола, этанола, пропанола, изопропанола и бутанола. Желательно, чтобы органические растворители согласно изобретению были водорастворимыми. Предпочтительной группой органических растворителей является группа низших алкильных спиртов. Термин «низший алкильный спирт» включает первичные, вторичные и третичные алкильные спирты, имеющие от одного до шести атомов углерода, т.е. алкильные спирты. Конкретные примеры низших алкильных спиртов включают метанол, этанол, денатурированный спирт, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол и трет-бутанол. Предпочтительными низшими алкильными спиртами являются метанол и этанол, в частности этанол, за счет цены, доступности и удобства в обращении.

Целесообразно, чтобы второй жидкой средой на второй стадии способа являлась водная среда, т.е. чтобы она содержала воду до некоторой степени. Предпочтительно, чтобы вторая жидкая среда содержала 0-30 об. % воды и 70-100 об. % первого водорастворимого органического растворителя (растворителей), предпочтительно 0-10 об. % воды и 90-100 об. % первого водорастворимого органического растворителя (растворителей). В некоторых вариантах осуществления концентрация первого водорастворимого органического растворителя (растворителей) может достигать 95%, например 99% или даже 99,5%, например 99% метанола или этанола. Считают, что высокая концентрация первого водорастворимого органического растворителя (растворителей) выгодна для достижения быстрого осаждения. Таким образом можно получить запутанную структуру, которая, вероятно, будет выгодна для получения гелевого продукта с заданными свойствами.

Вторую стадию способа осуществляют без сшивания, и это может быть достигнуто путем неиспользования сшивающих агентов на этой стадии и/или путем обеспечения условий, которые не подходят для сшивания. Важно гарантировать, что сшивание не происходит до тех пор, пока не будет получена предпочтительная форма. Это дает преимущества для получения и сохранения требуемой формы конечного продукта, поскольку придание субстрату формы не ограничивается уже существующими сшивками, и все поперечные связи, полученные на третьей стадии, направлены на поддержание требуемой формы продукта. Предпочтительно, чтобы вторую стадию осуществляли в отсутствие сшивающего агента. Это обеспечивает хороший контроль того, что сшивание не происходит в растворенной фазе и/или между стадиями способа. Это также гарантирует, что количество сшивающего агента строго контролируется и что полученные продукты являются однородными по качеству, так как сшивающий агент не вступает в реакцию или не теряется на предыдущих стадиях. Устранение сшивания и особенно добавления сшивающего агента на этой стадии полезно для обеспечения способа производства, который подходит для масштабирования до промышленных объемов и для получения продуктов однородного качества.

При необходимости, вторая стадия способа дополнительно включает придание субстрату гиалуроновой кислоты желаемой формы, такой как частица, волокно, лента, нить, сетка, пленка, диск и гранула, которые могут быть полыми или содержать различные слои материала. Это может быть достигнуто различными способами, например литьем и экструзией. Эта форма может сохраняться в течение всего способа производства и в конечном продукте. Предпочтительно, чтобы форма осажденного субстрата имела протяженность менее 5 мм, предпочтительно менее 1 мм, например менее 0,5 мм или даже менее 0,2 мм, по меньшей мере в одном измерении, когда субстрат гиалуроновой кислоты находится в осажденной форме. Это облегчает доступ для сшивающего агента (агентов) к большому количеству доступных мест связывания осажденных продуктов гиалуроновой кислоты на последующей стадии сшивания. Также предпочтительно, чтобы форма была вытянута в продольном направлении и имела соотношение ее продольной длины к ее наибольшей поперечной длине 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже. Поскольку вытянутая в продольном направлении форма сохраняется в течение всего способа и в полученном продукте, может быть разработан сшитый продукт, с которым устраняется или снижается миграция/смещение in vivo, но который остается легко инъецируемым. Подходящим примером такой формы является волокно, а соотношение между его длиной и шириной составляет 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже. Например, продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению имеет форму одиночной нити или волокна, заполняет шприц на 20 мл, и может иметь толщину 1 мм и длину 25 м в набухшем состоянии, т.е. соотношение между его продольным размером и его наибольшим поперечным размером составляет 25000:1

Вторая стадия способа может включать экструзию субстрата гиалуроновой кислоты во вторую жидкую среду, которая включает количество первого водорастворимого органического растворителя (растворителей), обеспечивающее условия осаждения гиалуроновой кислоты. Это обычно включает прессование раствора субстрата гиалуроновой кислоты через отверстие нужного размера во вторую жидкую среду. Экструдированный субстрат гиалуроновой кислоты самопроизвольно образует осажденное волокно, ленту или нить во второй жидкой среде. Размеры, например толщину волокна, ленты или нити можно контролировать, изменяя размер или тип отверстия, например, с использованием различных диаметров отверстий в диапазоне 0,1-2 мм или 14-30 G, давление экструзии, скорость экструзии и/или концентрацию гиалуроновой кислоты. При использовании других типов отверстий и щелей можно получить различные формы или структуры. Например, гиалуроновая кислота может быть осаждена в виде пленки, сетки, дисков или гранул. Когда образуется волокно, лента или нить, предпочтительно, чтобы соотношение между их длиной и средним диаметром составляло 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже. Преимущество формы в виде волокна/ленты/нити в том, что волокна/ленты/нити сами по себе могут быть запутанными на макроскопическом уровне, обеспечивая эффект спирали или шара, который может быть предпочтительным, например, для поддержания целостности имплантата.

На третьей стадии способа осажденный субстрат гиалуроновой кислоты впервые подвергают сшиванию в третьей жидкой среде. Термин "сшивание" относится к образованию стабильных ковалентных связей (сшивок) между (по меньшей мере) двумя различными цепями гиалуроновой кислоты, или (по меньшей мере) двумя различными местами одной цепи гиалуроновой кислоты, которые создают непрерывную сеть молекул гиалуроновой кислоты. Сшивка может просто представлять собой ковалентную связь между двумя атомами в цепях гиалуроновой кислоты, например простую эфирную связь между двумя гидроксильными группами или сложноэфирную связь между гидроксильной группой и карбоксильной группой. Сшивка также может быть линкерной молекулой, которая ковалентно связана с двумя или более атомами разных цепей гиалуроновой кислоты или различных мест одной цепи гиалуроновой кислоты. Хотя сшивание может происходить спонтанно при определенных условиях, сшивание обычно включает использование сшивающего агента, одного или более, что облегчает и ускоряет процесс. Когда выполнено сшивание, сшивающий агент (агенты) могут быть полностью или частично связаны с гиалуроновой кислотой, или могут быть разрушены. Все остатки несвязанного сшивающего агента можно удалить после сшивания.

Важно гарантировать, что сшивание не происходит до тех пор, пока не будет получена предпочтительная форма. Это дает преимущества для получения и сохранения требуемой формы конечного продукта, поскольку придание субстрату формы не ограничивается уже существующими сшивками, и все поперечные связи, полученные на третьей стадии, направлены на поддержание требуемой формы продукта. Предпочтительно, чтобы первые две стадии осуществляли в отсутствие сшивающего агента, и сшивающий агент добавляли на третьей стадии сшивания. Это обеспечивает хороший контроль сшивания, поскольку оно происходит в твердой (осажденной) фазе и не происходит в растворенной фазе и/или между стадиями способа. Это также гарантирует, что количество сшивающего агента строго контролируется и что полученные продукты являются однородными по качеству, так как сшивающий агент не вступает в реакцию или не теряется на предыдущих стадиях, например на стадии осаждения. В целом, фокусируясь на сшивании и, в частности, на добавлении сшивающего агента на конечной стадии, полезно получить способ производства, который подходит для масштабирования до промышленных объемов и для получения продуктов однородного качества.

Третья жидкая среда содержит один или более сшивающих агентов, которые являются полифункциональными, то есть имеют два или более реакционных сайтов для образования ковалентных связей с молекулами гиалуроновой кислоты, которые подвергаются сшиванию. Предпочтительно, чтобы сшивающий агент (агенты), который используется на этой третьей стадии, являлся бифункциональным, т.е. имел два реакционных сайта для образования ковалентных связей с молекулами гиалуроновой кислоты, которые подвергаются сшиванию. Не ограничиваясь этим, полезные полифункциональные сшивающие агенты включают дивинилсульфон, полиэпоксиды и диэпоксиды, такие как бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидиловый эфир (EDDE) и диэпоксиоктан, предпочтительно BDDE. Желательно, чтобы один или более полифункциональных сшивающих агентов образовывали простые эфирные поперечные связи. Настоящий способ преимущественно обеспечивает гелевые продукты из гиалуроновой кислоты, поперечно-сшитой простыми эфирными связями, которые являются стабильными и могут быть легко стерилизованы, например, в автоклаве. Сложноэфирные поперечные связи менее стабильны и более легко гидролизуются.

Сшивание на третьей стадии способа проводят в условиях осаждения таким образом, что осаждается формованный субстрат гиалуроновой кислоты. В частности, доступная поверхность молекул гиалуроновой кислоты находится в осажденной форме благодаря условиям осаждения. Третья жидкая среда содержит количество одного или более вторых органических растворителей, обеспечивающих условия осаждения для гиалуроновой кислоты, причем количество и/или органические растворители могут быть такими же или другими, чем те, которые используют во второй жидкой среде на второй стадии способа, чтобы осадить формованный субстрат гиалуроновой кислоты.

Как подробно описано выше, следует понимать, что органические растворители используют для уравновешивания и изменения растворимости гиалуроновой кислоты в течение способа производства. Специалисту в данной области хорошо известно, что другие факторы могут оказывать влияние на предельную концентрацию органического растворителя (растворителей) для осаждения гиалуроновой кислоты, такие как температура, pH, ионная сила и тип органических растворителей. Предельная концентрация для осаждения гиалуроновой кислоты в определенных условиях хорошо известна или может быть легко определена специалистом в данной области.

Используя этот способ, можно получить формованные продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты с единственной реакцией сшивания на третьей стадии способа. В зависимости от выбора и количества сшивающих агентов на стадии с единственной реакцией сшивания, полученный в результате формованный продукт может быть сшитым одним способом, т.е. может содержать по существу единственный тип сшивок, предпочтительно стабильные простые эфирные поперечные связи, или может быть сшитым множественным способом, т.е. может содержать по меньшей мере два различных типа сшивок, предпочтительно включающих стабильные простые эфирные связи. Удивительно, что способ с единственной реакцией сшивания позволяет получить формованные продукты с такими желательными свойствами.

Органические растворители согласно изобретению могут быть выбраны из группы (без ограничения этим), состоящей из пентана, гексана, циклогексана, 1,4-диоксана, N,N-диметилформамида, N,N-диметилацетамида, этилацетата, ацетамида, диэтилового эфира, тетрагидрофурана, ацетонитрила, метилэтилкетона, ацетона, низших алкильных спиртов, например метанола, этанола, пропанола, изопропанола и бутанола. Желательно, чтобы органические растворители согласно изобретению были водорастворимыми. Предпочтительной группой органических растворителей является группа низших алкильных спиртов. Термин «низший алкильный спирт» включает первичные, вторичные и третичные алкильные спирты, имеющие от одного до шести атомов углерода, т.е. C_1-6 алкильные спирты. Конкретные примеры низших алкильных спиртов включают метанол, этанол, денатурированный спирт, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол и трет-бутанол. Предпочтительными низшими алкильными спиртами являются метанол и этанол, в частности этанол, за счет цены, доступности и удобства в обращении.

Целесообразно, чтобы третьей жидкой средой на третьей стадии способа являлась водная среда, т.е. чтобы она содержала воду до некоторой степени. Предпочтительно, чтобы третья жидкая среда, в дополнение к сшивающим агентам, содержала 0-35 об. % воды и 65-100 об. % второго водорастворимого органического растворителя (растворителей), предпочтительно 20-35 об. % воды и 65-80 об. % второго водорастворимого органического растворителя (растворителей).

Третья жидкая среда имеет pH 11,5 или выше, т.е. сшивание выполняют при pH 11,5 или выше. Специалисту хорошо известно, что следует принимать во внимание кислотность исходного материала гиалуроновой кислоты, чтобы получить желательный уровень pH в третьей жидкой среде. Это может быть достигнуто путем добавления кислот, оснований или буферных систем с подходящей буферной емкостью. Предпочтительным регулятором pH является сильное основание, такое как гидроксид натрия. Было обнаружено, что щелочное pH выгодно для сшивания осажденных молекул гиалуроновой кислоты. Предпочтительно, чтобы третья жидкая среда на третьей стадии имела pH 13 или выше. В жидкой среде, содержащей и воду и органический растворитель (растворители), измеренное pH может отличаться от теоретического pH вследствие типа растворителя (растворителей) и количества соответствующего растворителя (растворителей). Поэтому используют термин «кажущееся pH» (pH_арр), чтобы указать pH, которое измеряют с использованием стандартного оборудования в заданных условиях. Точное значение pH может быть легко определено, например, титрованием.

Сшивание на третьей стадии обеспечивает получение формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению является гелем или гидрогелем. То есть его можно рассматривать как нерастворимую в воде, но по существу разбавленную поперечно-сшитую систему молекул гиалуроновой кислоты при воздействии на него жидкости, обычно водной жидкости. Поскольку сшивание третьей стадии способа осуществляют в условиях осаждения, формованный субстрат гиалуроновой кислоты и формованный сшитый продукт находятся в осажденном состоянии. В частности, доступная поверхность формованного субстрата гиалуроновой кислоты и формованного сшитого продукта находится в осажденной форме из-за условий осаждения на третьей стадии способа. Реакция сшивания протекает при подходящих условиях до тех пор, пока не прореагирует требуемое количество сшивающего агента (агентов) с формованным субстратом гиалуроновой кислоты. Количество сшивающего агента (агентов), которое связалось с гиалуроновой кислотой, можно рассчитать и представить в виде степени модификации (MoD), т.е. молярного количества связанного сшивающего агента (агентов) по отношению к общему количеству повторяющихся дисахаридных звеньев ГК. Предпочтительно, чтобы реакция сшивания протекала до степени модификации (MoD) продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты в диапазоне 1-40 фрагментов сшивающего агента на 1000 дисахаридных звеньев (0,1-4%), предпочтительно 1-10 фрагментов сшивающего агента на 1000 дисахаридных звеньев (0,1-1%). Требуемое время реакции регулируется несколькими факторами, такими как концентрация гиалуроновой кислоты, концентрация сшивающего агента, температура, pH, ионная сила и тип органических растворителей. Все эти факторы хорошо известны специалистам в данной области техники, которые могут легко подобрать эти или другие соответствующие параметры, и тем самым обеспечить подходящие условия для получения степени модификации в пределах 0,1-4% и проверить характеристики полученных продуктов по отношению к этой степени модификации. Сшивание на третьей стадии происходит в течение по меньшей мере 2 ч, предпочтительно при комнатной температуре в течение не менее 24 ч.

Любые остаточные несвязанные сшивающие агенты можно удалить, когда формованный осажденный продукт отделяют от сшивающей среды. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты может быть дополнительно очищен с помощью дополнительных стадий промывки подходящей промывочной жидкостью, например, водой, метанолом, этанолом, физиологическим раствором или их смесями, и/или их комбинациями.

Способ производства согласно изобретению, таким образом, позволяет изготавливать заранее заданные физические формы или структуры продуктов из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, такие как частица, волокно, лента, нить, сетка, пленка, диск и гранула. Особенно пригодны в качестве медицинских или косметических имплантатов структуры, которые вытянуты в продольном направлении или имеют форму стержня и имеют соотношение их продольной длины к их наибольшей поперечной длине 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже, поскольку они могут иметь такие размеры, чтобы избежать миграции за счет достаточной длины, и в то же время могут быть легко введены путем инъекции через иглу за счет ограниченной ширины. Например, продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению, имеющий форму одиночной нити или волокна, заполняющий шприц на 20 мл, может иметь толщину 1 мм и длину 25 м в набухшем состоянии, т.е. соотношение между его продольным размером и его наибольшим поперечным размером составляет 25000:1.

Заранее заданные структуры, при необходимости, могут быть полыми или иметь несколько слоев. Пространство внутри полой заранее заданной структуры может быть заполнено ГК, которая может быть модифицирована, например, может быть поперечно-сшитой или замещенной другими соединениями. Один или более из множества слоев в заранее заданной слоистой структуре может состоять из сшитой или несшитой ГК, которая может быть химически модифицирована путем замещения другими соединениями. Это может быть достигнуто путем придания субстрату гиалуроновой кислоты желаемой формы на первой стадии способа, например, путем экструзии или формования, или на второй стадии способа, например, путем экструзии растворенного субстрата гиалуроновой кислоты в осаждающей среде, например, в этиловом спирте. Полученные формы можно поддерживать в течение всего способа производства и в конечном продукте.

При необходимости, способ производства дополнительно включает четвертую стадию, на которой формованный осажденный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты подвергают воздействию неосаждающих условий. То есть этот способ в некоторых вариантах осуществления включает четыре стадии, или, альтернативно, состоит из четырех стадий. При этом обычно формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты подвергают воздействию жидкой среды и позволяют ему вернуться в неосажденное состояние. Жидкая среда, как правило, представляет собой воду, физиологический раствор или их смеси, и/или их комбинации, возможно, с неосаждающей концентрацией органического растворителя, например, метанола или этанола. Из-за поперечной сшивки, полученный формованный продукт гиалуроновой кислоты имеет непрерывную сеть соединенных между собой и перепутанных цепей гиалуроновой кислоты, которая в неосаждающих условиях поглощает жидкость (набухает) и образует гель. Набухание может продолжаться до тех пор, пока гель полностью не набухнет и дополнительная жидкость не может быть поглощена, или набухание можно прервать на более ранней стадии, чтобы получить частично набухший гель. Частично набухший гель может быть полезен в качестве промежуточного продукта для дополнительной обработки геля, например, дополнительного механического производства гелевых структур желаемого размера и формы. Например, пленка может быть разрезана на частицы, пластинки или кусочки, гелевые волокна могут быть разрезаны на более короткие фрагменты, из пленки можно изготовить четко определенные неправильные формы и т.д.

Сшитые волокна, ленты или нити ГК также могут быть сплетены вместе, чтобы сформировать сеть или пленку после завершения сшивания до или после сушки. Также можно удобно использовать частично набухший формованный гелевый продукт при его имплантации в желаемом месте, чтобы облегчить введение и свести к минимуму дискомфорт пациента, и повысить несущую способность путем использования оставшейся набухаемости.

Когда формованный гелевый продукт подвергают воздействию неосаждающих условий в избытке жидкости, можно также определить его максимальную степень набухания, или наоборот, минимальную концентрацию гиалуроновой кислоты в нем (C_min), т.е. концентрацию гиалуроновой кислоты, когда гелевый продукт является полностью набухшим. Использование способа производства согласно изобретению позволяет получить степень набухания 4-300 мл на грамм гиалуроновой кислоты, предпочтительно 15-180 мл на грамм гиалуроновой кислоты. Это подразумевает значения C_min в диапазоне 0,3-25% (масс./об.), предпочтительно 0,6-7% (масс./об.), что соответствует 3-250 мг/г, предпочтительно 6-70 мг/г. Очень выгодно, что желаемую степень набухания (или значение C_min) можно достичь с минимальной степенью модификации, хотя традиционный способ регулирования степени набухания осуществляют посредством изменения степени модификации. Настоящий способ производства, следовательно, обеспечивает новую концепцию регулирования набухаемости формованного гелевого продукта, который удивительным образом позволяет изготавливать твердые формованные гели с однородно высоким значением C_min (низкой степенью набухания) при относительно низкой степени модификации геля.

Эффективность модификации (MoE) является мерой соотношения между минимальной концентрацией ГК (C_min) или жесткостью/прочностью геля и степенью его химической модификации с помощью сшивающего агента (агентов). Использование способа производства в соответствии с настоящим изобретением позволяет получить продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющий эффективность модификации 10 или выше, предпочтительно 10-200, например 20-150 или 20-190. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, полагают, что полезные свойства геля являются результатом неожиданно высокой степени эффективного поперечного сшивания, т.е. высокой степени связанного сшивающего агента (агентов) (содержания сшивающего агента, как правило, 0,35, или 35% или выше, например до 40% или выше, или даже 50% или выше), фактически связанного с гиалуроновой кислотой в двух (или более) точках, в сочетании с эффективным положением поперечных связей, для достижения желаемой цели, и, возможно, чрезвычайно высокой степени остаточной запутанности. В противоположность тому, что специалист в данной области мог бы ожидать от низкой степени модификации полученного продукта гиалуроновой кислоты, способ согласно изобретению удивительно обеспечивает гель с высокой жесткостью/прочностью. При любых обстоятельствах способ согласно изобретению обеспечивает удобный способ дополнительного регулирования степени набухания относительно степени модификации. Этот способ также очень подходит для непрерывной работы, которая является предпочтительной для крупномасштабного производства.

При необходимости, способ производства также включает конечную стадию выделения продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты. То есть этот способ в некоторых вариантах осуществления включает четыре или пять стадий или, альтернативно, состоит из четырех или пяти стадий. В зависимости от того, выдерживают ли продукт в осаждающих условиях или подвергают воздействию в неосаждающих условиях, эта стадия может включать выделение продукта в осажденной форме или в неосажденной форме. Выделенный осажденный или неосажденный продукт может быть затем подвергнут стерилизации таким образом, чтобы получить стерильный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты.

При желании, после получения продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты можно добавить другие вещества, такие как местные анестетики (например гидрохлорид лидокаина), противовоспалительные лекарства, антибиотики и другие подходящие вспомогательные лекарственные средства, например, факторы роста костей или клетки.

Согласно одному аспекту изобретение обеспечивает формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты. Согласно одному варианту осуществления этот продукт изготавливают или он может быть изготовлен с помощью способа производства согласно изобретению. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению является гелем или гидрогелем. То есть его можно рассматривать как нерастворимую в воде, но по существу разбавленную поперечно-сшитую систему молекул гиалуроновой кислоты при воздействии на него жидкости, обычно водной жидкости. Гель по существу является жидким в массе и может, например, содержать 90-99,9% воды, но он ведет себя как твердое тело за счет трехмерной сшитой сети гиалуроновой кислоты в жидкости. Из-за значительного содержания жидкости формованный гель является структурно гибким и близким природной ткани, что делает его очень полезным в качестве каркаса в тканевой инженерии и для наращивания тканей. Поперечные связи и их положения прикрепления на молекулах гиалуроновой кислоты вместе с естественной перепутанностью цепей гиалуроновой кислоты придают гелю структуру и свойства, которые тесно связаны с его степенью набухания.

Количество связанного сшивающего агента (агентов) может быть количественно определено и представлено в виде степени модификации (MoD), т.е. молярного количества связанного сшивающего агента (агентов) по отношению к общему количеству повторяющихся дисахаридных звеньев ГК. Предпочтительно, чтобы продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты в соответствии с изобретением имел степень модификации 1-40 фрагментов сшивающего агента на 1000 дисахаридных звеньев (0,1-4%), предпочтительно 1-10 фрагментов сшивающего агента на 1000 дисахаридных звеньев (0,1-1%). Эффективность реакции сшивания характеризуется количеством присоединенного сшивающего агента (агентов), который присоединен (по меньшей мере) к двум концам одной (или более) цепи гиалуроновой кислоты, и представлена в виде отношения сшивающего агента (CrR). Предпочтительно, чтобы продукт согласно изобретению имел отношение сшивающего агента 35% или выше, предпочтительно 40% или выше, более предпочтительно 50% или выше, например, в диапазонах 35-80%, 40-80% и 50-80%. Эти продукты, следовательно, имеют низкое количество сшивающих агентов, которые не обеспечивают эффективные поперечные связи в продукте. Высокие отношения сшивающего агента позволяют использовать удивительно низкую общую степень модификации по отношению к прочности геля, которая, в свою очередь, является преимуществом для обеспечения высокой биосовместимости.

Другой характеристикой геля является его способность поглощать воду до тех пор, пока он полностью не набухнет. Дальнейшее добавление жидкости не будет дополнительно разбавлять гель, т.е. гель не может быть разбавлен в неопределенной степени как раствор свободных молекул. Когда гель подвергают воздействию неосаждающих условий, можно также определить его степень набухания, или, наоборот, его минимальную концентрацию (C_min), т.е. концентрацию гиалуроновой кислоты, когда гелевый продукт является полностью набухшим. Более твердые (низкого набухания) гели, как правило, менее вязкие, более упругие и, как ожидается, имеют более длительный период полураспада in vivo, чем более мягкие (высокого набухания) гели. Однако тело может распознавать твердые гели как инородные материалы, если они высоко химически модифицированы. Предпочтительно, чтобы продукт согласно изобретению имел степень набухания 4-300 мл на грамм гиалуроновой кислоты, а предпочтительно 15-180 мл на грамм гиалуроновой кислоты. Это означает, что значения C_min находятся в диапазоне 0,3-25% (масс./масс.), т.е. 3-250 мг/г, например 0,6-7% (масс./масс.), т.е. 6-70 мг/г. Предпочтительно значение C_min составляет 0,6-5% (масс./об.), т.е. 6-50 мг/мл.

Предпочтительно, чтобы формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты в соответствии с изобретением был сшит одним или более сшивающих агентов, которые являются полифункциональными, т.е. имеют два или более реакционных центров для образования ковалентных связей с молекулами гиалуроновой кислоты, которые подвергают сшиванию. Предпочтительно, чтобы сшивающий агент или агенты являлись бифункциональными, т.е. имели два реакционных центра для образования ковалентных связей с молекулами гиалуроновой кислоты, которые подвергают сшиванию. Не ограничиваясь этим, полезные полифункциональные сшивающие агенты включают дивинилсульфон, полиэпоксиды и диэпоксиды, такие как 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидиловый эфир (EDDE) и диэпоксиоктан, предпочтительно BDDE. Желательно, чтобы гелевый продукт из гиалуроновой кислоты был сшит простыми эфирными связями, которые являются стабильными.

Формованный гелевый продукт из гиалуроновой кислоты может представлять собой многократно сшитый продукт, т.е. продукт, содержащий по меньшей мере два различных типа связей, предпочтительно содержащий простые эфирные связи. Предпочтительно продукт из гиалуроновой кислоты является поперечно сшитым однократно, т.е. содержащим поперечные связи одного типа, предпочтительно простые эфирные связи. Однократно сшитый продукт имеет то преимущество, что он является химически хорошо определенным. Предпочтительно, что формованный продукт с одним типом поперечных связей проявляет такие желаемые свойства. В конкретных вариантах осуществления продукт из гиалуроновой кислоты является поперечно-сшитым простыми эфирными связями, что обеспечивает стабильный и автоклавируемый продукт.

Очень выгодно получать желаемую степень набухания (или значение C_min) формованного продукта при минимальной степени модификации, хотя традиционный способ регулирования степени набухания осуществляют посредством изменения степени модификации. Основной причиной минимизации степени модификации является обеспечение высокой биосовместимости геля, но специалист в данной области хорошо знает и о других преимуществах. Формованный продукт характеризуется уникально высоким значением C_min (низкой степенью набухания) по отношению к степени модификации геля. Эффективность модификации (MoE) является мерой соотношения между минимальной концентрацией ГК (C_min), которая отражает жесткость и прочность геля, и степенью химической модификации геля с помощью сшивающего агента (агентов). Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты в соответствии с изобретением имеет эффективность модификации 10 или выше, предпочтительно в диапазоне 10-200, например в диапазоне 20-150 или 20-190. Продукты с эффективностью модификации 10 или выше, например в диапазоне от 20-190, сочетают, в первую очередь, степень модификации от низкой до умеренной и в то же время степень набухания или способность удерживать жидкость от низкой до умеренной. Таким образом, можно получить твердый продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, который является биосовместимым и имеет высокую стойкость к деформации.

Кроме того, формованные гелевые продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению предпочтительно являются вязкоупругими. Это означает, что гелевые продукты обладают комбинацией вязких и упругих свойств. Как хорошо известно специалисту в данной области, вязкоупругие свойства могут быть определены с помощью реометра. В осциллирующем режиме модуль упругости (G') и модуль вязкости (Gʺ) можно определять на частоте 0,1 или 1 Гц. Для некоторых вязкоупругих гелевых продуктов в соответствии с изобретением предпочтительно, чтобы выполнялось следующее соотношение:

, предпочтительно .

Продукт согласно изобретению изготавливают в заранее заданных физических формах или структурах, таких как частица, волокно, лента, нить, сетка, пленка, диск и гранула, которые необязательно являются полыми или состоят из различных слоев материалов на основе гиалуроновой кислоты. Структуры, которые являются вытянутыми в продольном направлении или имеют форму стержня, имеют соотношение их продольной длины к их наибольшей поперечной длине 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже, особенно полезны в качестве медицинских или косметических имплантатов, поскольку они могут иметь такие размеры, чтобы избежать миграции за счет достаточной длины, и в то же время могут быть легко введены путем инъекции через иглу за счет ограниченной ширины. При образовании волокна, ленты или нити предпочтительно соотношение между их продольной длиной и их шириной или средним диаметром составляет 5:1 или выше, например 10:1 или выше, например 20:1 или выше, и, возможно, 100000:1 или ниже, например 25000:1 или ниже, например 100:1 или ниже. Например, продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению, имеющий форму одиночной нити или волокна, заполняющий шприц на 20 мл, может иметь толщину 1 мм и длину 25 м в набухшем состоянии, т.е. соотношение между его продольным размером и его наибольшим поперечным размером составляет 25000:1. Предпочтительная толщина ленты составляет 50-200 мкм.

Гелевые продукты могут быть изготовлены в виде полых контейнеров, которые содержат человеческие клетки, лекарственные средства или другие вещества. Согласно одному варианту осуществления изобретения гелевый продукт из поперечно-сшитой ГК может быть полезным в качестве устройства для доставки лекарства и может быть использован в способе доставки лекарственных средств. Согласно варианту осуществления изобретения гелевый продукт из поперечно-сшитой ГК можно объединять с несшитой ГК или сшитой ГК с разной степенью модификации или степенью сшивки. Например, гелевый продукт из поперечно-сшитой ГК может быть получен в виде контейнера желаемой формы. Контейнер может образовывать резервуар для несшитой ГК или сшитой ГК с другой, например, более низкой степенью модификации, которые затем могут медленно высвобождаться или оставаться в контейнере с целью модуляции общей прочности получаемого комбинированного продукта.

Из-за поперечной сшивки формованный продукт на основе гиалуроновой кислоты является непрерывной сетью соединенных между собой и запутанных цепей гиалуроновой кислоты, которая при неосаждающих условиях поглощает жидкость (набухает) и образует гель. Набухание может продолжаться до тех пор, пока гель полностью не набухнет и дополнительная жидкость не может быть поглощена. Таким образом, формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты может быть предоставлен в полностью набухшем состоянии. Набухание также можно прервать на более ранней стадии, чтобы получить частично набухший гель. Частично набухший гель может быть полезен в качестве промежуточного продукта для дополнительной обработки геля, например, дополнительного производства гелевых структур или фрагментов желаемого размера и формы. Можно также удобно использовать частично набухший гель при имплантации его в желаемом месте для облегчения введения и сведения к минимуму дискомфорта пациента. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению поэтому может быть представлен в частично набухшем или ненабухшем состоянии.

Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению полезен в косметической или медицинской хирургической операции. Неограничивающими примерами косметической хирургической операции являются дермальное наполнение и контурная пластика тела. Неограничивающими примерами медицинской хирургической операции являются дермальное наполнение, контурная пластика тела, предотвращение адгезии тканей, ортопедические применения, лечение недержания, лечение пузырно-мочеточникового рефлюкса (ПМР) и формирование каналов для целей дренажа, например, в офтальмологии, и для удерживания тканей разделенными. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты в соответствии с изобретением также полезен для доставки лекарств. Кроме того, он может быть использован в качестве пленки для послеоперационного (интраперитонеального) сцепления и в терапии тазобедренных и других суставов.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение предлагает способ лечения субъекта, подвергающегося косметической или медицинской хирургической операции, включающий введение формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. Неограничивающими примерами медицинской хирургической операции являются дермальное наполнение, контурная пластика тела, предотвращение адгезии тканей, ортопедические применения, например терапия тазобедренных суставов, формирование каналов для целей дренажа, например, в офтальмологии, и для удерживания тканей разделенными.

Согласно одному варианту осуществления изобретения формованный гелевый продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты может быть введен в другие структуры или фрагменты разных форм, имеющие размер более 0,1 мм при воздействии физиологического солевого раствора. Предпочтительно продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению имеют продольно вытянутую форму и наибольший поперечный размер в полностью набухшем состоянии менее 5 мм, предпочтительно менее 1,5 мм, например менее 0,8 мм или даже менее 0,5 мм. Это выгодно для целей введения набухших гелевых продуктов посредством шприца желаемых размеров. Предпочтительно также, что формованные продукты из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно данному изобретению имеют продольно вытянутую форму и продольную длину более 5 мм, предпочтительно более 500 мм (0,5 м), например более 5 м или даже более 25 м в полностью набухшем состоянии. Среди многих возможностей такая вытянутая в продольном направлении форма предотвращает миграцию и/или смещение имплантированного гелевого продукта in vivo.

Нужную форму и размер обеспечивают во время изготовления продукта, т.е. путем придания желаемой формы субстрату перед сшиванием. В другом подходящем способе получения структуры желаемого размера получают формованный гель из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты с желаемой концентрацией и подвергают этот гель механическому разрушению, такому как измельчение, расплющивание или пропускание набухшего или частично набухшего геля или осажденного поперечно-сшитого продукта через фильтр или сито с соответствующим размером пор. Полученные гелевые частицы или кусочки диспергируют в физиологическом солевом растворе с получением дисперсии геля или суспензии с частицами желаемого размера и формы. В зависимости от формы, размер гелевой структуры можно определить любым подходящим способом, например путем лазерной дифракции, микроскопии, фильтрации и т.д., который будет определяться наибольшим расстоянием между двумя концами частицы. Для сферических структур диаметр равен размеру для этой цели.

Полезные диапазоны размеров и форм гелевых структур зависят от назначения. Для увеличения объема мягких тканей, предпочтительно для подкожного введения, введения под мышцу или супрапериостального введения, полезными являются гелевые частицы, кусочки или волокна, имеющие размер более 0,1 мм при воздействии физиологического солевого раствора. Термин "увеличение объема мягких тканей", как он использован здесь, относится к любому типу объемного увеличения мягких тканей, в том числе, но не ограничиваясь этим, к контурной пластике лица (например, более выраженных щек или подбородка), к коррекции вогнутых деформаций (например, посттравматической, ВИЧ-ассоциированной липоатрофии) и к коррекции глубоких, связанных с возрастом морщин на лице. Таким образом, увеличение объема мягких тканей можно использовать исключительно в косметических или медицинских целях, таких как посттравматические или дегенеративные заболевания. Эти две цели легко отличить специалисту в данной области. Термин "мягкая ткань", как используется здесь, относится к тканям, которые соединяют, поддерживают или окружают другие структуры и органы тела. Мягкие ткани включают в себя мышцы, фиброзные ткани и жир. Увеличение объема мягких тканей можно выполнять у любого млекопитающего, включая человека. Предпочтительно этот способ выполняют у человека.

Термины "субэпидермальное введение" или "субкутикулярное введение", как они использованы здесь, относятся к введению под эпидермис кожи, включая введение в дерму, под кожу или глубже, например, под мышцу или в надкостницу, где это применимо (в непосредственной близости от костной ткани).

Введение гелевых структур может быть выполнено любым подходящим способом, таким как инъекция из стандартной канюли и иглы соответствующих размеров, или хирургическое введение, например в случае введения пленки. Введение осуществляют в тех местах, где желательно увеличение объема мягких тканей, таких как подбородок, щеки, или в другом месте лица или тела.

Имплантат в соответствии с изобретением может представлять собой водную композицию, содержащую формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению, например, в форме гелевых структур гиалуроновой кислоты размером ≥0,1 мм, таких как частицы, гранулы, волокна или отрезанные ленты, и, при необходимости, буферный агент. Композиция может обычно содержать физиологический солевой раствор с буфером. Композиция может дополнительно содержать другие подходящие добавки, такие как местные анестетики (например гидрохлорид лидокаина), противовоспалительные лекарственные средства, антибиотики и другие подходящие поддерживающие лекарственные средства, например факторы роста костей или клетки. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению или его водная композиция могут быть представлены в предварительно заполненном шприце, т.е. в шприце, который предварительно заполнен стерилизованным формованным продуктом из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты или стерилизованной водной композицией, содержащей этот формованный продукт. При необходимости, формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты может содержаться в шприце, пакете или другом подходящем контейнере в осажденной форме и может быть переведен в неосажденную форму перед инъекцией или в теле после его инъекции.

Предпочтительно, чтобы набухший или частично набухший формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты являлся автоклавируемым, так как это наиболее удобный способ стерилизации конечного продукта. Это позволяет приготовить стерильный формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты.

Само собой разумеется, что размер гелевых структур, например волокон, согласно изобретению, зависит от того, как долго гель был оставлен набухать, от ионной силы буфера, раствора или носителя, которые включены в гелевые структуры и/или окружают гелевые структуры. В данном описании конкретные размеры структуры предполагают физиологические условия, в частности изотонические условия. Следует отметить, что, хотя предпочтительно, что гелевые структуры содержат физиологический солевой раствор и диспергированы в нем, предполагается, что гелевые структуры в соответствии с изобретением временно могут быть доведены до различных размеров при воздействии на них раствором другой тоничности, другого pH, или если структурам геля не дают набухнуть до их максимального размера.

Как используется здесь, понятие «физиологический или изотонический раствор» означает раствор, имеющий осмолярность в интервале 200-400 мОсм/л, предпочтительно 250-350 мОсм/л, более предпочтительно примерно 300 мОсм/л. Для практических целей эта осмолярность легко достигается путем получения 0,9% (0,154 М) раствора NaCl.

Формованный гелевый продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению является в физиологических условиях стабильным, но не постоянно. Стабильность in vitro продемонстрирована в примере 7 с помощью ускоренного исследования стабильности при 60°C в течение 14 дней. В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 90% формованного гелевого продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты сохраняется в течение не менее двух недель in vivo, более предпочтительно от двух недель до двух лет. Термин "разрушается" означает, что менее 20%, предпочтительно менее 10% среды сохраняется в организме.

Формованный гелевый продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению является более устойчивым к биоразложению in vivo, чем природная гиалуроновая кислота. Длительное присутствие стабильного гелевого продукта является предпочтительным для пациента, поскольку время между обработками увеличивается. Важно также, что продукт является очень похожим на природную гиалуроновую кислоту для сохранения высокой биосовместимости природной гиалуроновой кислоты. Продукт, который похож на природную ГК, должен разлагаться под действием фермента гиалуронидазы предпочтительно до степени по меньшей мере 99%. Биоразлагаемость пленочных гелевых продуктов на основе гиалуроновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением показана в примере 8, где они распознаются гиалуронидазой. Это отражает их сходство с природной гиалуроновой кислотой.

Определения

На протяжении данного описания приведенные ниже термины имеют следующие значения.

Термин	Свойство	Значение
ГК		ГК относится к соли гиалуроната натрия
Гелевая форма ГК		Гелевая форма ГК представляет собой поперечно-сшитую ГК, которая не может быть экстрагирована из геля путем промывания, например, физиологическим солевым раствором, в отличие от экстрагируемой ГК
Экстрагируемая ГК		Экстрагируемая ГК представляет собой ГК, которая является поперечно-сшитой или несшитой, которая может быть экстрагирована путем промывания, например, физиологическим солевым раствором
CГК	Концентрация ГК
Выражают в мг/г, мг/мл, % (масс./масс.), % (масс./об.)
SwD	Степень набухания
SwD предпочтительно выражают в г/г, мл/г или в виде безразмерной величины. SwD является обратной концентрацией гелевой формы ГК в геле, который является полностью набухшим в 0,9% физиологическом солевом растворе, т.е. объем или масса полностью набухшего геля, который может быть получен на грамм сухой поперечно-сшитой ГК. SwD описывает максимальную способность продукта поглощать жидкость (0,9% физиологический солевой раствор).
Cmin	Минимальная концентрация ГК	Концентрация гелевой формы ГК в геле, который является полностью набухшим в 0,9% физиологическом солевом растворе, обычно выражают в мг/г или мг/мл.
Cmin-1=SwD
GelC	Содержание геля
Выражают в г/г, в виде безразмерной величины или в %. Содержание геля - это доля ГК, которая связана в гелевой форме, от общего содержания ГК в продукте.
MoD	Степень модификации
Выражают в моль/моль, в виде безразмерной величины или в мол. %. MoD описывает количество сшивающего агента (агентов), которое связано с ГК, т.е. молярное количество связанного сшивающего агента (агентов) по отношению к общему количеству молей повторяющихся дисахаридных звеньев ГК. MoD отражает, в какой степени ГК химически модифицирована сшивающим агентом (агентами).
CrR	Отношение сшивающего агента
		где X - сшивающий агент. CrR также может быть выражено как:
Выражают в моль/моль, в виде безразмерной величины или в мол. %. CrR описывает долю от общего количества связанного сшивающего агента (ГК-Х-ГК и ГК-Х), которая связана с двумя (или более) дисахаридами (только ГК-Х-ГК)
MoE	Эффективность модификации
		MoE - это безразмерная величина, равная отношению Cmin, выраженной в мг/г, к MoD, выраженной в %. MoE описывает количество связей, образованных в результате химической модификации и молекулярных переплетений, которые были достигнуты за счет определенной степени химической модификации с помощью сшивающих агентов.
		Пример: MoE для продукта с Cmin=35 мг/мл и MoD=1,15% составляет примерно 30 и рассчитывается следующим образом:
G'	Модуль упругости	Модуль упругости описывает устойчивость геля к упругой деформации и выражается в Па (Паскалях). Прочный гель будет иметь большее значение по сравнению со слабым гелем.
Gʺ	Модуль вязкости	Модуль вязкости описывает устойчивость геля к вязкой деформации и выражается в Па (Паскалях). Вместе с G' описывает общую устойчивость к деформациям.

Не желая быть ограниченным этим, настоящее изобретение будет далее проиллюстрировано на примерах.

Примеры

Методы анализа

Определение концентрации ГК

Метод определения содержания ГК принят из аналитического теста для гиалуроната натрия, описанного в Ph. Eur. 1472. Принцип этого метода заключается в том, что реакция конденсации производных фурфурола, образованных при нагревании в серной кислоте, происходит с реагентом карбазолом с образованием пурпурно-красного продукта. Эта реакция является специфичной для D-глюкуроновой кислоты, которая является частью ГК. Поглощение измеряют при 530 нм и в качестве стандарта используют глюкуроновую кислоту.

Образовавшийся продукт из D-глюкуроновой кислоты (GlcA), содержащейся в образце, определяют с помощью реакции с карбазолом. Чтобы получить однородные растворы образцов, стабилизированный гель ГК разрушают серной кислотой при 70°C и разбавляют 0,9% раствором NaCl. Растворы смешивают с серной кислотой при температуре 95°C, а затем с реагентом карбазолом. Реакции приводят к образованию растворов розового цвета. Интенсивность окраски измеряют с помощью колориметра при 530 нм, причем оптическая плотность каждого образца прямо пропорциональна содержанию GlcA. Содержание ГК рассчитывают из содержания GlcA в каждом образце.

Определение содержания геля (GelC)

GelC описывает в % долю общей ГК, которая связана в виде геля. Содержание геля определяют как количество ГК в образце, который не проходит через 0,22 мкм фильтр. GelC рассчитывают из количества ГК, которое собирается в фильтрате, здесь обозначенное как экстрагируемая ГК. Содержание геля и содержание экстрагируемой ГК даны в процентах от общего количества ГК в образце геля. Короче говоря, содержание геля определяют путем смешивания определенного количества образца геля с 0,9% раствором NaCl в пробирке. Гелю дают набухнуть, затем NaCl-фазу отделяют от гелевой фазы путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Концентрацию ГК в фильтрате определяют в соответствии с методикой, описанной в определении концентрации ГК.

Определение степени набухания (SwD)

SwD описывает способность продукта поглощать жидкость, то есть способность поглощать 0,9% раствор NaCl. Продукт, как правило, является сухим гелем поперечно-сшитой ГК. Сухой продукт может быть осажденным или неосажденным. SwD можно определить из массы полностью набухшего продукта, который образуется при набухании определенной массы сухого продукта в физиологическом растворе. Если сухой продукт является осажденным, его возвращают в неосажденную форму в этих условиях.

Сухой продукт с заданным весом (обычно 0,1 г) подвергают воздействию избытком 0,9% NaCl (водн.), и продукт оставляют набухать в течение одного часа при комнатной температуре (23°C). Полностью набухшие продукты собирают и взвешивают после удаления неабсорбированной жидкости. Удаление неабсорбированной жидкости также удаляет любые вещества, которые не связаны или запутались в сшитом геле, например, не сшитые и слабо сшитые молекулы гиалуроната. Так как эти вещества, которые не будут вносить вклад в массу полностью набухшего продукта, тем самым давая, по-видимому, более низкое значение SwD, следует сделать поправку на содержание геля для определения истинной SwD. Если содержание геля считается достаточно близким к 100%, что не влияет на результат, эту поправку можно не делать.

SwD рассчитывают как соотношение между массой продукта, полностью набухшего и промытого от экстрагируемой ГК, как описано выше, и массой сухого продукта из поперечно-сшитой ГК в продукте:

,

где GelC выражено в виде безразмерной величины. Если GelC считают близким 1 (100%), SwD можно рассчитать следующим образом:

Были использованы три методики сбора полностью набухшего продукта и удаления непоглощенной жидкости: 1) сбор набухшего продукта кусочек за кусочком, позволяя продуктам кратко коснуться сухой поверхности, 2) сбор всего набухшего продукта с использованием металлической сетки, позволяя сетке кратко коснуться сухой поверхности, 3) удаление жидкости из набухшего продукта путем отсасывания через 0,2 мкм фильтр. В последнем случае массу полностью набухшего продукта не взвешивали непосредственно, а вычисляли на основе веса сухого образца до набухания, веса добавленной жидкости и веса жидкости, удаленной при фильтрации, используя формулу:

m_{полностью набухшего гелевого продукта} = m_{добавленной жидкости} - m_{удаленной жидкости} + m_{сухого продукта}

Примечательно, что более прочный гель будет иметь более низкую SwD, а более слабый гель будет иметь более высокую SwD.

Определение минимальной концентрации (C_min)

C_min описывает концентрацию гелевой формы ГК в гелевом продукте из поперечно-сшитой ГК, полностью набухшем в 0,9% растворе NaCl после полного удаления экстрагируемой ГК. Поскольку продукт не может поглотить больше жидкости, эта концентрация является минимальной концентрацией ГК, которая может быть получена для данного гелевого продукта. Следует отметить, что более прочный гель будет иметь более высокую C_min, в то время как слабый гель будет иметь более низкую C_min.

C_min определяют по аналогии с определением SwD, как изложено выше, используя соотношение:

.

Определение степени модификации (MoD)

MoD описывает молярное количество связанного сшивающего агента (агентов) по отношению к общему количеству повторяющихся дисахаридных звеньев ГК. Эта величина не делает различий между моно-связанным и фактически поперечно-сшитым сшивающим агентом (агентами), т.е. включен весь сшивающий агент (агенты), который связан с ГК с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи. Например, MoD 1% для геля ГК, сшитого с помощью BDDE, означает, что имеется 1 связанная (моно-связанная или поперечно-сшитая) молекула BDDE на 100 дисахаридных звеньев в геле ГК.

MoD определяют с помощью ЯМР-спектроскопии на ферментативно разрушенном гелевом продукте. Растворимую ГК, остаточный (несвязанный) сшивающий агент (агенты) и их производные отмывают перед разрушением геля путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Гелевый продукт разрушают при 37°C с помощью ферментативной обработки с использованием хондроитиназы АС от Arthrobacter aurescens. Разрушенный гелевый продукт подвергают ЯМР-спектроскопии, записывая одномерные спектры ¹H-ЯМР на спектрометре 400 МГц, оснащенном стандартным 5 мм датчиком.

Спектры ЯМР оценивают путем интегрирования сигнала на δ_н 1,6 м.д., который происходит от четырех протонов в молекуле, сшитой BDDE, и сигнала на δ_н 2,0 м.д., который происходит от трех протонов в группах CH₃ на остатках N-ацетилглюкозамина дисахаридов ГК. Соотношение между интегралами для этих двух сигналов пропорционально соотношению между молярным количеством связанного BDDE и дисахаридов после поправки на число протонов, ответственных за каждый сигнал, следовательно, оно дает значение MoD.

Определение эффективности модификации (MoE)

MoE представляет собой соотношение между минимальной концентрацией ГК и степенью модификации геля, т.е.:

C_min (мг/г или мг/мл) и MoD (%) определяют, как описано ранее. Так как C_min тесно связана с прочностью геля, MoE является мерой того, насколько эффективной является процедура сшивания при производстве геля желаемой прочности. Процесс с высоким MoE будет производить гель с высокой C_min и низкой MoD, т.е. получают прочный гель, несмотря на ограниченную химическую модификацию ГК.

Определение отношения сшивающего агента (CrR)

CrR характеризует долю сшивающего агента от всего связанного сшивающего агента (агентов) (ГК-Х-ГК и ГК-Х), который связан с двумя (или более) дисахаридами (только ГК-Х-ГК):

где X представляет собой сшивающий агент.

Этот метод основан на определении фрагментов ГК-Х с использованием SEC-УФ-МС после разрушения геля ГК с помощью хондроитиназы АС от Arthrobacter aurescens или хондроитиназы ABC от Proteus vulgaris на фрагменты, состоящие из основного дисахарида (Δди-ГК), и фрагменты со связанным сшивающим агентом (ГК-X), содержащие 1-16 дисахаридов. Фрагменты разделяют с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), и детектируют с использованием масс-спектрометрии (МС). Площади пиков для каждой группы фрагментов суммируют и CrR рассчитывают следующим образом:

Предполагают, что все типы фрагментов ГК-Х имеют одинаковые отклики в МС-детекторе, т.е. определенная площадь пика соответствует определенному молярному количеству для всех типов фрагментов ГК-Х (Kenne et al., Carbohydrate Polymers 91 (2013) 410-418).

При определении CrR следует позаботиться, чтобы включать только BDDE, присоединенный простыми эфирными связями. В зависимости от условий во время сшивания, BDDE может связываться с ГК как простыми эфирными, так и сложноэфирными связями. Поскольку сложноэфирные связи легко гидролизуются, только BDDE, связанный простыми эфирными связями, будет вносить вклад в прочность геля и долгосрочное существование. Фрагменты с BDDE со сложноэфирными связями имеют такую же массу, как и с BDDE с простыми эфирными связями, однако их можно детектировать, поскольку они имеют немного разные времена удерживания при хроматографии. Для определения CrR без BDDE со сложноэфирными связями образцы должны быть гидролизованы перед анализом. Гидролиз образцов можно осуществить, например, путем добавления основания и/или путем нагревания до или после ферментативного расщепления.

Определение pH

Определение pH осуществляют потенциометрически при температуре окружающей среды с использованием стеклянного электрода. Способ, используемый для определения pH набухшего продукта, основан на методе USP <791>. Процедура: Калибровать pH-метр при комнатной температуре окружающей среды с буферными растворами для стандартизации при pH 7,0 и 4,0. Поместить около 1,2 мл образца (для каждого измерения) в подходящую емкость. Убедиться, что образец находится при комнатной температуре. Измерить pH на двух пробах образца. Промыть электрод дистиллированной водой и вытереть тщательно перед каждым измерением.

Способ определения pH технологических растворов, в частности органических растворителей, является таким, как указано выше, но с калибровкой при pH 7,0 и 10,0.

Значения pH, измеренные в смеси воды и органического растворителя (растворителей), отличаются от значений pH, измеренных в чистых водных растворах с той же концентрацией основания, например гидроксида натрия (NaOH). Поэтому выражение «кажущееся pH» (pH_арр) используется для pH, измеренного в водной смеси органического растворителя (растворителей). Кажущееся pH зависит от нескольких факторов, включая тип органического растворителя (растворителей), концентрацию органического растворителя (растворителей), температуру, ионную силу и присутствие других соединений в смеси.

Кажущиеся значения pH, приведенные в экспериментальной части, были измерены с помощью анализатора Mettler Toledo М.А. 234 pH/lon с электродом Mettler Toledo Inlab Routine Pro для диапазона pH 0-14.

Реометрия

Для определения вязкоупругих свойств набухшего гелевого продукта используют реометрию в осциллирующем режиме. Модуль упругости (G') описывает прочность геля в смысле физического сопротивления геля упругой деформации. Модуль вязкости (Gʺ) описывает прочность геля в смысле физического сопротивления геля вязкой деформации. Измерение выполняют с использованием осциллирующего реометра.

Реометрические измерения выполняют следующим образом. Частотные развертки выполняют со временем покоя по меньшей мере 15 минут между загрузкой образца и измерением, и с деформацией (γ) 0,1%. Используют датчик с параллельными пластинами с диаметром 25 мм и зазором 2 мм. Средние значения модуля упругости (G') и модуля вязкости (Gʺ) определяют при 0,1 и 1 Гц из частотных разверток. Амплитудные развертки выполняют при частоте 1 Гц, чтобы убедиться, что частотная развертка выполнена при деформации (γ) в пределах линейного вязкоупругого диапазона.

Определение способности к ферментативному разрушению

Ферментативное разрушение выполняют для того, чтобы убедиться, что сшитый гель эквивалентен природной ГК по биологическому разрушению, путем подтверждения, что он разлагается гиалуронидазой из бараньих семенников.

Продукт (сухой или набухший до известной концентрации) с заданным весом оставляют набухать в течение ночи при 37°C в 100 мл 0,9% физиологического раствора. Добавляют гиалуронидазу из бараньих семенников (Тип II, Н2126 Сигма) для получения концентрации фермента 200 ед./мл и встряхивают препарат в течение ночи при 37°C. Раствор фильтруют через 0,22 мкм фильтр, а количество ГК в фильтрате определяют с использованием карбазольного способа. Разрушение рассчитывают как отношение количества ГК в фильтрате к общему количеству ГК в образце.

Примеры

Пример 1 - Способы сшивания

Приблизительно 1 г гиалуроната натрия, имеющего молекулярную массу 0,8-3 МДа, растворяли в 10-50 мл водного раствора, содержащего 0-40% этанола и 0-120 мМ сильного основания. После полного растворения полученный раствор гиалуроната имел pH_арр 6-13, измеренное, как описано выше (стадия получения).

Раствор гиалуроната экструдировали через отверстие с диаметром 0,3-0,5 мм в жидкую среду, содержащую органический растворитель. Экструдированный раствор гиалуроната сразу осаждали с получением волокон гиалуроната (стадия осаждения).

Приблизительно 1 г осажденных волокон ГК затем переносили в примерно 20-70 мл водной сшивающей среды, содержащей 65-80% органического растворителя, 0,3-1,2 г (30-230 мМ) сшивающего агента и 1-75 мМ сильного основания. Гиалуронат оставался осажденным и в виде волокон. Полученная сшивающая среда, содержащая ГК имела pH выше 11,5. Волокна ГК оставляли для сшивания в водно-органической сшивающей среде (стадия сшивания).

Полученные таким образом сшитые волокна гиалуроната извлекали из сшивающей среды и нейтрализовали фосфорной кислотой и тому подобным. Сшитые волокна ГК сушили в вакуумной камере при пониженном давлении (~200 мбар) при комнатной температуре в течение приблизительно 1 часа.

Осажденный промежуточный продукт был охарактеризован следующим образом. Определяли вес сухих сшитых волокон гиалуроната. Высушенные волокна пропитывали избытком 0,9%-ного водного физиологического раствора и оставляли свободно поглощать жидкость. Затем волокна образовывали водный гель, и физиологический раствор поглощался до получения равновесного (максимального) набухания волокон. Гелевые волокна удаляли вручную из раствора с оставшимся физиологическим раствором и несшитым гиалуронатом, и переносили непосредственно на весы. Определяли вес полностью набухшего волокна. Из результатов по поглощению соли определяли степень набухания (SwD), соответствующую определенной концентрации гиалуроната натрия полностью набухшего геля (C_min).

Степень модификации (MoD) полученного сшитого волокна гиалуроната определяли с помощью ЯМР-спектроскопии, как описано выше. Вкратце, интенсивность сигнала от связанного BDDE относится к сигналу от ацетильной группы в ГК. Молярное отношение связанного BDDE относительно ГК может быть рассчитано после поправки на количество протонов, вызывающих сигналы. Соответствующую эффективность модификации (MoE) рассчитывали из степени набухания.

Описанные осажденные промежуточные продукты сшитых волокон ГК оставляли набухать в определенной концентрации ГК следующим образом. Физиологический раствор с фосфатным буфером (4 мМ фосфата и 150 мМ NaCl) или тому подобный добавляли в высушенные волокна ГК до концентрации 10-40 мг ГК/мл. Частично набухший гель помещали в пластиковые шприцы на 10 мл. Заполненные шприцы стерилизовали с помощью влажного тепла при 123°C с конечным эквивалентным временем (F₀) приблизительно 20 минут. Содержание автоклавированных шприцев характеризовали в отношении pH, концентрации ГК, степени набухания (SwD) и минимальной концентрации (C_min) способами, описанными выше, и рассчитывали MoE из MoD, определенной для промежуточного продукта.

Сшитые волокна ГК получали, как описано выше. Аналитические данные для осажденных промежуточных продуктов приведены в таблице 1, а данные, полученные для набухших и автоклавированных продуктов, приведены в таблице 2.

Пример 2 - Сшивание с использованием различных сшивающих агентов

Готовили раствор гиалуроната, как описано в примере 1. После полного растворения полученный раствор гиалуроната имел pH выше 9, измеренное, как описано выше. Раствор гиалуроната экструдировали через отверстие диаметром 0,5 мм в жидкую среду, содержащую 99,5% этанола. Экструдированный раствор гиалуроната сразу осаждали с получением волокон гиалуроната.

Приблизительно 1 г осажденных волокон ГК переносили в водно-органическую сшивающую среду, содержащую 70% этанола, сшивающий агент и NaOH. Гиалуронат оставался осажденным и в виде волокон. Полученная сшивающая среда, содержащая ГК, имела pH выше 11,5.

Волокна ГК оставляли сшиваться в водно-органической сшивающей среде. Полученные таким образом сшитые волокна гиалуроната извлекали из сшивающей среды и нейтрализовали фосфорной кислотой. Сшитые волокна ГК сушили в вакуумной камере при пониженном давлении (~200 мбар) при комнатной температуре в течение приблизительно 2 часов.

Описанному осажденному промежуточному продукту из сшитых волокон ГК давали набухать до определенной концентрации ГК следующим образом. Физиологический раствор с фосфатным буфером добавляли к сухим волокнам ГК до концентрации от приблизительно 20 мг ГК/мл. Частично набухший гель помещали в пластиковые шприцы на 10 мл. Заполненные шприцы стерилизовали с помощью влажного тепла при 123°C с конечным F₀ приблизительно 20 минут. Содержание автоклавированных шприцов характеризовали в отношении pH, степени набухания (SwD, способ 3), минимальной концентрации (C_min), степени модификации (MoD) и эффективности модификации (MoE) описанными выше способами. Результаты, показанные в таблице 3, означают, что различные диэпоксиды являются полезными сшивающими агентами в описанных способах.

Пример 3 - Сшивание в метаноле

Раствор гиалуроната готовили, как указано в примере 1. После полного растворения полученный раствор гиалуроната имел pH выше 9, измеренное, как описано выше. Раствор гиалуроната экструдировали через отверстие диаметром 0,5 мм в жидкую среду, содержащую 99,5% этанола. Экструдированный раствор гиалуроната сразу осаждали с получением волокон гиалуроната.

Приблизительно 0,75 г осажденных волокон ГК затем переносили в водную сшивающую среду, содержащую 80% метанола, 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE) и NaOH. Гиалуронат оставался осажденным и в виде волокон. Полученная сшивающая среда, содержащая ГК, имела pH выше 11,5.

Волокна ГК оставляли сшиваться в водно-органической сшивающей среде. Полученные таким образом сшитые волокна гиалуроната извлекали из сшивающей среды и нейтрализовали фосфорной кислотой. Сшитые волокна ГК сушили в вакуумной камере при пониженном давлении (~200 мбар) при комнатной температуре в течение приблизительно 1 часа.

Степень набухания измеряли в соответствии со способом 1 SwD. Высушенные промежуточные сшитые волокна оставляли набухать до 20 мг ГК/мл в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Набухший гель помещали в пластиковые шприцы на 10 мл. Заполненные шприцы стерилизовали с помощью влажного тепла при 123°C с конечным F₀ приблизительно 20 минут. Содержание автоклавированных шприцев характеризовали в отношении pH и степени модификации (MoD) описанными выше способами. Полученная гелевая композиция имела pH 6,8 и MoD 0,34%.

Пример 4 - Сшивание в изопропаноле

Раствор гиалуроната готовили, как указано в примере 3. Приблизительно 0,5 г осажденных волокон ГК затем переносили в 30 мл водной сшивающей среды, содержащей 70% изопропанола, 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE) и NaOH. Гиалуронат оставался осажденным и в виде волокон. Полученная сшивающая среда, содержащая ГК, имела pH выше 11,5.

Волокна ГК оставляли сшиваться в водно-органической сшивающей среде. Полученные таким образом сшитые волокна гиалуроната извлекали из сшивающей среды и нейтрализовали фосфорной кислотой. Сшитые волокна ГК сушили в вакуумной камере при пониженном давлении (~200 мбар) при комнатной температуре в течение приблизительно 1 часа.

Высушенные промежуточные сшитые волокна оставляли набухать до 20 мг ГК/мл в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Набухший гель помещали в пластиковые шприцы на 10 мл. Заполненные шприцы стерилизовали с помощью влажного тепла при 123°C с конечным F₀ приблизительно 20 минут. Содержание автоклавированных шприцев характеризовали в отношении pH, степени набухания (согласно способу 3), содержания геля и степени модификации (MoD) описанными выше способами. Полученная гелевая композиция имела pH 7,6, 47 SwD г/г ГК, C_min 21 мг/мл, MoD 0,41%, а MoE 52.

Пример 5 - Сшивание в желаемых формах и структурах

Раствор гиалуроната готовили, как указано в примере 1. После полного растворения полученный раствор гиалуроната имел pH выше 9, измеренное, как описано выше.

Из вышеописанного раствора гиалуроната готовили осажденные субстраты ГК различных форм или структур путем:

1) экструзии через отверстие диаметром 0,5 мм, формирующей капельки;

2) экструзии через отверстие диаметром 0,5 мм, формирующей сетку; и

3) распределения на пластиковой пластинке, формирующей пленку,

и последующего погружения в жидкую среду, содержащую 99,5% этанола. Экструдированный раствор гиалуроната сразу осаждался в виде гиалуронатых капель, сетки и пленки, соответственно.

Приблизительно 1 г каждого субстрата ГК затем переносили в 45 мл водно-сшивающей среды, содержащей 70% этанола, 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE) и NaOH. Во время реакции сшивания гиалуронат оставался осажденным и в виде заданных форм. Полученная сшивающая среда, содержащая ГК, имела pH выше 11,5.

После сшивания композиции из сшитого гиалуроната извлекали вручную из сшивающей среды, нейтрализовали фосфорной кислотой и сушили в вакуумной камере при пониженном давлении (~200 мбар) при комнатной температуре в течение приблизительно 1 часа, затем их характеризовали.

Для капель и пленки определяли степень набухания (SwD). Известное количество сухого сшитого образца гиалуроната смачивали в избытке 0,9%-ного водного физиологического раствора и оставляли свободно поглощать жидкость. Образцы затем образовывали водные гели, и физиологический раствор поглощался до получения равновесного (максимального) набухания образцов. Образцы гелей затем извлекали вручную из раствора избытка физиологического раствора и несшитого остаточного гиалуроната, и переносили непосредственно на весы. Максимальное поглощение физиологического раствора оценивали путем сравнения веса набухших гелей с первоначальным весом сухого материала. Результаты представлены в таблице 4 в виде степени набухания (SwD, способ 1) и минимальной концентрации (C_min). Сетку оставляли набухать в избытке 0,9%-ного водного физиологического раствора, как описано выше. Набухшая гелевая сетка показана на фиг. 1.

Степень модификации (MoD) сшитых капель и пленки гиалуроната определяли с помощью ЯМР-спектроскопии, как описано выше. Вкратце, интенсивность сигнала от связанного BDDE относится к сигналу от ацетильной группы в ГК. Молярное отношение связанного BDDE относительно ГК затем рассчитывают после поправки на количество протонов, вызывающих сигналы. Соответствующую эффективность модификации (MoE) рассчитывали из степени набухания. Результаты MoD и расчетной эффективности модификации (MoE) представлены в таблице 4.

Сухой промежуточный продукт из сшитых капель оставляли набухать в физиологическом растворе с фосфатным буфером до концентрации ГК 20 мг ГК/мл. Набухший гель помещали в пластиковые шприцы на 10 мл. Заполненные шприцы стерилизовали с помощью влажного тепла при 123°C с F₀ примерно 20 минут. Результаты по определению характеристик автоклавированных капель также представлены в таблице 4.

Полученные результаты показывают, что можно производить материалы из поперечно-сшитой ГК заранее определенной формы, которая сохраняется во время процесса сшивания и автоклавирования.

Пример 6 - Сшивание щелочных волокон

Раствор гиалуроната готовили, как указано в примере 1. После полного растворения полученный раствор гиалуроната имел pH выше 9, измеренное, как описано выше. Раствор гиалуроната экструдировали через иглу 21G (внутренний диаметр 0,5 мм) в жидкую среду, содержащую 99,5% этанола. Экструдированный раствор гиалуроната сразу осаждался с получением волокон гиалуроната.

Приблизительно 1 г осажденных непромытых волокон ГК затем переносили в 68 мл водной сшивающей среды, содержащей 70% этанола и 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE). Гиалуронат оставался неосажденным, щелочным и в виде волокон. Полученная сшивающая среда после добавления щелочных волокон ГК имела pH выше 11,5.

Волокна ГК оставляли сшиваться в водно-органической сшивающей среде. Полученные таким образом сшитые волокна гиалуроната затем извлекали из водной сшивающей среды, нейтрализовали фосфорной кислотой, сушили в вакуумной камере при пониженном давлении (~200 мбар) при комнатной температуре в течение приблизительно 1 часа и характеризовали.

Высушенный промежуточный продукт из сшитых волокон оставляли набухать до концентрации ГК приблизительно 20 мг/мл в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Частично набухший гель помещали в пластиковые шприцы на 10 мл. Заполненные шприцы стерилизовали с помощью влажного тепла при 123°C с конечным F₀ примерно 20 минут. Содержание автоклавированных шприцов характеризовали в отношении pH, степени набухания (SwD), содержания геля и степени модификации (MoD) в соответствии со способами, описанными выше. Минимальную концентрацию C_min и эффективность модификации (MoE) рассчитывали, как описано выше. Результаты представлены в таблице 5.

Таким образом, сшивание щелочных волокон в нейтральной сшивающей среде, содержащей 70% спирта, с конечным кажущимся pH выше 11,5 приводит к получению хорошо очерченных гелевых волокон.

Пример 7 - Исследование биосовместимости и стабильности

Готовили четыре композиции, как изложено в примере 1, с целью изучения биосовместимости материала in vivo. После полного растворения полученный раствор гиалуроната имел pH выше 9, измеренное, как описано выше. Раствор гиалуроната экструдировали через широкие отверстия 18G (∅ 0,8 мм; композиции 1 и 2) или 25G (∅ 0,3 мм; композиции 3 и 4) в жидкую среду, содержащую 99,5% этанола. Экструдированный раствор гиалуроната сразу осаждался с получением волокон гиалуроната.

Приблизительно 1 г осажденных волокон ГК затем переносили в 60 мл водной сшивающей среды, содержащей 70% этанола, 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE) и NaOH. Композиции 2 и 4 обрабатывали в четыре раза большей концентрацией BDDE, чем композиции 1 и 3. Гиалуронат оставался осажденным и в виде волокон. Полученная сшивающая среда, содержащая ГК, имела pH выше 11,5, как измерено прибором, описанным выше.

Волокна ГК оставляли сшиваться в водно-органической сшивающей среде. Полученные таким образом сшитые волокна гиалуроната затем извлекали из водной сшивающей среды, нейтрализовали фосфорной кислотой, сушили в вакуумной камере при пониженном давлении (~200 мбар) при комнатной температуре в течение приблизительно 1 часа и характеризовали.

Высушенные волокна замачивали в избытке 0,9%-ного водного физиологического раствора и оставляли свободно поглощать жидкость. Волокна затем образовывали водный гель, физиологический раствор поглощался, пока не было получено равновесное (максимальное) набухание волокон. Затем гелевые волокна извлекали вручную из раствора, содержащего избыток физиологического раствора и несшитый гиалуронат, и переносили непосредственно на весы. Максимальное поглощение физиологического раствора оценивали путем сравнения первоначального веса осажденного материала с весом полностью набухших волокон. Результаты, полученные для гелевых волокон перед стерилизацией, представлены в таблице 6, также как и степень набухания (SwD) и минимальная концентрация (C_min).

Степень модификации (MoD) полученного волокна из сшитого гиалуроната определяли с помощью ЯМР-спектроскопии, как описано выше. Вкратце, интенсивность сигнала от связанного BDDE относится к сигналу от ацетильной группы в ГК. Молярное отношение связанного BDDE относительно ГК можно рассчитать с поправкой на число протонов, вызывающих сигналы. Фиг. 2A (композиция 1) и 2B (композиция 2) показывают ¹H ЯМР спектры при 400 МГц ферментативно разрушенного ГК-геля в дейтерированной воде (D₂O). Сигналы от связанного BDDE и N-ацетильной группы (NAc) отмечены в спектрах. Результаты MoD и CrR для каждой соответствующей композиции представлены в таблице 6 вместе с эффективностью модификации (MoE).

Высушенный промежуточный продукт из сшитых волокон оставляли набухать в определенной концентрации ГК следующим образом. Физиологический раствор с фосфатным буфером добавляли к высушенным ГК-волокнам с достижением рассчитанной концентрации примерно 20 мг ГК/мл. Композиции 1 и 3 поглотили весь добавленный раствор, в то время как композиции 2 и 4 - нет. Набухший гель затем помещали в асептических условиях в стеклянные шприцы на 1 мл. Заполненные шприцы стерилизовали с помощью влажного тепла при 125°C с конечным F₀ примерно 20 минут.

Содержимое автоклавированных шприцев характеризовали в отношении концентрации ГК, содержания геля (GelC), степени набухания (SwD) и pH в соответствии со способами, описанными выше. Результаты для продукта после стерилизации представлены в таблице 7.

Как видно из Таблиц 6 и 7, композиции 1 и 3 являются менее прочными и менее химически модифицированными, чем композиции 2 и 4. Высокие концентрации ГК композиций 2 и 4 отражают, что максимальное поглощение воды является низким, и что нельзя получить гелевый продукт с низкой концентрацией ГК для геля, полученного в этих условиях.

Композиции анализировали в отношении бионагрузки (чашечный метод) и эндотоксинов (метод гель-тромб). Все композиции имели бионагрузку 0 КОЕ/шприц и значение эндотоксина <0,21 ЕЭ/мл. Все композиции отвечают требованиям относительно чистоты для изучения биосовместимости.

Микроскопия

Набухшие и автоклавированные волокна визуализировали путем окрашивания волокон в водном растворе толоуидинового синего в течение 15 минут. Микроскопические изображения показаны на фиг. 3A-D. 3A: Композиция 1; 3B: Композиция 2; 3C: Композиция 3; и 3D: Композиция 4. Длина отрезка = 1 мм.

Тестирование стабильности

Тестирование стабильности композиций проводили при 60°C и относительной влажности окружающей среды (RH) в течение 14 дней. Все композиции показали хорошую стабильность. Фиг. 4 показывает увеличение SwD с течением времени при 60°C (измерено в соответствии со способом 3 определения SwD и с поправкой на содержание геля). Композиция 1 ; Композиция 2 ; Композиция 3 ; и Композиция 4 .

Биологическая оценка

Биосовместимость композиций проверяли с помощью подкожных инъекций на 24 крысах Sprague-Dawley. Животных анестезировали, брили дорсально и вводили подкожно 1 мл каждой композиции. Две инъекции проводили с каждой стороны от средней линии на спине крысы. Животные были разделены на две группы. Одну группу умерщвляли через одну неделю после инъекции, а другую группу через три недели после инъекции. Животных проверяли ежедневно и не было зарегистрировано никаких признаков болезни. Инъецированные композиции макроскопически и гистологически хорошо переносились на всех образцах кожи. Таким образом, никаких признаков некроза или острого воспаления не было видно. Не было обнаружено ни одного образования гранулем или признаков тканевой реакции, кроме тонкой фиброзной капсулы (не показана), окружающей место имплантированной композиции. Можно сделать вывод, что эти композиции были биосовместимыми у крыс.

Пример 8 - Разрушение гиалуронидазой гелей с различной прочностью

Готовили раствор гиалуроната, как указано в примере 1. После полного растворения полученный раствор гиалуроната имел pH выше 11,5, измеренное, как описано выше. Раствор гиалуроната экструдировали через отверстие диаметром 0,5 мм в жидкую среду, содержащую 99,5% этанола. Экструдированный раствор гиалуроната сразу осаждался с получением волокон гиалуроната.

Приблизительно 1 г осажденных волокон ГК переносили в водно-органическую сшивающую среду, содержащую 70% этанола, BDDE и NaOH. Гиалуронат остался осажденным и в виде волокон. Полученная сшивающая среда, содержащая ГК, имела pH выше 11,5.

Волокна ГК оставляли сшиваться в водно-органической сшивающей среде. Полученные таким образом сшитые волокна гиалуроната затем извлекали из сшивающей среды и нейтрализовали фосфорной кислотой. Сшитые волокна ГК сушили в вакуумной камере при пониженном давлении (~200 мбар) при комнатной температуре в течение приблизительно 2 часов.

Описанный осажденный промежуточный продукт из сшитых волокон ГК оставляли набухать до определенной концентрации ГК следующим образом. Физиологический раствор с фосфатным буфером добавляли к высушенным волокнам ГК до концентрации примерно 20-40 мг ГК/мл. Частично набухший гель помещали в пластиковые шприцы на 10 мл. Заполненные шприцы стерилизовали с помощью влажного тепла при 123°C с конечным F₀ приблизительно 20 минут. Содержимое автоклавированных шприцев характеризовали в отношении степени набухания (способ 2 определения SwD), концентрации ГК, минимальной концентрации ГК (C_min), степени модификации (MoD), эффективности модификации (MoE) и вязкоупругих свойств в соответствии с описанными выше способами. Все различные продукты подвергали разрушению гиалуронидазой в соответствии с "Определением способности разрушаться ферментами", чтобы убедиться, что биоразлагаемость ГК сохраняется в сшитом продукте.

Результаты представлены в таблицах 8A и 8B. Значения G'/(G'+Gʺ) составляют >70% для всех композиций, которые ясно показывают, что все они являются гелями. Кроме того, значения G' показывают, что гели являются твердыми. Тем не менее, гели разлагаются с помощью гиалуронидазы более чем на 99% в широком диапазоне прочности геля, как показано с помощью определенных свойств набухания и реологических свойств. Это показывает, что биоразлагаемость природной ГК преимущественно сохраняется в гелевых продуктах в соответствии с настоящим изобретением.

Пример 9 - Сравнительный пример

Пять образцов гелей гиалуроновой кислоты (ГК) готовили в соответствии с примером 4 из EP 2199308 A1, смотрите таблицу 9A ниже. Контрольный образец в соответствии с изобретением (FU0509:1) получали с использованием способа сшивания, описанного в примере 1 выше.

Гели были получены для всех образцов, см. Таблицу 9B. Частицы геля неправильной формы, полученные для сравнительных образцов 1-5, показали значения MoD в том же диапазоне, что и образец, полученный способом в соответствии с изобретением. Однако, значения G' и Gʺ значительно ниже для сравнительных образцов 1-5 по сравнению с образцом, полученным способом в соответствии с изобретением. Сделан вывод, что способ в соответствии с настоящим изобретением является более эффективным, чем способ, описанный в EP 1993082 A1, поскольку настоящее изобретение обеспечивает получение прочных гелей при более низкой MoD.

Микроскопические изображения сравнительных образцов 1-5 (фиг. 5A-E, соответственно, каждый из которых имеет 50-кратное увеличение) демонстрируют широкое распределение по размерам и форме продукта, показывая, что способом, раскрытым в EP 2199308 A1, получают частицы случайного размера. Форма и размер полученных частиц не контролируются. В противоположность этому, микроскопические изображения продукта, полученного способом согласно изобретению (фиг. 5F), показывают продукт с однородным размером и формой.

Пример 10 - Концентрации этанола на стадии осаждения

Был протестирован эффект осаждения лент ГК в различных концентрациях этанола. Готовили четыре водноэтанольных раствора с концентрацией 65, 75, 85, 95% масс./масс. Раствор ГК (5% масс./масс.) в этаноле (35% масс./масс.) с 0,5% NaOH (масс./масс.) экструдировали вручную на небольшие пластиковые (ПЭ) пленки, которые погружали в ванны с каждым из растворов этанола и с чистым этанолом (99,5% масс./масс.), или последовательно погружали на одну минуту в 75% и 85% этанол, и затем переносили в 99,5% этанол.

Полученные осажденные ленты собирали и оценивали визуально с использованием световой микроскопии. Также оценивали органолептические ощущения при обращении с этими лентами. Было обнаружено, что ленты имеют более гладкую и ровную поверхность, и являются более скрученными, более хрупкими и показывают большее расслоение структуры, чем выше была концентрация этанола в осадительной ванне.

Ленты, которые были осаждены последовательно (75%→85%→99,5%) вели себя как ленты, которые осаждали только в 75 масс./масс. % или 85 масс./масс. %. Не наблюдалось полного осаждения ГК в 65% этаноле в этих условиях. Образец, который обрабатывали в 65% этаноле в течение 20 мин и затем полностью осаждали в 99,5% этаноле, имел совершенно другой внешний вид по сравнению с другими лентами: плоские и тонкие полосы без структурных расслоений.

Пример 11 - Придание желаемой формы на гидрофобной поверхности

Эффект способа осаждения был проверен путем сравнения двух следующих способов:

(I): 1) экструзия - 2) помещение на пленку из ПЭ - 3) осаждение в 99,5% этаноле (см. Пример 10)

(II): 1) экструзия - 2) свободное падение через 99,5% этанол - 3) оседание на пленку из ПЭ.

Полученные осажденные ленты собирали и оценивали визуально с использованием световой микроскопии. Также оценивали органолептические ощущения при обращении с этими лентами. Было обнаружено, что при первом способе (I) осаждения получены гладкие и ровные ленты, а при втором способе (II) осаждения получены хрупкие и неровные ленты с вмятинами.

Пример 12 - Подкожное введение крысам

Гелевую композицию, полученную по существу таким же образом, как описано в примере 7, тестировали in vivo путем подкожной инъекции бесшерстным крысам (Sprague Dawley). Было отмечено, что форма ленты имплантированного геля (фиг. 6A) сохраняется через 6 месяцев (фиг. 6B) в подкожной области у крыс. Фиг. 6A показывает ленты (не экспланты), разбавленные в Milli-RX и окрашенные толуидиновым синим после экструзии через канюлю 18G. Фиг. 6B показывает ту же партию лент, эксплантированных из подкожной области крыс через 6 месяцев.

Сделан вывод, что форма ленты сохраняется после экструзии через иглу, а также через 6 месяцев у крыс.

Пример 13 - Сравнительный пример

В US 2012/0034462 A1 предполагается без экспериментальных доказательств, что тонкие ленты из поперечно-сшитого геля ГК могут быть получены пропусканием сплошной массы сшитого геля ГК через сито или сетку. Чтобы проверить эту теорию, гель получали в соответствии с примером 1 US 2012/0034462 A1 (ГК MB 3 МДа; BDDE 75 мг/г ГК; температура 50°C, в течение 2 часов). Гидрогель пропускали через сито с размером отверстий 32 мкм или 63 мкм один раз.

Полученные гелевые структуры из ГК с 10-кратным увеличением показаны на фиг. 7, (A) размер ячейки сита 32 мкм; (B) размер ячейки сита 63 мкм (длина отрезка = 2 мм). Полученные частицы не продемонстрировали какой-либо упорядоченной структуры, в частности, какой-либо продолговатой формы.

1. Способ производства формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, включающий стадии:

(i) получения субстрата гиалуроновой кислоты, растворенной в первой жидкой среде, которая представляет собой водный раствор, без какого-либо сшивания;

(ii) осаждения субстрата гиалуроновой кислоты, подвергая его воздействию второй жидкой среды, содержащей количество одного или более первых водорастворимых органических растворителей, которые обеспечивают условия осаждения гиалуроновой кислоты без какого-либо сшивания;

причем стадия (i) и/или стадия (ii) дополнительно включает придание субстрату гиалуроновой кислоты желаемой формы, выбранной из группы, состоящей из частицы, волокна, ленты, нити, сетки, пленки, диска и гранулы; и

(iii) подвергания осажденного субстрата несшитой гиалуроновой кислоты в желаемой форме единственной стадии сшивания в третьей жидкой среде, имеющей рН 11,5 или выше и содержащей один или более полифункциональных сшивающих агентов и количество одного или более вторых органических растворителей, обеспечивающих условия осаждения гиалуроновой кислоты, в условиях, подходящих для получения осажденного формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первые две стадии (i) и (ii) осуществляют в отсутствие сшивающего агента, и при этом на третьей стадии (iii) сшивания добавляют полифункциональный сшивающий агент (агенты).

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что стадия (i) дополнительно включает придание раствору субстрата гиалуроновой кислоты желаемой формы на гидрофобной поверхности; и при этом осаждение формованного субстрата гиалуроновой кислоты на стадии (ii) проводят на указанной гидрофобной поверхности.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что гидрофобную поверхность выбирают из фторуглеродов, полипропилена (ПП), полиэтилентерефталата, модифицированного гликолем (ПЭТГ), полиэтилена (ПЭ) и политетрафторэтилена (ПТФЭ).

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная форма является волокном и соотношение его длины к его ширине составляет 10:1 или выше.

6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадия (ii) включает экструдирование субстрата гиалуроновой кислоты во вторую жидкую среду, содержащую количество первого водорастворимого органического растворителя (растворителей), обеспечивающего условия осаждения гиалуроновой кислоты, с образованием во второй жидкой среде осажденного волокна из экструдированного субстрата гиалуроновой кислоты.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вторая жидкая среда на стадии (ii) содержит 0-30 об. % воды и 70-100 об. % первого водорастворимого органического растворителя (растворителей).

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что вторая жидкая среда на стадии (ii) содержит 0-10 об. % воды и 90-100 об. % первого водорастворимого органического растворителя (растворителей).

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что третья жидкая среда на стадии (iii) содержит 0-35 об. % воды, 65-100 об. % второго органического растворителя (растворителей) и один или более полифункциональных сшивающих агентов.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что органический растворитель (растворители) индивидуально выбирают из одного или более низших алкильных спиртов.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что водный раствор на стадии (i) содержит 40-100 об. % воды и 0-60 об. % низшего(их) алкильного(ых) спирта(ов).

12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что низший алкильный спирт представляет собой этанол.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные полифункциональные сшивающие агенты индивидуально выбирают из группы, состоящей из дивинилсульфона, полиэпоксидов и диэпоксидов.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанные полифункциональные сшивающие агенты индивидуально выбирают из группы, состоящей из 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидилового эфира (EDDE) и диэпоксиоктана.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанный полифункциональный сшивающий агент представляет собой 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE).

16. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадии:

(iv) подвергания осажденного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты воздействию неосаждающих условий; и

(v) выделения продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты в неосажденной форме.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что стадия (v) дополнительно включает стерилизацию продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты.

18. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, имеющий форму, выбранную из группы, состоящей из частицы, волокна, ленты, нити, сетки, пленки, диска и гранулы, и имеющий степень модификации 1-40 фрагментов сшивающего агента на 1000 дисахаридных звеньев, степень набухания 4-300 мл на грамм гиалуроновой кислоты и эффективность модификации 10 или выше, где эффективность модификации является мерой соотношения между минимальной концентрацией гиалуроновой кислоты (C_min) геля и степенью его химической модификации с помощью сшивающего агента (агентов).

19. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по п. 18, отличающийся тем, что представляет собой волокно и соотношение его длины к его ширине составляет 10:1 или выше.

20. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 18 или 19, отличающийся тем, что представляет собой волокно и имеет длину в продольном направлении более 2 мм.

21. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по п. 18, отличающийся тем, что имеет степень набухания 15-180 мл на 1 грамм гиалуроновой кислоты.

22. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по п. 18, имеющий эффективность модификации в диапазоне от 20 до 190.

23. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по п. 18, отличающийся тем, что имеет соотношение сшивающего агента 35% или выше.

24. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по п. 18, отличающийся тем, что является поперечно сшитым с помощью одного или более полифункциональных сшивающих агентов, индивидуально выбранных из группы, состоящей из дивинилсульфона, полиэпоксидов и диэпоксидов.

25. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по п. 24, отличающийся тем, что полифункциональные сшивающие агенты индивидуально выбраны из группы, состоящей из 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE), 1,2-этандиолдиглицидилового эфира (EDDE) и диэпоксиоктана.

26. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по п. 25, отличающийся тем, что полифункциональный сшивающий агент представляет собой 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE).

27. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по п. 18, отличающийся тем, что является стерилизованным.

28. Формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, изготовленный способом производства по любому из пп. 1-17.

29. Водная композиция, содержащая формованный продукт из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 18-28 и, возможно, буферный агент.

30. Применение формованного продукта из поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 18-28 или водной композиции по п. 29 в косметической хирургической операции.

31. Применение по п. 30 в косметической хирургической операции, выбранной из дермального наполнения и контурной пластики тела.