Полипептид для понижения уровня сахара в крови на основе глюкагоноподобного пептида-1 человека, рекомбинантный штамм-продуцент e. coli и способ получения этого полипептида

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный модифицированный глюкагоноподобный пептид-1 человека (рмГПП-1), способ его получения и штамм-продуцент E.coli ВКПМ В-12555. рмГПП-1 имеет последовательность SEQ ID NO 1. рмГПП-1 получают путем культивирования рекомбинантного штамма-продуцента E.coli ВКПМ В-12555 для получения предшественника пептида рмГПП-1 с последующим выделением полученного предшественника, его автокаталитическим расщеплением и очисткой целевого полипептида. На мышиной модели показано, что при подкожном или внутримышечном применении рмГПП-1 имеет показатели сахаропонижающей активности и продолжительности действия, сходные с показателями коммерческого препарата «Ликсумия», получаемого с использованием химического синтеза, и на протяжении минимум 3 ч после введения способен эффективно снижать уровень глюкозы в крови практически в два раза по сравнению с контролем. Штамм E. coli ВКПМ В-12555 позволяет осуществлять биосинтез предшественника рмГПП-1 на уровне 40% от суммарного белка клеток, что соответствует биосинтезу рмГПП-1 на уровне 13% от суммарного белка клеток. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 7 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного генетически модифицированного производного глюкагоноподобного пептида-1 человека (рмГПП-1), полученного путем микробиологического синтеза и характеризующегося пролонгированным сахаропонижающим действием, что позволяет рассматривать его в качестве основы перспективного лекарственного средства (ЛС) для лечения сахарного диабета типа 2 (СД2).

Сахарный диабет является хроническим, угрожающим жизни заболеванием. Будучи одним из самых затратных заболеваний как в социальном, так и экономическом плане, сахарный диабет приобрел значение одной из важнейших мировых проблем в области здравоохранения [Дедов и др., 2008].

В настоящее время при терапии инсулинозависимого СД2 предпочтение отдается средствам, способным не только компенсировать диабет, но и задерживать развитие и прогрессирование его осложнений. Основной целью современных способов лечения болезни является компенсация нарушений углеводного обмена [Алгоритмы, 2015].

Этим условиям удовлетворяют ЛС, действие которых подобно действию природного пептидного гормона глюкагоноподобного пептида-1 человека (ГПП-1), относимого к семейству инкретинов и вызывающего стимуляцию секреции инсулина в ответ на прием пищи.

Такие ЛС, реализующие «инкретиновый» эффект, содержат в качестве активного компонента различные аналоги ГПП-1, действующие как агонисты рецепторов ГПП-1. Одним из главных проявлений биологической активности таких ЛС является стимулирование процесса выведения сахара, а именно глюкозы, из крови. Но не менее ценно, что одновременно с сахаропонижающим эффектом применение таких ЛС способствует преодолению дисфункции β-клеток, т.е. воздействует непосредственно на причину повышения уровня сахара в крови.

Природный ГПП-1 представляет собой пептид, который в организме человека присутствует в трех формах: ГПП-1(1-37); ГПП-1(7-37); ГПП-1(7-36)NH₂. Инкретиновой активностью в одинаковой степени обладают лишь формы 2 и 3.

Первичная структура формы ГПП-1(7-37) представлена ниже.

Однако применение форм ГПП-1(7-37) и ГПП-1(7-36)NH₂ для лечения СД2 является неэффективным в связи с их крайне низкой стабильностью в кровотоке (период полураспада 1-2 мин). Известно, что основной вклад в их быструю инактивацию вносит фермент дипептидилпептидаза-4 (ДПП-4), присутствующий на поверхности большинства клеток, а также циркулирующий в крови [Kikuchi et al., 1988]. Этот фермент отщепляет от активированных форм ГПП-1 N-концевой дипептид HisAla, содержащий аланин, который и определяет чувствительность форм ГПП-1(7-37) и ГПП-1(7-36)NH₂ к ДПП-4.

В этой связи на практике вместо нативных форм ГПП-1 применяют их аналоги, обладающие одновременно схожим действием и высокой протеолитической стабильностью, или же используют ингибиторы ДПП-4, блокирующие протеолитическую активность фермента [Capuano et al., 2013].

Аналоги ГПП-1 получают с помощью химического синтеза и/или с использованием рекомбинантных технологий. В последнем случае речь идет исключительно о разработке аналогов ГПП-1(7-37).

Основными направлениями разработки рекомбинантных аналогов ГПП-1 являются: (1) поиск мутантных производных ГПП-1 с увеличенной устойчивостью к действию ДПП-4; (2) получение производных ГПП-1, слитых с долгоживущими белками крови (далее в тексте для их обозначения использован термин «фьюжин»).

При разработке мутантных производных ГПП-1(7-37), как правило, производят замену аланина-8, что приводит к значительному снижению эффективности действия ДПП-4. В роли замещающего остатка используют Gly, Val или Ser [Gao et al., 2009]. В частности, аналоги ГПП-1(7-37), содержащие замену Ala8Gly, применяются в составе ЛС Альбиглютида (Albiglutide) [Baggio et al., 2004; Dou et al., 2008] и Дулаглютида [http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Public_assessment_report/human/002825/WC500179473.pdf].

Блокирующий эффект в отношении ДПП-4-зависимой деградации вызывает также удлинение ГПП-1 с N-конца, например, путем присоединения остатка лизина [Gao et al., 2009].

Известны также аминокислотные замены в составе ГПП-1, которые приводят к увеличению биологической активности мутантных аналогов или повышают их устойчивость к инактивации под действием других протеолитических ферментов [Gao et al., 2009].

Устойчивости к протеолитической инактивации достигают также путем внесения замен, приводящих к изменению конформации производных ГПП-1. Известен стабилизированный аналог ГПП-1, в составе которого сформирована дисульфидная связь, для чего в положения С33 и С37 введены остатки цистеина, а С-конец удлинен путем присоединения пептида PSSGAPPPSGGGGG [Li et al., 2011]. Стабилизируют мутантные производные ГПП-1 и путем введения замещающих остатков, способных формировать внутримолекулярные лактамовые мостики [Murage et al., 2010].

Увеличение времени жизни и активности природного агониста рецептора ГПП-1 - белка эксенатида (Exenatide) достигают за счет его С-концевого удлинения, осуществляемого путем присоединения шести остатков лизина [Barnett, 2011].

Известны также стабилизированные аналоги ГПП-1, удлиненные с С-конца путем присоединения долгоживущих белков крови или их функциональных фрагментов.

Эффективные фьюжины производных ГПП-1 получены с такими белками крови, как IgG [US 8071103; Wang et al., 2010], сывороточный альбумин [Baggio et al., 2004; Dou et al., 2008], трансферрин [Kim et al., 2010], эластин [US 8178495] и другие. В составе некоторых из них используют мутантный вариант ГПП-1(7-37), содержащий замену Ala8Gly.

Производные ГПП-1 в составе таких фьюжинов устойчивы к деградации и сохраняют сахаропонижающую активность; одновременно с этим период их жизни в кровотоке значительно увеличивается. Так фьюжин с альбумином обладает периодом полужизни 54,2 чВ [Baggio et al., 2004; Dou et al., 2008], фьюжин ГПП-1 с негликозилированной формой человеческого трансферрина, которые разделяет спейсер из двух повторов PEAPTD, обладает периодом полужизни около 2 дней [Kim et al., 2010], а фьюжины ГПП-1 с эластиноподобными пептидами (ELP) имеют период полужизни до 24 часов [US 8178495].

Известны фьюжины, полученные в результате генно-инженерного слияния мутантных производных ГПП-1(7-37) и Fc фрагмента IgG4. В их составе в качестве спейсерного пептида (L), расположенного между С-концом ГПП-1 и N-концом IgG4, используют последовательность (Gly₄Ser)₃, повторенную один, полтора и два раза подряд [US 8273854]. Один из таких фьюжинов получил название дулаглютид (Dulaglutide). На его основе разработан лекарственный препарат «Трулисити» (Tonicity™) [Jimenez-Solem et al, 2010]. Дулаглютид устойчив к действию ДПП-4 и уменьшает содержание глюкозы в крови, его применяют один раз в неделю.

Стабилизации и удлинения времени жизни производных фармацевтически активных белков достигают также в результате слияния с гепарансульфат (ГС) - содержащими протеогликанами (ГСПГ) [Sommer & Rifkin, 1989; Dubrac et al., 2010; Bramono et al., 2012; Xia et al., 2012; Xu & Esko, 2014; http://sportswiki.ru/%D0%93%D0%B5%D0%BF%D0%B0%D1%80%D0%B8%D0%BD], представляющими собой белки, модифицированные линейными отрицательно заряженными (кислые) полисахаридами подкласса гликозаминогликанов [Bourin & Lindahl, 1993]. ГСПГ в обилии представлены на поверхности практически всех видов клеток животных и в составе внеклеточного матрикса [Xu & Esko, 2014]. Высокая аффинность ГС обусловлена наличием в их составе значительного количества отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп, представляющих собой сильные природные полианионы, способные к электростатическим взаимодействиям со многими белковыми и синтетическими соединениями поликатионной природы.

ГС в составе ГСПГ вовлечены в различные физиологические процессы и взаимодействуют с множеством других белков, включая белки крови, содержащие в своем составе гепарин-связывающие домены (НВ). В результате этого взаимодействия происходит стабилизация и стимулирование функциональной активности таких белков [Dubrac et al., 2010; Zhao et al., 2010; Xia et al., 2012].

На фармацевтическом рынке присутствуют несколько коммерческих препаратов, основу которых составляют агонисты рецепторов ГПП-1.

В 2005 г. в США зарегистрирован препарат из группы агонистов рецепторов ГПП-1 «Баета» (Byetta; Bristol-Myers Squibb Co., зарегистрирован в РФ). Препарат создан на основе 39-членного пептида эксенатида, имеющего 50%-ную аминокислотную гомологию с ГПП-1 человека и являющегося синтетическим вариантом гормона эксендина-4 (exendin-4) американской ящерицы ядозуба Heloderma suspectum. Эксенатид обладает природной устойчивостью к действию протеиназы ДПП-4, производится путем прямого химического синтеза и вводится подкожно 2 раза в сутки.

В 2009-2010 гг. появился препарат «Виктоза» (Victoza; Novo Nordisk; зарегистрирован в РФ) на основе лираглутида (Liraglutide). Лираглутид представляет собой относительно устойчивое к протеолизу производное ГПП-1(7-37), у которого модифицированы оба остатка лизина: остаток лизина в положении 34 заменен остатком аргинина, а к остатку лизина в положении 26 через спейсер (глутаминовая кислота) присоединена молекула жирной кислоты (С16, пальмитиновая кислота). Такая гибридная молекула способна образовывать мицелло-подобные структуры и нековалентно связываться с сывороточным альбумином в плазме крови, что обеспечивает эффект пролонгации и защиты от протеолиза. Генетически модифицированный ГПП-1 производится путем экспрессии в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Применяют препарат подкожно раз в сутки.

В 2012 году в США одобрен препарат «Байдьюрон» (Bydureon; Amylin Pharmaceuticals/Eli Lilly) на основе эксенатида, инкапсулированного в биодеградируемые микросферы сополимера молочной и гликолевой кислот, что обеспечивает его постепенное высвобождение. Применяют препарат подкожно раз в неделю.

В 2013 году одобрен препарат «Ликсумия» (Lyxumia; Sanofi; зарегистрирован в РФ), содержащий ликсисенатид (Lixisenatide), представляющий собой эксендин-4(1-39), модифицированный по С-концу путем удаления остатка пролина в положении 38 и добавления 6 остатков лизина. Ликсисенатид получают в результате химического синтеза. Режим применения препарата «Ликсумия» раз в сутки.

В апреле 2016 года одобрен препарат «Танзеум» (альбиглютид) (Tanzeum; Albiglutide; GlaxoSmithKline LLC). Этот препарат представляет собой фьюжин, в составе которого две копии ГПП-1 соединены с сывороточным альбумином человека. Каждая копия содержит аминокислотную замену Ala8Gly, опосредующую устойчивость к протеолитической инактивации под действием ДПП-4. Режим введения препарата подкожно один раз в неделю.

Дулаглютид (препарат «Трулисити») (Trulicity; Eli Lilly), одобренный в 2014 году, представляет собой ГПП-1 (7-37), ковалентно связанный с Fc-фрагментом человеческого IgG4. Этот фьюжин устойчив к действию ДПП-4. Применяют раз в неделю.

Задача заявляемой группы изобретений: расширить арсенал лекарственных средств для понижения уровня сахара в крови. Задача решена путем: 1) получения полипептида для понижения уровня сахара в крови, представляющего собой слитой белок на основе ГПП-1 человека, и соответствующего последовательности SEQ ID N1; 2) конструирования рекомбинантного штамма Escherichia coli ВКПМ В-12555, используемого для получения заявляемого полипептида; 3) разработки способа получения заявляемого полипептида путем автокаталитического выщепления из состава белка-предшественника, включающего последовательность рекомбинантного мутантного варианта интеина Pch PRP8 Intein Penicillium chrysogenum, имеющего размер 157 аминокислотных остатков [Elleuche et al., 2006] относящегося к семейству PRP8, содержащего замену аминокислотного остатка лейцина в положении 93 на остаток пролина, замену остатка цистеина в положении 1 на остаток аланина и не обязательно содержащий замену цистеина в положении 11 на остаток тирозина, и синтезированного в процессе культивирования рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli ВКПМ В-12555.

В процессе решения этой задачи разработана структура рекомбинантного модифицированного ГПП-1 человека (рмГПП-1), включающая, начиная с N-конца, аминокислотную последовательность мутантного ГПП-1 (7-37) человека, содержащего известную мутацию Ala8Gly, обеспечивающую устойчивость ГПП-1 к действию ДПП-4, слитую с аминокислотной последовательностью спейсерного пептида (G₄S)₄, слитого с последовательностью гепарин-связывающего пептида НВ1 (KRKKKGKGLGKKR), слитого с С-концевой последовательностью (G₄S), где G-остаток глицина, S-остаток серина, K-остаток лизина, R-остаток аргинина, L-остаток лейцина.

Заявляемый полипептид рмГПП-1 относится к классу агонистов рецепторов ГПП-1 и является продуктом генной модификации ГПП-1. Он состоит из N-концевой активной части и С-концевого вспомогательного полипептида.

Вспомогательная последовательность в составе рмГПП-1 представляет собой сложный полипептид, в составе которого последовательно соединены:

- известная аминокислотная последовательность (G₄S)₄, обладающая неупорядоченной структурой и одновременно выполняющая спейсерную функцию;

- гепарин-связывающий пептид НВ1 из состава природного белка HB-EGF человека, отвечающий за взаимодействие белка с гепарин-содержащими мишенями на поверхности клеток и в составе внеклеточного матрикса [Thompson et al.,. 1994];

- аминокислотная последовательность G₄S на С-конце молекулы, выполняющая функцию защиты белка от действия карбоксипептидаз крови.

Все функциональные части вспомогательной последовательности в составе рмГПП-1 введены с целью стимулировать депонирование рмГПП-1 в месте инъекции.

Последовательность, состоящую из нескольких блоков (G₄S), включают в состав заявляемого полипептида ввиду ее экспериментально показанной способности обеспечивать подкожное или внутримышечное депонирование рекомбинантных белков в области введения и, как следствие, замедление их поступления в кровоток [RU 2515913]. Такую последовательность, как не обладающую иммуногенными свойствами, используют в качестве спейсерной последовательности для соединения/разделения ГПП-1 и Fc-фрагмента IgG4 в составе дулаглютида [Jimenez-Solem et al., 2010].

В состав заявляемого полипептида рмГПП-1 включен также гепарин-связывающий пептид НВ1, ранее использованный в составе рекомбинантной аспарагиназы [RU 2562166; Sannikova et al., 1016]. В составе рекомбинантного аналога ГПП-1 пептид с таким функциональным назначением использован впервые. Также впервые использован прием структурной локализации НВ1 пептида внутри последовательности (G₄S)₄-HB1-G₄S для обеспечения защиты НВ1 пептида от протеолитической деградации под действием карбоксипептидаз крови.

Для получения полипептида рмГПП-1 используют способ биосинтеза целевого полипептида в составе слитого белка-предшественника, формирующего тельца включения. С этой целью рмГПП-1 получают в составе слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, содержащего мутантный температуро-чувствительный вариант интеина Int4bPro. Уникальные свойства Int4bPro обусловлены наличием у него мутаций Cys1Ala, Cys11Tyr и Leu93Pro, первые две из которых инактивируют его способность к сплайсингу, а последняя делает его способность к формированию телец включения и C-концевому автокаталитическому процессингу зависимой от температуры.

В результате в условиях биосинтеза при температуре +37°C предшественник заявляемого полипептида - слитой белок ПРЕ-рмГПП-1, содержащий интеин Int4bPro, синтезируется в нерастворимой фракции в клетках штамма-продуцента E.coli, что обеспечивает его значительный уровень биосинтеза и позволяет упростить последующие стадии (денатурации-ренатурации, автокаталитический процессинг слитого белка и получение очищенного рмГПП-1) за счет их проведения при пониженной температуре.

Показано, что в отсутствие ключевой мутации Leu93Pro использование интеина Pch PRP8 Penicillium chrysogenum для получения рмГПП-1 приводит к биосинтезу слитого белка во фракции растворимых клеточных белков, что снижает его выход в результате преждевременного процессинга, а также значительно затрудняет процедуру его очистки.

Штамм E.coli ECR-Glp20 - продуцент слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 получают путем трансформации реципиентного штамма Escherichia coli BL21(DE3) [Novagen, ВКПМ B-10189] плазмидой pET28-Glp20, являющейся производной вектора pET28b+ [Novagen] и содержащей структурный ген слитого белка - ПРЕ- рмГПП-1 под контролем сильного промотора, узнаваемого РНК полимеразой фага Т7 E.coli.

Слитой белок ПРЕ-рмГПП-1 синтезируют в клетках штамма-продуцента в нерастворимой фракции клеточных белков, а получение рмГПП-1 из состава слитого белка осуществляют путем автокаталитического выщепления в процессе денатурации-ренатурации. Автокаталитическому расщеплению подвергается пептидная связь, предшествующая первому N-концевому остатку рмГПП-1, что позволяет получать рмГПП-1, имеющий нативный N-конец.

Для биосинтеза других производных ГПП-1 в составе слитых белков известно применение мини-интеина Ssp DnaB [Ma et al., 2010; Gao et al., 2012; Jiang et al., 2015].

Способ получения заявляемого полипептида в общем виде

Посевной материал штамма - продуцента ПРЕ-рмГПП-1 засевают и культивируют в питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, обычно используемые для выращивания клеток E.coli при температуре от 24°C до 37°C [Маниатис и др., 1984]. Культивирование осуществляют в колбах или в биореакторах (ферментерах). Индукцию синтеза целевого гибридного белка осуществляют путем внесения в среду культивирования индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) в концентрации от 0,1 до 2 мМ или лактозы в концентрации от 0,5% до 3%. Индуктор вносят на стадии роста культуры, предшествующей стационарной фазе роста. Индукцию осуществляют на протяжении не менее 1 ч. В результате клетки штамма-продуцента накапливают целевой слитой белок в количестве до 40% от суммарного белка клеток.

Заявляемый полипептид получают следующим образом.

Выращенные клетки штамма-продуцента собирают центрифугированием, разрушают преимущественно с использованием механической гомогенизации, используя буфер, содержащий ингибиторы протеиназ. Слитой белок, присутствующий в нерастворимой фракции, осаждают путем центрифугирования, осадок промывают промывочным буфером, содержащим мочевину в концентрации 0,5-2 М.

Белок-предшественник ПРЕ-рмГПП-1 экстрагируют из промытого осадка в сильно щелочных условиях (50 мМ Трис, pH 12,5) в присутствии 2 М мочевины.

Для осуществления ренатурации и автокаталитического процессинга полученный экстракт разбавляют Na-фосфатным буфером pH 7,0 и инкубируют при температуре 5-25°C в течение 12-96 ч до завершения процесса автокаталитического процессинга слитого белка и образования зрелого рмГПП-1, которое устанавливают с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГЭ) в денатурирующих условиях.

Полученную инкубационную смесь, осветляют с помощью центрифугирования. Осветленный раствор содержит зрелый рмГПП-1 и интеин, разделение которых осуществляют комбинацией методов хроматографии на катионообменнике, например SP-Сефарозе, и ультрафильтрации.

После стерилизующей фильтрации получают препарат рмГПП-1 с выходом 18,6% и чистотой, составляющей 97% (данные ПААГЭ в денатурирующих условиях).

Заявляемая группа изобретений проиллюстрирована следующими фигурами.

Фиг. 1 Структура фрагментов ДНК, использованных для конструирования рекомбинантной плазмиды pET28-Glp20.

Фиг. 2. Сравнение сахаропонижающей активности заявляемого полипептида и препарата сравнения «Ликсумия» при подкожном введении в зависимости от дозы и времени применения. Препараты применяли в дозе 1 мкг или 5 мкг (рмГПП -1) и 0,5 мкг (препарат «Ликсумия») за 1 ч (А), за 3 ч (Б) или за 5 ч (В) до введения глюкозы. Животным контрольной группы вместо указанных препаратов вводили физиологический раствор. Показаны средние значения содержания тестовой глюкозы в крови животных. По оси абсцисс указано время после введения глюкозы (мин), по оси ординат - концентрация глюкозы в крови животных (ммоль/л).

Фиг. 3. Сравнение сахаропонижающей активности заявляемого полипептида и препарата сравнения «Ликсумия» в зависимости от дозы и времени после применения. Препараты применяли подкожно (п/к) (А) или внутримышечно (в/м) (Б). рмГПП-1 вводили в дозе 1, 2 или 5 мкг. Препарат Ликсумия применяли в дозе 0,5 мкг. Животным контрольной группы вместо указанных препаратов вводили физиологический раствор. Показаны средние значения концентрации тестовой глюкозы в крови животных через 30 мин после ее введения. По оси абсцисс указано время после введения сравниваемых препаратов (ч), по оси ординат - концентрация глюкозы в крови животных (ммоль/л).

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pET28-Glp20

Рекомбинантную плазмиду pET28-Glp20 конструируют путем клонирования комплексного фрагмента ДНК размером 713 пар оснований, заключающего структурный ген pre-Glp20, кодирующий слитый белок ПРЕ-рмГПП-1 - предшественник заявляемого полипептида рмГПП-1, в вектор экспрессии pET-28(b)+(Novagen).

Конструирование комплексного фрагмента ДНК производят путем последовательного линейного лигирования пяти фрагментов ДНК, А, В, С, D и E (Фиг. 1), которые конструируют следующим образом:

- фрагмент «А», кодирующий структурный ген мутантного интеина int4bPRO (Cys1Ala, Cys11Tyr, Leu93Pro), получают в результате ПЦР-амплификации фрагмента ДНК плазмиды pET28b_(His)x10_IntMUT, которая представляет собой плазмиду pET-28(b)+ (Novagen), содержащую последовательность ДНК, кодирующую ген мутантного интеина (Cys1Ala, Cys11Tyr, Leu93Pro), дополненный на 3'-конец (перед стоп-кодоном) линкерной областью, кодирующей триплет Ser-Gly-Ser и заключающей сайт эндонуклеазы рестрикции BamHI для удобства последующего клонирования. Амплификацию осуществляют с использованием праймеров:

Липкие концы полученного в результате амплификации фрагмента ДНК открывают с помощью рестриктазы NcoI (локализация сайтов узнавания рестриктазы NcoI в составе праймеров амплификации указана).

- фрагмент «В», кодирующий модифицированный глюкагоноподобный пептид 1 человека, синтезируют искусственно в виде двуцепочечной последовательности ДНК с липким концами NcoI и BamHI;

- фрагмент «С», кодирующий линкерный пептид (Gly₄Ser)₄, синтезируют искусственно в виде двуцепочечной последовательности ДНК с липкими концами BgHlII и BamHI;

- фрагмент «D», кодирующий гепарин-связывающий пептид KRKKKGKGLGKKR из состава природного белка HB-EGF человека, синтезируют искусственно в виде двуцепочечной последовательности ДНК с липкими концами BglII и BamHI;

- фрагмент «Е», кодирующий С-концевую аминокислотную последовательность Gly₄Ser и терминирующий кодон, искусственно синтезируют в виде двуцепочечной последовательности ДНК с липкими концами BglII и XhoI.

Результирующий комплексный фрагмент ДНК размером 713 пар нуклеотидов, имеющий липкие концы NcoI и XhoI, получают в результате последовательного лигирования указанных фрагментов ДНК.

Комплексный фрагмент ДНК заключает структурный ген слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, являющегося предшественником заявляемого полипептида, составными частями которого являются последовательность модифицированного интеина Pch PRP8 Penicillium chrysogenum (InBase, http://www.neb.com/neb/inteins.html), содержащего мутации Cys1Ala, Cys11Tyr и Leu93Pro и последовательность рекомбинантного модифицированного глюкагоноподобного пептида 1 человека рмГПП-1.

Клонирование комплексного фрагмента ДНК в вектор экспрессии рЕТ-28(b)+ производят по сайтам узнавания рестриктаз NcoI и XhoI.

В результате клонирования получают рекомбинантную плазмиду pET28-Glp20, которая содержит ген слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 под контролем сильного промотора, узнаваемого РНК полимеразой фага Т7.

Пример 2. Конструирование штамма - продуцента слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, являющегося предшественником заявляемого полипептида

Штамм E.coli ECR-Glp20 - продуцент слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 получают в результате трансформации реципиентного штамма E.coli BL21(DE3) [Novagen, ВКПМ В-10189] плазмидой pET28-Glp20.

Трансформацию реципиентного штамма осуществляют с применением CaCl₂-реактива [Маниатис и др., 1984]. Колонии трансформированного штамма отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик канамицин.

В результате трансформации получают штамм E.coli ECR-Glp20, который используют для биосинтеза слитого белка ПРЕ-рмГПП-1.

Полученный штамм E.coli ECR-Glp20 депонируют во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В-12555.

Пример 3. Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в колбах с использованием индуктора-лактозы

Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в колбах осуществляют следующим образом. Сначала получают посевную культуру. Для этого одну колонию штамма E.coli ВКПМ В-12555 засевают в пробирку, содержащую 3 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1, триптон бакто - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Культуру выращивают на роторной качалке со скоростью 250 об/мин в течение 18 ч при температуре 37°C.

Выросшую культуру переносят в среду с индуктором. С этой целью 0,5 мл посевной культуры переносят в колбу, содержащую 50 мл среды TRB следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 2,4; триптон бакто - 1,2; одномолярный фосфатный буфер (pH7) - 10; раствор 1 М сульфата магния - 0,2; лактоза - 0,5; глицерин - 0,5; канамицин - 0,009; вода - остальное. Культивирование продолжают в течение 20 ч в тех же условиях.

Индуктором синтеза слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 является лактоза, изначально входящая в состав среды TRB.

Полученную биомассу осаждают центрифугированием в пластмассовых пробирках объемом 50 мл в течение 10 мин со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°C). Надосадочную жидкость сливают. Клеточный осадок суспедируют в 30 мл буфера PBS следующего состава: 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,4, после чего вновь подвергают центрифугированию в течение 10 мин со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°C). Надосадочную жидкость сливают и остатки жидкости тщательно удаляют с помощью вакуумного насоса.

В результате получают 12 г биомассы штамма E.coli ВКПМ В-12555 с 1 л культуры. Полученную биомассу замораживают и хранят при температуре минус 20°C.

Согласно данным анализа, выполненного методом ПААГЭ в денатурирующих условиях, содержание слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биомассе штамма E.coli ВКПМ В-12555 составляет 40% относительно суммарного белка клеток.

Пример 4. Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в колбах с использованием индуктора-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ)

Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в колбах осуществляют следующим образом. Для получения посевной культуры одну колонию штамма E.coli ВКПМ В-12555 засевают в пробирку, содержащую 3 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1, триптон бакто - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Культуру выращивают на роторной качалке со скоростью 250 об/мин в течение 18 ч при температуре 37°C.

Выросшую посевную культуру переносят в среду для индукции. С этой целью 0,5 мл посевной культуры переносят в колбу, содержащую 50 мл среды следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 2,4; триптон бакто - 1,2; одномолярный фосфатный буфер (pH7) - 10; одномолярный раствор сульфата магния - 0,2; NaCl - 1, канамицин - 0,009; вода - остальное. Культивирование продолжают в тех же условиях в течение 2 ч до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀=1-2. Затем в среду вносят индуктор ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и продолжают культивирование в тех же условиях в течение 5 ч.

Полученную в результате культивирования биомассу осаждают центрифугированием в пробирках объемом 50 мл в течение 10 мин со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°C). Надосадочную жидкость сливают. Клеточный осадок суспедируют в 30 мл буфера PBS следующего состава: 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,4, после чего вновь подвергают центрифугированию в течение 10 мин со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°C). Надосадочную жидкость сливают и ее остатки тщательно удаляют с помощью вакуумного насоса.

В результате получают 3 г биомассы штамма E. coli ВКПМ В-12555 с 1 л культуры. Полученную биомассу замораживают и хранят при температуре минус 20°С.

Согласно данным анализа, выполненного методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, содержание слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биомассе штамма E. coli ВКПМ В-12555 составляет 40% относительно суммарного белка клеток.

Пример 5. Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биореакторе

Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биореакторе осуществляют следующим образом. Для получения посевной культуры одну колонию штамма E. coli ВКПМ В-12555 засевают в колбу, содержащую 50 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт 0207/0-MG-L ("Springer") - 1, пептон-140 соевый (Р-140, "Amresco") - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Культуру выращивают на роторной качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 37°С до оптической плотности OD₆₀₀=1,5.

Затем 50 мл выросшей посевной культуры переносят в рабочую колбу биореактора «Applicon» ("Applicon") общим объемом 1 л, содержащую 450 мл стерильной среды следующего состава (на 1 л): дрожжевой экстракт 0207/0-MG-L ("Springer") - 24 г; пептон-140 соевый (Р-140, "Amresco") - 12 г; глюкоза - 10 г; пеногаситель А-204 ("Sigma") - 0,1 мл; сульфат аммония - 3,4 г; 1 М фосфатный буфер (рН 7) - 100 мл; раствор 1 М сульфата магния - 2 мл; канамицин - 90 мг; вода - остальное.

Культивирование ведут 3 ч до истощения уровня глюкозы в культуральной среде, используя следующие параметры ферментации: температура - 37°С; расход воздуха - 1 л/л/мин; скорость перемешивания культуры - 700 об/мин; рН=6,9±0,1 (рН-статирование культуры производят с помощью автоматической подтитровки растворами 10% H₂SO₄ и 10% аммиаком).

Далее в ферментер стерильно вносят 10 мл стерильного 50% раствора глюкозы и культивирование продолжают еще 1,5 ч. Затем в ферментер добавляют 50% раствор глицерина до конечной концентрации 5% и 25 мл 20% раствора лактозы (конечная концентрация 1%). Культивирование продолжают в течение 18-20 ч в тех же условиях.

По окончании ферментации культуру клеток штамма-продуцента центрифугируют при 4°С и 8000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают. Клеточный осадок суспедируют в буфере PBS следующего состава: 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, после чего вновь подвергают центрифугированию в тех же условиях. Надосадочную жидкость сливают и остатки жидкости тщательно удаляют с помощью вакуумного насоса.

В результате получают 60 г биомассы штамма E. coli ВКПМ В-12555 с 1 л культуры.

Полученную биомассу замораживают и хранят при температуре минус 20°С и в дальнейшем используют для выделения слитого белка ПРЕ-рмГПП-1.

Согласно данным анализа, выполненного методом ПААГЭ в денатурирующих условиях, содержание слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биомассе штамма E.coli ВКПМ В-12555 составляет 40% относительно суммарного белка клеток.

Пример 6. Выделение и очистка заявляемого пептида

Для выделения и очистки полипептида рмГПП-1 из фракции нерастворимых белков используют биомассу штамма E.coli ВКПМ В-12555, полученную, как описано в примере 3, или примере 4, или примере 5.

6.1. Разрушение биомассы и получение нерастворимой фракции клеточного лизата Биомассу (70 г) ресуспендируют на ледяной бане в 1 л холодного 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7,0, содержащего 0,137 М NaCl и 5 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). К суспензии клеток добавляют 5 мл 0,2 М раствора фенилметилсульфонилфторида (PMSF), тщательно перемешивают на диспергаторе (IKA Т18 basic ULTRA-TURRAX). Разрушение клеток производят на дезинтеграторе APV1000 (APV1000, "SPX Flow Technology") при давлении 970 бар. Проводят 4 цикла с охлаждением биомассы до 15°C между циклами.

В результате получают 1,07 л общего клеточного лизата.

6.2. Выделение нерастворимой фракции клеточного лизата

1,07 л клеточного лизата центрифугируют на центрифуге KR 25i, ("Jouan") 20 мин при 9000 об/мин и температуре 4°C. Полученный осадок (46 г) (нерастворимая фракция лизата), смешивают с 0,64 л воды марки Milli Q "(Millipore") и тщательно перемешивают до получения однородной суспензии. Суспензию центрифугируют, как сказано выше. К полученному осадку (31 г) прибавляют 0,22 л 0,02 М Трис-HCl буфера, рН 9.0, содержащего 0,005 М ЭДТА (буфер 1), перемешивают и центрифугируют, как описано выше.

6.3. Экстракция слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 из нерастворимой фракции клеточного лизата

К осадку, полученному выше (30 г), прибавляют 0.34 л 0,05 М раствора Трис, содержащего 2 М мочевину и 0,005 М Na4ЭДТА, pH 12,5 (буфер 2), и тщательно перемешивают. Суспензию выдерживают 15 мин при 4°C и центрифугируют 20 мин при 9000 об/мин. В результате получают 0,35 л экстракта слитого белка ПРЕ-рмГПП-1. Выход этого белка на стадии составляет 85,2%

6.4. Ренатурация и процессинг слитого белка ПРЕ-рмГПП-1

Экстракт слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, полученный выше, помещают в стеклянную бутыль емкостью 20 л, прибавляют 14 л 0,02 М раствора натрия фосфата, содержащего 0,005 М ЭДТА, pH 7,0 (буфер 3), и тщательно перемешивают. Значение pH суспензии доводят до 7,0 с помощью 3 и раствора соляной кислоты. Объем суспензии увеличивают до 15 л с помощью буфера 3 и выдерживают при 4°C в течение 3 суток до завершения процессинга, которое устанавливают с помощью ПААГЭ. Смесь центрифугируют на центрифуге MISTRAL 6L с ускорением 5500 об/мин в течение 15 мин. Полученная надосадочная жидкость содержит смесь продуктов процессинга слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, в том числе искомый пептид. Выход рмГПП-1 на стадии составляет 38,9%.

6.5. Очистка рмГПП-1 хроматографией на колонке с SP-Сефарозой (Хроматография I)

Супернатант, полученный выше (15 л), разбавляют в 2 раза равным объемом 0,02 М раствора натрия фосфата, содержащего 0,005 М ЭДТА, pH 7,0 (буфер 4) и центрифугируют на центрифуге MISTRAL 6L при 5500 об/мин в течение 15 мин.

Фильтрат (29,5 л) л наносят на колонку, содержащую 40 мл SP-Сефарозы, уравновешенной буфером 4. Элюцию осуществляют градиентом концентрации хлорида натрия (0-1 М).

Средний выход целевого белка на стадии - 68%.

6.6. Ультрафильтрация

Элюат, полученный в ходе хроматографии 1, подвергают ультрафильтрации на ячейке Stirred Cell Model 8050 ("Millipore") емкостью 0,05 л, снабженной мембраной Ultracel 3 KDa ("Millipore"). Выход рмГПП-1 на стадии составляет 91,9%

6.7. Очистка рмГПП-1 хроматографией на колонке, содержащей 20 мл SP-сефарозы (Хроматография II)

Раствор рмГПП-1, полученный на предыдущей стадии очистки, наносят на колонку, содержащую 20 мл SP-сефарозы. Элюцию осуществляют градиентом концентрации хлорида натрия (0-1 М). Выход рмГПП-1 на стадии составляет 93,9%.

6.8. Очистка рмГПП-1 методом ультрафильтрации

Раствор рмГПП-1, очищенный в ходе хроматографии II (0,04 л), помещают в ультрафильтрационную ячейку Stirred Cell Model 8050, Millipore емкостью 0,05 л, снабженную мембраной Ultracel 3 KDa ("Millipore"). Раствор концентрируют до объема 0,01 л, затем разбавляют водой марки Milli Q до объема 0,05 л и снова концентрируют при тех же условиях до объема 0,01 л. В ходе этой процедуры концентрация целевого пептида в растворе увеличивается в 4 раза, а концентрация соли уменьшается в 5 раз, достигая 0,15 М. Выход рмГПП-1 на стадии составляет 96,7%.

6.9. Стерилизующая фильтрация раствора рмГПП-1

Стерилизующую фильтрацию раствора рмГПП-1, полученного на предыдущей стадии очистки, осуществляют с помощью фильтр-насадки Millex-GV Syringe Driven Filter Unit с удерживающим размером пор 0,22 мкм ("Millipore") в ламинарном шкафу. В результате получается 0,01 л стерильного раствора рмГПП-1 с концентрацией искомого пептида 6 мг/мл. Выход на стадии составляет 99%.

Суммарно из 1 л клеточного лизата получают 60 мг рмГПП-1. Суммарный выход составляет свыше 18%, при чистоте - 97%.

Пример 7. Оценка специфической сахаропонижающей активности заявляемого полипептида рмГПП-1

Исследование проводят на здоровых мышах линии Balb/c весом 22-24 г.

Для разведения исследуемых препаратов и приготовления тестовых растворов глюкозы используют апирогенную очищенную воду (ГФ XIII.ФС.2.2.0019.15).

Тестовый раствор 20% глюкозы (D-Glucose Aristar ("BDH Chemicals"; Prod 45213) готовят следующим образом: 2 г глюкозы растворяют в апирогенной очищенной воде и доводят конечный объем раствора до 10 мл.

Раствор 20% глюкозы вводят животным внутрибрюшинно (в/бр) из расчета 10 мл на 1 кг веса.

Для введения исследуемых препаратов и тестовых растворов глюкозы используют шприцы инсулиновые U-100, 1 мл (0,33 mm (29G) X 12,7 mm) BD Micro-Fine Plus.

Для контроля содержания глюкозы в образцах крови животных используют глюкометр - Акку-Чек Актив (Accu-Chek Active; "Roche Diagnostics") и тест полоски - Акку-Чек Актив (Accu-Chek Active; "Roche Diabetes Care", 06656854).

Тестируемые препараты разводят в апирогенной очищенной воде непосредственно перед введением животным исходя из требования, чтобы объем вводимого препарата при подкожном (п/к) и внутрибрюшинном (в/бр) применении составлял 200 мкл на мышь, при внутримышечном (в/м) применении -100 мкл на животное.

При в/бр применении препараты вводят в брюхо. При п/к применении препараты вводят в холку. При в/м применении препараты вводят в мышцу бедра.

Накануне дня проведения исследования животных делят на группы по 4 мыши на группу, рассаживают в отдельные клетки и лишают корма. Мыши голодают 12 ч. После голодания, перед введением препаратов у животных определяют уровень глюкозы в крови.

Для определения уровня глюкозы забор образцов крови осуществляют из хвостовой вены животных.

Далее животным опытных групп вводят заявляемый полипептид в количестве 1 мкг, или 2 мкг, или 5 мкг животным группы сравнения вводят препарат сравнения - аптечный препарат Ликсумия (Sanofi), в количестве 0,5 мкг, а животным в контрольной группе (контроль) в это же время вводят физиологический раствор.

Через 30 мин, 1 ч, 3 ч и 5 ч с момента введения препаратов у животных снова определяют уровень глюкозы в крови (точка 0 мин) и сразу после этого вводят тестовый раствор глюкозы. Далее по истечении 30 мин и 60 мин с момента введения глюкозы проводят измерения содержания глюкозы в крови животных.

Статистическую обработку данных содержания глюкозы в крови животных, полученных в ходе измерений, проводят в программе Microsoft office Excel.

На основании полученных данных строят график, в котором по оси абсцисс откладывают время (мин) от нагрузки глюкозой, а по оси ординат - усредненные значения концентрации глюкозы в крови животных (ммоль/л).

Экспериментальные данные показывают (Фиг. 2), что при подкожном применении заявляемый полипептид и препарат сравнения, коммерческий препарат «Ликсумия», эффективно снижают уровень глюкозы в крови на протяжении, минимум 3 ч после применения. При этом, если в крови контрольных животных концентрация тестовой глюкозы достигает показателя 18 ммоль/л, то под действием введенных препаратов концентрация тестовой глюкозы в крови опытных животных поднимается не выше 10 ммоль/л через 1 ч и 11,5 ммоль/л через 3 ч после введения препаратов. Через 5 ч после подкожного применения действие заявляемого полипептида и препарата сравнения прекращается. Таким образом, заявляемый полипептид и препарат сравнения оказывают сходное действие как по величине достигаемого эффекта, таки и по его продолжительности.

Экспериментальные данные также наглядно показывают (Фиг. 3), что не только при подкожном, но также и при внутримышечном применении показатели эффективности (снижения уровня глюкозы в крови) и продолжительности действия, характерные для заявляемого полипептида оказываются близкими к показателям препарата сравнения «Ликсумия». Это свидетельствует о том, что заявляемый полипептид обладает такой же эффективностью и продолжительностью действия, как и препарат сравнения, и на протяжении, минимум, 3 ч после введения способен эффективно снижать уровень глюкозы в крови практически в два раза по сравнению с контролем.

Преимущества заявляемой группы изобретений:

- заявляемый полипептид понижает уровень сахара в крови;

- заявляемый полипептид обладает пролонгированным сахаропонижающим действием, а именно обладает специфической сахаропонижающей активностью и длительностью действия, сопоставимым с показателями коммерческого препарата «Ликсумия», имеющей рекомендуемый режим применения 1 раз в сутки;

- сконструированный штамм Escherichia coli ВКПМ В-12555 позволяет осуществлять биосинтез предшественника заявляемого полипептида на уровне 40% от суммарного белка клеток, что соответствует биосинтезу заявляемого полипептида на уровне 13% от суммарного белка клеток;

- разработанный способ микробиологического синтеза предшественника заявляемого полипептида делает процесс получения целевого продукта экологически чистым и конкурентоспособным.

Список цитируемых источников научно-технической информации

Алгоритмы, 2015; Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом. Под ред. Дедова И.И. и Шестаковой М.В. 2015, №7.

Дедов и др., 2008; Дедов И.И., Шестакова М.В., Сунцов Ю.И. (2008) Сахарный диабет в России: проблемы и решения. М., 16 с.

Маниатис и др., 1984; Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование. Пер. с англ. М.: Мир. 480 с.

Baggio et al., 2004; Baggio L.L., Huang О., Brown Т.J., Drucker D.J. (2004) A recombinant human glucagon-like peptide (GLP)-1-albumin protein (albugon) mimics peptidergic activation of GLP-1 receptor dependent pathways coupled with satiety, gastrointestinal motility, and glucose homeostasis. Diabetes, 53 (9): 2492-2500.

Barnett. 2011; Barnett A.H. (2011). Lixisenatide: evidence for its potential use in the treatment of type 2 diabetes. Core Evidence, 6: 67-79.

Bourin & Lindhal. 1993; Bourin M.C., Lindhal U. (1993). Glycosaminoglycans and the regulation of blood coagulation. Biochem J, 289 (Pt 2): 313-330.

Bramono et al, 2012; Bramono D.S., Murali S., Rai В., Ling L., Poh W.T., Lim Z.X., Stein G.S., Nurcombe V., van Wijnen A.J, Cool S.M. (2012). Bone marrow-derived heparan sulfate potentiates the osteogenic activity of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). Bone, 50 (4): 954-964.

Capuano et al,. 2013; Capuano A., Sportiello L., Maiorino M.I., Rossi F., Giugliano D. (2013). Dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes therapy - focus on alogliptin. Drug Design Develop.Therapy, 7: 989-1001.

Dou et al., 2008; Dou W.F., Lei J.Y., Zhang L.F., Xu Z.H., Chen Y., Jin J. (2008). Expression, purification, and characterization of recombinant human serum albumin fusion protein with two human glucagon-like peptide-1 mutants in Pichia pastoris. Prorei. Expr Puriƒ, 61 (1): 45-49.

Dubrac et al., 2010; Dubrac A., Quemener C, Lacazette E., Lopez F., Zanibellato C., Wu W.-G., Bikfalvi A., Prats H. (2010). Functional divergence between 2 chemokines is conferred by single amino acid change. Blood, 116 (22): 4703-4711.

Gao et al.., 2009; Gao Z., Bai G., Chen J., Zhang Q., Pan P., Bai F., Geng P. (2009). Development, characterization, and evaluation of a fusion protein of a novel glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analog and human serum albumin in Pichia pastoris. Biosci Biotechnol Biochem, 73 (3): 688-694.

Gao et al., 2012; Gao M., Tong Y., Tian H., Gao X., Yao W. (2012). Recombinant production of mGLP-1 by coupling of refolding and intein-mediated self-cleavage (CRIS). Appl Microbiol Biotechnol (2012) 96: 1283-1290.

Jiang et al., 2015; Jiang A., Jin W., Zhao F., Tang Y., Sun Z., Liu J.-N. (2015). Split Ssp DnaB mini-intein-mediated production of recombinant human glucagon-like peptide-1/7-36. Biotechnol Appl Biochem., 62 (3): 309-315.

Jimenez-Solem et al., 2010; Jimenez-Solem E., Rasmussen M.H., Christensen M., Knop F.K. (2010) Dulaglutide, a long-acting GLP-1 analog fused with an Fc antibody fragment for the potential treatment of type 2 diabetes. Curr Opin Mol Ther, 12 (6): 790-797.

Kikuchi et al., 1988;) Kikuchi M., Fukuyama K., Epstein W.L. (1988). Soluble dipeptidyl peptidase IV from terminal differentiated rat epidermal cells: purification and its activity on synthetic and natural peptides. Arch Bioche. Biophys, 266 (2): 369-376.

Kim et al., 2010; Kim B-J., Zhou J., Martin В., Carlson O.D., Maudsle S., Greig N.H., Mattson M.P., Ladenheim E.E., Wustner J., Turner A., Sadeghi H., Egan J.M. (2010). Trasferrin fusion technology: A novel approach to prolonging biological half-life of insulin. J Pharmacol Exp Ther, 334 (3): 682-692.

Li et al., 2011; Li Y., Li X., Zheng X., Tang L, Xu W., Gongh M. (2011). Disulfide bond prolongs the half-life of therapeutic peptide-GLP-1. Peptides, 32 (7): 1400-1407.

Ma et al., 2010; Ma C, Gao M., Liu W., Zhu J., Tian H., Gao X. and Yao W. (2010). Intein-Mediated Expression and Purification of an Analog of Glucagon-like Peptide-1 in Escherichia coli. Protein & Peptide Lett, 17: 1245-1250.

Murage et al., 2010;) Murage E.N., Gao G., Bisello, Ahn J.M. (2010). Development of potent glucagon-like peptide-1 agonist with high enzyme stability via introduction of multiple lactam bridges. J J Med Chem, 53 (17): 6412-6420.

Sannikova et al., 2016; Sannikova E.P., Bulushova N.V., Cheperegin S.E., Gubaydullin I.I., Chestukhina G.G., Ryabichenko V.V., Zalunin I.A., Kotlova E.K., Konstantinova G.E., Kubasova T.S., Shtil A.A., Pokrovsky V.S., Yarotsky S.V., Efremov B.D., Kozlov D.G. (2016). The Modified Heparin-Binding L-Asparaginase of Wolinella succinogenes. Mol Biotechnol, DOI 10.1007/sl2033-016-9950-l. Mol Biotechnol, 58 (8): 528-539.

Sommer & Rifkin, 1989; Sommer A., Rifkin D.В., (1989) Interaction of heparin with human basic fibroblast growth factor: protection of the angiogenic protein from proteolytic degradation by a glycosaminoglycan. J Cell Physiol, 138 (1): 215-220.

Thompson et al., 1994; Thompson S. A., Higashiyama S., Wood K., Pollitt N.S., Damm D., McEnroe G., Garrick В., Ashton N., Lau K., Hancock N., Klagsbrun M., Abraham J. A. (1994) Characterization of sequences within heparin-binding EGF-like growth factor that mediate interaction with heparin. J Biol Chem, 269 (4): 2541-2543.

Wang et al., 2010; Wang Q., Chen K., Liu R., Zhao F., Gupta S., Zhang N., Prud'homme J.I. (2010). Novel GLP-1 fusion chimera as potent long acting GLP-1 receptor agonist. PLoS ONE, 5 (9): e12734.

Xia et al., 2012; Xia X., Babcock J.P., Blaber S.I., Harper K.M., Blaber M. (2012). Pharmacokinetic Properties of 2nd-Generation Fibroblast Growth Factor-1 Mutants for Therapeutic Application. PLoS One, 7 (11): e48210.

Xu & Esko, 2014; Xu D., Esko J.D. (2014). Demystifying Heparan Sulfate-Protein Interactions. Annu Rev Biochem, 83: 129-157.

Zhao et al, 2010; Zhao В., Zhang C, Forsten-Williams K., Zhang J., Fannon M. (2010). Endothelial Cell Capture of Heparin-Binding Growth Factors under Flow. PLoS Computational Biol, 6 (10): e1000971.

1. Рекомбинантный глюкагоноподобный пептид-1 человека для понижения уровня сахара в крови, имеющий последовательность SEQ ID NO 1.

2. Рекомбинантный штамм-продуцент Escherichia coli ВКПМ В-12555, используемый для получения пептида по п. 1 и являющийся продуцентом предшественника пептида по п. 1.

3. Способ получения рекомбинантного глюкагоноподобного пептида-1 человека по п. 1 путем культивирования рекомбинантного штамма-продуцента по п. 2 для получения предшественника пептида по п. 1 с последующим выделением полученного предшественника, его автокаталитическим расщеплением и очисткой целевого полипептида.