Способ сохранения и стабилизации протеинов

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу сохранения (консервирования) и стабилизации протеинов. Изобретение может быть использовано для промышленной разработки композиций, используемых в составе санитарной, фармацевтической и косметической продукции, в частности факторов роста клеток, таких как эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов (bFGF). В соответствии с настоящим изобретением протеины помещают в безводную среду, сформированную масляными компонентами, имеющими гидрофильные свойства и взаимодействующими с протеинами с сохранением их нативной конформации. По сравнению с известными аналогами изобретение позволяет повысить стабильность дисперсии протеинов.

 

Изобретение относится к способу сохранения (консервирования) и стабилизации протеинов (белков), который может быть использован для промышленной разработки рецептур составов санитарной, фармацевтической и косметической продукции.

Цель изобретения - разработка способа, предполагающего создание дисперсной системы как средства сохранения, стабилизации и хранения протеинов в масляной фазе (среде) при условиях нормальной температуры и нормального давления. В частности, способ, предлагаемый в рамках изобретения, основывается на включении протеинов, таких как факторы роста клеток, например эпидермальных факторов роста (EGF) и факторов роста фибробластов (bFGF), но не ограничиваясь этим, в среду, состоящую из таких компонентов, как масло из виноградных косточек, основы, состоящей из различных компонентов, более детальное содержание которых будет приведено ниже в этом описании, и бутилдигрокситолуола (ВНТ), формирующих указанную масляную среду. В частности, предлагаемый способ использует преимущество некоторых химических групп компонентов масляной среды способствовать определенным физико-химическим взаимодействиям с остатками протеинов, которые усиливают на более продолжительные периоды времени поддержание исходной молекулярной структуры протеинов, благодаря чему данный способ является простым, экономичным и доступным для широкого применения, потенциально способным заменить сложные технологии сохранения и/или использования средств на водной основе, используемых обычно для сохранения протеинов.

Область применения изобретения

Изобретение относится к химической промышленности, в частности к производству фармацевтической и косметической продукции, в частности, предназначенной для сохранения факторов роста.

Предпосылки создания изобретения

На сегодняшний день вопрос стабильности протеинов представляет существенный интерес для таких областей, как химическая промышленность, производство фармацевтической и косметической продукции. Протеины используются в качестве активных веществ в составе ряда лекарственных средств для лечения таких заболеваний, как диабет, рак, гемофилия, инфаркт миокарда и многие другие [Кришнамурти (Krishnamurthy) и Мэннинг (Manning), 2002]. Следует отметить, что использование протеиновых структур, таких как факторы роста, например эпидермальный фактор роста (EGF), вызывает в последние годы повышенный интерес в косметической промышленности. Таким образом, если протеин не может быть надлежащим образом стабилизирован, он может утратить свою исходную структуру с последующей утратой биологической активности [Кришнамурти (Krishnamurthy) и Мэннинг (Manning), 2002].

Проблема заключается в том, что стабилизация протеинов является особенно трудной задачей, поскольку протеины в высокой степени подвержены деградации: физической, химической и энзимной. Химическая деградация связана с деаминированием, окислением, редуцированием, процессами гидролитического расщепления и химическими взаимодействиями, такими как реакции дисульфидных связей. Физическая деградация включает процессы поверхностной адсорбции, агрегирования, диссоциации, денатурирования и фотолиза. В дополнение, имеются факторы, которые оказывают влияние на агрегирование протеинов, относящиеся к свойствам дисперсионной среды, таким как температура (в связи с термодинамикой и кинетикой трансформирования конформации структурного белка), кислотно-щелочной баланс pH (относящийся к взаимодействию положительно и отрицательно заряженных частиц с остатками белков), ионная сила (воздействующая на соли и их концентрации для взаимодействия с заряженными группами) и суфрактанты (относящиеся к конформационной термодинамической стабильности) [Чи (Chi) и др., 2003].

Имеются технологические процессы, направленные на обеспечение того, чтобы протеины в течение более продолжительного периода времени сохраняли свою нативную (естественную) конформацию, они могут проводиться с использованием физических процессов, таких как замораживание (до температуры ниже минус 10°С) или лиофилизация (для удаления влаги, присутствующей в водном растворе протеина), тем не менее, даже продукты, полученные с использованием этих методов, подвержены деградации; или химических процессов посредством добавления сорастворителей [Чанг (Chang) и Пикал (Pikal), 2009].

Эпидермальный фактор роста (EGF) стал первым полипептидом, выделенным и охарактеризованным как фактор роста. У него наблюдалась биологическая активность, имеющая отношение к его естественной структуре, способная стимулировать пролиферацию кератиноцитов и фибробластов (с последующим формированием коллагена), вызывать регенерацию тканей (формирование новых кровеносных сосудов) и выполнять последующую васкуляризацию области, к которой был применен EGF. Все эти свойства способствуют появлению новой кожи значительной толщины, восстановлению ее эластичности и прочности, уменьшая, таким образом, нежелательные эффекты клеточного оксидирования, и по этой причине способствуют разглаживанию морщин [Тэнг (Tang) и др., 1994]. Такой фактор роста стал с недавнего времени использоваться в лекарственных формах для наружного применения, при использовании которых были получены очень хорошие результаты в области регенерации тканей, наблюдалось также ускорение процесса заживления при ожогах, улучшение результатов при лечении келоидных рубцов, акне, при удалении стрий (повреждений кожи после беременности), рубцов, оставшихся после проведения хирургического лечения, при заживлении после пересадки кожи, а также при восстановлении кожного покрова после проведения процедуры пилинга. Тем не менее, хотя доля использования указанных протеинов в фармацевтической и косметической отраслях промышленности возросла, они не стали использоваться массово по причине высокой стоимости и затруднительности их стабилизации [Счоуест (Schouest) и др., 2012].

Фактор роста фибробластов (FGF) является фактором роста, действие которого направлено на увеличение индекса миотической активности и рост показателей синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), облегчающее пролиферацию различных клеточных прекурсоров, таких как хондробласты, коллагенобласты, остеобласты и др., формирующих волокнистые соединительные ткани, соединительные и хрящевые ткани человеческого тела. Фактор роста фибробластов способствует ускорению процесса заживления ран, развитию гематопоэтических клеток, кровеносных сосудов, а также внутриутробному развитию плода. В этом направлении они выполняют весьма различные функции: а) способствуют реэпителизации тканей, поврежденных в процессе заживления; б) они способствуют усилению активности клеток при формировании кровеносных сосудов; в) они принимают участие в процессах дифференцирования границ кровяных телец, и г) они принимают участие в дифференциации волокон скелетных и сердечных мышц, матурации легочных тканей и выделении гепатоцитов из эндодермальных клеток.

Поэтому целью настоящего изобретения является создание нового способа для сохранения и стабилизации протеинов, который может использоваться для промышленной разработки композиций, входящих в состав санитарной, фармацевтической и косметической продукции, который, в отличие от традиционно использующихся методов, применяется с использованием масляной среды, благодаря чему является более простым и экономически целесообразным. При этом заявителю неизвестно о существовании какого-либо документа или изобретения, в котором раскрывается метод сохранения и стабилизации или сходного изобретения, имеющего такие же технические характеристики, как предлагаемое изобретение, или сходные с ними.

Техническим результатом заявленного технического решения является простота и низкая стоимость осуществления способа.

Указанный технический результат достигается за счет того, что способ сохранения и стабилизации протеинов, который может использоваться для промышленной разработки композиций, используемых в составе санитарной, фармацевтической и косметической продукции, в частности факторов роста клеток и/или протеинов, таких как эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов (bFGF), включает в себя фазу дисперсии при условии нормальной температуры и нормального давления, в которой протеины помещают в безводную среду, сформированную масляными компонентами, имеющими гидрофильные остатки и взаимодействующими с протеинами, сохраняя при этом нативную конформацию протеинов.

При этом масляные компоненты включают в себя масло из виноградных косточек.

Масляные компоненты включают в себя основу, в состав которой входят: триглецирид каприловой/каприновой кислоты, ПЭГ-18 диолеат касторового масла, пропиленгликоль, пентаэритритил тетра ди-Т-бензил гидрокси гидроцинамат, токоферол, триизопропаноламин.

Масляные компоненты содержат бутилгидрокситолуол.

Либо компонентами масляной фазы являются масло из виноградных косточек, бутилгидрокситолуол и основа, состоящая из триглецирида каприловой/каприновой кислоты, ПЭГ-18 диолеата касторового масла, пропиленгликоля, пентаэритритила тетра ди-Т-бензила гидрокси гидроцинамата, токоферола, триизопропаноламина.

Осуществление изобретения

Как было сказано, эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (bFGF) и другие факторы роста клеток и/или протеины являются макромолекулами с затрудненной стабилизацией, поскольку на сегодняшний день большинство средств для дисперсии имеют водную основу и позволяют достичь стабилизации лишь в течение короткого периода времени посредством использования дисперсионных систем, таких как эмульсии, или применения дорогостоящих и очень специфических методов, не гарантирующих более продолжительное существование естественной структуры протеина, таких как, например, метод лиофилизации.

В рамках настоящего изобретения, для дисперсии протеинов разработана среда с маслянистыми компонентами. Эпидермальный фактор роста и/или протеины были помещены в масляную среду и, таким образом, было достигнуто усиление стабильности протеинов по сравнению с используемыми способами, благодаря более активному воздействию на неденатурированные протеины в подобной среде.

Точнее говоря, в соответствии со способом, предлагаемым в рамках настоящего изобретения, в составе лекарственной формы факторы роста окружены безводной средой, компонентами которой являются:

- масло из виноградных косточек, создающее среду, снижающую электростатическое взаимодействие с остатками протеинов при поддержании естественной конформации протеинов;

- основа, состоящая из: триглецирида каприловой/каприновой кислоты; ПЭГ-18 диолеата касторового масла; пропиленгликоля; пентаэритритила тетра ди-Т-бензила гидрокси гидроцинамата; токоферола, триизопропаноламина, которые способствуют усилению взаимодействий межмолекулярных сил с областями (доменами) протеинов, делающими структуру термодинамически более стабильной; и

- бутилгидрокситолуол (ВНТ), который действует как антиоксидант, что позволяет избежать явления химической деградации в результате окислительных процессов в клетках.

Следует отметить, что процесс помещения протеинов в компоненты масляной среды должен выполняться с обеспечением надлежащего качества. Такой процесс должен предпочтительно проводиться в чистых комнатах, при хорошем освещении, стерильность конечной продукции должна гарантироваться благодаря применению средств контроля качества окружающей среды и средств микробиологического контроля.

В сжатом изложении, настоящим изобретением предлагается разработка способа для сохранения (консервирования), хранения и стабилизации протеинов, в рамках которого рассматривается обезвоженная (т.е. в условиях отсутствия воды) фаза дисперсии, производимая в условиях качественного контроля условий окружающей среды и микробиологического контроля посредством применения маслянистых веществ, имеющих гидрофильные составляющие, гарантирующие взаимодействия с протеинами, удерживающие конформацию протеинов в исходном состоянии. Предлагаемый способ представляет собой воспроизводимый, простой и экономически эффективный метод по отношению к другим методам, требующим использования устройств, сложных технологических процессов и задействования квалифицированного персонала.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Чанг Л.Л. (Chang LL), Пикал М. Джей (Pikal MJ). Механизмы стабилизации протеинов в твердом состоянии. Журнал фармацевтических наук. 98; 2009: 2886-2908.

2. Чи Е.И. (Chi EY), Кришнан С (Krishnan S), Рэндольф Т.У. (Randolph TW), Карпентер Джей Ф. (Carpenter JF). Физическая стабильность протеинов в водном растворе: механизм и движущие силы в агрегировании ненативных протеинов. Журнал химических и фармацевтических исследований. 2003; 20: 1325-36.

3. Кришнамурти P. (Krishnamurthy R), Мэннинг М.С. (Manning МС). Фактор стабильности: важность при разработке лекарственной формы. Современная фармацевтическая биотехнология. 2002; 3: 361-71.

4. Счоуест Джей М. (Schouest JM), Лан Т.К. (Lun TK), Мой Р.Л. (Moy RL). Усовершенствованная текстура и улучшенный внешний вид произведенной из ячменя синтетической сыворотки с эпидермальным фактором роста (ФЭР, EGF), сходным ЭФР человека. Журнал лекарственных средств в дерматологии. 2012; 11 (5): 613-620.

5. Танг З. (Tang Z), Чжан З. (Zhang Z), Чжэн И. (Zheng Y) и др. Старение клеток диплоидных фибробластов человека связано с изменениями в способности реагирования на эпидермальный фактор роста и с изменениями в экспрессии HER-2. Механизмы старения и развития. 1994; 73 (1): 57-67.

Способ сохранения и стабилизации протеинов, заключающийся в том, что:

создают дисперсную систему, в которой дисперсионной средой является масло, в которую вводят дисперсную фазу в виде протеина, при этом в дисперсионную среду добавляют дисперсные наполнители и антиоксиданты, отличающийся тем, что дисперсную систему формируют в виде безводной композиции с гидрофильными остатками, включающую в себя дисперсионную среду в виде масла из виноградных косточек, а в качестве дисперсных наполнителей используют состав из: триглицерида каприловой/каприновой кислоты, PEG-18 диолеата касторового масла; пропилена гликоля, пентаэритритила тетра ди-Т-бензила гидрокси гидроцинамата, токоферола, триизопропаноламина с образованием гидрофильных остатков;

затем в дисперсионную среду вводят протеины с возможностью гарантированного обеспечения их исходной нативной конформации посредством взаимодействия с ними гидрофильных остатков в условиях нормальной температуры и нормального давления;

в качестве протеинов используют эпидермальные факторы роста (EGF), факторы роста фибробластов (bFGF);

в качестве антиоксидантов используют бутилгидрокситолуол (ВНТ).