Способ получения капсулярного полисахарида haemophilus influenzae типа b, применение капсулярного полисахарида и способ получения вакцинной композиции

Авторы патента:

C12P19/04 - полисахариды, т.е. соединения, содержащие более пяти сахаридных радикалов, связанных друг с другом гликозидными связями

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

A61K39/102 - Pasteurella;Haemophilus

Владельцы патента RU 2644246:

САНОФИ ПАСТЕР (FR)

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ получения капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, применение вышеуказанного капсулярного полисахарида для получения вакцинной композиции и способ получения вакцинной композиции. Способ получения капсулярного полисахарида включает культивирование штамма Haemophilus influenzae типа b в культуральной среде, сбор и обработку супернатанта культуры для экстрагирования капсулярного полисахарида. Причем культуральная среда содержит цинк и не содержит сложного источника азота или углерода. Способ получения вакцинной композиции включает получение вышеуказанного капсулярного полисахарида и конъюгирование капсулярного полисахарида с белком-носителем. Изобретения обеспечивают увеличение производства полисахарида без увеличения эндотоксинов. 3 н. и 21 з.п. ф-лы, 1 ил., 11 табл., 8 пр.

Изобретение относится к способу получения в промышленном масштабе капсулярных полисахаридов Haemophilus influenzae типа b (Hib), согласно которому штамм Hib культивируют в особой культуральной среде, которая имеет определенный химический состав и которая не содержит каких-либо сложных источников азота или углерода.

В уровне техники, в частности из заявки WO 2009007641, известны улучшенные среды для культивирования Haemophilus influenzae типа b, которые не содержат компонентов из животных источников, как это рекомендуется, когда культура Haemophilus influenzae типа b имеет целью получение капсулярного полисахарида, который будет затем вводиться как антиген в состав вакцины. В средах, описанных в этом документе уровня техники, источник азота, обычно состоящий из животных пептонов, заменен растительными пептонами.

Такие среды представляют большой прогресс для безопасности фармацевтических продуктов в том, что касается, в частности, устранения риска переноса таких заболеваний, как бычий губчатый энцефалит; таким образом, они позволяют отвечать рекомендациям органов здравоохранения.

Однако состав пептонов может варьировать в зависимости от поставляемых партий, что может повлечь за собой изменения количеств образованных бактерий, а также изменение выхода по желаемым антигенам, что производители вакцин пытались ограничить или скорректировать, модифицируя некоторые параметры при осуществлении способа. Однако в рамках промышленного получения фармацевтического продукта желательно располагать надежными способами, требующими как можно меньше модификаций при каждом применении, и результаты которого на каждой стадии воспроизводятся от партии к партии.

Такие способы должны также позволять получать выходы, совместимые с промышленной рентабельностью, причем критерием является в случае получения антигенов из бактерий не только получить как можно большее количество бактерий, но также получить лучшее соотношение между титром антигенов и количеством полученных бактерий; таким образом, желательно, чтобы бактерии культивировались в условиях, ориентирующих их метаболизм на получение капсулярного полисахарида.

С этой целью объектом изобретения является способ получения в промышленном масштабе капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b (PRP), предназначенного для вакцинальных целей, согласно которому культивируют штамм Haemophilus influenzae типа b (Hib) в культуральной среде, собирают супернатант культуры, который обрабатывают для экстрагирования капсулярного полисахарида, причем указанная культуральная среда содержит по меньшей мере:

- один источник углерода,

- протопорфирин,

- соли,

- аминокислоты,

- NAD или NADH,

- витамины,

- средства регулирования pH,

отличающийся тем, что указанная культуральная среда имеет определенный химический состав.

Благодаря изобретению можно одновременно иметь надежный промышленный способ и повысить образование капсулярного полисахарида без необходимости соответственно увеличивать биомассу, что позволяет уменьшить количество получаемых липополисахаридов (LPS) относительно количества получаемого PRP.

Кроме того, отсутствие белков в составе культуральной среды снижает необходимую потребность в противовспенивающих средствах и упрощает стадию очистки, что позволяет, исходя из супернатанта культуры, получить антиген, образованный из капсулярного полисахарида.

Согласно изобретению культуральная среда содержит средства регулирования pH. Эти средства регулирования pH могут представлять собой буферные соли и/или являться средствами измерения pH в комбинации со средствами добавления к среде кислоты или основания. Благодаря регулированию pH можно оптимизировать производительность.

Согласно одному варианту осуществления способ по изобретению дополнительно включает конъюгирование полученного PRP с белком-носителем, таким как столбнячный белок.

Объектом изобретения является также способ получения вакцинной композиции, согласно которому:

- готовят в промышленном масштабе антиген к Haemophilus influenzae типа b (Hib), состоящий из капсулярного полисахарида (PRP), путем культивирования штамма Hib в среде с заданным химическим составом, природа и количество каждого компонента в которой вполне определено и которая содержит по меньшей мере:

- один источник углерода,

- протопорфирин,

- соли,

- аминокислоты,

- NAD или NADH,

- витамины,

- а также средства регулирования pH,

- собирают супернатант культуры, который обрабатывают для экстрагирования очищенного капсулярного полисахарида,

- конъюгируют капсулярный полисахарид с белком-носителем.

Согласно одному варианту осуществления полученный конъюгат дополнительно комбинируют с по меньшей мере одним или несколькими антигенами, предназначенными для вакцинации от одной или нескольких следующих инфекций: дифтерии, столбняка, полиомиелита, гепатита B, ветряной оспы, свинки, краснухи, инфекций, вызванных Neisseria meningitidis или Streplococcus pneumoniae, инфекций, вызванных ротавирусом, чтобы получить вакцинальную композицию, позволяющую одновременную иммунизацию от нескольких болезней.

Согласно изобретению культуральная среда является химически определенной, то есть известна химическая структура, а также количество каждого компонента. Такая среда не содержит сложного источника азота или углерода, такого как пептоны, казеины, сыворотки или другое, и, следовательно, при желании можно гарантировать, что она не содержит каких-либо элементов, напрямую происходящих от животных.

Изобретение относится к способу получения в промышленном масштабе капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b. Такой способ позволяет получить выходы по биомассе и капсулярным полисахаридам или PRP, совместимые с промышленными требованиями. Такой способ позволяет, в частности, получить антиген, исходя из штамма Haemophilus influenzae типа b, содержащего в своем генетическом коде по меньшей мере 2 копии локуса cap, кодирующего функции, позволяющие синтез капсул, без особого регулирования среды (например, регуляторы pH или pO₂), причем через 12 ч культивирования биомасса соответствует оптической плотности D.O. при 694 нм по меньшей мере 2,4, и количество связанного PRP составляет по меньшей мере 240 мг/л культуральной среды. Определение количества полученного PRP производилось методом анионообменной хроматографии высокого разрешения в сочетании с амперометрическим детектором (HPAEC-PAD) (Dionex) или методом, дающим эквивалентные результаты. Предпочтительно способ согласно изобретению позволяет получить количество PRP по меньшей мере 270 мг/л среды и еще более предпочтительно количество по меньшей мере 300 мг/л.

Из возможных источников углерода можно назвать любые источники, метаболизируемые штаммом Haemophilus influenzae типа b, в частности глюкозу, фруктозу, галактозу, глицерин, ксилозу, рибозу, фукозу, сиаловую кислоту, лактат. Можно также использовать 2 или более разных источников, в частности лактат и глюкозу. Согласно изобретению количество глюкозы, присутствующей в исходной среде, составляет от 5 до 25 г/л, в частности от 10 до 20 г/л, в частности от 12 до 16 г/л.

Количество лактата, присутствующего в исходной среде, может составлять от 0 до 15 г/л, в частности от 0,5 до 10 г/л.

Согласно одному варианту осуществления изобретения протопорфирин в среде представляет собой синтетический протопорфирин, например, поставляемый компанией Sigma Aldrich под индексом 258385 (Protoporphyrin disodium salt - динатриевая соль протопорфирина). Таким образом, можно использовать среду, для которой можно гарантировать, что она полностью лишена веществ животного происхождения. Альтернативно используют синтетический протопорфирин IX следующей формулы:

где R означает H или противоион, предпочтительно противоион щелочного металла, в частности натрия.

Такой протопорфирин IX и способ его получения описаны в патентной заявке FR2914302.

Согласно изобретению количество протопорфирина, присутствующего в исходной среде, предпочтительно составляет от 0,1 до 10 мг/л, в частности от 0,25 до 2 мг/л.

Культуральная среда согласно изобретению содержит соли, которые вносят минералы, необходимые для роста клеток, позволяют обеспечить осмотическое давление, благоприятное для бактерии, и которые дополнительно оказывают буферное действие на pH.

Предпочтительно использовать смесь одновалентных катионов, таких как Na⁺ и/или K⁺, двухвалентных катионов, как Ca⁺⁺, Mg⁺⁺, Co⁺⁺, Zn⁺⁺, Mn⁺⁺, Fe⁺⁺, фосфатных анионов в виде HPO₄^2-, H₂PO₄^- и/или PO₄^2-, анионов SO₄^2-, и Cl^-, в виде солевых растворов, причем молярность каждого из них обычно может варьироваться в диапазоне концентраций от 10^-4 мМ до 1000 мМ.

Соли, присутствующие в культуральной среде, выбраны, в частности, из K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄⋅7H₂O, Na₂HPO₄⋅12H₂O, NaH₂PO₄⋅2H₂O, CaCl₂⋅2H₂O, FeSO₄⋅7H₂O, ZnSO₄⋅7H₂O, CoCl₂⋅6H₂O, MnSO₄⋅H₂O.

Концентрации солей выбирают так, чтобы иметь осмолярность в интервале от 200 до 700 мосм/л, в частности от 300 до 400 мосм/л, в частности 350 мосм/л, и pH от 6,5 до 7,5.

Для этого культуральная среда согласно изобретению может содержать, в частности:

- MgSO₄⋅7H₂O в концентрации от 150 до 1500 мг/л,

- CaCl₂⋅2H₂O в концентрации от 6,5 до 52 мг/л,

- FeSO₄⋅7H₂O в концентрации от 1,25 до 10 мг/л,

- ZnSO₄⋅7H₂O в концентрации от 2,5 до 80 мг/л,

- CoCl₂⋅6H₂O от 0,5 до 2 мг/л,

- MnSO₄⋅H₂O от 2,5 до 10 мг/л,

- натрий, в частности, в форме 60%-ного лактата натрия, в количестве от 0 до 4 мл/л,

- K₂HPO₄ и KH₂PO₄ в концентрации, составляющей для каждого от 100 до 1200 мг/л, когда буферный эффект обеспечивается парой Na₂HPO₄⋅12H₂O/NaH₂PO₄⋅2H₂O.

- Na₂HPO₄⋅12H₂O в концентрации от 15 до 120 г/л,

- NaH₂PO₄⋅2H₂O в концентрации в 10-30 раз меньшей концентрации Na₂HPO₄⋅12H₂O.

Альтернативно буферный эффект можно обеспечить парой K₂HPO₄/KH₂PO₄; в этом случае концентрация K₂HPO₄ составляет от 15 до 120 г/л, и концентрация KH₂PO₄ в 10-30 раз ниже концентрации K₂HPO₄; концентрация Na₂HPO₄⋅12H₂O и NaH₂PO₄⋅2H₂O может тогда составлять от 100 до 1200 мг/л.

Можно отметить, что присутствие цинка среди названных солей было особенно выгодным для получения биомассы и PRP, в частности, в концентрации от 2,5 до 80 мг/л или, в частности от 5 до 20 мг/л. Очень хорошие результаты были получены при концентрации 20 мг/л.

В случае, когда pH культуральной среды регулируют в фазе культивирования путем добавления, в частности, сильно концентрированного основания, такого как NaOH или KOH, можно снизить количество солей, присутствующих в среде, в частности количество буферных пар Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ или K₂HPO₄/KH₂PO₄, при условии, однако, сохранения осмолярности на приемлемом уровне, то есть в интервале от 200 до 700 мосм/л, путем возможного добавления NaCl.

Согласно изобретению культуральная среда содержит также NAD или источник NAD, или любой другой эквивалентный коэнзим. NAD (или (β-никотинамид адениндинуклеотида), называемый также коэнзимом I или фактором V, является незаменимым фактором роста для культуры Haemophilus influenzae типа b. Он предпочтительно присутствует в концентрации от 0,5 до 50 мг/л, в частности от 2 до 10 мг/л, в частности в концентрации 5 мг/л культуральной среды. Он может быть внесен в среду в своей восстановленной форме NADH. Вместо NAD культуральная среда согласно изобретению может содержать предшественники NAD, которые будут способны утилизировать, такие как NADP/NADPH (β-никотинамид фосфата адениндинуклеотида), или NMN ((β-никотинамид аденинмононуклеотида), или NR (никотинамид рибозида), β-ацетилпиридинадениндинуклеотид (APAD), или β-ацетилпиридинмононуклеотид (APMN).

Согласно изобретению культуральная среда содержит аминокислоты, которые предпочтительно выбраны из аргинина, аланина, лизина, гистидина, триптофана, валина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, цистина (или эквивалента), аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты. Рецептура культуральной среды согласно изобретению включает только аргинин, аланин, гистидин, триптофан, тирозин, фенилаланин, цистин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Альтернативно в культуральной среде присутствуют все вышеназванные аминокислоты.

Согласно одному частному варианту изобретения цистин заменен глутатионом или цистеином.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления в способе согласно изобретению применяется культуральная среда, не содержащая следующих аминокислот: L-метионина, L-глицина, L-пролина, L-серина и L-треонина. Действительно, присутствие этих аминокислот приводило к увеличению биомассы, но не к соответствующему увеличению выработки PRP.

Аминокислоты поставляются компанией Sigma в виде очень чистых порошков. Особенно предпочтительно эти аминокислоты имеют синтетическое происхождение или получены способами, гарантирующими, что они не содержат каких-либо элементов, напрямую поступающих от животного, чтобы исключить любой риск заражения передаваемыми инфекциями, в частности ESB (бычий губчатый энцефалит). Количество каждой аминокислоты выбирают так, чтобы оптимизировать рост клеток и образование PRP. Количество аспарагиновой кислоты, аспарагина и глутамина выбирают так, чтобы вызвать дефицит в клеточной культуре, что позволяет ориентировать метаболизм клетки на получение капсулярного полисахарида, и количества других аминокислот выбирают так, чтобы не было нехватки в фазе культивирования.

Согласно изобретению культуральная среда содержит, кроме того, витамины, которые выбраны из тиамина, пантотената, урацила, пироксантина, биотина, рибофлавина и пиридоксина. В контексте изобретения термин витамины охватывает также урацил и пироксантин, которые представляют собой азотсодержащие основания.

Особенно предпочтительно, что витамины, присутствующие в культуральной среде согласно изобретению, имеют неживотное происхождение, в частности являются синтетическими, что позволяет исключить любой риск заражения передающимися инфекциями, в частности ESB (бычий губчатый энцефалит). Используют, в частности, витамины, поставляемые компанией Sigma, степень чистоты которых точно известна, что позволяет иметь очень точную дозировку при приготовлении культуральной среды.

Количества витаминов, присутствующих в среде, выбирают так, чтобы оптимизировать получение биомассы и PRP.

Согласно одному частному варианту изобретения культуральная среда содержит цитруллин, который может заменить аргинин и урацил.

В этом случае количество цитруллина, содержащегося в культуральной среде, предпочтительно составляет от 150 до 500 мг/л.

Благодаря культуральной среде согласно изобретению удалось получить полирибосил-рибитол-фосфат в большем количестве, чем при использовании сред согласно уровню техники, не расходуя при этом больше углевода и не образуя больше загрязняющих веществ, в частности LPS.

Согласно одному варианту осуществления изобретения культивируемый штамм Haemophilus influenzae типа b является капсулярным штаммом, содержащим в своем генетическом коде по меньшей мере 2 копии локуса cap. Этот локус cap размером от 17 до 18 кб объединяет гены, экспрессия которых связана с синтезом и выносом капсулы. Экспрессия капсулы придает белый цвет бактерии, когда ее культивируют на особом агаре, поэтому колонии бактерий, обладающих локусом cap, называются белыми колониями, тогда как бактерии, не выносящие капсулярный полисахарид на поверхность капсулы, называются серыми колониями. Экспрессия капсулы потенциально подвержена генетической нестабильности, которая может вызвать появление мутантов, лишенных капсулы, что как следствие приводит к снижению образования PRP. Исследования позволили продемонстрировать, что среда с определенным химическим составом, используемая в способе по изобретению, позволяет обеспечить хорошую генетическую стабильность используемого штамма в течение примерно двадцати репликаций клеток.

Согласно изобретению культивирование бактерии Haemophilus influenzae типа b можно осуществить в несколько последовательных стадий для постепенного увеличения биомассы.

В этом случае производят посев бактерий, происходящих из лиофилизата или замороженного продукта, в объем среды, обычно не превышающий 1 л. По истечении ночи культивирования или когда оптическая плотность среды станет достаточной, эту первую культуру переводят во вторую культуральную среду, идентичную первой, но объем которой может быть до 10-20 раз больше. Количество бактерий, засеваемых во вторую среду, подбирают так, чтобы начальная оптическая плотность (D.O.) второй культуральной среды при 694 нм составляла от 0,2 до 0,4, чтобы облегчить быстрый рост популяции бактерий. Это второе культивирование обычно производят в ферментере, но можно использовать и другие типы резервуаров (колбы, роллерные колбы и т.п.). Когда культивирование осуществляют в ферментере, обычно в течение всего периода культивирования используют температуру 37°C±1°C, постоянное перемешивание, давление 0,1 бар, pO₂ 30% и расход воздуха 0,25 объема газа на объем среды в минуту. В компетенции специалиста выбрать другие параметры для этого типа культивирования. К концу фазы экспоненциального размножения бактерий можно еще больше увеличить биомассу, переводя ее в другой ферментер большей емкости, применяя тот же порядок действий и т.д. Объемы полученной культуры могут достигать и даже превосходить 1000 л. Культивирование обычно осуществляют в периодическом режиме.

Наконец, из последней культуры после инактивации бактерий отбирают супернатант. Инактивацию классически реализуют с помощью раствора формалина в конечной концентрации 0,35-0,37% (об./об.). Супернатант классически отделяют от бактерий посредством стадии центрифугирования. PRP, содержащийся в полученном супернатанте, затем экстрагируют и очищают классическими способами, хорошо известными специалисту в данной области.

Собранный и очищенный PRP затем предпочтительно конъюгируют с белком-носителем, таким как столбнячный белок, чтобы сделать его T-зависящим и позволить, в частности, провести иммунизацию маленьких детей. Полученный таким образом антиген PRP-T можно затем использовать самостоятельно в моновакцине или комбинировать с другими антигенами, чтобы можно было провести одновременную вакцинацию от нескольких болезней.

Особенно предпочтительно изобретение предлагает способ получения вакцинной композиции, согласно которому полученный конъюгат комбинируют с по меньшей мере одним или нескольким антигенами, обычно присутствующими в детских прививках, в частности антигенами против дифтерии, столбняка, полиомиелита, гепатита B, инфекций, вызванных Neisseria meningitidis или Streplococcus pneumoniae, ветряной оспы, свинки, краснухи, инфекций, вызванных ротавирусом, и т.д. Согласно одному варианту осуществления конъюгат PRP-T находится в виде порошка, и другие антигены находятся в жидкой форме, причем все антигены смешивают непосредственно перед введением; согласно одному альтернативному варианту осуществления вакцинная композиция является полностью жидкой.

Таким образом, предлагаемый изобретением способ получения позволяет изготовить четырехвалентную вакцинную композицию, содержащую наряду с конъюгатом PRP-T антигены против дифтерии, столбняка, гепатита B. Альтернативно можно изготовить четырехвалентную вакцинную композицию, содержащую помимо конъюгата PRP-T, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, бесклеточные антигены Bordetella pertussis в числе 2 (анатоксин и нитевидный гемагглютинин), или 3 (2 предыдущих+пертактин), или 5 (3 предыдущих+агглютиногены). Способ позволяет также изготовить пятивалентную вакцинную композицию, содержащую наряду с конъюгатом PRP-T дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, бесклеточные антигены Bordetella pertussis в числе 2, 3 или 5, а также инактивированные вирусы полиомиелита типа 1, 2 и 3.

Указанный способ позволяет также изготовить шестивалентную вакцинную композицию, содержащую помимо конъюгата PRP-T дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, бесклеточные антигены к Bordetella pertussis в числе 2, 3 или 5, гепатиту B, а также инактивированные вирусы полиомиелита типа 1, 2 и 3. Такая шестивалентная композиция может быть, в частности, жидкой и содержать на дозу 0,5 мл:

- дифтерийный анатоксин в количестве 20 МЕ,

- столбнячный анатоксин в количестве 40 МЕ,

- поверхностный антиген гепатита B из расчета 10 мкг,

- анатоксин Pertussis из расчета 25 мкг,

- нитевидный гемагглютинин Pertussis из расчета 25 мкг,

- PRP-T из расчета 12 мкг PRP,

- инактивированные вирусы полиомиелита типа 1, 2 и 3 в количестве соответственно 40, 8 и 32 D-антигенных единиц,

- гидроксид алюминия из расчета 0,6 мг Al³⁺.

Альтернативно способ позволяет получить вакцинные композиции, в которых антигены коклюша образованы из цельных бактерий Bordetella pertussis.

Благодаря предлагаемому изобретением способу культивирования можно повысить образование полирибозил-рибитол-фосфата без увеличения количества биомассы, что позволяет уменьшить количество загрязнителей LPS; это преимущество способа по изобретению особенно важно для промышленности вакцин, где эти продукты вводят в качестве антигенов в вакцинные композиции и где количество LPS должно быть сведено к минимуму. Располагая способом, позволяющим обойтись без увеличения количества полученного LPS при большем количестве PRP, можно упростить последующий процесс очистки.

Пример 1. Приготовление культуральной среды согласно изобретению

Культуральную среду согласно изобретению готовили, исходя из базовой среды, в которую непосредственно перед приготовлением добавляли обогащающие растворы.

Состав базовой среды приведен в таблице I.

Таблица I
Соединения	Количество, мг на 1 л	Поставщик	Индекс продукта
Лактат натрия 60%	1,5 мл	Prolabo	27925.292
K₂HPO₄	300	VWR Prolabo	26931.263
KH₂PO₄	300	VWR Prolabo	26923.298
MgSO₄⋅7H₂O	368	VWR Prolabo	25165.260
Na₂HPO₄⋅12H₂O	28620	VWR Prolabo	28028.298
NaH₂PO₄⋅2H₂O	1870	VWR Prolabo	28015.294
L-аргинин	87	Sigma	A5006 или A8094
L-аланин	134	Sigma	A7627 или A7469 или A4349
L-аспарагин	198	Sigma	A0884 или A7094
L-лизин	140	Sigma	L5626 или L8662 или L7039
L-глутамин	220	Sigma	G3126 или G8540 или G5792
L-гистидин	78	Sigma	H8000 или H6034 или H3911
L-триптофан	200	Sigma	T0254 или T8941 или T4196
L-валин	115	Sigma	V0500 или V0513 или V4638
L-изолейцин	130	Sigma	12752 или 17403 или 15281
L-лейцин	130	Sigma	L8000 или L6914 или L8912
L-тирозин	180	Sigma	T3754 или T8566 или T4321
L-фенилаланин	165	Sigma	P5482
L-цистин	61	Sigma	C8755 или C7602 или C5735
L-аспарагиновая кислота	1065	Sigma	A9256 или A5474
L-глутаминовая кислота	1471	Sigma	G1251 или G8415
Пиридоксин HCl	4	Sigma	P5669
Рибофлавин	0,2	Sigma	R4500
Тиамин HCl	4	Sigma	T4625
Биотин	4	Sigma	B4501
Пантотенат Ca	4,5	Sigma	P5710
Урацил	70	Sigma	U0750
Пироксантин	20	Sigma	H9377
FeSO₄⋅7H₂O	2,5	Adrich	450278
ZnSO₄⋅7H₂O	5	Sigma	Z4750
CoCl₂⋅6H₂O	1	Fulka	60818
MnSO₄⋅H₂O	5	Sigma	M7634
CaCl₂⋅2H₂O	13	Panreac	131232.1211

Для приготовления 1 л среды добавляют в примерно 100 мл деминерализованной воды, при перемешивании на магнитной мешалке различные соединения, следуя порядку, описанному в таблице. Перед добавлением все порошки были предварительно растворены в небольшом объеме деминерализованной воды, в некоторых случаях с добавлением кислоты или основания.

Так, для валина, изолейцина и лейцина оказалось необходимым добавить к количествам, указанным в таблице, 140 мкл 10 н. KOH; к тирозину потребовалось добавить 280 мкл 10 н. KOH; к фенилаланину потребовалось добавить 210 мкл 37%-ной HCl, и к цистину потребовалось добавить 70 мкл 37%-ной HCl.

В конце устанавливали величину pH 7,2±0,1 добавлением 10 н. KOH (в случае, когда pH был слишком высоким, использовали 37%-ную HCl), затем добавляли деминерализованную воду до достижения желаемого объема.

Затем среду стерилизовали путем фильтрования через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм.

В результате среду можно было хранить 72 ч при 5°C.

Перед инокуляцией среды добавляли:

- 27,3 мл глюкозы концентрацией 512,8 г/л, полученной из безводной глюкозы D(+), поставляемой компанией VWR под индексом 24379.294,

- 5 мл раствора NAD 1 г/л, поставляется компанией Sigma под названием β-никотинамид гидрата адениндинуклеотида (индекс 43410),

- 4 мл маточного раствора, содержащего протопорфирин в концентрации 0,25 г/л и гидроксид аммония в концентрации 5 мл/л; причем протопорфирин поставляется компанией Sigma Aldrich под названием динатриевая соль протопорфирина IX (индекс 258385), и гидроксид аммония поставляется компанией VWR под названием аммиачный раствор 28% (индекс 21190.292),

с получением 1 л среды, готовой для инокуляции и содержащей наряду с компонентами, описанными в таблице I, дополнительные элементы в концентрациях, указанных в таблице II.

Таблица II
Соединения	Концентрация перед инокуляцией среды
Протопорфирин	1 мг/л
Гидроксид аммония	17,7 мкг/л
Безводная глюкоза	14 г/л
NAD	5 мг/л

Пример 2. Приготовление культуральной среды согласно уровню техники

Культуральную среду согласно уровню техники готовили, добавляя в базовую среду особые обогащающие растворы.

Состав базовой среды указан в таблице III.

Таблица III
Соединения	Концентрация в базовой среде
Пептон гороха	7,42 г/л
Лактат натрия 60%	1,5 мл/л
Na₂HPO₄⋅12H₂O	31,14 г/л
NaH₂PO₄⋅H₂O	2,03 г/л
Цистин (L)	0,07 г/л
HCl (10н)	0,07 мл/л
Триптофан (L)	0,02 г/л
(NH₄)₂SO₄	1 г/л
MgSO₄⋅7H₂O	0,4 г/л
CaCl₂⋅2H₂O	0,02 г/л

Для получения этой базовой среды к 100 мл деминерализованной воды, поддерживаемой при перемешивании на магнитной мешалке, добавляли каждый из элементов, следуя порядку, в каком они указаны в таблице. До этого каждый из элементов, поставляемых в виде порошка, был растворен в небольшом объеме деминерализованной воды.

Пептон гороха получен от компании Kerry, он продается под индексом Hy-pea 7404. (NH₄)₂SO₄ поставляется компанией VWR под индексом 21333.296.

Другие компоненты приобретены у тех же поставщиков, они поставляются под теми же индексами, как описано в примере 1 для получения среды согласно изобретению.

Конечный pH устанавливали на значение 7,2±0,1 добавлением 10 н. KOH (в случае, когда pH был слишком высоким, использовали 37%-ную HCl).

Затем добавляли деминерализованную воду с получением желаемого объема, после чего стерилизовали в автоклаве, следуя циклу 30 мин при 120°C.

После стерилизации среду можно было хранить 15 дней при 4°C.

К этой базовой среде добавляли обогащающие растворы A, B, C и D.

Раствор A представляет собой раствор, содержащий безводную глюкозу в концентрации 512,8 г/л, поставляется компанией VWR под названием глюкоза D(+) безводная (индекс 24379.294).

Раствор B является маточным раствором, содержащим NAD в концентрации 1 г/л, поставляется компанией Sigma под названием β-никотинамид гидрата адениндинуклеотида (индекс 43410).

Раствор C является маточным раствором, содержащим NAD в концентрации 0,25 г/л и гидроксид аммония в концентрации 5 мл/л; причем протопорфирин поставляется компанией Sigma Aldrich под названием протопорфирин IX динатриевая соль (индекс 258385), и гидроксид аммония компанией VWR под названием аммиачный раствор 28% (индекс 21190.292),

Раствор D представляет собой концентрированный раствор, содержащий ультрафильтрат автолитического экстракта дрожжей (Ufel) концентрации 125 г/л; он поставляется компанией Biospringer под названием ультрафильтрат автолитического экстракта дрожжей (Ufel) (индекс Springer 0701).

Каждый из этих растворов стерилизовали фильтрованием на фильтре с порогом отсечки 0,22 мкм.

К 1 л базовой среды добавляли:

- 35,1 мл раствора A,

- 5 мл раствора B,

- 4 мл раствора C,

- 40 мл раствора D.

Добавление каждого раствора в базовую среду осуществляли под вытяжкой в ламинарном потоке, что привело к культуральной среде, содержащей перед инокуляцией помимо элементов, указанных в таблице III, дополнительные элементы в концентрациях, указанных в таблице IV.

Таблица IV
Соединения	Концентрация перед инокуляцией среды
Ультрафильтрат автолитического экстракта дрожжей (Ufel)	4,9 г/л
Протопорфирин	1 мг/л
Гидроксид аммония	17,7 мкг/л
Безводная глюкоза	18 г/л
NAD	5 мг/л

Пример 3. Сравнение образования PRP в среде согласно изобретению, описанной в примере 1, и в среде согласно уровню техники, описанной в примере 2

Эти сравнительные эксперименты проводили согласно протоколу культивирования в 2 стадии:

стадию предварительного культивирования проводили в стеклянной колбе Эрленмейера объемом 1 л без перегородок, при 36°C и перемешивании на 130 об/мин в течение 8 ч, по истечении которых штамм находился в конце линейной фазы роста; эту предкультуру инициировали путем инокуляции 280 мл культуральной среды инокулятом бактерии Haemophilus influenzae типа b, содержащим по меньшей мере 2 копии локуса cap, в концентрации 0,5% (об./об.);

затем перенос 90 мл предкультуры позволил произвести посев в ферментер Biostat B объемом более 2 л, содержащий 1,8 л культуральной среды. Этот ферментер поддерживали при 37°C, перемешивании на 400 об/мин с аэрацией 0,45 л/мин в течение 12 ч.

После 12 ч культивирования измеряли оптическую плотность (D.O.) на 694 нм, что позволило определить биомассу. Действительно, в предыдущих опытах удалось определить, что одна единица оптической плотности, измеренной при 694 нм, соответствует 0,64 г биомассы в сухой массе на литр.

Полное количество PRP в супернатанте культуры определяли анионообменной хроматографией высокого разрешения в сочетании с импульсным амперометрическим детектором (HPAEC-PAD, по методу, очень близкому к описанному в публикации Sturgess et al. (Vaccine 17 (1999) 1169-1178). Супернатант культуры фильтровали, проводя через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм, затем 500 мкл супернатанта подвергали ультрафильтрации, используя колонки Amicon ultra с порогом отсечки 10 кДа (ультратонкий фильтр, позиция UFC5010BK), и затем подвергали стадии основного гидролиза путем добавления NaOH.

Гидролиз протекал при температуре окружающей среды в течение минимум 4 ч.

Достоверность дозировки контролировали, используя внутренний эталон глюкозамин 1 фосфат (GlcN1P), присутствующий в растворе для гидролиза, и путем регулярного прохождения внутреннего контроля, имеющего известную концентрацию PRP. В сравнении с указаниями Sturgess et al., подвижная фаза состояла из NaOH 35 мМ и CH₃COONa 114 мМ, и стадию регенерации осуществляли в течение 10 мин с NaOH 100 мМ и CH₃COONa 400 мМ.

Полученные результаты приведены в таблице V.

Таблица V
	Среда по изобретению (4 опыта)	Среда согласно уровню техники (1 опыт)
D.O. при 694 нм	2,52±0,14	3,9
Биомасса, г сухой массы на литр культуральной среды	1,74±0,09	2,6
Концентрация PRP, мг/л культуральной среды	349±22	169
Удельная производительность, мг PRP/г биомассы	199±3	66

Эти результаты показывают выгоду способа согласно изобретению для образования PRP: действительно, отметим, что хотя при одинаковом объеме культуральной среды полученная биомасса была больше, чем с культуральной средой согласно уровню техники, но количество PRP, напротив, было меньше.

Пример 4. Сравнение количества PRP и LPS, присутствующих в супернатанте культуры согласно способу по изобретению и в супернатанте культуры согласно способу уровня техники

Культивирование Haemophilus influenzae типа b осуществляли для сравнения на среде согласно изобретению и на среде согласно уровню техники по способу, описанному в примере 3, но с тем отличием, что базовая среда в способе по уровню техники содержала 10 г/л продукта кислотного гидролиза казеина, поставляемого компанией Solabia (индекс A1434), вместо пептона гороха, присутствовавшего в среде согласно примеру 3.

Время предварительного культивирования, как и в примере 3, составило 8 ч, и время культивирования 12 ч.

Количественное определение как PRP, так и LPS осуществляли по методу HPAEC-PAD; но количественное определение LPS проводили путем количественной оценки особого моносахарида, гептозы, исходя из спектра эталонов очищенного LPS, обработанного согласно тому же протоколу, причем внутренним контролем для этого количественного анализа была рамноза.

Полученные результаты указаны в таблице VI.

Таблица VI
	Среда по изобретению (4 опыта)	Среда согласно уровню техники (3 опыта)
D.O. при 694 нм	2,5±0,1	3,9±0,3
Биомасса, г сухой массы на литр среды	1,7±0,1	2,5±0,2
Концентрация LPS, мг/л среды	5±1	4,6±1
Концентрация PRP, мг/л среды	349±22	17±5
Отношение PRP/LPS	74±15	38±6

Полученные результаты показывают выгоду способа согласно изобретению, который позволяет снизить количество полученного LPS по сравнению с количеством PRP.

Это является большим преимуществом способа по изобретению, так как это во многом упрощает операции очистки при сохранении надлежащего уровня безопасности.

Пример 5. Опыт, позволяющий оценить важность цинка

Изучали важность присутствия цинка в культуральной среде.

Для этого сравнивали три среды:

- среда, описанная в примере 1, обозначенная MS,

- среда, имеющая состав, идентичный составу из примера 1, но без ZnSO₄, обозначенная MS Zn-,

- среда, описанная в примере 1, но с концентрацией ZnSO₄ в 4 раза выше, то есть 20 мг/л, обозначенная MS Zn++.

Указанные среды затем стерилизовали путем фильтрации через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм.

Сначала осуществляли одностадийный способ предварительного культивирования в 1-литровой колбе Эрленмейера без перегородок, в течение 16 ч при 36°C и перемешивании на 130 об/мин, засеивая 280 мл среды, описанной в примере 4, замороженными бактериями Haemophilus influenzae типа b, имеющими в своем генетическом коде по меньшей мере 2 копии локуса cap. Затем 9,5 мл предкультуры промывали в каждой из тестируемых культуральных сред перед засеванием культуры, что проводилось каждый раз в 500-мл колбе Эрленмейера из поликарбоната, с перегородкой, содержащей 170 мл тестируемой культуральной среды; культивирование проводили в течение 12 ч при 37°C и перемешивании на 150 об/мин.

Для каждой среды определяли биомассу, концентрацию PRP, а также количество LPS в конце культивирования, тем же способом, как описано в примерах 3 и 4, и рассчитывали отношения PRP/биомасса, а также LPS/биомасса и PRP/LPS.

Полученные результаты приведены в таблице VII.

Таблица VII
	MS	MS Zn-	MS Zn++
Биомасса, г сухой массы на литр культуральной среды	1,98	1,23	2,22
Концентрация PRP, мг/л культуральной среды	319	203	372
Удельная производительность, мг PRP/г биомассы	160	165	167
Концентрация LPS, мг/л культуральной среды	11,5	8,8	12,1
Отношение LPS/биомасса, мг/г биомассы	6,1	7,2	5,5
Отношение PRP/LPS, мг/мг	30	23	31

Эти результаты показали, что присутствие цинка в культуральной среде позволяет значительно повысить образование биомассы, а также образование PRP, однако без пропорционального увеличения количества LPS.

Пример 6. Опыт в ферментере на 5 л

Проводили культивирование Haemophilua injluenzae типа b в культуральной среде, описанной согласно изобретению в примере 1, используя только продукты, которые согласно гарантиям поставщиков не содержат животных источников, и используя синтетический протопорфирин, как описано в патентной заявке FR2914302 и поставляется компанией SOLVIAS AG под названием: протопорфирин IX динатриевая соль (индекс SOL20402). Затем проводили опыты способом, описанным в примере 3, за исключением того, что использовали ферментеры объемом 5 л, поддерживаемые при 37°C, перемешивании 550 об/мин и аэрации 0,5 л/мин. Объем инокулята составлял в таком случае 280 мл, то есть весь объем предкультуры из колбы Эрленмейера.

Определение концентрации PRP и LPS производили, следуя протоколам, описанным в примерах 3 и 4.

Полученные результаты приведены в таблице VIII.

Таблица VIII
	Среда без животных источников согласно изобретению
D.O. при 694 нм	3,58
Биомасса, г сухой массы на литр среды	2,29
Концентрация PRP, мг/л среды	567
Удельная производительность, мг PRP/г биомассы	247

Эти результаты подтверждают предыдущие результаты и демонстрируют выгоду от способа согласно изобретению для получения больших количеств PPR.

Пример 7. Сравнение образования биомассы и PRP на среде согласно изобретению, описанной в примере 1, и на химически определенных средах, описанных в уровне техники

Проводили культивирование Haemophilus influenzae типа b в культуральной среде согласно изобретению, описанной в примере 1, а также в 8 средах, описанных в публикациях в связи с культурой Haemophilus influenzae и представленных как имеющие определенный химический состав.

Эти 8 сред готовили, следуя рекомендациям авторов. Речь идет о средаx в хронологическом порядке:

Talmadge, Herriott: Biochemical and Biophysical Research Communications, (March 1960), Vol. 2 N°3, p. 203-206),

Butler: J. gen. Microbiol. (1962), 27, 51-60,

Wolin: J. Bacteriol. Vol. 85, (1963) Notes, p. 253-254,

Herriott et al.: Journal of Bacteriology, (Feb. 1970), Vol. 101, N°2, 513-516,

Klein, Luginbuhl: Journal of General Microbiology (1979), 113, 409-411,

Coleman et al.: Journal of Clinical Microbiology, (Sept 2003), Vol. 41, N°9 p. 4408-4410.

Сведения относительно продуктов, использованных для получения этих 8 сред, приводятся в таблице IX.

Таблица IX
Продукты	Поставщик	Индекс продукта
Уридин	Sigma	U3003
Инозин	Sigma	14125
Аденозин	Sigma	A4036
Гуанин	Sigma	G6779
Гуанозин	Sigma	LG6264
Витамин B12	Sigma	V2876
Цитруллин	Sigma	C7629
Холинхлорид	Fulka	26978
Тимидин	Sigma	T9250
Инозитол	Sigma	15125
Путресцина дигидрохлорид	Sigma	P5780
Никотинамид	Sigma	N0636
Гематин свиной	Sigma	H3281
Гемин	Fulka	51280
Олеат натрия	Sigma	O7501
Ацетат натрия	Fulka	71185
Фолиевая кислота	Sigma	F7876
Поливиниловый спирт	Sigma	341584
Триэтаноламин	Sigma	90278
Глицилглицин буфер	libios	B-GLYGLY250
Tween 40	Sigma	P1504
Tween 80	Sigma	P1754
Буфер Tris	VWR	33621,260
Этилендиамина тетраацетат	VWR	20302.180
HEPES	Sigma	H3375
Глутатион	Sigma	G6013
Аденин	Sigma	A8626
Пралин	Sigma	P0380
Треонин	Sigma	T8625
Глицин	Sigma	G7126
Метионин	Sigma	M9625
Серин	Sigma	S4500
Глицерин	VWR	24387.292
K₂SO₄	VWR	26994.293
KCl	VWR	26764.298
MgCl₂⋅6H₂O	Panreac	131396.1211
NaCl	VWR	27810.295
NaHCO₃	VWR	27778.260
NH₄Cl	VWR	21236.291
RPMI 1640 с L-глутамином и 25 мМ HEPES	Invitrogen	Старый индекс, приведенный в публикации Coleman (2003) индекс 61870036 => новый индекс 52400025
Пируват натрия MEM 100 мМ	Invitrogen	Старый индекс, приведенный в публикации Coleman (2003) индекс 11360070 => новый индекс 11360039

Затем среды стерилизовали путем фильтрования через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм.

Сначала осуществляли одностадийный способ предварительного культивирования в 1-литровой колбе Эрленмейера без перегородок, в течение 16 ч при 36°C с перемешиванием на 130 об/мин, засеивая 280 мл среды, описанной в примере 4, замороженными бактериями Haemophilus influenzae типа b, имеющими в своем генетическом коде по меньшей мере 2 копии локуса cap. Затем 9,5 мл предкультуры промывали в каждой из тестируемых культуральных сред перед засеванием для культивирования, которое проводится каждый раз в 500-мл колбе Эрленмейера из поликарбоната, с перегородкой, содержащей 170 мл испытуемой культуральной среды; культивирование проводили в течение 12 ч при 37°C и перемешивании на 150 об/мин. Каждый опыт проводили по меньшей мере 3 раза.

Для каждой среды каждый час измеряли D.O. при 694 нм и определяли концентрацию PRP в конце культивирования тем же способом, как описано в примере 3. Результаты по D.O. воспроизведены на фиг. 1.

Результаты определения PRP приведены в таблице X.

Таблица X
Через 12 ч	D.O. при 694 нм	PRP (мг/л)
Среда по изобретению	2,86±0,12	320±15
Talmadge	0,28±0,10	20±1
Butler	0,04±0,00	2±0
Wolin	0,04±0,00	6±0
Herriot Mic-cit	1,26±0,15	138±7
Herriot Mie	0,98±0,13	101±5
Klein MMA (cit)	0,38±0,01	40±2
Klein MME	0,20±0,03	27±1
Coleman	1,43±0,04	204±10

Пример 8. Получение PRP в промышленном масштабе (1000 л)

Готовили культуральную среду согласно изобретению, имеющую состав как в примере 1 за исключением цинка, концентрация которого составляет 20 мг/л вместо 5 мг/л. Действительно, пример 5 показал, что эта концентрация позволяла получить больше PRP без увеличения количества LPS.

Среда для предварительного культивирования и культивирования была одинаковой за исключением pH (начальный pH 7,2±0,1, затем произвольный pH для предкультур и установка pH на значение 6,7±0,1 для продуктовой культуры).

Среду готовили как в примере 1. После смешения соединений, предварительно растворенных в небольшом объеме очищенной воды, в некоторых случаях с добавлением кислоты или основания (ср. пример 1), и перед добавлением очищенной воды до 100% pH устанавливали на значение 7,2±0,1 для предкультур и на 6,7±0,1 для окончательной культуры (10 н. гидроксидом калия или натрия или 37%-ной HCl).

Затем среду стерилизовали путем фильтрования через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм.

Полученную так среду можно хранить 72 ч при 5°C.

Перед инокуляцией среды добавляли:

глюкозу 512,8 г/л, полученную из безводной глюкозы D(+), поставляемой компанией VWR под индексом 24379.294,

раствор NAD 1 г/л, поставляется компанией Sigma под названием β-никотинамид гидрата адениндинуклеотида (индекс 43410),

маточный раствор, содержащий протопорфирин в концентрации 0,25 г/л и гидроксид аммония в концентрации 5 мл/л; причем протопорфирин поставляется компанией Sigma Aldrich под названием протопорфирин IX динатриевая соль (индекс 258385), и гидроксид аммония компанией VWR под названием аммиачный раствор 28% (индекс 21190.292),

с получением среды, готовой к инокуляции и содержащей помимо элементов, описанных в таблице I из примера 1, дополнительные элементы в концентрациях, указанных в таблице II из примера 1 (за исключением глюкозы с конечной концентрацией 14,87 г/л вместо 14 г/л).

Способ в масштабе 1000 л содержал 3 серии предкультур:

первые предкультуры получали в колбе Эрленмейера на 1 л без перегородок, содержащей 290 мл полной культуральной среды, при 37°C, перемешивании на 130 об/мин, в течение 17-18 ч. Эти предкультуры инициировали путем инокуляции культуральной среды инокулятом бактерии Haemophilus influenzae типа b, содержащей по меньшей мере 2 копии локуса cap, со степенью инокуляции, соответствующей целевой начальной оптической плотности D.O. при 694 нм 0,014;

вторую серию предкультур получали в ферментере на 6,8 л. Два ферментера, содержащие 5,2 л полной культуральной среды, засеивали каждый 260 мл предкультуры из серии 1. Эти ферментеры поддерживали в течение 4 ч при 37°C±1°C, при начальном pH 7,2±0,2, парциальном давлении кислорода pO₂, удерживаемом на значении 30% согласно каскадной схеме, включающей усиление перемешивания (от 500 до 800 об/мин), затем повышение аэрации (от 0,5 до 2,5 л/мин) и затем увеличение расхода чистого O₂ от 0 до 6 л/мин;

третью серию предкультур получали в ферментере на 120 л, содержащем 57 л полной среды, которую засеивали 5,8 л предкультуры из серии 2. Этот ферментер поддерживали в течение 3 ч 10 мин при 37°C±1°C, при начальном pH 7,2±0,2, pO₂ удерживали на значении 30% согласно каскадной схеме, включающей усиление перемешивания (от 300 до 425 об/мин), затем повышение аэрации (от 6 до 28 л/мин) и затем увеличение расхода чистого O₂ от 0 до 50 л/мин.

Промышленное культивирование реализовали в ферментере на 1000 л, содержащем 778 л полной среды, которую засеивали 39 л предкультуры из серии 3. Этот ферментер поддерживали при 32°C±1°C, с установкой pH на значение 6,7±0,2 (2,5 н. раствором гидроксида натрия), pO₂ удерживали на 70% согласно каскадной схеме, включающей усиление перемешивания (от 100 до 230 об/мин), затем повышение аэрации (от 70 до 150 л/мин) и затем увеличение расхода чистого O₂ от 0 до 500 л/мин. Кроме того, при необходимости добавляли противовспениватель (Biospumex 4%-ный) в зависимости от уровня пены.

После 12 ч культивирования измеряли D.O. при 694 нм, что позволило определить биомассу (согласно соответствию одной единицы D.O. 0,64 г сухой биомассы). Определение концентрации PRP и LPS проводили, следуя протоколам, описанным в примерах 3 и 4.

Полученные результаты приведены в таблице XI.

Таблица XI
	Среда согласно изобретению (1 опыт)
D.O. при 694 нм	3,45
Биомасса, г сухой массы на литр культуральной среды	2,21
Концентрация PRP, мг/л культуральной среды	865
Удельная производительность, мг PRP на г биомассы	392
Концентрация LPS, мг/л культуральной среды	35,6
Отношение LPS/биомасса, мг/г биомассы	16,1
Отношение PRP/LPS, мг/мг	24,3

Эти результаты показали преимущество способа согласно изобретению для образования PRP и для отношения PRP/LPS, причем результаты продемонстрированы в промышленном масштабе.

1. Способ получения в промышленном масштабе капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b (PRP), предназначенного для вакцинальных целей, согласно которому культивируют штамм Haemophilus influenzae типа b (Hib) в культуральной среде, собирают супернатант культуры, который обрабатывают для экстрагирования капсулярного полисахарида, причем указанная культуральная среда содержит по меньшей мере:

один источник углерода,

протопорфирин,

соли,

аминокислоты,

никотинамид аденин динуклеотид или один из его предшественников,

витамины,

средства регулирования рН,

отличающийся тем, что культуральная среда не содержит сложного источника азота или углерода и содержит цинк в количестве, соответствующем ZnSO₄⋅7H₂O в концентрации от 2,5 до 80 мг/л.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные средства регулирования рН состоят из буферных солей.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный источник углерода выбран из глюкозы, фруктозы, галактозы, глицерина, ксилозы, рибозы, фукозы, сиаловой кислоты, лактата.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный протопорфирин представляет собой синтетический протопорфирин IX.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные соли выбраны из солей калия, магния, натрия, кальция, железа, цинка, кобальта и марганца.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанные соли выбраны из K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄⋅7H₂O, Na₂HPO₄⋅12H₂O, NaH₂PO₄⋅2H₂O, CaCl₂⋅2H₂O, FeSO₄⋅7H₂O, ZnSO₄⋅7H₂O, CoCl₂⋅6H₂O, MnSO₄⋅H₂O.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные аминокислоты выбраны из:

аргинина,

аланина,

по меньшей мере одного из аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты,

лизина,

гистидина,

триптофана,

валина,

изолейцина,

лейцина,

тирозина,

фенилаланина,

цистина.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная культуральная среда содержит по меньшей мере аргинин, аланин, гистидин, триптофан, тирозин, фенилаланин, цистин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная культуральная среда включает по меньшей мере:

аргинин,

аланин,

гистидин,

триптофан,

тирозин,

фенилаланин,

цистеин или глутатион,

аспарагиновую кислоту и

глутаминовую кислоту.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные витамины выбраны из тиамина, пантотената, урацила, пироксантина, биотина, рибофлавина и пиридоксина.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культуральная среда содержит цитруллин.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию конъюгирования полученного капсулярного полисахарида с белком-носителем.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию конъюгирования полученного капсулярного полисахарида со столбнячным анатоксином.

14. Применение капсулярного полисахарида, полученного по п. 1, для получения вакцинной композиции против заболеваний, вызываемых Haemophilus influenzae типа b.

15. Способ получения вакцинной композиции, согласно которому:

a) готовят в промышленном масштабе антиген к Haemophilus influenzae типа b (Hib), состоящий из капсулярного полисахарида (PRP), путем культивирования штамма Hib в среде, химическая структура и количество каждого из компонентов которой является известной(известным) и которая содержит по меньшей мере:

источник углерода,

протопорфирин,

соли,

аминокислоты,

никотинамид аденин динуклеотид или один из его предшественников,

витамины,

цинк в количестве, соответствующем ZnSCO₄⋅7Н₂О в концентрации от 2,5 до 80 мг/л,

а также средства регулирования рН,

b) собирают супернатант культуры, который обрабатывают для экстрагирования очищенного капсулярного полисахарида,

c) конъюгируют капсулярный полисахарид, полученный на стадии b), с белком-носителем.

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что белок-носитель представляет собой столбнячный анатоксин.

17. Способ по любому из пп. 15 или 16, отличающийся тем, что комбинируют конъюгат, полученный на стадии с), с по меньшей мере одним или несколькими антигенами, предназначенными для вакцинации против одной или нескольких следующих инфекций: дифтерии, столбняка, полиомиелита, гепатита В, ветряной оспы, свинки, краснухи, инфекций, вызванных Neisseria meningitidis или Streplococcus pneumoniae, инфекций, вызванных ротавирусом, для получения вакцинной комбинации, позволяющей одновременную иммунизацию от нескольких болезней

18. Способ получения вакцинной композиции по любому из пп. 15 или 16, отличающийся тем, что конъюгат, полученный на стадии с), комбинируют с антигенами дифтерии, столбняка, гепатита В.

19. Способ получения вакцинной композиции по любому из пп. 15 или 16, отличающийся тем, что конъюгат, полученный на стадии с), комбинируют с дифтерийным анатоксином, столбнячным анатоксином, бесклеточными антигенами Bordetella pertussis, представляющими собой анатоксин и нитевидный гемагглютинин.

20. Способ получения вакцинной композиции по любому из пп. 15 или 16, отличающийся тем, что конъюгат, полученный на стадии с), комбинируют с дифтерийным анатоксином, столбнячным анатоксином, бесклеточными антигенами Bordetella pertussis, представляющими собой анатоксин, пертактин и нитевидный гемагглютинин.

21. Способ получения вакцинной композиции по любому из пп. 15 или 16, отличающийся тем, что конъюгат, полученный на стадии с), комбинируют с дифтерийным анатоксином, столбнячным анатоксином, бесклеточными антигенами Bordetella pertussis, представляющими собой анатоксин, пертактин, агглютиногены и нитевидный гемагглютинин.

22. Способ получения вакцинной композиции по любому из пп. 15 или 16, отличающийся тем, что конъюгат, полученный на стадии с), комбинируют с дифтерийным анатоксином, столбнячным анатоксином, бесклеточными антигенами Bordetella pertussis, а также с инактивированными вирусами полиомиелита типа 1, 2 и 3.

23. Способ получения вакцинной композиции по любому из пп. 15 или 16, отличающийся тем, что конъюгат, полученный на стадии с), комбинируют с дифтерийным анатоксином, столбнячным анатоксином, гепатитом В, бесклеточными антигенами Bordetella pertussis, а также с инактивированными вирусами полиомиелита типа 1, 2 и 3.

24. Способ получения вакцинной композиции по любому из пп. 15 или 16, отличающийся тем, что конъюгат, полученный на стадии с), комбинируют с целой клеткой бактерии Bordetella pertussis.

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии, фармакологии и медицине. Предложено применение физиологического липополисахарида, продуцируемого штаммом фототрофной бактерии Rhodobacter capsulatus ВКМ ИБФМ РАН B-2381Д, в качестве нетоксичного фактора, усиливающего дифференцирующую активность 1α,25-дигидроксивитамина D3 при дифференцировке моноцитоподобных клеток в моноциты.

Иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы // 2636041

Изобретение относится к области биохимии. Предложен иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы.

Получение альгинатного гидрогеля с использованием липаз // 2631003

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу изготовления альгинатного гидрогеля с применением липазы, субстрата, гидролизуемого липазой, альгината и карбоната, высвобождающего двухвалентные катионы.

Способ получения низкомолекулярного хитозана и олигомеров хитозана // 2627870

Изобретение относится к области химии биополимеров. Описан способ получения низкомолекулярного хитозана и олигомеров хитозана методом химической деполимеризации, включающий гидролиз хитозана в присутствии кислоты с последующими фильтрацией, фракционированием, очисткой и сушкой продуктов, отличающийся тем, что гидролиз хитозана проводят 2,5-12,5% разбавленной азотной кислотой при температуре 70°С с последующим разделением гидролизата на две фракции - осадок низкомолекулярного хитозана и маточный раствор, далее из маточного раствора при добавлении изопропилового спирта и охлаждении осаждают олигомеры хитозана, затем оба продукта промывают изопропиловым спиртом и высушивают на воздухе, окончательно продукты деполимеризации хитозана перерастворяют в воде и высушивают лиофильно.

Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция // 2627156

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения капсульного полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы X, его конъюгат с белком-носителем и иммуногенная композиция на основе конъюгата для приготовления вакцин против менингита.

Штамм haemophilus influenzae spb тип в - высокоактивный продуцент капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата // 2624014

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, обладающий высокоактивной продуктивностью капсульного полисахарида полирибозилрибитолфосфата, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-7884.

Гидролиз целлюлозы с корректированием ph // 2609001

Настоящее изобретение относится к способу переработки лигноцеллюлозы и может быть использовано в химической промышленности. Предложенный способ включает подготовку лигноцеллюлозной биомассы, которая содержит первую твердую фракцию, содержащую целлюлозу и лигнин, первую жидкую фракцию; отделение указанной первой твердой фракции от указанной первой жидкой фракции; смешивание указанной первой твердой фракции с водой с образованием суспензии; где указанная суспензия имеет рН от рН 3,0 до рН 4,5; повышение указанного рН указанной суспензии на величину от 0,5 единицы рН до 5,0 единиц рН, чтобы получить суспензию со скорректированным рН; где указанная суспензия со скорректированным рН имеет рН от рН 5,0 до рН 8,0; необязательно, предварительное нагревание указанной суспензии со скорректированным рН до температуры, которая ниже критической точки воды; приведение указанной суспензии со скорректированным рН в контакт с текучим веществом для второй реакции, содержащим сверхкритическое или близкое к сверхкритическому текучее вещество, с получением реакционной смеси, которая содержит вторую твердую фракцию, содержащую лигнин; и вторую жидкую фракцию, содержащую растворимый С6-сахарид, выбранный из группы, состоящей из целлоолигосахаридов, глюкозы, галактозы, маннозы, фруктозы и их смесей; где указанное сверхкритическое или близкое к критическому текучее вещество содержит воду и, необязательно, СО2 при температуре, равной 300°С или выше, и давлении, по меньшей мере достаточно высоком для того, чтобы гарантировать, что все текучее вещество для второй реакции находится в жидкой фазе или сверхкритической фазе; и где указанное приведение указанной суспензии со скорректированным рН в контакт с указанным текучим веществом для второй реакции имеет длительность больше чем 2 секунды; необязательно, снижение температуры указанной реакционной смеси до температуры ниже 280°С; и необязательно, гидролиз указанной второй жидкой фракции с образованием С6-сахарида, выбранного из группы, состоящей из С6-олигосахарида, имеющего звенья с меньшей степенью полимеризации, глюкозы, галактозы, маннозы, фруктозы и их смесей.

Повышенный выход продукта растворимых с5-сахаров // 2609000

Настоящее изобретение относится к способу гидролиза лигноцеллюлозы и может быть использовано в химической промышленности. Предложенный способ включает предоставление фракционированной лигноцеллюлозной биомассы, содержащей фракцию твердых веществ, содержащую необязательно нерастворимый С5-олигосахарид, целлюлозу и лигнин, и первую жидкую фракцию при первой температуре не более 240°С, содержащую растворимые C5-сахариды, выбранные из C5-олигосахаридов, ксилозы, арабинозы, ликсозы, рибозы и их смесей; контактирование указанной первой жидкой фракции с твердым кислотным катализатором с образованием второй жидкой фракции при температуре не более 240°С; где указанная вторая температура меньше, чем указанная первая температура; где указанное контактирование сдвигает молекулярно-массовое распределение указанных растворимых C5-сахаридов к меньшей средней молекулярной массе; необязательно гидролиз указанной второй жидкой фракции с использованием кислоты или фермента с получением C5-сахаридов, выбранных из C5-олигосахаридов, содержащих меньше мономерных звеньев, ксилозы, арабинозы, ликсозы, рибозы и их смесей; где указанную фракционированную лигноцеллюлозную биомассу получают приведением указанной целлюлозной биомассы в контакт с первой реакционной жидкостью, содержащей горячую воду под давлением и необязательно диоксид углерода; где указанная первая реакционная жидкость дополнительно содержит кислоту, где указанная лигноцеллюлозная биомасса содержит древесину мягких пород; где указанная первая реакционная жидкость находится при температуре менее 100°С под давлением, достаточным для поддержания указываемой первой реакционной жидкости в жидкой форме.

Многостадийный гидролиз целлюлозы и быстрое охлаждение с использованием и без использования кислоты // 2608999

Настоящее изобретение относится к способам переработки лигноцеллюлозной биомассы. Предложенный способ включает подачу лигноцеллюлозной биомассы, включающей первую твердую фракцию целлюлозы и лигнина и первую жидкую фракцию; необязательно, разделение указанных твердой и жидкой фракций; смешение указанной твердой фракции с водой с образованием пульпы с предварительным нагреванием пульпы до 210°С-240°С при 225-250 бар; контактирование указанной пульпы со второй реакционной жидкостью с образованием второй реакционной смеси, включающей вторую твердую фракцию лигнина и вторую жидкую фракцию растворимого С6 сахарида, выбранного из С6 моносахаридов, С6 олигосахаридов и их смесей; где указанная вторая реакционная жидкость включает сверхкритическую воду и, необязательно, диоксид углерода и находится при температуре, по меньшей мере, 374,2°С и давлении, достаточном для поддержания указанной второй реакционной жидкости в сверхкритическом состоянии; понижение температуры указанной пульпы ниже 140°С; необязательно кислотный гидролиз указанной второй жидкой фракции с образованием композиции, включающей С6 сахарид, выбранный из С6 олигосахарида, имеющего меньшее число элементарных звеньев, глюкозы, галактозы, маннозы, фруктозы и их смесей.

Способ получения капсульного полисахарида с пневмококковым серотипом // 2606022

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения капсульного полисахарида с пневмококковым серотипом.

Способ продуцирования с2-оксигенатов путем ферментации с использованием серы с высокой степенью окисления // 2644239

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ продуцирования С2-оксигенатов путем анаэробной ферментации с использованием микробной культуры карбоксидотрофного микроорганизма.

Штамм бактерий pseudomonas plecoglossicida, осуществляющий биодеградацию перфтороктансульфоновой кислоты // 2644206

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D, обладающий способностью биодеградировать устойчивые токсичные соединения перфтороктансульфоновой кислоты (ПФОС), депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.

Способ получения модели ожирения животного // 2644204

Изобретение относится к способу получения модели ожирения животного. Способ предусматривает инокулирование аксенического животного бактерией Enterobacter cloacae, имеющей ген 16S рРНК, для получения инокулированного животного, где последовательность гена 16S рРНК представляет собой SEQ ID NO.1; и кормление инокулированного животного кормом, имеющим 34,9% содержания жира, в течение по крайней мере четырех недель для получения модели ожирения животного.

Способ управления процессом производства биомассы аэробных микроорганизмов // 2644193

Изобретение относится к автоматизации технологических процессов. Предложен способ управления процессом производства биомассы аэробных микроорганизмов.

Способ экспрессии // 2642324

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен способ получения белка протеазы посредством бактерии рода Bacillus путем введения в нее первой экспрессионной конструкции, которая кодирует целевой белок протеазу, и второй экспрессионной конструкции, которая кодирует отличную от целевого белка вспомогательную протеазу с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и дальнейшей экспрессии указанных протеаз в указанном микроорганизме.

Рекомбинантный продуцент омега-амидазы человека nit2 на основе escherichia coli // 2642323

Настоящее изобретение относится к биохимии и генетической инженерии, в частности к рекомбинантному штамму Escherichia coli BL21(DE3; pQE-Nit2). Указанный штамм получен путём трансформации штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной конструкцией pQE-Nit2, которая находится под контролем промотора фага Т5, и предназначен для получения ω-амидазы человека (Nit2) при культивировании на питательных средах на основе пептона, дрожжевого экстракта и глюкозы.

Набор штаммов бактерий, используемый для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики чумы // 2642322

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой набор, содержащий авирулентные штаммы Yersinia pestis подвида pestis биовара orientalis КМ 2011, подвида pestis биовара antiqua КМ 2008, КМ 2012, КМ 260 (12), КМ 130(3), подвида pestis биовара medievalis КМ 2010, КМ 2014, КМ 2024, подвида caucasica КМ 2013, штаммы Yersinia pseudotuberculosis КМ 2004, КМ 2005, КМ 2006, Yersinia enterocolitica КМ 2007 и штамм Pasteurella multocida КМ 2003, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

Пробиотические штаммы для лечения и/или профилактики диареи // 2642320

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ отбора пробиотического штамма Bacillus, включающий оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR или белка NHE3; пробиотический штамм Bacillus subtilis, вызывающий уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, депонированный в CNCM под регистрационным номером I-2745; клетки, полученные путем культивирования пробиотического штамма Bacillus, и композиция, содержащая эффективное количество клеток, для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота // 2642316

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма Brucella melitensis Rev-1. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота предусматривает посев и выращивание штамма Brucella melitensis Rev-1 на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина глубокой степени расщепления, экстракта дрожжей, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и агар-агар в заданном соотношении компонентов в течение 72 часов при 37°C.

Штамм lactobacillus, обладающий ингибирующей активностью против дрожжей и плесневых грибов (варианты), и его применение // 2642306

Группа изобретений относится к штаммам бактерий рода Lactobacillus, композициям на их основе и их применению. Предложены штамм бактерий Lactobacillus paracasei DSM 25832, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25833, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25834, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25835, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25836 и штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25837.

Лпс вакцина // 2637448

Группа изобретений относится к ветеринарии и касается вакцины для птиц и может быть использована для профилактики инфекций, вызываемых Salmonella. Композиция вакцины по изобретению включает в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от Salmonella, при условии, что указанная структура не содержит целую клетку, причем указанная структура, содержащая О-антиген, представляет собой липополисахарид, содержащий Липид А.