Способ получения полимер-композитного состава, содержащего наночастицы меди, и полимер-композитный состав, полученный этим способом

Группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии, а именно к способу получения полимер-композитного состава, состоящего из наночастиц меди в матрице гиперразветвленного полиэфирполиола третьей генерации на основе 2,2-дигидроксиметилпропановой кислоты с 32 гидроксильными группами, включающему стадии предорганизации ионов меди(II) в составе сульфата меди в матрице указанного полиэфирполиола в мольном соотношении CuSO₄:полиэфирполиол на первой стадии 1:16, выдерживания смеси при постоянном интенсивном перемешивании в течение 3 ч и восстановления реакционной смеси CuSO₄-полиэфирополиол 5%-ным водным раствором гидразин гидрата при рН 10 и перемешивании в течение 4 ч до появления устойчивой коричневой окраски; а также к полимер-композитному составу, полученному данным способом, который обладает антимикотической активностью против культур рода Candida, Aspergillus и Penicillium с возможностью подавлять активность протеиназ Candida albicans. Группа изобретений обеспечивает получение полимер-композитного состава в виде устойчивого коллоидного раствора. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.

 

Настоящее изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека, а именно к области ветеринарии и медицины, а также к области различных технологических процессов, а именно нанотехнологий.

Более конкретно, изобретение относится к способу получения полимер-композитного состава на основе наночастиц меди и гиперразветвленных (дендрито-подобных) полиэфирполиолов различных генераций, а также к полимер-композитному составу, полученному заявленным способом, который может быть использован в качестве активных основ антипротеиназных и антимикотических (противогрибковых) препаратов.

Биологически активные наночастицы металлов (Cu, Со, Mn, Mg, Zn, Mo, Fe, Ag) обладают биологической совместимостью по отношению к тканям и органам живых организмов и поэтому могут быть использованы в качестве основы антипротеиназных и антимикотических (противогрибковых) препаратов [1, 2]. Сравнительное изучение токсичности наночастиц, в том числе наночастиц меди, показало, что их токсичность намного ниже, чем ионов меди: наночастицы меди с диаметром 23,5 нм имеют ЛД50 413 мг/кг, а ионы (CuCl₂) 110 мг/кг [3]. Твердые наночастицы токсичнее, чем жидкие (коллоидные) [4], наночастицы вытянутой формы (например, нанотрубки) и в целом более опасны, чем сферические наночастицы [5, стр. 36]. Известно, что наночастицы диаметра от 30-40 до 200 нм могут пассивно аккумулироваться в опухолевых очагах, т.е. являются высокотоксичными, при этом наночастицы с диаметром менее 8 нм выводятся почками, частицы от 8 до 30 нм выводятся из кровяного русла печенью и через желчные протоки [4]. Таким образом, для целей биомедицинского применения необходимо получить коллоидные растворы (суспензии или эмульсии) наночастиц металлов со сферической формой частиц и размером частиц не более 30 нм.

Основной проблемой коллоидных систем (суспензий, эмульсий), содержащих наночастицы металлов, является протекание нежелательных процессов, связанных с высокой поверхностной активностью наночастиц, а именно они обладают свойством слипаться (агрегировать) между собой, вследствие чего теряются свойства биопроницаемости и биодоступности. Для реализации задач по их стабилизации существует ряд методов [6, 7, 8], в том числе применение веществ-стабилизаторов. Природа стабилизатора определяет стабильность и морфологию наночастиц (состав, форму, размер). Известно достаточно большое количество способов стабилизации наночастиц металлов: стабилизация неорганическими соединениями, стабилизация органическими кислотами и спиртами, природными полимерами, стабилизация в полимерной матрице, организованных мицеллярных средах поверхностно-активных веществ и т.д. [6]. Среди обозначенных классов соединений синтетические полимерные матрицы обладают следующими преимуществами для синтеза полимер-композитных наночастиц металлов: химическая природа и структура синтетических полимеров позволяют управлять формированием оболочки наночастиц металлов и их морфологией; происходит объединение свойства наночастиц с индивидуальными реологическими и механическими свойствами полимеров [6, 9].

Поэтому заявленное техническое решение ограничивается использованием в качестве стабилизаторов синтетических полимеров.

Задачей заявленного технического решения в целом является способ получения полимер-композитного состава, содержащего наночастицы меди, в среде нетоксичного полимера-стабилизатора для применения в области медицины и ветеринарии, а также полимер-композитный состав, полученный заявленным способом, со следующими свойствами:

- диаметр частиц - не более 30 нм;

- форма частиц - сферическая или близкая к сферической;

- фазовое состояние - коллоидный раствор;

- стабильность в течение не менее 12 месяцев;

- проявление антимикотической активности;

- проявление антипротеиназной активности по отношению к протеиназам Candida albicans.

Из исследованного уровня техники выявлены следующие аналоги.

Известны наночастицы меди и способ получения наночастиц меди в водной среде [10], сущностью является способ получения раствора, включающий растворение стабилизирующих компонентов в растворителе, помещение в полученный раствор стабилизатора наночастиц анода в виде медной пластины и катода, последующее электрохимическое растворение медного анода при пропускании через раствор стабилизированного постоянного тока, отличающийся тем, что в качестве растворителя применяют дистиллированную воду, а в качестве стабилизирующих компонентов используют органические и неорганические стабилизирующие компоненты (полигликоль, полиакрилат, желатин, поливинилпирролидон). Получена «водная среда, содержащая наночастицы меди». Наночастицы меди представляют собой агломераты атомарной меди размерами 1-100 нм, поверхность которых окружена слоем молекул полимеров-стабилизаторов, что позволяет достигать времени «жизни» системы вода/стабилизаторы/наночастицы меди не менее 12 месяцев.

Недостатком данной композиции является широкий диапазон распределения нанчастиц меди по размерам, вследствие чего затруднена возможность создания наночастиц меди для биомедицинского применения с размерами не более 30 нм, так как полезная (целевая) фракция наночастиц может составлять от 10 до 30%. Недостатком указанного способа является его многостадийность и сложное аппаратурное оформление.

Известен полимерный медьсодержащий композит и способ его получения [11], сущностью известной композиции является полимерный медьсодержащий композит, отличающийся тем, что композит состоит из однородных сферических конгломератов диаметром 50-200 нм с внедренными в них сферическими наночастицами меди диаметром 5-10 нм. Сущностью известного способа является получение однородных сферических конгломератов, в качестве предшественника используют медьсодержащую соль ароматической дикарбоновой кислоты, которую подвергают термическому разложению в инертной атмосфере при 450°С, полученный продукт охлаждают в инертной атмосфере с последующим выделением конгломератов композита последовательной обработкой полученного продукта селективными растворителями, при этом в качестве медьсодержащей соли используют нормальный фталат меди или кислый фталат меди, а в качестве селективных растворителей используют последовательно толуол, ацетонитрил и четыреххлористый углерод, с последующим отделением целевого продукта от растворителя и высушиванием его на воздухе.

Недостатком известного состава является твердофазное агрегатное состояние получаемых композитных составов, т.к. известный способ обеспечивает получение известного состава исключительно в виде порошков, кроме указанного получается широкое распределение агломератов по размеру (5-200 нм), при этом авторами утверждается наличие на поверхности полученных медных наночастиц графеновых образований. Кроме указанного, в известном техническом решении нет информации о наличии антимикотической и/или антипротеиназной активностей.

Недостатком известного способа является использование многостадийной очистки токсичными органическими растворителями, высокая температура синтеза, требующая специального аппаратурного оформления, а именно использования реакторов с возможностью поддержания атмосферы гелия, корундовых тиглей.

Из исследованного уровня техники известен коллоидный раствор наночастиц металла, нанокомпозиты металл-полимер и способы их получения [12], сущностью композиции является коллоидный раствор наночастиц металла, получаемый растворением соли металла и водорастворимого полимера в воде и/или неводном растворителе, далее реакционную емкость с полученным раствором продувают газообразным азотом или аргоном, после этого на получающийся в результате продукт воздействуют радиоактивным излучением, предпочтительно гамма-излучением, до дозы облучения 10-50 кГр, далее можно дополнительно разбавить раствор и обработать его ультразвуком. В качестве соли металла можно использовать нитрат, перхлорат, сульфат или ацетат меди. В качестве полимера берут поливинилпирролидон, сополимеры 1-винилпирролидона с акриловой или винилуксусной кислотами, со стиролом или с виниловым спиртом. В качестве неводного растворителя можно использовать метанол, этанол, изопропиловый спирт или этиленгликоль. При получении нанокомпозитов металл-полимер вместо водорастворимого полимера используют полимерный стабилизатор, например полиэтилен, полиакрилонитрил, полиметилметакрилат, полиуретан, полиакриламид или полиэтиленгликоль. В этом случае для получения эмульсии можно дополнительно ввести в реакционную емкость поверхностно-активное вещество. Коллоидный раствор стабилен в течение 10 месяцев с сохранением формы частиц и незначительным увеличением их размера. Свежеприготовленный коллоидный раствор содержит наночастицы металла размером не более 8 нм.

Недостатком известной композиции является тот факт, что в композите присутствуют токсичные соединения: полимеры (стирол, поливинилпирролидон, полиакрилонитрил, полиуретан и т.д.) и метанол. Недостатком известного способа получения является сложное аппаратурное оформление, связанное с использованием радиоактивного излучения, необходимость продувки азотом или аргоном.

Синтетические полимеры-стабилизаторы, используемые в получении нанокомпозитов для биомедицинского применения, должны быть биосовместимым, биоподобным и биодеградируемым. Этим требованиям удовлетворяют дендримерные и гиперразветвленные полиэфиры, полипропиленимины, полиамидоамины, содержащие спиртовые функционализирующие фрагменты в терминальных (периферических) положениях, которые применяются в качестве стабилизаторов для создания нанокомпозитов и стабилизации наночастиц металлов [13-18].

Использование метода химического восстановления в растворах [6] позволяет получать коллоидно-устойчивые композитные составы наночастиц металлов в среде дендримеров и гиперразветвленных полимеров.

Для синтеза наночастиц меди, стабилизированных дендримерами или гиперразветвленными полимерами методом химического восстановления в растворах из исследованного уровня техники известно:

- использование поли(амидоаминовых) дендримеров 4 поколения, функционализированных тиофеновыми дендронами. В качестве прекурсора использовались медьсодержащие дендримеры, в качестве способа получения использовался метод химического восстановления борогидридом натрия NaBH₄ [19]. Недостатком является отсутствие данных о стабильности, размерах, морфологии, антимикотической и антипротеиназной активностях синтезированных композитов;

- получение наночастиц меди, стабилизированных полиамидоаминовыми дендримерами с третьего по шестое поколение с триметильным ядром. Исходным медьсодержащим соединением является сульфат меди CuSO₄, соотношение концентраций соль меди:полимер составило 2:1 (для третьей генерации), 4:1 (для четвертой генерации), 8:1 (для пятой генерации), 16:1 (для шестой генерации), восстановитель - борогидрид натрия NaBH₄. Средний размер наночастиц меди в композитном составе 5,6 нм (для третьей генерации), 4,7 нм (для четвертой генерации), 3,6 нм (для пятой генерации), 3,2 нм (для шестой генерации) [20];

- использование полипропилениминовых дендримеров с диаминобутановым ядром с первого по пятое поколение [21] для синтеза полимер-содержащих композитов наночастиц меди с размерами наночастиц металла 1,6±0,3 нм.

Общими недостатками всех трех композитных составов являются вероятная загрязненность бором [22] и цитотоксичность используемых полимеров-стабилизаторов, вследствие чего указанные композитные составы не могут быть в принципе использованы в качестве активных основ для синтеза медицинских препаратов для лечения человека и животных [23], кроме указанного, в источниках отсутствуют данные о наличии антимикотической или антипротеиназной активности.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению по сущности является выбранный заявителем в качестве прототипа способ получения наночастиц меди, стабилизированных гиперразветвленными полимерами - гиперразветвленными полиэфирполиолами (ГРПО) второй, третьей и четвертой генераций [24]. Сущностью композиции является получение сферических полимер-композитных наночастиц меди с диаметром 4 нм и гексагональных композитных наночастиц меди с диаметром 12-26 нм. Сущностью способа получения наночастиц меди является приготовление насыщенного раствор полимера в 50%-ном водно-этанольном растворе (m_{полимера}=1,15-1,3 г), добавление к нему раствора 0,1 М сульфата меди, мольное соотношение CuSO₄:ГРПО = 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 34:1 при рН 8-9 и 1:20, 1:10, 1:5 с последующей ультразвуковой обработкой реакционной смеси и дальнейшим восстановлением соединения-предшественника (CuSO₄) гидразин гидратом (N₂H₄×H₂O) до появления темно-коричневого цвета.

Недостатком известного композитного состава, полученного при соотношении соль:полимер=5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 34:1, является твердофазное состояние, присутствие гексагональных агрегатов металлической меди и, вследствие указанного, его низкая агрегационная стойкость (не более 10 дней), а следовательно, невозможность применения для целей биомедицины, а также окисление наночастиц меди кислородом воздуха с образованием в качестве побочного продукта оксида меди Cu₂O и CuO. Кроме указанного, в материалах отсутствуют данные по количеству восстановителя (N₂H₄×H₂O), отсутствуют данные о рН среды, который является определяющим фактром при проведении процессов восстановления солей металлов данным реагентом [22], вследствие чего не представляется возможным осуществить оценку полученного состава и его морфологии, кроме указанного, отсутствует указание на временной интервал протекания реакции синтеза в известном способе.

Таким образом, целью заявленного технического решения является способ получения полимер-композитного состава, содержащего наночастицы меди, в среде нетоксичного полимера-стабилизатора для применения в области медицины и ветеринарии, а также полимер-композитный состав, полученный заявленным способом, со следующими свойствами:

- диаметр частиц - не более 30 нм;

- форма частиц - сферическая или близкая к сферической;

- фазовое состояние - коллоидный раствор;

- стабильность в течение не менее 12 месяцев;

- проявление антимикотической активности;

- проявление антипротеиназной активности по отношению к протеиназам Candida albicans.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве полимера-стабилизатора используется нетоксичный гиперразветвленный полиэфирполиол третьей генерации (ГРПО-Н30) на основе 2,2-дигидроксиметилпропановой кислоты [25], способный стабилизировать наночастицы металлов и в виде предорганизованного поверхностного слоя, и при инкапсулировании в полости или молекулярные агрегаты полимера [26].

ГРПО-Н30 представляет собой прогрессивно развивающуюся дендрито-подобную макромолекулу, содержащую четыре ветви со сложноэфирными и гидроксильными группами (Фиг. 1). Благодаря разветвленной структуре, молекулы ГРПО имеют в своем составе большое количество функциональных групп, обладают биодоступностью, биопроницаемостью и за счет присутствия сложноэфирных фрагментов обладают низкой токсичностью (ЛД₅₀=2000 мг/кг) [27, 28]. Возможность деградации полиэфирной структуры и терминальных фрагментов может обеспечиваться за счет процессов гидролиза [29-32].

Поставленная цель достигается также способом получения полимер-композитных наночастиц меди в виде коллоидного раствора методом химического восстановления в водно-органической среде, содержащей полимер-стабилизатор, в качестве медьсодержащего исходного соединения используется сульфат меди CuSO₄, при мольном соотношении CuSO₄:гиперразветвленный полиэфирполиол третьей генерации 1:16. В качестве восстановителя применяют гидразин гидрат N₂H₄×H₂O, образующий в ходе реакции восстановления в качестве побочного продукта только газообразный азот, по указанной причине полученные композитные частицы не содержат примесей в принципе.

Сущностью заявленного технического решения является способ получения полимер-композитного состава, состоящего из наночастиц меди в матрице гиперразветвленного полиэфирполиола третьей генерации на основе 2,2-дигидроксиметилпропановой кислоты с 32 гидроксильными группами, включающий стадию предорганизации ионов меди(II) в составе сульфата меди в матрице указанного гиперразветвленного полиэфирполиола в мольном соотношении CuSO₄:гиперразветвленный полиэфирполиол третьей генерации на первой стадии 1:16, выдерживание смеси при постоянном интенсивном перемешивании в течение трех часов, и выполнение стадии восстановления реакционной смеси CuSO₄-гиперразветвленный полиэфирполиол третьей генерации 5%-ным водным раствором гидразин гидрата (N₂H₄×H₂O), при рН 10 и постоянном перемешивании в течение четырех часов до появления устойчивой коричневой окраски полимер-композитного состава. Полимер-композитный состав, полученный способом по п. 1, обладает антимикотической активностью против культур рода Candida, Aspergillus и Penicillium с возможностью подавлять активность протеиназ Candida albicans.

В качестве полимерной матрицы применяют гиперразветвленный полиэфирполиол третьей генерации на основе 2,2-дигидроксиметилпропановой кислоты ГРПО-Н30 (32 гидроксильные группы, М_{r (теор)}=3608 г/моль, гидроксильное число 480-520 мг КОН /г) Sigma Aldrich Cas №: 326794-48-3.

Заявленное техническое решение поясняется Фиг. 1-5 и Таблицей.

На Фиг. 1 приведена структура ГРПО третьей (ГРПО-Н30) генерации.

На Фиг. 2 приведены электронные спектры растворов ГРПО H-30, CuSO₄ и смеси CuSO₄-ГРПО-Н30 через 1 час и через 3 часа после смешения. Смещение полосы поглощения в электронном спектре растворов, содержащих смесь CuSO₄-ГРПО-Н30 относительно полосы поглощения раствора индивидуальной соли CuSO₄ (810 нм), указывает на протекание процесса предорганизации ионов меди(II) в матрице ГРПО-Н30. В результате изменяется химическое окружение иона Cu(II) и, соответственно, энергия электронных d-d переходов в нем. Наибольшее смещение полосы поглощения раствора, содержащего смесь CuSO₄-ГРПО-Н30 наблюдается через 3 часа (полоса поглощения смеси CuSO₄-ГРПО-Н30 при 764 нм). Данные спектры демонстрируют факт завершения предорганизации ионов Cu(II) в матрице ГРПО-Н30 через три часа после смешивания.

На Фиг. 3 приведена микрофотография, сделанная методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) полимер-композитного состава Cu/ГРПО-Н30. Методом ПЭМ установлено, что наночастицы Cu/ГРПО-Н30 представляют два типа сферических частиц, размер которых 8±4 нм и 20±5 нм.

На Фиг. 4 представлены электронные спектры поглощения растворов полимер-композитного состава Cu/ГРПО-Н30 через 1 сутки (Фиг. 4а) и через 12 месяцев после осуществления синтеза (Фиг. 4б). Присутствие наночастиц в полимер-композитном составе подтверждено методом спектрофотометрии, в электронных спектрах поглощения присутствует полоса плазмонного резонанса с максимумами в области 585 нм, характерная для сферических наночастиц металлической меди [36].

На Фиг. 5 приведены фотографии чашек Петри, в которых расположены диски, пропитанные композитным составом Cu/ГРПО-Н30 (в чашке Петри соответствует образцам 6 и 7 - параллельные опыты) и видны зоны лизиса, диаметр которых использован для оценки фунгицидной активности дискодиффузионным методом по отношению к культурам рода Penicillium ochro-chloron, Aspergillus niger, Paecilomyces variotii, Trichoderma viride, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae [37], при этом следует обратить внимание на то, что с другими заявленными культурами (Candida albicans, Candida tropicalis) фотографии чашек Петри не представлены вследствие затруднений при визуализации (изображения получаются засвеченными), в этой связи для данных культур представлен только диаметр зоны лизиса в Таблице.

В Таблице приведены данные по каталитической активности (A_SAP) коктейля секреторных аспарагиновых протеиназ (SAP2 и SAP4 - протеиназ) Candida albicans (C. alb.) по отношению к гемоглобину (Hb) в присутствии в Cu/ГРПО-Н30 (c_SAP2=3,7×10^-7 моль/л, c_SAP4=1,19×10^-12 моль/л, c_Hb=2×10^-6 моль/л, рН 4,2, время инкубации системы [SAP C. alb - Hb] равно 25 мин). В результате ферментативного протеолиза субстрат (гемоглобин) подвергается гидролизу и разрушается до олигопептидов или аминокислот. Водные растворы наночастиц Cu/ГРПО-Н30 использовались в диапазоне концентраций 1×10^-8-1×10^-4 мг/мл, приведены данные по эффекту ингибирования (уменьшения) каталитической активности (A_SAP) коктейля секреторных аспарагиновых протеиназ (SAP-протеиназ) Candida albicans, доказывающие, что полимер-композитные наночастицы Cu/ГРПО-Н30 обладают антипротеиназной активностью;

приведены данные по фунгицидной активности [37], проявляемой Cu/ГРПО-Н30 по отношению к культурам рода Candida albicans, Candida tropicalis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Paecilomyces variotii, Penicillium ochro-chloron, Trichoderma viride.

Заявленное техническое решение реализовано на практике следующим путем.

Получение полимер-композитных наночастиц меди, стабилизированных гиперразветвленным полиэфирполиолом (ГРПО) третьей генерации (Cu/ГРПО-Н30)

Для получения полимер-композитных наночастиц меди, стабилизированных гиперразветвленным полиэфирполиолом (ГРПО-Н30) третьей генерации (Cu/ГРПО-Н30), берут 10 мл 0,016 мМ раствора ГРПО-Н30 третьей генерации в 50%-ном водно-этанольном растворе, смешивают с 2 мл 0,005 мМ раствора сульфата меди (CuSO₄) в дистиллированной воде, выдерживают 3 ч при постоянном интенсивном перемешивании. Данное время необходимо для осуществления стадии предорганизации ионов меди в матрице полиэфирополиола ГРПО-Н30 (Фиг. 2).

Далее в реакционную смесь CuSO₄-ГРПО-Н30 добавляют водный раствор NaOH с концентраций 0,1 М до установления значения рН 10, затем добавляют 1 мл 5%-ного водного раствора гидразин гидрата (N₂H₄×H₂O) (добавление производится порциями по 0,01 мл каждые 15 с) при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки, затем смесь перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре до появления устойчивой коричневой окраски полимер-композитного состава наночастиц меди Cu/ГРПО-Н30. Поддержание рН смеси при восстановлении в значении рН 10 позволяет провести наиболее полное восстановление соли CuSO₄ гидразин гидратом N₂H₄×H₂O, так как при данном рН восстановитель имеет наиболее отрицательное значение окислительно-восстановительного потенциала в растворе [22]. Изменение рН приведет к загрязнению полимер-композитного состава наночастиц меди Cu/ГРПО-Н30 исходной солью CuSO₄. Перемешивание в течение 4 часов позволяет полностью завершить восстановительные процессы в системе, способствует равномерному распределению наночастиц меди в среде гиперразветвленного полиэфирполиола с образованием сферических полимер-композитных наночастиц Cu/ГРПО-Н30 с размерами не более 30 нм. Уменьшение или увеличение времени перемешивания приводит к изменению геометрии и увеличению размеров композитных наночастиц, что делает их не пригодными для целей применения в медицине и ветеринарии.

Присутствие в полимер-композитном составе наночастиц Cu/ГРПО-Н30 доказано методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). По данным метода ПЭМ наночастицы меди в полимер-композитном составе Cu/ГРПО Н-30 имеют сферическую форму и диаметр 8±4 нм и 20±5 нм (Фиг. 3).

Присутствие и стабильность полимер-композитных наночастиц Cu/ГРПО-Н30 подтверждено методом спектрофотометрии (Фиг. 4а). В электронных спектрах поглощения растворов наночастиц Cu/ГРПО Н-30 присутствует полоса плазмонного резонанса в области 585 нм, что подтверждает наличие металлических наночастиц меди сферической формы [33]. Коллоидный раствор образца полимер-композитных наночастиц меди стабилен в течении 12 месяцев, на что указывает неизменность в течение этого срока интенсивности, положения и формы полосы плазмонного резонанса в электронных спектрах поглощения в растворах образца (Фиг. 4б).

Для проведения испытаний на противогрибковую активность использовали штаммы, поддерживаемые в коллекции ФГУН «Казанский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора РФ»: Candida albicans Y-4, Candida tropicalis Y-7, а также Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Trichoderma viride, Penicillium ochro-chloron, Paecilomyces variotii. Скрининговые исследования антимикотической активности соединений проводили аппликационным дискодиффузионным методом на модифицированном агаре Сабуро [34]. Посевы тест-культур (суспензию спор) наносят из расчета 1 млн КОЕ/чашка. Исследуемые вещества растворяют в легколетучих растворителях (этанол, ацетон) для получения 10%-ного раствора. Полученный раствор наносят на бумажные стерильные диски. Диски высушивают в стерильных условиях до полного удаления растворителя и помещают в чашку с культурой. Посевы инкубируют в течение 2-4 суток при 28°С [35]. Для контроля обрастания культуры с дисками выдерживают до 7 суток. Зона задержки роста 1-3 мм соответствует слабой фунгицидной активности; 3-5 мм - умеренной активности; ≥5 мм соответствует высокой активности. В качестве отрицательного контроля использовали диски без препаратов, обработанные растворителем аналогичным образом. В качестве положительных контрольных опытов использовали диски с противогрибковым препаратом «Нистатин».

Установлено, что полимер-композитные наночастицы меди Cu/ГРПО-Н30 обладают антимикотической активностью по отношению к культурам Candida albicans, Candida tropicalis, Aspergillus fumigatus, Penicillium ochro-chloron, Aspergillus niger, Paecilomyces variotii, Trichoderma viride, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae (Фиг. 5, Таблица).

Для оценки антипротеиназной активности полимер-композитных наночастиц Cu/ГРПО Н-30 использовали коктейль секреторных аспарагиновых протеиназ Candida albicans индуцируемого (SAP2 C. alb.) (Mr=53680 Да) (Protein Date Bank: doi: 10.2210/pdb 1zap/pdb) и конститутивного типа (SAP4 C. alb) (Mr=42820 Да) (Protein Date Bank: doi: 10.2210/pdb 2qzx/pdb) [36], выделенных из надосадочной жидкости при выращивании патогенных дрожжеподобных грибов Candida albicans (C. alb.), с последующим центрифугированием биомассы и переосаждением этанолом по оригинальной методике, разработанной в лаборатории грибковых аллергенов ФГУН «Казанский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора РФ» [37-40]. Исходный антиген C. alb. был получен центрифугированием биомассы гриба C. alb., выращенного в течение 48 часов при 30°С. Для определения чистоты и молекулярной массы протеиназ использовали гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (Ds-Na) в денатурирующих условиях при 100°С на установке АВГЭ - 1 р/к «Хийу калур» (Эстония) в 4,5 и 9,0% полиакриламидном геле при рН 8,3. Нагрузка белка-метчика на одну дорожку составляла 20 мкг, нагрузка SAP - 30-50 мкг. Электрофорез проводили при 20°С в течение 90 мин при силе тока 45 мА. Гели окрашивают в течение 30 мин в растворе кумасси бриллиантового голубого G-250 и отмывают в течение суток в растворе 5%-ной уксусной кислоты. Концентрацию лиофилизированной формы фермента определяют исходя из его подобности к антигену C. alb. методом вольтамперометрии с помощью иммуноферментного сенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы и антител к антигену C. alb. [41]. Исходная концентрация SAP2 составила 7,26×10^-6 моль/л, SAP4 – 5,9×10^-9 моль/л. Для работы использовали протеиназный коктейль, содержащий растворы SAP2 с концентрацией 7,26×10^-7 моль/л, SAP4 – 5,9×10^-10 моль/л, приготовленные методом последовательного разбавления. Растворы хранили не более суток.

В качестве субстрата использовали бычий гемоглобин (Hb) «АГАТ-МЕД», c_Hb=120 г/л (с содержанием железа не менее 0,3%, Mr=64250 Да). Растворы субстрата получают методом последовательного разбавления и хранят при температуре +4-5°С не более одних суток. Рабочая концентрация Hb - 2,0×10^-6 моль/л. Активность фермента (A_SAP) определяют в стандартных условиях по увеличению скорости каталитической реакции по сравнению с некаталитической. Скорость реакции указывали как изменение концентрации субстрата (мг/л) за единицу времени (мин). В мерную колбу на 5 мл вводят 0,52 мл раствора гемоглобина (Hb) с концентрацией 1,91×10^-5 моль/л (c_Hb в рабочем растворе - 2×10^-6 моль/л или 123×10³ мкг/л); 0,1 мл SAP C. alb. (концентрация в исследуемом растворе 3,70×10^-7 моль/л для индуцируемой протеиназы и 1,19×10^-12 моль/л для конститутивной). Доводят до метки буферным раствором с рН 4,20. Раствор перемешивают и переносят в кварцевую спектрофотометрическую кювету. После инкубирования в течение 25 мин при Т=36,60±0,01°С регистрируют электронный спектр поглощения полученного раствора в области длин волн 190-900 нм и измеряют интенсивность полосы поглощения при длине волны λ=406 нм. Оставшуюся после взаимодействия с протеиназой C. alb. в растворе концентрацию субстрата определяют по градуировочному графику зависимости величины поглощения от концентрации Нb, описываемому уравнением:

Y=(0,17±0,09)+(409195,79±27211,89)×c_Hb R=0,98912.

В качестве растворов сравнения использовали растворы без субстрата.

Активность фермента определяли по формуле:

,

где А - активность, c_Hb - концентрация гидролизовавшегося Hb (мг/л), t - время (мин), .

Доказано, что в присутствии раствора полимер-композитных наночастиц Cu/ГРПО-Н30 в диапазоне концентраций 1×10^-8-1×10^-4 мг/мл каталитическая активность секреторных аспарагиновых протеиназ Candida albicans в системе [SAP C. alb - Hb] уменьшается, таким образом проявляется эффект ингибирования (Таблица). Максимальный эффект ингибирования наблюдается при концентрации Cu/ГРПО-Н30 1×10^-5 моль/л 83%.

Таким образом, заявленным техническим решением поставленная цель достигнута полностью: разработан способ получения полимер-композитного состава, содержащего наночастицы меди, в среде нетоксичного полимера-стабилизатора для применения в области медицины и ветеринарии, а также полимер-композитный состав, полученный заявленным способом, со следующими свойствами:

- диаметр частиц - не более 30 нм;

- форма частиц - сферическая или близкая к сферической;

- фазовое состояние - коллоидный раствор;

- стабильность в течение не менее 12 месяцев;

- проявление антимикотической активности;

- проявление антипротеиназной активности по отношению к протеиназам Candida albicans.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как на дату предоставления заявочных материалов заявителем из подвергнутых анализу источников патентной и не патентной информации РФ и стран зарубежья не выявлена заявленная совокупность признаков способа получения композитных составов на основе наночастиц меди, а также композитные составы с идентичными заявленному техническому решению свойствами.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», т.к. совокупность заявленных признаков обеспечивает реализацию всех поставленных целей и обеспечивает возможность получения более чем полутора десятков неочевидных для специалиста технических результатов.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «промышленная применимость», т.к. в результате испытаний получено подтверждение возможности реализации всех заявленных целей и выявлена возможность создания новых, более эффективных методов диагностики в области медицины и ветеринарии с применением заявленного технического решения.

Используемая литература

1. Кобаяси Н. Введение в нанотехнологию // М.: Бином. Лаборатория знаний, 2007. - 134 с.

2. Арсентьева И.П., Глущенко Н.Н., Павлов Г.В., Фолманис Г.Э. Использование биологических активных препаратов на основе наночастиц металлов в медицине и сельском хозяйстве // Доклад на совещании: «Индустрия наносистем и материалы: оценка нынешнего состояния и перспективы развития». - Москва, Центр «Открытая экономика». - 2006 г.

3. Chen Z. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo // Toxicology Letters. - 2006. - Vol. 163, Iss. 2. - P. 109-120.

4. Чугунов A.O. Невидимая граница: где сталкиваются "нано" и "био" / А. Чугунов // Косметика и медицина. - 2010. - N 1. - С. 12-24.

5. Андреев Г.Б., Минашкин В.М., Невский И.А., Путилов А.В. Материалы, производимые по нанотехнологиям: потенциальный риск при получении и использовании // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). - 2008. - Т. LII, №5. - С. 32-38.

6. Помогайло А.Д. Наночастицы металлов в полимерах / А.Д. Помогайло, А.С. Розенберг, И.Е. Уфлянд // М.: Химия. - 2000. - 672 с.

7. Сергеев Г.Б. Нанохимия // М.: Изд-во МГУ, 2003. - 286 с.

8. Гусев А.И. Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии // М.: Физматлит, 2005. - 416 с.

9. С.А. Войциховская, М.Е. Соколов, В.Т. Панюшкин, В.Г. Власенко, Я.В. Зубавичус. Локальная атомная структура наночастиц кобальта в полимерной матрице // Журнал неорганической химии. - 2015. - Т. 60, №2. - С. 259-265.

10. Патент РФ №2410472.

11. Патент РФ №2528981.

12. Патент РФ №2259871.

13. Gao С., Yan D. Hyperbranched polymers: from synthesis to applications // Progress in polymer science. - 2004. - Vol. 29. - 183-275.

14. Yates C.R. Synthesis and applications of hyperbranched polymers / C.R. Yates, W. Hayes // Eur. Polym. J. - 2004. - Vol. 40, №7. - P. 1257-1281.

15. Inoue K. Functional dendrimers. hyperbranched and starpolymers // Progress in polymer science. - 2000. - Vol. 25. - 453-571.

16. Wang S.J., Brechbiel M., Wiener E.C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropylenimine dendrimers, generation 2 // Invest. Radiol. - 2003.- Vol. 7. - 572-579.

17. Labieniec M., Watala С РАМАМ dendrimers - diverse biomedical application / Facts and unresolved questions // Central European Journal of Bioligy. - 2009. - Vol. 4, I. 4. – p. 434-451.

18. Dendritic Supermolecules - Towards Controllable Nanomaterials - [86 refs.]. - (SMITH D.K.; Chem. Commun. (Cambridge) 2006 - V. 1. - P. 34-44.

19. Deng S., Locklin J., Patton D., Baba A. and Advincula R.C. Thiophene Dendron Jacketed Poly(amidoamine) Dendrimers: Nanoparticle Synthesis and Adsorption on Graphite // Journal of the American Chemical Society. 2005. V. 127. №6. P. 1744-1751.

20. L. Jin, S.-P. Yang, Q.-W. Tian, H.-X. Wu, Y.-J. Cai. Preparation and characterization of copper metal nanoparticles using dendrimers as protectively colloids. Materials Chemistry and Physics. - 2008. - Vol. 112. - No. 3. - P. 977-983.

21. Floriano P.N., Noble C.O., Schoonmaker J.M., Poliakoff E.D. and McCarley R.L. // Cu(0) Nanoclusters Derived from Poly(propylene imine) Dendrimer Complexes of Cu(II). Journal of the American Chemical Society. 2001. V. 123. №43. P. 10545-10553.

22. Солдатенко E.M., Доронин С.Ю., Чернова P.K. Химические способы получения наночастиц меди // Бутлеровские сообщения. - 2014. - Т. 37, №2. - С. 103-113.

23. Reul, J. Nguyen, Т. Kissel. Amino-modified hyperbranched polyesters as non-toxic, biodegradable gene delivery systems. Biomaterials, 30 (2009), 5815-5824.

24. Кутырева M.П. Биохимическая активность композиционных составов наночастиц биофильных металлов и гиперразветвленных полиэфирополиолов / М.П. Кутырева, А.Р. Гатаулина, О.И. Медведева, И.И. Стоиков, Н.А. Улахович // Бутлеровские сообщения. - 2013.- Т. 34. - №6. - С. 1-8.

25. Bosman A.W., A.P.H.J. Schenning, R.A.J. Janssen, E.W. Meijer. Recueil Chem. Ber., M., Dong H., Tang B.Z. // Inorganic and Organometallic Macromolecules: Design and applications. - 2008. - P. 21-35.

26. Бронштейн Л.М., Шифрина З.Б. Наночастицы в дендримерах: от синтеза к применению // Российские нанотехнологии. - 2009. - Т. 4, №9-10. - С. 32-55.

27. Arce Е., Nieto P., Diaz V., Castro R.G., Bernard A., Rojo J. // Bioconjugate Chem. - 2003. - V. 14. - I. 4. - P. 817.

28. Zou J., Shi W., Wang J., Bo J. // Macromol. Biosci. - 2005. - V. 5. - I. 7. P. 662.

29. Jiang H.L., Zhu K.J. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a new family of alternate poly(ester-anhydrides) based on aliphatic and aromatic diacids // Biomaterials. - 2001. - V. 22. - P. 211-218.

30. Arshady R. Biodegradable Microcapsular Drag Delivery Systems: Manufacturing Methodology, Release Control and Targeting Prospects // J. Bioact. Compat. Polym. - 1990. - V. 5, I. 3. - P. 315-342.

31. Dunne M., Corrigan O.I., Ramtoola Z. Influence of particle size and dissolution conditions on the degradation properties of polylactide-co-glycolide particles // Biomaterials. - 2000. - Vol. 21. I. 16. - P. 1659-1668.

32. Chao Gao, Yimin Xu, Deyue Yan, Wei Chen Water-soluble degradable hyperbranched polyesters: novel candidates for drug delivery? // Biomacromolecules. - 2003. - Vol. 4. - P. 704-712.

33. Б.Г. Ершов. Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические и каталитические свойства.// Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). - 2001. - T. XLV. - №3. - С. 20-30.

34. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник / С.М. Семенов // Москва: Агропромиздат, 1990. - 240 с.

35. Градова Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии / Н.Б. Градова, Е.С. Бабусенко, И.Б. Горнова // Москва: ДеЛи принт, 2004. - 113 с.

36. Abad - Zapatero С. Structure of a secreted aspartic protease from Candida albicans with a potent inhibitor: implications for the design of antiful agents / C. Abad - Zapatero, R. Goldman, S.W. Muchmore, С. Hutchins, J. Stewar, C.D. Payne, T.L. Ray // Protein Sci. - 1996. - Vol. 5, I. 4. - P. 640-65

37. White T.C. Three distinct secreted aspartic proteinases in Candida albicans / T.C. White, S.H. Miyasaki & N. Agabian // J. Bacterion. - 1993. - V. 175, I. 19. - P. 6126-6133.

38. Borg-Von Zepelin M. The expression of the secreted aspartic proteinases SAP4 to SAP6 from Candida albicans in murine macrophages / M. Borg-Von Zepelin // Mol Microbiol. - 1998. - V. 28. - P. 543-554.

39. Шварценбах Г. Комплексонометрическое титрование / Г. Шварценбах, Г. Флашка // Москва: Химия, 1970. - 360 с.

40. Методы экспериментальной микологии. Справочник // Киев: «Наукова думка», 1982. - 340 с.

41. Кутырева М.П. Определение антигена Candida albicans с помощью амперометрического иммуноферментного сенсора / М.П. Кутырева, Э.П. Медянцева, Е.В. Халдеева, Г.К. Будников, Н.И. Глушко // Вопросы медицинской химии. - 1998. - Т. 44, №2. - С. 172-178.

1. Способ получения полимер-композитного состава, состоящего из наночастиц меди в матрице гиперразветвленного полиэфирполиола третьей генерации на основе 2,2-дигидроксиметилпропановой кислоты с 32 гидроксильными группами, включающий стадию предорганизации ионов меди(II) в составе сульфата меди в матрице указанного гиперразветвленного полиэфирполиола в мольном соотношении CuSO₄:гиперразветвленный полиэфирполиол третьей генерации на первой стадии 1:16, выдерживание смеси при постоянном интенсивном перемешивании в течение трех часов, и выполнение стадии восстановления реакционной смеси CuSO₄-гиперразветвленный полиэфирополиол третьей генерации 5%-ным водным раствором гидразин гидрата (N₂H₄×H₂O) при рН 10 и постоянном перемешивании в течение четырех часов до появления устойчивой коричневой окраски полимер-композитного состава.

2. Полимер-композитный состав, полученный способом по п. 1, обладающий антимикотической активностью против культур рода Candida, Aspergillus и Penicillium с возможностью подавлять активность протеиназ Candida albicans.