Флуоресцентный способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом

Авторы патента:

G01N33/52 - использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

Владельцы патента RU 2647834:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) (RU)

Изобретение относится к области биофизики, а именно к медицинской физики, и описывает способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), в частности прогнозирования рисков возникновения лекарственной резистентности при проведении химиотерапии у пациентов с ОЛЛ с помощью исследования свойств биологических жидкостей физическими методами. Флуоресцентный способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, включающий забор крови до и после химиотерапии, выделение флуоресцентного макро-биомаркера эффективности химиотерапии, отличается тем, что макро-биомаркером является концентрация аденозин-трифосфата (АТФ), которую определяют автоматизировано, с помощью лазерного конфокального микроскопа, путем подсчета интенсивности флуоресценции макро-биомаркера, и при концентрации АТФ 1,04±0,14 мг/мл не наблюдается риск развития гепатотоксических эффектов в данный момент времени, при концентрации АТФ 0,8±0,112 мг/мл наступает апоптоз клеток, при концентрации АТФ 0,312±0,042 мг/мл наступает некроз клеток. 1 табл.

Изобретение относится к области биофизики, а именно к медицинской физики, и описывает способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), в частности прогнозирования рисков возникновения лекарственной резистентности при проведении химиотерапии у пациентов с ОЛЛ с помощью исследования свойств биологических жидкостей физическими методами. Способ включает в себя определение и оценку количественных уровней концентрации аденозинтрифосфата (АТФ), в клетках крови, методом лазерной конфокальной микроскопии, после получения курса химиотерапии пациентом. Изобретение может быть использовано в онкологии, в клинической лабораторной практике для индивидуального прогнозирования эффективности химиотерапии при лечении острых лимфобластных лейкозов у детей.

Известно изобретение «Способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей» (патент РФ №2542505, 2013 г., G01N 33/49), содержащее сходный с используемым в заявленном способе принцип выбора молекулярных маркеров химиочувствительности новообразований.

Недостатком этого способа является то, что с его помощью не представляется возможным производить работу с флуоресцентными маркерами, а именно обеспечивать их использование для определения концентраций АТФ в клетках крови, и, как следствие, производить оценку степени гепатотоксических эффектов и степени лекарственной резистентности, необходимых для индивидуализации химиотерапии (и ее эффективности) у пациентов.

За прототип изобретения выбран способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными опухолями эпителиальных тканей, включающий в себя исследование крови до и после лечения с количественным определением содержания CD50⁺ антигена (Алясова А.В. Клинико-неврологические и клинико-иммунологические характеристики рака молочной железы: Автореферат диссертации д.м.н., Иваново, 2004, 43 с.).

Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводят с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции. Для выделения мононуклеарных клеток периферической крови гепаринизированную кровь, разведенную на 1/3 средой 199, наслаивают на градиент фиколл-верографина (9 объемов крови на 3 объема градиента) и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 40 минут при 20°C. Мононуклеарные клетки собирают из интерфазы, а затем трижды отмывают средой 199. При этом центрифугируют в течение 20 минут при 1200 об/мин.

На обезжиренное предметное стекло, предварительно покрытое парафилмом фирмы American Can Company, имеющим круглые перфорации диаметром 7 мм, наносят по 20-50 мкл поли-L-лизина Serva в концентрации 50 мкг/мл. Предметное стекло помещают на 30 минут в термостат при температуре 37°C. Затем его отмывают физиологическим раствором, забуференным 0,01 молярным фосфатным буфером pH 7,4. Суспензию клеток в концентрации 2-10⁶ кл/мл наносят по 40 мкл в лунки на предметное стекло. Предметное стекло выдерживают 30 минут при 37°C во влажной камере. Затем не прикрепившиеся к стеклу клетки отсасывают пипеткой и наносят в лунки раствор моноклональных антител (МКА) объемом 40 мкл. В контрольных образцах клетки обрабатывают физиологическим раствором взамен МКА.

Вновь инкубируют стекла при 37°C во влажной камере в течение 30 минут, после чего отмывают их в пяти порциях физиологического раствора с фосфатным буфером pH 7,4. На отмытые клетки наслаивают по 40 мкл ФИТЦ-меченных фрагментов козьих антител против мышиных иммуноглобулинов производства НПК Препарат и стекла инкубируют на льду во влажной камере в течение 30 минут. Затем стекла промывают в пяти порциях физиологического раствора с фосфатным буфером pH 7,4, заливают 50%-ным глицерином в физиологическом растворе и препарат закрывают предметными стеклами. Просмотр препаратов проводят с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И2. Учитывают свечение при увеличении объектива × 40-100, окуляра × 2,5-10. Люминесценцию клеточной поверхности регистрируют визуально. В препарате просчитывали 200-300 клеток. Учитывают общее количество клеток и антиген-положительных клеток. Затем подсчитывают относительное содержание антиген-положительных клеток.

В результате проведенных исследований было показано, что изменение содержания CD50⁺ клеток является устойчивым признаком, позволяющим прогнозировать исход заболевания. Снижение уровня этой популяции по окончании лечения не менее чем в 1,2-1,6 раза, по сравнению с ее содержанием перед 1 курсом ПХТ, особенно на фоне угнетения иммунологической реактивности, свидетельствует о неэффективности проводимой терапии, возможности развития рецидива заболевания в ближайшие 4-5 месяцев или прогрессирования процесса на фоне введения цитостатиков. Напротив, в случаях повышения в процессе лечения исходно сниженного количества CD50⁺ клеток отмечалось развитие стойкой ремиссии болезни.

Несовершенство этого способа заключается в недостаточной его автоматизации, а именно ручной подсчет клеток и антиген-положительных клеток, что может приводить к ошибкам. Другим недостатком способа является невозможность непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.

Задачей предлагаемого изобретения является создание флуоресцентного способа для прогнозирования эффективности химиотерапии у больных с острыми лимфобластными лейкозами, обладающего высокой степенью автоматизации ключевых этапов эксперимента, а также обеспечение возможности непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.

Поставленная задача решается тем, что во флуоресцентном способе для прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, при котором производится забор крови до и после химиотерапии, выделяется флуоресцентный макро-биомаркер эффективности химиотерапии, согласно изобретению, макро-биомаркером является концентрация аденозинтрифосфата, определяемая автоматизировано, с помощью лазерного конфокального микроскопа, путем подсчета интенсивности флуоресценции макро-биомаркера для непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.

Заявленный способ основан на использовании определения концентрации АТФ методом лазерной конфокальной микроскопии, который начинается с обработки образца после формирования кровяного сгустка (не ранее чем через 30 минут и не более 3 часов после забора). Далее осуществляется центрифугирование на скоростях 1500 об/мин в течение 10 минут, 2000 об/мин в течение 10 минут и 3000 об/мин в течение 7,5 минут. Максимальное разделение сыворотки и клеточного осадка наблюдают при режиме центрифугирования 2000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре.

Далее сыворотка отбирается по 1 мл в криовиалы объемом (1,8-2,0) мл. Пробы хранят в штативах с крышками, при -20°C, -40°C, -60°C, -80°C до выполнения анализа. При температуре -80°C количество жизнеспособных мононуклеарных клеток превышало должно быть не меньше 25 млн. Для длительного хранения и коллекционирования образцов выбирается температурный режим -80°C. Для реализации способа проводят выделение мононуклеарных клеток и их подготовку для конфокальной микроскопии.

Обработку предварительно подготовленных образцов начинают после их размораживания в течение 30 минут при комнатной температуре. В ламинарном шкафу, при помощи 0,5 мл и 1 мл механических пипеток переносят образцы периферической крови в маркированные пробирки типа Фалькон объемом 10 мл. Пробу разводят стерильным 0,2 молярным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) из расчета 5:1. Значение pH буфера составляло 7,8 ед. Далее центрифугируют образцы на скорости 4000 оборотов в минуту в течение 10 минут при температуре 4°C. Аккуратно удаляют жидкую фазу механической пипеткой и добавляли 5 мл ФСБ к осадку. Также используют механическую пипетку объемом 1 мл, разводят осадок в ФСБ и доливают ФСБ до 5 мл, далее перемешивают. Затем повторяют процедуру отмывки (центрифугирования образца, удаления жидкой фазы, добавления буфера) при указанных выше параметрах еще 2 раза.

После проводят лизирование образцов в течение двух часов при температуре -80°C. Далее пробу размораживают при комнатной температуре, добавляют до 5 мл ФСБ и центрифугируют на скорости 4000 об/мин в течение 4 минут при комнатной температуре 4°C. Жидкую фазу удаляют пипеткой. Для наблюдения внутриклеточного АТФ используют ATP Bioluminescent Assay Kit (BAK), используемый для количественного определения АТФ в клетках.

После подготовительных процедур используется 96-луночный плоскодонный культуральный планшет ТРР. Механической пипеткой подготовленные образцы помещаются в лунки планшета в объеме 0,1 мл, и делается отметка соответствия об их размещении в лабораторном журнале. Согласно инструкции BAK готовится люминесцентный реагент, который в объеме 0,1 мл смешивается с образцом в лунке. Для каждой серии эксперимента подготавливается контрольный образец (смесь стандарта АТФ из BAK и ATPAssayMix из BAK в пропорции 1:1 объемом 0,1 мкл), а также образцы для построения калибровочной кривой, согласно инструкции BAK. Далее значение интенсивности люминесценции регистрируется с помощью детектора конфокального микроскопа. Детекция проводится в спектре свечения люцеферина желтого (в видимом диапазоне ~500-700 нм) с ожидаемым максимумом около 536 нм. Для анализа каждой лунки данные снимаются в нескольких точках. Для построения калибровочной кривой используются стандарты в разной степени разведения и без него. После построения калибровочных кривых берутся пробы пациентов с тяжелыми клиническими проявлениями НПР, где проводятся измерения степени интенсивности люминесценции АТФ с помощью лазерного конфокального микроскопа. На основании полученных спектральных данных о пиковой средней величине интенсивности, рассчитывалась концентрация АТФ (мг/мл) по формуле

Где In_exp - интенсивность свечения образца, In_st - интенсивность свечения стандарта,

[АТФ]_st - концентрация АТФ в стандарте, бралась равной 0.1 мг/мл.

Расчетные данные концентрациям АТФ в клетках крови сводятся в таблицу. В таблицу также добавляются данные по возрасту, полу, площади поверхности тела пациента, количественное значение аланинаминотрансфераза (АЛТ), количественное значение аспартатаминотрансфераза (ACT). Номера каждого спектра нумеруются по номеру пациента.

В таблице 1 показаны данные по пациентам и рассчитанные для каждого концентрации АТФ, где АЛТ - аланинамилотрансфераза, АСТ - аспартатаминотрансфераза, ППТ - рассчитанная площадь поверхность тела.

По результатам подсчитанной концентрации АТФ делается прогностический вывод об эффективности проводимой химиотерапии посредством взятия нормы концентрации АТФ для здоровой функционирующей клетки (1,04±0.14 мг/мл), при которой осуществляется лекарственный транспорт и не наблюдается риска развития гепатотоксических эффектов в данный момент терапии. Концентрация АТФ в клетке более (0,8±0,112 мг/мл) сигнализируют о наступлении апоптоза клетки. Потери АТФ в клетке более 70% (0,312±0,042) сигнализирует о некрозе клеток.

Таким образом, в заявляемом способе, включающем исследование крови до и после лечения, определяют и используют значение концентрации макро-биологического маркера - АТФ в клетках крови пациентов, что позволяет произвести прогноз риска возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности пациентов, оценив, эффективность проводимой химиотерапии в нужный момент времени.

Флуоресцентный способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, при котором производят забор крови до и после химиотерапии, выделяют флуоресцентный макро-биомаркер эффективности химиотерапии, отличающийся тем, что макро-биомаркером является концентрация аденозин-трифосфата (АТФ), которую определяют автоматизировано, с помощью лазерного конфокального микроскопа, путем подсчета интенсивности флуоресценции макро-биомаркера, и при концентрации АТФ 1,04±0,14 мг/мл не наблюдается риск развития гепатотоксических эффектов в данный момент времени, при концентрации АТФ 0,8±0,112 мг/мл наступает апоптоз клеток, при концентрации АТФ 0,312±0,042 мг/мл наступает некроз клеток.

Изобретение относится к медицине и касается способа определения антител к вирусам полиомиелита 1, 3 типов в сыворотке крови, где в сыворотку крови в модифицированной реакции связывания комплемента вносят убитый антиген вируса полиомиелита, содержащийся в инактивированной полиомиелитной вакцине, и гемолитическую сыворотку, исследуемые образцы выдерживают, затем проводят количественное определение оксидазных ферментов, вышедших из гемолизированных эритроцитов, используя тетраметилбензидин.

Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ количественного определения фетальной днк в кровотоке беременной женщины на основе анализа гиперметилированных участков днк плода // 2642622

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ получения ДНК-праймеров и зондов для определения присутствия и определения относительного количества фетальной ДНК в образце плазмы крови беременной женщины.

Способ диагностики деструктивных бациллярных форм туберкулеза легких // 2642241

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в фтизиопульмонологии для ранней диагностики инфильтративных (бациллярных) форм туберкулеза легких.

Длинные жесткие спейсеры для улучшения кинетики связывания в иммуноанализах // 2641032

Группа изобретений относится к области детектирования молекулы-мишени в образце. Устройство для детектирования молекулы-мишени в образце содержит контейнер для образцов для количественного определения молекулы-мишени в образце; по меньшей мере одну первую частицу, функционализированную первой связывающей молекулой, способной к специфическому связыванию с молекулой-мишенью; поверхностную структуру, содержащую вторую связывающую молекулу, где поверхностная структура покрывает плоскую поверхность или присутствует на по меньшей мере одной второй частице.

Способ выделения и очистки лактоферрина из молочного сырья // 2634859

Изобретение относится к области фармакологии, а именно к способу выделения и очистки лактоферрина из молочного сырья. Способ выделения и очистки лактоферрина из молочного сырья – коровьего молока, включающий одностадийную хроматографию лактоферрина из молочного сырья в колонке с сорбентом, уравновешенным натрий-фосфатным буфером, элюирование лактопероксидазы натрий-фосфатным буфером, элюирование лактоферрина в градиенте натрия хлористого, обессоливание и лиофильное высушивание.

Способ оценки секреторной функции малых слюнных желез // 2632446

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ оценки секреторной функции малых слюнных желез (МСЖ), заключающийся в наложении на слизистую оболочку нижней губы пластинки, окрашенной метиленовым синим, с последующей стимуляцией функции МСЖ и сравнением оптической плотности пластинки до и после стимуляции, отличающийся тем, что пластинка выполнена из прозрачного материала и имеет округлую форму площадью 1 см2, проводится двукратное наложение пластинки, длительность каждого наложения пластинки составляет 5 минут, после первого наложения пластинки слизистую обрабатывают 1 мл 1% водного раствора пилокарпина гидрохлорида и ждут 15 минут, если оптическая плотность пластинки до стимуляции пилокарпином в 1,5 и более раза больше, чем после стимуляции, то секреция МСЖ не нарушена, в противном случае - при соотношении оптической плотности пластинки до и после стимуляции менее чем в 1,5 раза - устанавливается тяжелая степень ксеростомии.

Способ прогноза развития постперикардиотомного синдрома у больных ибс, перенесших аортокоронарное шунтирование // 2630592

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогноза развития постперикардиотомного синдрома (ПКТС) у больных ишемической болезнью сердца (ИБС), перенесших аортокоронарное шунтирование, характеризующийся тем, что у пациентов через сутки после операции определяют активность аргиназы в эритроцитах и арилэстеразную активность параоксоназы (PON) в плазме крови, затем рассчитывают коэффициент К по формуле: К = аргиназа/PON, где «аргиназа» - это активность аргиназы, МЕ/(г Hb); «PON» - арилэстеразная активность параоксоназы, МЕ/(мг белка); и при значении коэффициента К, равном 0,39 и более, у пациента прогнозируют развитие ПКТС с вероятностью 67%.

Способ определения степени метаболической зрелости гетеротопических оссификатов по биохимическим показателям крови пациента // 2628869

Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для определения степени метаболической зрелости гетеротопических оссификатов.

Способ дифференциальной диагностики доброкачественных, первичных и вторичных злокачественных опухолей головного мозга // 2628816

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для предоперационной дифференциальной диагностики первичных и вторичных злокачественных, а также доброкачественных опухолей головного мозга.

Способ определения свободно-радикального окисления в модельной системе // 2627459

Изобретение относится к диагностике, а именно способу получения модельной системы на основе лецитина из подсолнечника для определения свободно-радикального окисления.

Способ неинвазивной диагностики состояния и организации внутриклеточного хроматина в gv-ооците млекопитающих // 2647832

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ неинвазивной диагностики состояния и организации внутриклеточного хроматина в GV-ооците млекопитающих.

N,n’-диэтил- n,n’-ди(2-бром-4-r-фенил)диамиды 2,2’-бипиридил-6,6’-дикарбоновой кислоты и способ их получения, циклизация полученных амидов с образованием 6,6’-диэтил-9,9’-диr-дибензо[f]-1,7-нафтиридин-5,5’(6н,6’h)-дионов // 2647578

Изобретение относится к новым соединениям N,N'-диэтил-N,N'-ди(2-бром-4-R-фенил)амидам 2,2'-бипиридил-6,6'-дикарбоновой кислоты и 6,6'-диэтил-9,9'-диR-3,3'-дибензо[ƒ]-1,7-нафтиридин-5,5'(6H,6'H)-дионам формулы (1) и (2) соответственно: .Изобретение также относится к способу их получения.

Системы и способы для улучшенной стабильности электрохимических сенсеров // 2647473

Группа изобретений относится к области медицинского тестирования, в частности к определению концентрации аналита в образце. Способ определения концентрации аналита в образце включает: введение образца с аналитом в электрохимическую ячейку; определение первой концентрации аналита; определение результата измерения параметра, коррелирующего с физическим свойством электрохимической ячейки; вычисление поправочного коэффициента и определение концентрации аналита с учетом поправочного коэффициента.

Способ определения цитотоксичности веществ // 2647464

Изобретение относится к биомедицине и может быть использовано для определения цитотоксичности веществ путем обработки клетки веществом с последующим определением токсичности вещества по изменению уровня внутриклеточных активных форм кислорода.

Способ прогнозирования развития критических состояний у женщин в родах и послеродовом периоде // 2647459

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и акушерству, и касается способа прогнозирования критических состояний у женщин в родах и послеродовом периоде.

Способ оценки пригодности эритроцитарной взвеси для проведения гемотрансфузии // 2647457

Изобретение относится к физико-химическим способам исследования биологического материала и может быть использовано в трансфузиологии для определения пригодности консервированной эритроцитарной взвеси (ЭВ) к переливанию.

Способ прогнозирования риска прогрессирования первичных в-клеточных неходжкинских лимфом с поражением костного мозга // 2647454

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и гематологии, и может быть использовано для прогнозирования риска прогрессирования первичных В-клеточных неходжкинских лимфом с поражением костного мозга.

Способ ранней диагностики хронической болезни почек у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких // 2647327

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в терапии, пульмонологии, нефрологии с целью диагностики хронической болезни почек (ХБП) у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).

Способ прогнозирования степени отморожения в ранние периоды // 2646827

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и касается прогнозирования степени отморожения в ранние периоды. Для этого определяют уровни маркеров эндотелиальной дисфункции в периферической крови пациентов: vWF, CD62E, CD62P, CD62L, VEGF, sPECAM-1, ИБЛ.

Способ прогнозирования эффективности снижения массы тела у больных с ожирением // 2646819

Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования эффективности лечения ожирения. В плазме крови определяют уровень лептина и растворимых рецепторов лептина иммуноферментным методом, рассчитывают индекс свободного лептина как отношение уровня лептина к его растворимым рецепторам, умноженное на 100, и при значении индекса свободного лептина менее 291 единицы прогнозируют снижение массы тела более чем на 5% от исходного.

Способ диагностики степени тяжести атаки у пациентов с язвенным колитом // 2647838

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики степени тяжести атаки у пациентов с язвенным колитом (ЯК), отличающийся тем, что рассчитывают степень тяжести атаки по формуле:СТА=-0,815-0,034*ФНО-α+0,018*СРБ+0,016*СОЭ+0,155*α2-ГЛ-0,01*АЛ,где СТА - степень тяжести атаки язвенного колита; ФНО-α - фактор некроза опухоли альфа сыворотки крови, пг/мл; СРБ - С-реактивный белок в сыворотке крови, мг/л; СОЭ - скорость оседания эритроцитов, мм/час; α2-ГЛ - α2-глобулины сыворотки крови, %; АЛ - альбумин сыворотки крови, г/л; и при значении СТА в интервале от 0 до 0,5 определяют отсутствие атаки или ремиссию заболевания, значение СТА в интервале от 0,5 до 1,2 соответствует легкой степени тяжести атаки ЯК, значение СТА в интервале от 1,2 до 2,2 соответствует умеренной тяжести атаки ЯК, при СТА более 2,2 следует говорить о тяжелой атаке ЯК. Технический результат: повышение специфичности и точности определения степени тяжести атаки язвенного колита, а также доступность и простота исполнения. 4 пр.