Композиция, включающая смесь изоформ cd95-fc

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к фармацевтической композиции, которая ингибирует сигнальный путь CD95, составу, который имеет величину pH в диапазоне 4-8, включающему указанную композицию, 20-100 мМ фосфата и 0,1-10 мас. % средства, повышающего вязкость, такого как сорбитол, а также способу получения указанной композиции. Композиция согласно изобретению включает смесь изоформ слитого белка APG101. Указанные изоформы отличаются от APG101 длиной белка, а именно могут быть укорочены с N-конца на 16, 20 или 25 аминокислот, имеют разную длину и дополнительно могут содержать замены и/или делеции аминокислот и имеют по меньшей мере 95% идентичности с APG101 и распределены в рамках pI-диапазона 4,0-8,5. Немодифицированный APG101 имеется в указанной смеси в количестве, не превышающем 1 мол. %. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность средств для ингибирования сигнального пути CD95. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 1 пр.

 

Настоящее изобретение относится к композиции, включающей смесь изоформ слитых белков, каждый слитый белок, включающий внеклеточный домен CD95 или его функциональный фрагмент или домен Fc или его функциональный фрагмент, к составам, обеспечивающим такую композицию в стабильной форме, а также к способу получения такой композиции.

Слитые белки, включающие внеклеточный домен рецептора смерти CD95 (Аро-1; Fas), слитый с доменом Fc иммуноглобулина, описаны в РСТ/ЕР04/03239. Однако выяснилось, что существуют трудности в получении таких слитых белков в достаточных количествах с удовлетворительной стабильностью.

С настоящим изобретением в первый раз появилась возможность обеспечить такие композиции или способы.

В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение относится к композиции, включающей смесь изоформ слитых белков, каждый слитый белок, включает, по меньшей мере, внеклеточный домен CD95 (АРО-1; Fas) или его функциональный фрагмент и, по меньшей мере, второй домен, представляющий собой домен Fc или его функциональный фрагмент, который распределяется в пределах pI-диапазона, равного от примерно 4,0 до примерно 8,5. Соответственно, внеклеточный домен CD95, как применен в настоящем документе, также может быть назван «первый домен», тогда как домен Fc может быть назван «второй домен».

Белок первого домена представляет собой внеклеточный домен CD95, предпочтительно, внеклеточный домен белка млекопитающих, в особенности, белок человека, т.е. внеклеточный домен CD95 человека. Первый домен, т.е. внеклеточный домен CD95, слитого белка предпочтительно включает аминокислотную последовательность вплоть до аминокислоты 170, 171, 172 или 173 CD95 человека (SEQ ID NO. 1). Сигнальный пептид (например, позиции 1-25 в SEQ ID NO: 1) может присутствовать или отсутствовать.

Особенно предпочтительно применение белка человека в терапевтических целях.

Слитый белок может включать один или несколько первых доменов, которые могут быть одинаковыми или разными. Однако предпочтителен один первый домен, т.е. слитый белок, включающий один внеклеточный домен CD95.

В соответствии с предпочтительным воплощением, домен Fc или его функциональный фрагмент, т.е. второй домен слитого белка в соответствии с изобретением, включает домен СН2 и/или домен СН3, и необязательно, по меньшей мере, часть домена шарнирной области или полученный из него модифицированный домен иммуноглобулина. Домен иммуноглобулина может представлять собой домен иммуноглобулина IgG, IgM, IgD или IgE или полученный из них модифицированный домен иммуноглобулина. Предпочтительно, второй домен включает, по меньшей мере, часть константного домена иммуноглобулина IgG. Домен иммуноглобулина IgG может быть выбран из доменов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или из полученных из них модифицированных доменов. Предпочтительно, второй домен представляет собой домен Fc человека, такой как домен Fc IgG, например, домен Fc IgG1 человека.

Слитый белок может включать один или несколько вторых доменов, которые могут быть одинаковыми или разными. Однако один второй домен, т.е. слитый белок, предпочтительно включающий один домен Fc.

Кроме того, предпочтительно оба домена, первый и второй, были из того же вида.

Первый домен, т.е. внеклеточный домен CD95 или его функциональный фрагмент, может быть локализован на N- или С-конце. Второй домен, т.е. домен Fc или функциональный фрагмент, также может быть локализован на С- или N-конце слитого белка. Однако предпочтительно, чтобы внеклеточный домен CD95 располагался на N-конце слитого белка.

В соответствии с дополнительным предпочтительным воплощением, слитый белок представляет собой APG101 (CD95-Fc, позиции 26-400 в SEQ ID NO: 1). Как определено в SEQ ID NO: 1 APG101 может представлять собой слитый белок, включающий внеклеточный домен CD95 человека (аминокислоты 26-172) и домен Fc IgG1 человека (аминокислоты 172-400), кроме того, необязательно, включающий N-терминальную сигнальную последовательность (например, аминокислоты 1-25 в SEQ ID NO: 1). Присутствие сигнального пептида указывает на незрелую форму APG101. При созревании, сигнальный пептид отщепляется. В соответствии с особенно предпочтительным воплощением сигнальная последовательность отщепляется. APG101 с сигнальной последовательностью также охвачен термином «немодифицированный APG101». В еще одном воплощении слитый белок представляет собой полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70% идентичности, более предпочтительно, 75% идентичности, 80% идентичности, 85% идентичности, 90% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности, 99% идентичности с APG101. В соответствии с настоящей заявкой термин «идентичность» относится к тому, в какой степени инвариантны две сравниваемые аминокислотные последовательности, другими словами, имеют одни и те же аминокислоты в тех же позициях.

Термин «APG101» описывает слитый белок в позиции 26-400 в SEQ ID NO: 1, с сигнальным пептидом и/или без него. Термин «APG101» также включает слитые белки, содержащие усеченные с N-конца формы внеклеточного домена CD95.

В другом предпочтительном воплощении слитый белок в соответствии с изобретением представляет собой функциональный фрагмент APG101. Как применен в настоящем документе, термин «фрагмент» как правило, обозначает «функциональный фрагмент», т.е. фрагмент или часть белка дикого типа или полноразмерного белка, который имеет существенно такую же биологическую активность и/или такие же свойства, как соответствующий белок дикого типа или полноразмерный белок.

Специалисту в данной области техники известны способы разработки и получения слитых белков в соответствии с настоящим изобретением. Однако смесь изоформ слитых белков, в особенности, изоформы APG101, получают способом, описанным ниже в настоящем документе. Такие способы описаны, например, в РСТ/ЕР 04/03239. В соответствии с предпочтительным воплощением конструирование слитого белка настоящего изобретения включает выбор концевой аминокислоты(концевых аминокислот) первого домена и второго домена с целью создания, по меньшей мере, одного перекрытия аминокислот между обоими доменами. Перекрытие между первым и вторым доменами или между двумя первыми доменами имеет длину, предпочтительно равную 1, 2 или 3 аминокислотам. Более предпочтительно, перекрытие имеет длину, равную одной аминокислоте. S, Е, K, Н, Т, Р и D представляют собой примеры перекрывающихся аминокислот.

Композиция в соответствии с изобретением включает смесь изоформ белка. Термин «изоформа», как применен в настоящем документе, обозначает различные формы одного и того же белка, такие как различные формы APG101, в особенности, APG101 без сигнальной последовательности. Такие изоформы могут различаться, например, по длине белка, по аминокислотам, т.е. заменой и/или делецией, и/или посттрансляционной модификацией, по сравнению с соответствующей посттрансляционной модификацией немодифицированного белка, т.е. белка, который транслируется и экспрессируется из данной кодирующей последовательности без какой-либо модификации. Различные изоформы может быть охарактеризованы, например, с помощью электрофореза, такого как SDS-электрофорез, и/или изоэлектрического фокусирования, применение которого предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением.

Изоформы, различающиеся по длине белка, могут быть, например, удлиненными и/или укороченными с N-конца и/или с С-конца, по сравнению с соответствующим немодифицированным белком. Например, смесь изоформ APG101 в соответствии с изобретением может включать APG101 в немодифицированной форме, а также его удлиненные и/или укороченные с N-конца и/или с С-конца варианты.

Таким образом, в соответствии с предпочтительным воплощением, смесь в соответствии с изобретением включает укороченные с N-конца и/или с С-конца варианты APG101.

В особенности предпочтительна смесь изоформ слитых белков, включающая укороченные с N-конца слитые белки.

Укороченные слитые белки могут включать последовательность SEQ ID NO: 1, укороченную с N-конца на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 и/или 50 аминокислот. Предпочтительные укороченные слитые белки имеют SEQ ID NO: 1, укороченную с N-конца на 16, 20, или 25 аминокислот.

Также в терминах настоящего изобретения могут быть названы такие укороченные с N-конца слитые белки, которые включают -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -35, -40, -45 и/или -50 укороченные с N-конца варианты немодифицированного APG101. Особенно предпочтительны укороченные с N-конца варианты -17, -21 и/или -26. Нумерация относится к белку APG101, включающему сигнальную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1, в которой номер указывает на первую аминокислоту в укороченном с N-конца варианте APG101.

Это означает, что укороченный слитый белок, имеющий SEQ ID NO:1, укороченную с N-конца на 16 аминокислот, соответствует варианту APG101, обозначенному как -17, и в результате получают белок, имеющий аминокислоты 17-400 в SEQ ID NO: 1, белок, укороченный с N-конца на 20 аминокислот, соответствует -21 (аминокислоты 21-400 в SEQ ID NO: 1) и укороченный с N-конца на 25 аминокислоты соответствует -26 (аминокислоты 26-400 в SEQ ID NO: 1).

Пример укороченной с С-конца изоформы APG101 - это обрезание Lys с С-конца.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения смесь слитых белков композиции в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает 50 мол. % немодифицированного APG101 по отношению к модифицированным изоформам, более предпочтительно, 40 мол. % немодифицированного APG101, более предпочтительно, 30 мол. % немодифицированного APG101, более предпочтительно, 20%, более предпочтительно, 10 мол. % немодифицированного APG101, более предпочтительно, 5 мол. % немодифицированного APG101 и еще более предпочтительно, 3 мол. % немодифицированного APG101 и наиболее предпочтительно 1 мол. % и/или менее немодифицированного APG101. Наиболее предпочтительно воплощение, включающее смесь изоформ слитых белков, которая не включает какой-либо немодифицированный APG101.

Как было указано выше, изоформы могут также различаться по замене аминокислот, делении аминокислот и/или вставке аминокислот. Такая замена и/или делеция может включать одну или несколько аминокислот. Однако замена единственной аминокислоты предпочтительна в соответствии с данным воплощением.

Изоформы в соответствии с изобретением также могут различаться по посттрансляционной модификации. Посттрансляционная модификация в соответствии с настоящим изобретением может включать, без ограничений, присоединение гидрофобных групп, в особенности, для мембранной локализации, например, миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование или присоединение гликозилфосфатидилинозитола (glypiation), добавление кофакторов для повышения ферментативной активности, например, липоилирование, добавление небольших химических групп, например, ацилирование, формилирование, алкилирование, метилирование, аминирование по С-концу, аминокислотные вставки, γ-карбоксилирование, гликозилирование, гидроксилирование, окисление, глицилирование, биотинилирование и/или пегилирование.

В соответствии с настоящим изобретением присоединение сиаловых кислот, гликозилирование на основе Fc, в особенности, N-концевое гликозилирование на основе Fc и/или пиро-Glu-модификация представляют собой предпочтительные воплощения посттрансляционной модификации.

В соответствии с предпочтительным воплощением слитые белки, охваченные композицией изобретения, включают большие количества сиаловых кислот. В соответствии с настоящим изобретением содержание сиаловых кислот предпочтительно равно от примерно 4,0 до 7,0 моль NeuAc/моль APG101, более предпочтительно, от 4,5 до 6,0 моль NeuAc/моль APG101 и наиболее предпочтительно, от примерно 5,0 моль NeuAc/моль APG101. Как применено в настоящем документе, термин сиаловые кислоты относится к N- или О-замещенным производным нейраминовой кислоты. Предпочтительная сиаловая кислота представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту (NeuAc). Аминогруппа обычно несет или ацетильную, или гликолильную группу, но были описаны и другие модификации. Гидроксильные заместители могут существенно различаться. Предпочтительные гидроксильные заместители представляют собой ацетильные, лактильные, метальные, сульфатные и/или фосфатные группы. Присоединение сиаловых кислот приводит, как правило, к образованию более анионных белков. Полученный отрицательный заряд дает возможность этой модификаций изменять поверхностный заряд белка и способность к связыванию. Высокое содержание сиаловых кислот приводит к улучшению стабильности в сыворотке и, таким образом, к усовершенствованию фармакокинетики и снижению иммуногенности. Высокая степень сиалилирования изоформы APG101 настоящего изобретения может быть объяснена высоким содержанием двуантенарных структуры. Следует рассматривать как весьма удивительный тот факт, что изоформы APG101 в композиции изобретения, полученные с помощью способа изобретения, демонстрируют такую высокую степень присоединения сиаловых кислот.

В соответствии с настоящим изобретением, гликозилирование обозначает реакцию, в которой углевод присоединяется к функциональной группе слитого белка, его функциональному фрагменту, как определен в настоящем документе. В особенности, это относится к присоединению углевода к APG101 или к его изоформе. Углевод может быть присоединен, например, через N-гликозидную связь или О-гликозидную связь. N-связанные углеводы прикреплены к азоту боковых цепей аспарагина или аргинина. О-связанные углеводы прикреплены к кислороду боковых цепей гидроксила серина, треонина, тирозина, гидроксилизина или гидроксипролина. В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно образование N-связи, в особенности, N-концевое гликозилирование на основе Fc. Особенно предпочтительные сайты N-связанного гликозилирования расположены в позициях N118, N136 и/или N250 в APG101 (SEQ ID NO: 1).

Фукозилирование в соответствии с настоящим изобретением относится к присоединению к молекуле сахарных звеньев фукозы. В отношении настоящего изобретения такое присоединение сахарных звеньев фукозы к слитому белку, и в особенности к APG101, представляет собой особенно предпочтительный тип гликозилирования. Большая доля фукозилированных форм приводит к снижению антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Таким образом, смесь изоформ слитых белков характеризуется сниженной ADCC, что выгодно для фармацевтических и диагностических приложений.

Разумеется, помимо первого и второго домена, как определены в настоящем документе, слитые белки в соответствии с изобретением могут включать дополнительные домены, такие как дополнительные целевые домены, например, одноцепочечные антитела или их фрагменты и/или сигнальные домены. В соответствии с дополнительным воплощением, слитый белок, примененный в соответствии с изобретением, может включать N-концевую сигнальную последовательность, которая позволяет осуществлять секрецию из клетки-хозяина после рекомбинантной экспрессии. Сигнальная последовательность может представлять собой сигнальную последовательность, которая гомологична первому домену слитого белка. Альтернативно, сигнальная последовательность также может представлять собой гетерологичную сигнальную последовательность. В различных воплощениях слитый белок свободен от дополнительной N-концевой последовательности, такой как сигнальный пептид.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может включать блокированные с N-конца слитые белки, которые обеспечивают более высокую стабильность в отношении N-концевой деградации под действием протеаз, а также слитые белки, имеющие свободный N-конец, который обеспечивает более высокую стабильность в отношении N-концевой деградации под действием протеаз.

Модификации, блокирующие N-конец белка, известны специалисту в данной области техники. Однако в соответствии с настоящим изобретением пиро-Глу-модификация представляет собой предпочтительную посттрансляционную блокирующую N-конец модификацию. Пиро-Глу также носит название пирролидонкарбоновая кислота. Пиро-Глу-модификация в соответствии с настоящим изобретением относится к модификации N-концевого глутамина в результате циклизации глутамина посредством конденсации α-аминогруппы с карбоксильной группой боковой цепи. Модифицированные белки демонстрируют увеличенное время полужизни. Такая модификация также может происходить на остатке глутамата. Особенно предпочтительная модификация представляет собой пиро-Глу-модификацию, т.е. пирролидонкарбоновую кислоту, в отношении укороченного с N-конца слитого белка -26.

В предпочтительном воплощении настоящей заявки композиция в соответствии с настоящим изобретением включает 80-99 мол. % блокированных с N-конца слитых белков и/или 1-20 мол. % слитых белков, имеющих свободный N-конец.

В соответствии с дополнительным предпочтительным воплощением композиция включает от 0,0 до 5,0 мол. %, более предпочтительно, от 0,0 до 3,0 мол. % и еще более предпочтительно, от 0,0 до 1,0 мол. %, форм слитого белка с высокой молекулярной массой, таких как агрегаты. В предпочтительном воплощении композиция в соответствии с настоящим изобретением не включает никаких агрегатов изоформ слитых белков, в особенности, не включает димеры или агрегаты APG101. Димеры или агрегаты, как правило, нежелательны, так как они оказывают негативное воздействие на растворимость.

Функциональная форма APG101 включает два слитых белка, как описано в настоящем документе, соединенные дисульфидными мостиками в шарнирной области в позициях 179 или/и 182 применительно к SEQ ID NO: 1 двух молекул (смотри фигуру 7). Дисульфидный мостик также может быть сформирован в позиции 173 применительно к SEQ ID NO: 1 двух молекул, что приводит к улучшенной стабильности. Если дисульфидный мостик в позиции 173 применительно к SEQ ID NO: 1 не требуется, то остаток Cys в этой позиции может быть заменен другими аминокислотами, или может быть удален.

В предпочтительном воплощении смесь в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают способом в соответствии с настоящим изобретением, описанным в настоящем документе.

В соответствии с изобретением, смесь изоформ слитых белков распределяется в pI-диапазоне от примерно 4,0 до примерно 8,5. В еще одном воплощении pI-диапазон смеси изоформ слитых белков, охваченный композицией в соответствии с изобретением, равен от примерно 4,5 до примерно 7,8, более предпочтительно, от примерно 5,0 до примерно 7,5.

Изоэлектрическую точку (pI) определяют по pH, при котором конкретная молекула или поверхность не несет электрический заряд. В зависимости от рН-диапазона окружающей среды аминокислоты бежа могут нести различные положительные или отрицательные заряды. Сумма всех зарядов белка равна нулю в определенном диапазоне рН, в его изоэлектрической точки, т.е. в его pI. Если молекула белка в электрическом поле достигает точки среды, имеющей данное значение рН, то его электрофоретическая подвижность снижается, и белок остается в этом месте. Специалисту в данной области техники известны способы определения величина pi данного белка, такие как изоэлектрическое фокусирование. Методика характеризуется чрезвычайно высоким разрешением. Белки, отличающиеся на один заряд, могут быть разделены и/или фракционированы.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением, описанным в настоящем документе, может быть применена для фармацевтических, диагностических и/или научных приложений. Она может быть применена при лечении людей, а также в ветеринарной медицине.

Другой аспект настоящего изобретения относится к составу, включающему композицию в соответствии с изобретением.

В соответствии с предпочтительным воплощением композиция включает

(а) фосфат, более предпочтительно, от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ фосфатного буфера, более предпочтительно, от примерно 5 мМ фосфата до примерно 85 мМ фосфата, более предпочтительно, от примерно 20 мМ до примерно 80 мМ фосфата, более предпочтительно, от примерно 30 мМ до примерно 70 мМ фосфата, еще более предпочтительно, от примерно 40 мМ до примерно 60 мМ фосфата, наиболее предпочтительно, примерно 50 мМ фосфат,

(b) средство, повышающее вязкость, предпочтительно, от примерно 0,1-10 мас. % средства, повышающего вязкость, более предпочтительно, от 1 до 8 мас. % средства, повышающего вязкость, более предпочтительно, от примерно 3 мас. % до примерно 7 мас. % средства, повышающего вязкость, еще более предпочтительно от примерно 6 мас. % до примерно 7 мас. % средства, повышающего вязкость, и наиболее предпочтительно, примерно 5 мас. % средства, повышающего вязкость, и

(c) имеет рН в диапазоне 4-8.

В терминах настоящего изобретения, термин «фосфат» включает любой подходящий фосфатный буфер, известный специалисту в данной области техники. В соответствии с особенно предпочтительным воплощением фосфатный буфер представляет собой Na-фосфат.

Средства, усиливающие или увеличивающие вязкость, хорошо известны специалисту в данной области техники и включают альгиновую кислоту, карбоксиметилцеллюлозу, декстрин, желатин, гуаровую камедь, гидроксиэтилцеллюлозу, алюмосиликат магния, поливиниловый спирт, полиэтиленоксид, диоксид кремния, крахмал, ксантановую камедь и т.д. Дополнительные вспомогательные вещества, которые, конечно, могут присутствовать, включают сахарозу, сорбитол и/или глицин. Однако сорбитол представляет собой повышающее вязкость средство, которое особенно предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с особенно предпочтительным воплощением, средство, повышающее вязкость, сорбитол, присутствует в количестве, равном примерно 5 мас. %.

Величина рН состава в соответствии с настоящим изобретением находится в рамках диапазона, равного примерно от 4 до 8. В соответствии с предпочтительным воплощением, она находится в рамках диапазона, равного от 5 до 8, более предпочтительно, от 6 до 8 и, еще более предпочтительно, от 6,5 до 8. В соответствии с особенно предпочтительным воплощением, рН равен примерно 6,5, примерно 7,0 или примерно 7,5.

В соответствии с особенно предпочтительным воплощением, композиция в соответствии с настоящим изобретением включает примерно 30 мМ Na-фосфат или примерно 50 мМ Na-фосфат, примерно 5% сорбитола и демонстрирует рН, равный примерно 6,5 (сравни буферы 5 и 6 на фигуре 10).

Удивительно, но композиция изобретения, обеспеченная в составе такого типа, очень стабильна и не склонна к образованию агрегатов. Например, составы настоящего изобретения дополнительно характеризуются сниженной фрагментацией APG101. Кроме того, существует возможность обеспечить высокую концентрацию белков, например, примерно 20 мг/мл, в стабильной форме.

Композиция и/или состав в соответствии с изобретением могут быть введены нуждающемуся в этом субъекту, особенно, пациенту-человеку, в достаточной дозе для лечения конкретных состояний подходящими средствами. Например, композиция и/или состав в соответствии с изобретением могут быть составлены в виде фармацевтической композиции вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или вспомогательными лекарственными средствами. Терапевтическая эффективность и токсичность могут быть определены в соответствии со стандартными протоколами. Фармацевтическая композиция может быть введена системно, например, внутрибрюпшнно, внутримышечно или внутривенно, или местно, например, интраназально, подкожно или интратекально. Доза вводимой композиции и/или состава будет, конечно, зависеть от подвергаемого лечению субъекта и от состояния субъекта, например, от массы субъекта, возраста субъекта и типа и тяжести заболевания или повреждения, подлежащего лечению, способа введения и решения лечащего врача. Например, пригодна суточная доза от 0,001 до 100 мг/кг.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции или составу, включающему композицию или состав в соответствии с изобретением, которые содержат, по меньшей мере, один дополнительный активный агент. Какой дополнительный активный агент будет применен, зависит от показаний, которые будут рассматриваться. Например, при лечении рака могут быть применены цитотоксические средства, такие как доксорубицин, цисплатин или карбоплатин, цитокины или другие противоопухолевые средства.

Композиция и/или состав в соответствии с изобретением могут дополнительно включать фармацевтически приемлемые носители, разбавители и/или вспомогательные лекарственные средства. Термин «носитель», при применении в настоящем документе, включает носители, вспомогательные вещества и/или стабилизаторы, которые не токсичны для клетки или млекопитающего, на которых воздействуют в применяемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемые носители представляют собой водные растворы с буфером для поддержания определенного рН или липосомы. Примеры физиологически приемлемых носителей включают такие буферы, как фосфат, цитрат и другие органические кислоты (однако, что касается состава настоящего изобретения, предпочтителен фосфатный буфер); антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту, низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, манозу или декстрины, желирующие средства, такие как EDTA, сахар, спирты, такие как маннитол или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, полиэтилен или полиэтиленгликоль.

В соответствии с предпочтительным воплощением композиция и/или состав в соответствии с изобретением могут быть применены для ингибирования сигнального пути CD95, в особенности, внешнего апоптического пути, запускаемого CD95L, т.е. лиганда рецептора CD95. В особенности, композиция может быть применена в профилактике и/или лечении заболеваний, выбираемых из аутоиммунных заболеваний, СПИДа, заболеваний сердца, например, инфаркта миокарда; реакций трансплантата против хозяина, отторжения трансплантата, поражения головного мозга, например, инсульта, повреждения спинного мозга, сепсиса, гепатита, расстройств, связанных с воспалением, ишемически-реперфузионного повреждения и нарушения функции почек. Разумеется, композиция и/или состав, описанные в настоящем документе, могут быть применены для лечения раков, предпочтительно солидных раков, например, раков мозга, например, глиобластомы. Альтернативно, подлежащий лечению рак может представлять собой рак лимфоидного или миелоидного происхождения.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения композиции в соответствии с изобретением. В соответствии с предпочтительным воплощением способ включает стадии

(a) получения композиции в соответствии с настоящим изобретением посредством процесса продуцирования с подпиткой, обеспечивающим сбор клеток, и

(b) выделение композиции настоящего изобретения из сбора клеток.

Высокий выход представляет собой одно из преимуществ способа настоящего изобретения по сравнению со способами, известными из предшествующего уровня техники.

Стадия (а), т.е. «способ получения композиция в соответствии с настоящим изобретением с помощью периодического процесса с подпиткой, обеспечивающего сбор клеток» в дальнейшем мы также будем обозначать как «начальный процесс (USP)». Способ в соответствии со стадией (а) настоящего изобретения мы также будем обозначать как «USP изобретения». Фигура 1 показывает сравнение начального процесса в соответствии с предшествующим уровнем техники и предпочтительного воплощения начального процесса согласно настоящему изобретению.

Стадия (b), т.е. «выделение композиции настоящего изобретения из собранных клеток» в дальнейшем мы также будем обозначать как «процесс последующей обработки (DSP)».

Предпочтительно, стадия (а) включает серию стадий культивирования данной партии клетки-хозяина до тех пор, пока соответствующие параметры сбора не будут достигнуты, с последующим осаждением клеток и фильтрацией супернатанта, предпочтительно содержащего слитый белок. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения стадии начального процесса можно представить как серию, включающую следующие стадии.

Оттаивание,

субкультивирование,

50 л биореактор,

200 л биореактор,

1000 л биореактор,

осаждение,

глубинная фильтрация и

фильтрация через фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Разумеется, при осуществлении стадий культивирования от субкультивирования до 1000 л биореактора представляет собой только один из путей осуществления изобретения. Например, стадии культивирования также могут быть выполнены в биореакторах с различными размерами. Разумеется, при проведении серий стадий субкультивирования, специалист в данной области техники можно определить подходящие параметры, такие как температура, время роста, культуральные среды и т.д. Решающим фактором служит достижение соответствующих параметров сбора, которые могут представлять собой титр, плотность клеток, с титром, находящемся предпочтительно в диапазоне от 0,5 г/л до 5 г/л, более предпочтительно, от 1 г/л до 3 г/л, более предпочтительно, от 1,5 г/л до 5 г/л и, наиболее предпочтительно, от 1,8 г/л до 2 г/л. Примеры предпочтительных величин плотности клеток представляют собой от примерно 1×10⁶ до 1×10⁸ клеток/мл, предпочтительно, от примерно 1×10⁷ клеток/мл. В особенно предпочтительном воплощением настоящего изобретения титр равен от примерно 1,8 г/л до примерно 2 г/л и плотность клеток равна примерно 1×10⁷ клеток/мл.

Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно осуществляют в пептонсодержащей основной среде и в среде с известным химическим составом.

Стадия (b) может включать хроматографию с захватом, вирусную инактивацию, серию анионных и/или катионных хроматографий, вирусную фильтрацию и/или доведение до желаемой конечной концентрации белка.

Процесс последующей обработки, представляет собой очистку композиции, включающий изоформы APG101, полученные на стадии (а), в соответствии с определенной выше стадией (b), и включает стадии хроматографии, стадию вирусной инактивации, стадию ультрафильтрации, стадию диафильтрации и стадию вирусной фильтрации. В соответствии с предпочтительным воплощением, данный процесс последующей обработки включает три различные хроматографические стадии. Первую хроматографическую стадию осуществляют с применением смолы для захвата целевого белка и/или для удаления возникающих при осуществлении способа примесей (например, белков клетки-хозяина, ДНК) и или для снижения объема фракции, содержащей продукт. Соответствующая смола может быть выбрана специалистом в данной области техники. Mab Select SuRE представляет собой пример смолы, которая также представляет собой предпочтительное воплощение в соответствии с изобретением.

После данной первой хроматографической стадии следует стадия вирусной инактивации. Предпочтительно, данную стадию вирусной инактивации выполняют в кислой среде (например, рН 3,5±0,2) с последующей обработкой пула инактивации или при менее кислых величинах рН, таких как рН 5,0. Буферная основа для вирусной инактивации и последующего доведения до рН 5,0 может представлять собой исключительно 20 нМ Na-цитратный буфер.

После данной хроматографической стадии вирусной инактивации, осуществляют стадию ионообменной хроматографии для снижения содержания связанных с способом примесей, таких как ДНК. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительна стадия анионообменной хроматографии (AIEX), в особенности, в проточном режиме. Целевой белка проходит через колонку AIEX, в то время как ДНК связывается со смолой. Предпочтительно, пул, вышедший с колонки AIEX, в дальнейшем обрабатывают с помощью следующей колоночной стадии без какой-либо кондиционирования. Данная необязательная дополнительная стадия способствует общему снижению вирусного загрязнения и остаточных НСР, ДНК и обесцвеченного лиганда белка-А. В соответствии с предпочтительным воплощением применяют колонку со смолой смешанного действия capto-MMC в режиме связывание/элюция.

Элюат пропускают через вирусный фильтр (VF) и в дальнейшем применяют на стадии ультра-диафильтрации (UF/DF). В соответствии с изобретением на стадии вирусной фильтрации может быть получена специфическая объемная нагрузка, равная ≤100 л/м². Предпочтительно, применяют мембрану с отсечением по молекулярным массам, равным примерно 30 кДа. Разумеется, описанные выше отдельные стадии очистки, могут быть заменены стадиями, известными специалисту в данной области техники, обеспечивающими такой же или сопоставимый эффект.

Наконец, получают ультраконцентрат UF/DF и концентрацию композиции APG101 в соответствии с настоящим изобретением доводят до желаемой концентрации белка, такой как 20±2 мг/мл.

Фигура 2 иллюстрирует технологическую схему предпочтительного воплощения процесса последующей обработки в соответствии с настоящим изобретением. Как можно видеть на фигуре 3, процесс последующей обработки по изобретению характеризуется рядом преимуществ по сравнению с процессами последующей обработки, известными из предшествующего уровня техники. Например, после вирусной инактивации не требуется стадия инкубации при нейтральном рН. В отношении стадии вирусной фильтрацией, возможно получить объемную нагрузку ≤100 л/м² по сравнению с нагрузкой 37 г/м², известной для процессов предшествующего уровня техники. Кроме того, при применении буфера композиции настоящего изобретения, может быть достигнута более высокая концентрация белка, такая как 20 мг/мл по сравнению с 10 мг/мл в PBS.

Способ получения композиции в соответствии с настоящим изобретением, описанный в настоящем документе, приводит к получению изоформ APG101 в диапазоне pI от 4,0 до 8,5. Композиция, обеспеченная данным способом, содержит только очень небольшие количества нежелательных форм с более высокой молекулярной массой, таких как димеры или агрегаты. Изоформы APG101, обеспеченные данным способом, характеризуются высоким содержанием сиаловых кислот, а также N-концевым гликозилированием на основе Fc, включающим высокое содержание фукозилированных форм.

Фигуры

Фигура 1: Сравнение начального процесса изобретения с начальным процессом, не обладающим признаками изобретения

Фигура 2: Технологическая схема, показывающая предпочтительное воплощение процесса последующей обработки изобретения

Фигура 3: Сравнение процесса последующей обработки изобретения с не обладающим признаками изобретения процессом последующей обработки

Фигура 4а: IEF фракции АЕХ смеси APG10, полученной с помощью способа изобретения.

Фигура 4b: IEF фракции AEX смеси APG10, полученной способом, не обладающим признаками изобретения.

Фигура 5: Схематический обзор анализа эффективности.

Фигура 6: In vitro биологические активности (ЕС50) смесей изоформ APG101, полученные с помощью способа изобретения по сравнению с APG101, полученным способами, не обладающими признаками изобретения.

Фигура 7: Функциональная молекула APG101.

Фигура 8: Результаты термофлуоресцентного анализа сравнения буфера композиции APG101.

Фигура 9: Результаты термофлуоресцентного анализа сравнения вспомогательного вещества композиции APG101.

Фигура 10: Аналитические результаты исследования стабильности при форсированной деградации: вспомогательные вещества демонстрируют хорошие (+) и демонстрируют плохие (-) показатели для буфера в отношении стабильности APG101.

Фигура 11: Оценка с помощью термофлуоресцентного анализа термостабильности двух партий APG101 от компании «Apogenix» при прямом сравнении с коммерчески доступным Fas/Fc.

Пример 1

Способ получения композиция в соответствии с изобретением

Способ обеспечения композиции в соответствии с настоящим изобретением включает начальный процесс и процесс последующей обработки, определенные выше.

1. Начальный процесс

1.1 Описание партии

Композицию, включающая изоформы APG101, получают при культивировании с подпиткой. Размораживают две ампулы из Главного банка клеток MCB1AGA. Жизнеспособность при третьем субкультивировании должна быть >90%, число живых клеток должно быть >1,5×10⁶ клеток/мл. Если обе ампулы отвечали этим требованиям, то применяли культуру с более высокой жизнеспособностью для четвертого субкультивирования и инокуляции в реактор для вьфащивания клеток. Культуру с более низкой жизнеспособностью отбрасывают после третьего субкультивирования. Клеточную культуру наращивали во встряхиваемых колбах вплоть до общего объема ≥4 л перед инокуляцией в первый биореактор для выращивания клеток. В качестве первого биореактора для выращивания клеток применяли 50 л одноразовый биореактор компании «Xcellerex» (XDR). Культуру клеток культивируют в течение трех дней перед перенесением во второй реактор для выращивания клеток 200 л XDR. После очередных 3-х дней культивирования, полученную культуру инокулировали в 1000 л реактор для получения клеток. Процедуру сбора начинали на день 13 или ранее, если жизнеспособность падала ниже 61%.

1.2 Клеточная линия

Примененные клетки из основного банка клеток (МСВ) обозначают как «MCB1AGA».

1.3 Оттаивание и субкультивирование

Две криопробирки с МСВ последовательно «реанимировали». Следующую процедуру оттаивания применяют для каждой ампулы: Криопробирки размораживают в химическом стакане с WFI при 36,8°С (заданная величина) до тех пор, пока не останется маленького кристалла льда. Клетки затем переносили в приблизительно 10 мл охлажденной (при 5±3°С) среды для выращивания (среда №. 3001772, приобретена у РАА), дополненной 6 мМ L-глутамином (конечная концентрация) и 50 нМ МТХ (конечная концентрация). Для удаления остаточного DMSO, выполняли стадию отмывки в охлажденной (5±3°С) среде с помощью центрифугирования. После стадии центрифугирования осадок клеток ресуспендировали в 50 мл предварительно нагретой (36,8±1°С) среды. Концентрацию и жизнеспособность клеток определяли с помощью устройства для подсчета клеток «Cedex». Данную оттаянную культуру, наконец, инкубировали в шейкере-инкубаторе с рабочим объемом 50 мл, применяя 250 мл встряхиваемые колбы.

Первая и вторая субкультуры представляли собой стабильные разделения, выполненные с рабочим объемом, равным 120 мл (первая субкультура) и 150 мл (вторая субкультура) с применением 500 мл встряхиваемых колб. Третья и четвертая субкультуры представляли собой первую фазу наращивания, их культивировали в 2000 мл встряхиваемых колбах с рабочим объемом, равным 800 мл. Для этих первых четырех пересевов, в качестве среды субкультивирования применяли предварительно нагретую (при 36,8±1°С) среду для выращивания (среда №. 3001772, приобретена у РАА), дополненную 6 мМ L-глутамином и 50 нМ МТХ (конечные концентрации).

Измерение концентрации и жизнеспособности клеток выполняли перед каждой стадией культивирования, применяя устройство для подсчета клеток «Cedex». Следующую субкультуру получали в зависимости от роста клеток.

На этапе субкультуры №5, встряхиваемые колбы объединяли в 5 л стеклянной бутыли. Из данного объединения отбирали образцы для определения концентрации и жизнеспособности клеток. Затем, в зависимости от фактической VCC, требуемый объем клеточной культуры переносили в 50 л биореактор для выращивания клеток.

1.4 Биореактор для выращивания клеток (50 л)

50-литровый биореактор для выращивания клеток был оснащен установленной на дне системой для перемешивания с магнитным приводом и 1 мм барботажными дисками. Перед инокуляцией в 50 л биореактор загружали приблизительно 20 л среды для выращивания (среда №. 3001772, приобретена у РАА), дополненной 6 мМ L-глутамином (конечная концентрация). Данные параметры были применены к среде для предварительной обработки и к способу культивирования в системе посевных ферментеров.

Когда параметры способа стабилизировались в приемлемых для них диапазонах, начинали перенос инокулята. После инокуляции реактор заполняли средой до конечного рабочего объема, равного 25 л. Во время наращивания клеточной массы в 50 л биореакторе питательные добавки не вносили. рН контролировали, вводя СО₂ с помощью барботажного устройства. Уровень кислорода, при необходимости, контролировали путем аэрации кислородом с погружением в жидкость. Газовый поток воздуха наслаивали на свободное пространство. Аэрацию с погружением в жидкость выполняли сжатым воздухом со скоростью потока, равной 0,1 л/мин, которую можно было регулировать для доведения рСО₂. Ожидаемое время культивирования в биореакторе для выращивания клеток было равно 3 дня перед инокуляцией в 200 л биореактор для выращивания клеток.

7.5 Биореактор для выращивания клеток (200 л)

200 л биореактор для выращивания клеток был оснащен установленной на дне системой для перемешивания с магнитным приводом и 1 мм барботажными дисками. Перед инокуляцией в 200 л биореактор загружали приблизительно 100 л среды для выращивания (среда №. 3001772, приобретена у РАА), дополненной 6 мМ L-глутамином (конечная концентрация). Данные параметры были применены к среде для предварительной обработки и к способу в системе посевных ферментеров культивирования.

Когда параметры способа стабилизировались в приемлемых для них диапазонах, начинали перенос инокулята. После инокуляции, добавляли среду до конечного рабочего объема, равного 120 л. Во время наращивания клеточной массы в 200 л биореакторе питательные добавки не вносили. рН корректировали введением газообразного СО₂. Уровень кислорода при необходимости контролировали путем аэрации кислородом с погружением в жидкость. Газовый поток воздуха наслаивали на свободное пространство.

Аэрации с погружением в жидкость осуществляли сжатым воздухом со скоростью потока 0,4 л/мин, которая может быть приспособлена для корректировки pCO₂. Ожидаемое время культивирования в биореакторе для выращивания клеток было равно 3 дня перед перенесением клеток в 1000 л реактор для получения клеток. 1.6 Способ получения с подпиткой

Способ получения композиции, включающей изоформы APG101, представляет собой культивирование с подпиткой. 1000 л реактор для получения клеток был оснащен установленной на дне системой для перемешивания с магнитным приводом и 1 мм барботажными дисками. Перед инокуляцией 1000 л биореактор заполняли приблизительно 580 л среды роста (среда №. 3001829, приобретена у компании «Becton Dickison»), дополненной 6 мМ L-глутамином (конечная концентрация, вычисленная относительно конечного исходного объема, равного 720 л). Когда параметры способа стабилизировались в приемлемых для них диапазонах, начинали перенос инокулята из биореактора для выращивания клеток в реактор для получения клеток. Целевая концентрация клеток после инокуляции в реактор для получения клеток равна 0,3*10⁶ жизнеспособных клеток/мл в общем объеме, равном 720 л. Необходимый объем клеточной культуры из биореактора для выращивания клеток переносили в реактор для получения клеток, который затем заполняли средой роста (среда №. 3001829, приобретена у компании «Becton Dickison») до тех пор, пока достигали исходного объема, равного 720 л. Клеточные культуры обеспечивали питательной средой А (РМ30728), начиная со дня 3, и питательной средой с глюкозой В (РМ30729).

Ежедневную подпитку начинали отдельно питательной средой В, можно подпитывать одновременно питательной средой А и глюкозой.

- Питательная среда В:

Болюсную подпитку начинали на день 3 после отбора проб.

Периодичность подкормки на дни 3-6: 5,184 г/л/день (рассчитано на исходный объем, равный 720 л)

Периодичность подкормки на дни 7-12: 2,592 г/л/день (рассчитано на исходный объем, равный 720 л)

- Питательная среда А:

Болюсную подпитку начинали на день 3 после отбора проб.

Периодичность подкормки на дни 3-5: 43,2 г/л/день (рассчитано на исходный объем, равный 720 л)

Периодичность подкормки на дни 6-12: 21.6 г/л/день (рассчитано на исходный объем, равный 720 л)

Подпитка D-глюкозой: Глюкозу добавляли, когда фактическая концентрация D-глюкозы снижалась <5 г/л, начиная со дня 7. Концентрацию D-глюкозы доводили до 5 г/л путем добавления требуемых количеств D-глюкозы подпитки.

Уровень кислорода контролировали путем применения каскадного регулятора кислорода с 3 приоритетами: Приоритет 1 состоял при необходимости из тока воздуха до тех пор, пока газовый поток, равный 10 л/мин не будет достигнут.Затем перемешивание (приоритет 2) непрерывно увеличивали до тех пор, пока не достигали скорость перемешивания, равную 100 оборотов в минуту. Третий приоритет состоит из барботирования О₂ с погружением в жидкость при необходимости.

Ток воздуха наслаивали на свободное пространство.

рН контролировали с помощью СО₂. При необходимости добавляли приготовленный 1 М Na₂CO₃. Регулярно наблюдали образование пены и при необходимости добавляли противовспениватель.

Процедуру сбора клеток начинали на день культивирования 13, или ранее, если жизнеспособность падала ниже <61% (Cedex). Первая стадия процедуры представляет собой стадию осаждения клеток, на которой клеточный бульон охлаждали до 10±5°С. Когда температура опускалась ниже 20°С, мешалку, аэрацию и рН-контроль выключали. После, как минимум 12 часов осаждения, начинали стадию осветления. Супернатант осветляли в две стадии: с помощью глубинной фильтрации и фильтрацией через фильтр с размером пор 0,2 мкм.

1.7 Осаждение

Процедуру сбора клеток начинали со стадии осаждения. Культурный бульон охлаждают до конечной температуры 10±5°С. Когда температура снижалась до <20°С, перемешивание, pO₂ и рН-контроль прекращали. После минимум 12-ти часов и максимум 22-х часов осаждения, начинали глубинную фильтрацию.

1.8 Фильтрация

Глубинную фильтрацию выполняли с помощью одноразовой системы для глубинного фильтрования Stax™ компании «Pall», загрузка 7х PDK5 и глубинные фильтры 2х PDD1. За фильтрацией через фильтры с размером пор 0,2 мкм следовало осветление. Глубинные фильтры промывали приблизительно 900 л PBS со скоростью потока ≤100 л/м²/час. Остаточную жидкость выдували из системы с помощью воздуха. Способ фильтрации выполняли со скоростью работы насоса ≤3,5 л/мин и максимальным давлением, равным 1,0 бар. Для увеличения извлечения продукта, фильтры впоследствии промывали приблизительно 60 л PBS с рН 7,25 и продували сжатым воздухом при максимальном давлении в 0,8 бар. Отфильтрованные собранные клетки переносили непосредственно через стенки канала в блок GD, собирали в 1000 л Mixtainer и хранили при комнатной температуре.

2. Процесс последующей обработки

В иллюстративных целях в дальнейшем будет дано описание индивидуальных стадий очистки при выполнении последующего способа.

2.1 Захват белка А (С10)

Полученный на предыдущей стадии отфильтрованный материал был переносен глубинной фильтрацией (0,2 мкм) и охлажден до 5±3°С. Перед обработкой собранные клетки разделяли на четыре равные аликвоты и хранили при комнатной температуре в течение ночи, чтобы достичь конечной температуры способа, равной 21±3°С. Обработку собранных клеток осуществляли без какого-либо дополнительного кондиционирования для четырех циклов.

Элюцию индуцировали с помощью стадии с низким рН. Профили при UV280 четырех циклов были в значительной степени сопоставимы и продемонстрировали ожидаемую форму, включающую единственный типичный пик в рамках стадии элюции.

Выходы пробегов белка А варьировали от 94 до 98%. Следовательно, извлечения продукта для пробегов белка А были в ожидаемом диапазоне. Кроме того, все извлечения были сравнимы друг с другом и подтверждали данные, полученные в способе переноса и адаптации.

2.2 Вирусная инактивация (V10)

Сразу же после сбора элюата белка А, в течение 5 мин добавляли фиксированный объем (уточнение: рН 3,5±0,2) 20 мМ лимонной кислоты для инактивации оболочечных вирусов. Растворы, прошедшие вирусную инактивацию, инкубировали отдельно в течение 75±15 мин при комнатной температуре (21±3°С). Наконец, рН растворов инактивации доводили до рН 5,0±0,2 добавлением фиксированного объема 20 мМ Na₃-цитрата для прекращения вирусной инактивации. Полные схемы кондиционирования были следующими:

В дальнейшем, кондиционированные растворы для вирусной инактивации фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм («Sartobran Р») для отделения потенциально сформировавшихся преципитатов и для ингибирования роста микроорганизмов в растворе способа. Каждую кондиционированную партию после вирусной инактивации хранили при 21±3°С и, наконец, объединяли перед обработкой на стадии AJEX (С20).

2.3 AIEX (С20) - Колонка

После вирусной инактивации, доведения рН и фильтрации кондиционированный пул вирусной инактивации обрабатывали на колонке «Capto Q» в режиме FT за два цикла. Способ включал стадию промывки без разборки 1 (буфер - 0,5 М NaOH), стадию уравновешивания (20 мМ Na-цитрат, рН 5), стадию нагрузки кондиционированным раствором вирусной инактивации, стадию отмывки (20 мМ Na-цитрат, рН 5,0), стадию регенерации (20 мМ Na-цитрат, 1 М Na-Cl, рН 5,5), стадию промывки без разборки 2 (0,5 М NaOH) и стадию хранения (0,01 М NaOH).

Профили при UV280 двух циклов совпадали и продемонстрировали ожидаемое увеличение в профиле UV280 поглощения при нанесении кондиционированного элюата белка А.

Каждая полученная сошедшая с колонки фракция была, наконец, профильтрована через фильтр с размером пор 0,22 мкм («Sartobran Р») в целях снижения бионагрузки. Впоследствии, отдельные фракции объединяли и хранили при 21±3°С до дальнейшей обработки на стадии ММС (С30). Сравнение смеси изоформы APG101 во фракциях AIEX, полученных с помощью способа изобретения, и APG101, полученного с помощью не обладающего признаками изобретения способа, с помощью IEF, показано на фигурах 4а и 4b.

Выходы пробегов AIEX были равны примерно 100%.

2.4 ММС (С30) - Колонка

После стадии С20 пул продукта AIEX обрабатывали на колонке Capto ММС в три цикла. Способ включал стадию промывки без разборки (буфер 0,5 М NaOH), стадию уравновешивания (20 мМ Na-цитрат, рН 5,0), стадию нагрузки с помощью AIEX продукт/промывка, стадию промывки (20 мМ Na-цитрат, рН 5,0), стадию элюции (50 мМ Na-фосфат, 105 мМ NaCl, рН 7,4), стадию регенерации (3 М NaCl, рН 11), стадию промывки без разборки (0,5 М NaOH), стадию кондиционирования (50 мМ Na-фосфат, 105 мМ NaCl, рН 7,4) и стадию хранения (20 мМ Na-фосфат, 20% этанол, рН 7,5).

Элюцию индуцировали увеличением рН. Профили при UV280 четырех циклов были в значительной степени сопоставимы и продемонстрировали ожидаемую форму, включавшую единственный типичный пик в рамках стадии элюции.

Затем, каждую фракцию элюата фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм («Sartobran Р») и хранили при 21±3°С. Перед дальнейшей обработкой на стадии вирусной фильтрации определенные фракции элюата с «Capto ММС» объединяли.

Выходы пробегов ММС варьировали в диапазоне примерно 100%.

2.5 Вирусная фильтрация (I10)

После стадии С30 объединенный элюат Capto ММС (1181 мл) перед вирусной фильтрацией пропускали через фильтр Durapore («Millipak 20») с размером пор 0,1 мкм. Вирусную фильтрацию выполняли, нанося аликвоту (887 мл) 0,1 мкм фильтрата на вирусный фильтр «Planova 15N» (100 см), уравновешенный 50 мМ PBS, рН 7,4 (буфер элюции для Capto ММС) при рабочем давлении 0,8±0,1 бар. Объем после промывки был равен 0,5 мл/см², при применении буфера для уравновешивания. Перед применением фильтра было проведено тестирование фильтра, основанное на обнаружении пузырьков воздуха под давлением. Скорость тока фильтрата оставалась постоянной во время обработки (са. 22 л/м²*час).

Вирусная фильтрация давала выход в 99%.

В дальнейшем, остаточный 0,1 мкм фильтрат и фракцию фильтрата от вирусной фильтрации объединяли и хранили при 5±3°С до дальнейшей обработки на последующей стадии UF/DF.

2.6 Улътрафилътрация/Диафилътрация (I20)

Перед диафильтрацией фильтрат I10 концентрировали в системе с перекрестным потоком ÄKTA до концентрации белка, равной 25,0±2,0 мгароки/мл, применяя две 30 кДа кассеты «Pellicon 3». После этого, была выполнена диафильтрация для изменения буферной системы до следующего буфера:

50 мМ Na-фосфат, 5% сорбитол, рН 6,5

Материал был подвергнут ультрафильтрации до указанных выше концентраций и диафильтрации с фактором 7,0±0,5. Параметры ультра- и диафильтрации были следующими:

Расход ретентата: 450 л/(м²*час)

ТМР: 1,2±0,1 бар

UF/DF давали 97%-ный выход продукта.

2.7 Доведение концентрации лекарственного вещества

Для окончательного доведение концентрации, определенный объем (107 мл) буфера композиции (50 мМ Na-фосфат, 5% сорбитол, рН 6,5) добавляли к пулу ретентата UF/DF. Конечная концентрация лекарственного вещества, определенная по А280, была равна 20,4 мг/мл. Наконец, лекарственное вещество фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм («Sartobran P»). Затем, аликвоты лекарственного вещества объемом 200 мкл разливали в 500 мкл флаконы.

2.8 Суммарный выход

Выход по стадиям и суммарный выход, полученные после ProA-HPLC и анализа по А280, приведены в таблице 1. Отбор проб для определения целевых молекул не принимали во внимание при расчете выходов.

Идентичность смеси изоформ APG101 подтверждали с помощью SDS Page и IEF в невосстанавливающих условиях. Образец изоформ показал дополнительные основные полосы по сравнению с веществом сравнения и незначительный сдвиг в распределении изоформ в сторону кислой pI.

Об этом свидетельствует, например, сравнение геля IEF фракций АХ, полученных способом настоящего изобретения, и смеси APG10, полученной способом, не обладающим признаками изобретения, в соответствии с фигурой 1.

Кроме того, смесь изоформ APG101 настоящего изобретения отличается присутствием углеводов (сиаловые кислоты N-гликанов).

Углеводы (степень разветвления/N-гликаны)

В таблице 2 суммирован анализ структуры углеводов. Несмотря на сопоставимые структуры углеводов между веществом сравнения и композицией изобретения, распределение структур углеводов отличается.

Углеводы (сиаловые кислоты)

Анализ содержания сиаловых кислот на моль APG101 композиции изобретения суммирован в таблице 3.

Вещество сравнения всегда относилось к смеси APG101, которая не была получена способом настоящего изобретения.

Наконец, проводили анализ для измерения биоактивности смеси в соответствии с настоящим изобретением, включающей изоформы APG101.

3. Способ определения активности изоформ APG101 in vitro

Для определения биологической активности APG101A применяли клеточный анализ с помощью постоянной Т-клеточной линии Jurkat A3. Данная активность схематически показана на фигуре 5.

С данным анализом апоптоза с применением клеток Jurkat A3, определяли величины ЕС50 для ингибирования под действием APG101 индуцированного APG293 (=CD95L-T4; 250 нг/мл) апоптоза.

Кратко, Jurkat A3 клетки выращивали в колбах со RPMI 1640-средой + GlutaMAX (GibCo), дополненной 10% FBS, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Сеяли по 100000 клеток на лунку в 96-луночный планшет для микротитрования. CD95L-Т4 (APG293) при постоянной концентрации, равной 250 нг/мл, инкубировали в отдельном 96-луночном планшете для микротитрования в течение 30-ти минут при 37°С с различными концентрациями APG101. К клеткам добавляли смесь APG101/CD95L-T4 и затем их инкубировали в течение 3-х часов при 37°С.Клетки лизировали, добавив буфер для лизиса (250 мМ HEPES, 50 мМ MgCl₂, 10 мМ EGTA, 5% Triton-X-100, 100 мМ DTT, 10 мМ AEBSF, рН 7,5) и планшеты оставляли на льду в течение от 30-ти минут до 2-х часов. Параллельно с протеканием апоптоза происходит повышение активности каспаз (например, каспазы 3 и 7). Следовательно, для определения степени апоптоза применяют расщепление субстрата каспаз Ac-DEVD-AFC. Фактически, активность каспазы коррелирует с процентом апоптотических клеток, определенных морфологически после окрашивания клеток с пропидийиодидом и Hoechst-33342.

Для анализа активности каспаз, 20 мкл лизата клеток переносили в черный 96-луночный планшет для микротитрования. После добавление 80 мкл буфера, содержащего 50 мМ HEPES, 1% сахарозу, 0,1% CHAPS, 50 мкМ Ac-DEVD-AFC и 25 мМ DTT, рН 7,5, планшет переносили в спектрофотометр для прочтения микропланшетов «Тесал» и регистрировали увеличение интенсивности флуоресценции в течение определенного времени (длина волны возбуждения 400 нм, длина волны излучения 505 нм). Применяя компьютерную программу «GraphPad Prism», рассчитывали величины ЕС50 для APG101 (т.е. снижение индукции апоптоза для данных концентраций CD95L на 50%).

Определение биологической активности APG101 с применением анализа на эффективность обеспечивает:

- высокую специфичность. Взаимодействуя с CD95, CD95L-T4 индуцирует апоптоз в клетках Jurkat A3. Взаимодействие CD95/CD95L-T4 специфически блокируют добавлением APG101.

- применение соответствующей клеточной системы; индукция апоптоза представляет собой одну из важных физиологических особенностей сигнапльного пути CD95/CD95L и может быть прослежена на хорошо охарактеризованной человеческой Т-клеточной линии Jurkat A3.

- высокая пропускная способность для образцов за счет применения 96-луночных планшетов для микротитрования и короткие времена инкубации.

Фигура 6 демонстрирует биологическую активность (ЕС50) смесей изоформ APG101, полученных неактивным способом (образцы изобретения) по сравнению с APG101, полученных с помощью способов, не обладающих признаками изобретения. Активность была сопоставима.

4. Термофлуоресцентный анализ композиции APG101

Стабильность композиции в соответствии с настоящим изобретением подтверждали с помощью термофлуоресцентного анализа (сравни фигуры 8 и 9).

Определение точки температурного перехода APG101 осуществляли с помощью термофлуоресцентного (TF) анализа. При этом флуоресцентный краситель связывается с гидрофобными участками белка. При повышении температуры белок разворачивается и больше красителя может связаться, что приводит к увеличению сигнала флуоресценции. Таким образом, более высокие точки температурного перехода (температуры плавления, Tm) указывают на более стабильные состояния для APG101. Условия проведения анализа показаны в таблице 4.

Точку температурного перехода определяли так, что она представляла собой точку перегиба в увеличения флуоресцентного сигнала при увеличении температуры. Тестировали стабильность APG101 в различных буферных системах (фигура 8).

С помощью термофлуоресцентного анализа определяли точки температурного перехода APG101 с исходным веществом 3 в отношении различных вспомогательных веществ, а именного, сахара, многоатомного спирта, аминокислот и полигликоля. Экспериментальный подход был идентичен описанному выше. Результаты показаны на фигуре 9. Величины Tm возрастали с увеличением концентрации сахарозы, сорбитола и глицина. Добавление глицилглицина (Gly-Gly) или PEG не показало положительных стабилизирующих эффектов.

Кроме того, провели термофлуоресцентный анализ для сравнения партий APG101, полученных в соответствии с изобретением, с коммерчески доступным образцом Fas/Fc. Образцы (APG101 или Fas/Fc) применяли в концентрации, равной 50 мкг/мл.

Термофлуоресцентный анализ ясно показывает превосходство двух партий APG101 изобретения (партия F10176 и партия 1011626) по сравнению с коммерчески доступным Fas/Fc от компании «Sigma» в отношении температурной стабильности (фигура 11).

1. Фармацевтическая композиция, которая ингибирует сигнальный путь CD95, включающая смесь изоформ слитого белка APG101, где немодифицированный APG101 представляет собой слитый белок, содержащий 400 аминокислот SEQ ID NO:1, и имеется в указанной смеси в количестве, не превышающем 1 моль %, где изоформы отличаются от APG101 длиной белка, имеют разную длину и дополнительно могут содержать замены и/или делеции аминокислот и имеют по меньшей мере 95% идентичности с APG101 и распределены в рамках pI-диапазона 4,0-8,5, причем изоформы являются вариантами APG101, представляющими собой APG101, укороченный с N-конца на 16, 20 или 25 аминокислот.

2. Композиция по п. 1, в которой APG101 содержит домен Fc, который представляет собой домен Fc человека.

3. Композиция по п.1, в которой pI-диапазон равен 4,5-7,8, предпочтительно 5,0-7,5.

4. Композиция по п.1, включающая 0,0-5,0 моль% высокомолекулярных форм слитого белка, таких как димеры и/или агрегаты.

5. Композиция по п.1, включающая высокие количества сиаловых кислот.

6. Композиция по п.1, в которой домен Fc или его функциональный фрагмент гликозилирован по N-связи и в особенности характеризуется высокими количествами фукозилированных форм.

7. Композиция по п.1, включающая блокированные с N-конца слитые белки, такие как слитые белки, блокированные с помощью пиро-Глу-модификации, и/или включающая слитые белки, имеющие свободный N-конец.

8. Композиция по п.1, включающая 80-99 моль% слитых белков, блокированных с N-конца.

9. Состав, который ингибирует сигнальный путь CD95, включающий

(a) композицию по любому одному из пп.1-8,

(b) фосфат, предпочтительно, от примерно 20 мМ до примерно 100 мМ фосфата, более предпочтительно, примерно 50 мМ фосфата, и

(с) средство, повышающее вязкость, такое как сорбитол, предпочтительно, от примерно 0,1-10 масс%, более предпочтительно, от примерно 5 масс%,

где состав имеет величину pH в диапазоне 4-8.

10. Способ получения композиции по любому из пп. 1-8, где способ включает стадии:

(a) получения композиции по любому из пп. 1-8 посредством процесса продуцирования с подпиткой, обеспечивающего сбор клеток, и

(b) выделения композиции по любому из пп. 1-8 из собранных клеток,

в котором стадия (a) включает серию стадий культивирования данного образца партии клеток до тех пор, пока не будут достигнуты соответствующие параметры сбора, с последующим осаждением клеток и фильтрацией супернатанта, содержащего слитый белок, и/или

стадия (b) включает хроматографию с захватом, вирусную инактивацию, серию анионных и/или катионных хроматографий, вирусную фильтрацию и/или доведение концентрации белка до желаемой конечной концентрации,

причем указанный способ осуществляют в пептон содержащей основной среде.