Способ разложения биоразлагаемой смолы
Настоящее изобретение относится к способу эффективного разложения биоразлагаемой смолы. Описаны варианты способа разложения биоразлагаемой смолы. Один вариант способа разложения биоразлагаемой смолы включает разложение биоразлагаемой смолы в буферном растворе, содержащем фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, с оптимальным уровнем pH, составляющим 7,5 или выше. Буферный раствор представляет собой раствор трис-аминометана, рН которого доведен до уровня 9,5 или выше. Фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, является щелочной протеазой. Другой вариант способа разложения биоразлагаемой смолы включает разложение смолы в буферном растворе, содержащем савиназу и/или эсперазу. При этом определяют оптимальную концентрацию фермента, при которой достигается максимальное разложение биоразлагаемой смолы в реакционном растворе. Разложение осуществляют в буферном растворе с концентрацией фермента, обеспечивающей коэффициент разложения биоразлагаемой смолы, составляющий 60% или выше, где коэффициент разложения биоразлагаемой смолы при указанной оптимальной концентрации рассматривается как 100%. Буферный раствор содержит буферный раствор трис-аминометана или буферный раствор 2-(циклогексиламино)этансульфоновой кислоты. Биоразлагаемая смола содержит смолу на основе полимолочной кислоты. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 18 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу эффективного разложения биоразлагаемой смолы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В настоящее время биоразлагаемые смолы, такие как смолы на основе полимолочной кислоты, находят все большее применение, включая такие области применения, как упаковочные материалы, мульчирующие пленки сельскохозяйственного назначения, способ бурения скважин для добычи полезных ископаемых и т.п. Данная тенденция породила спрос на разработку технологий, удовлетворяющих требованиям различных применений, например усовершенствованная технология повышения скорости разложения биоразлагаемой смолы и технология контроля запуска процесса разложения и скорости разложения. Способ вращательного бурения представляет собой способ, при котором бурение осуществляется с помощью буровой установки, в то время как осуществляется циркуляция глинистой воды. При таком способе образуется подобие фильтрующей перегородки под названием «фильтрационная корка бурового раствора» посредством использования понизителя фильтрации в качестве финишной жидкости. Таким образом, стенка скважины поддерживается в стабильном состоянии для предотвращения смятия, и трение снижается. В то же время, при методе гидравлического разрыва, наполняющая скважину жидкость подвергается высокому давлению для образования трещин рядом со скважиной. Таким образом, улучшается проницаемость (текучесть жидкости) около скважины и увеличивается эффективное поперечное сечение, через которое в скважины протекает ресурс, такой как нефть или газ, для повышения продуктивности скважины.
В случае финишной жидкости, в которой в качестве понизителя фильтрации в основном используют карбонат кальция или гранулированную соль, для удаления понизителя фильтрации необходима обработка кислотой: понизитель фильтрации засоряет пласт скважины, вызывая нарушение производства. Кроме того, жидкость, используемая при методе гидравлического разрыва, также имеет название «жидкость для гидравлического разрыва», и в прошлом использовали вязкие текучие среды, такие как отвержденный бензин. По мере разработки получения сланцевого газа из сланцевого пласта, присутствующего на относительно неглубоком участке, и т.п., в последнее время, принимая во внимание воздействие на окружающую среду, использовали водные дисперсии, в которых полимер растворяют или диспергируют в воде. Известно, что полимолочная кислота является таким полимером.
В частности, полимолочная кислота является веществом, проявляющим гидролизуемость и способность к ферментативному разложению. Даже когда полимолочная кислота остается в почве пласта, происходит разложение полимолочной кислоты с помощью воды или ферментов в почве пласта. Таким образом, полимолочная кислота не оказывает никакого неблагоприятного воздействия на окружающую среду. Кроме того, следует отметить, что вода, используемая в качестве диспергирующей среды, не оказывает почти никакого влияния на окружающую среду по сравнению с бензином и т.п.
Кроме того, при наполнении скважины такой водной дисперсией полимолочной кислоты под давлением полимолочная кислота проникает внутрь близлежащего пространства скважины. Затем полимолочная кислота гидролизуется, теряя форму смолы, и образуются полости (т.е. трещины) в тех частях, в которые проникает полимолочная кислота. Таким образом, можно увеличить площадь пространства, через которое ресурс попадает в скважину.
Кроме того, полимолочная кислота выступает в качестве понизителя фильтрации. В частности, полимолочная кислота функционирует в качестве ингибитора избыточного проникновения воды, используемой в качестве диспергирующей среды, в почву пласта для сведения к минимуму изменения среды в пласте. Так как полимолочная кислота разлагается в почве пласта, обработка кислотой не требуется.
Кроме того, молочная кислота, которая представляет собой продукт разрушения полимолочной кислоты, является органической кислотой. При разложении полимолочной кислоты происходит выделение молочной кислоты, и эта кислота разрушает сланец в сланцевом пласте. Таким образом, молочная кислота функционирует в качестве ускорителя порообразования в сланце.
Однако скорость гидролиза полимолочной кислоты низкая при температуре ниже 100°C, относительно быстро ее гидролиз происходит при температуре 100°C или выше. Таким образом, при добыче сланцевого газа из участка в почве пласта с низкой температурой и т.п. использование полимолочной кислоты является малоэффективным и требует усовершенствования.
С другой стороны, предложено использование полигликолевой кислоты вместо полимолочной кислоты. Также известно, что полигликолевая кислота является биоразлагаемой смолой и, кроме того, обладает более высокой гидролизуемостью, чем полимолочная кислота. Например, скорость гидролиза полигликолевой кислоты намного выше при температуре приблизительно 80°C, чем у полимолочной кислоты. Таким образом, полигликолевая кислота эффективна в качестве альтернативы полимолочной кислоте.
Однако проблема состоит в том, что стоимость полигликолевой кислоты намного выше, чем полимолочной кислоты. Это является серьезным недостатком при методе гидравлического разрыва, при котором жидкость для гидравлического разрыва используют в большом количестве. Кроме того, при определенных температурных условиях невозможно достичь разлагаемости, в достаточной мере удовлетворяющей требованиям.
Для эффективного разложения биоразлагаемой смолы была, например, разработана легко разлагаемая смоляная композиция, биоразлагаемость которой повышается при смешивании алифатического сложного полиэфира с выделением кислоты при гидролизе (Международная публикация №WO 2008/038648). Кроме того, опубликованы данные о способе разложения вышеописанной легко разлагаемой смоляной композиции и т.п. (публикация заявки на патент Японии № 2010-138389). Также представлены данные о способе разложения биоразлагаемой смолы в растворе посредством использования любой из различных гидролаз (публикация заявки на патент Японии № 2003-284550 и 2005-162832). Однако существует необходимость в разработке технологии для дальнейшего повышения скорости разложения биоразлагаемой смолы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является обеспечение способа эффективного разложения биоразлагаемых смол.
Авторы изобретения настоящей заявки обнаружили, что при разложении биоразлагаемой смолы в буферном растворе возможно эффективное разложение биоразлагаемой смолы посредством использования конкретного фермента, разлагающего биоразлагаемую смолу, и конкретного буферного раствора.
Более конкретно, первый аспект настоящего изобретения относится к способу разложения биоразлагаемой смолы, включающему разложение биоразлагаемой смолы в буферном растворе, содержащем фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, с оптимальным уровнем pH, составляющим 7,5 или выше, где
отсутствует анион, происходящий из буферного компонента, в одной части уравнения равновесия буферного действия буферного раствора, и
уровень pH буферного раствора корректируют в пределах диапазона pH, создающего условия для сдвига равновесия в ту сторону, в которой отсутствует анион.
Кроме того, авторы настоящей заявки на изобретение обнаружили, что при разложении биоразлагаемой смолы в растворе конкретная гидролаза имеет оптимальную концентрацию (т.е. пик разложения в зависимости от концентрации фермента), при которой достигается максимальная эффективность разложения биоразлагаемой смолы.
Более конкретно, второй аспект настоящего изобретения относится к способу разложения биоразлагаемой смолы, включающему разложение биоразлагаемой смолы в жидкости с ферментативной реакцией, содержащей фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, с оптимальной концентрацией, где
разложение осуществляют в реакционной жидкости с концентрацией фермента, обеспечивающей коэффициент разложения биоразлагаемой смолы, составляющий 60% или выше, причем коэффициент разложения биоразлагаемой смолы при указанной оптимальной концентрации рассматривается как 100%.
Настоящее изобретение обеспечивает возможность для быстрого разложения биоразлагаемой смолы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг. 1 представлены результаты разложения пленки из полимолочной кислоты посредством использования буферных растворов различных видов и с различными уровнями pH.
На фиг. 2 представлена кривая разложения пленки из полимолочной кислоты с Савиназой.
На фиг. 3 представлена кривая разложения смолы из полимолочной кислоты с Эсперазой.
На фиг. 4 представлена кривая разложения смолы из полимолочной кислоты с Протеиназой K.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Первый аспект настоящего изобретения относится к способу разложения биоразлагаемой смолы, включающему разложение биоразлагаемой смолы в буферном растворе, содержащем фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, с оптимальным уровнем pH 7,5 или выше, где отсутствует анион, полученный из буферного компонента, в одной части уравнения равновесия буферного действия буферного раствора, и уровень pH буферного раствора корректируют в пределах диапазона pH, создающего условия для сдвига уравнения в ту сторону, в которой отсутствует анион.
В первом аспекте настоящего изобретения биоразлагаемая смола конкретно не ограничена, и используют алифатический сложный полиэфир, который, как правило, является биоразлагаемым и т.п. Примеры биоразлагаемого алифатического сложного полиэфира включают смолы на основе полимолочной кислоты, полибутиленсукцинат, поликапролактон, полигидроксибутират, сополимер полибутиленсукцината/адипата, сополимеры вышеописанных алифатических сложных полиэфиров, сополимеры ароматического сложного полиэфира, такие как полиэтилентерефталат, полиэтиленнафталат или полибутилентерефталат с любым из вышеописанных алифатических сложных полиэфиров и т.п. Один из этих сложных полиэфиров можно использовать в отдельности или можно использовать комбинацию двух или более из перечисленного.
Примеры компонентов, образующих вышеописанные сополимеры алифатических сложных полиэфиров, включают полиолы, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль, бутандиол, октанедиол, додеканедиол, неопентилгликоль, глицерин, пентаэритритол, сорбитан, бисфенол A и полиэтиленгликоль; дикарбоновые кислоты, такие как янтарная кислота, адипиновая кислота, себациновая кислота, глутаровая кислота, декандикарбоновая кислота, циклогександикарбоновая кислота, терефталевая кислота, изофталевая кислота и антрацендикарбоновая кислота; гидроксикарбоновые кислоты, такие как гликолевая кислота, L-молочная кислота, D-молочная кислота, гидроксипропионовая кислота, гидроксимасляная кислота, гидроксивалериановая кислота, гидроксикапроновая кислота, миндальная кислота и гидроксибензойная кислота; лактоны, такие как гликолид, капролактон, бутиролактон, валеролактон, пропиолактон и ундекалактон и т.п.
Полимеры, которые можно смешивать, включают целлюлозу, ее производные, хитин, гликоген, хитозан, полиаминокислоты, крахмал и т.п. Следует отметить, что при использовании полимолочной кислоты молочной кислотой, используемой для полимеризации, может быть или L-изомер, или D-изомер, или ею может быть смесь L-изомера и D-изомера.
Предпочтительные биоразлагаемые алифатические сложные полиэфиры включают смолы на основе полимолочной кислоты, полибутиленсукцинат и т.п., и смолы на основе полимолочной кислоты, являются особенно предпочтительными.
Молекулярная масса биоразлагаемого алифатического сложного полиэфира конкретно не ограничена, и средневзвешенная молекулярная масса биоразлагаемого алифатического сложного полиэфира предпочтительно находится в диапазоне от 5000 до 1000000, более предпочтительно в диапазоне от 10000 до 500000, принимая во внимание механические характеристики и пригодность для обработки при изготовлении контейнера и т.п. посредством использования биоразлагаемой смолы, содержащей алифатический сложный полиэфир.
При необходимости известные добавки, такие как пластификаторы, термостабилизаторы, светостабилизаторы, антиоксиданты, поглотители ультрафиолетовых лучей, антипирены, красители, пигменты, наполнители, противоадгезионные средства, антистатики, отдушки, смазочные средства, пенообразующие средства, антибактериальные/противогрибковые средства и нуклеирующие агенты, можно смешивать с биоразлагаемой смолой, подлежащей разложению посредством способа по первому аспекту настоящего изобретения. Кроме того, можно смешивать смолу, за исключением биоразлагаемого алифатического сложного полиэфира, если это не уменьшает эффект настоящего изобретения. Например, можно смешивать водорастворимые смолы, такие как полиэтиленгликоль и поливиниловый спирт, и также можно смешивать полиэтилен, полипропилен, этилен-пропиленовый сополимер, кислотно-модифицированный полиолефин, сополимер этилена и метакриловой кислоты, этилен-винилацетатный сополимер, иономерную смолу, полиэтилентерефталат, полибутилентерефталат, поливинилацетат, поливинилхлорид, полистирол, полиэстеровый каучук, полиамидный каучук, стирол-бутадиен-стирольный сополимер и т.п.
Следует отметить, что для повышения разлагаемости вышеописанной ферментативно разлагаемой смолы гидролизуемую смолу, ускоряющую разложение сложного эфира (далее в настоящем документе в некоторых случаях сокращенно обозначаемую как «смола, разлагающая сложный эфир»), можно смешивать с ферментативно разлагаемой смолой.
Эта смола, разлагающая сложный эфир, не проявляет какой-либо способности разложения сложного эфира, когда смола, разлагающая сложный эфир, присутствует в отдельности, но смола, разлагающая сложный эфир, выделяет кислоту или щелочь, которая функционирует в качестве катализатора разложения сложного эфира при смешивании с водой.
В основном, смола, разлагающая сложный эфир, равномерно растворяется во внутренней части вышеописанной гидролизуемой смолы, которая имеет низкую гидролизуемость, и кислота или щелочь, выделяющаяся из смолы, разлагающей сложный эфир, ускоряет гидролиз гидролизуемой смолы. В этом отношении, например, в качестве смолы, разлагающей сложный эфир, используют смолу, разлагающую сложный эфир, со средневзвешенной молекулярной массой приблизительно от 1000 до 200000.
Кроме того, можно использовать смолы, разлагающие сложный эфир с выделением щелочи, альгинат натрия, акрилат щелочного металла, такой как акрилат натрия, и т.п. Однако выделение щелочи оказывает большое негативное воздействие на окружающую среду. Таким образом, особенно предпочтительным является использование смол с выделением кислоты.
В качестве смолы, разлагающей сложный эфир с выделением кислоты, в частности, предпочтительным является использование полимера с уровнем pH (при 25°C) 4 или ниже, особенно предпочтительно 3 или ниже в водном растворе или водной дисперсии при концентрации 0,005 г/мл и который с легкостью гидролизуется при смешивании с водой, выделяя кислоту.
Примеры вышеописанных полимеров включают полиоксалаты, полигликолевую кислоту и т.п. Этими полимерами могут быть сополимеры. Альтернативно, один из этих полимеры можно использовать в отдельности или можно использовать комбинацию двух или более из перечисленных.
Примеры компонентов, образующих сополимеры, включают полиолы, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль, бутандиол, октанедиол, додеканедиол, неопентилгликоль, глицерин, пентаэритритол, сорбитан, бисфенол A и полиэтиленгликоль; дикарбоновые кислоты, такие как янтарная кислота, адипиновая кислота, себациновая кислота, глутаровая кислота, декандикарбоновая кислота, циклогександикарбоновая кислота, терефталевая кислота, изофталевая кислота и антрацендикарбоновая кислота; гидроксикарбоновые кислоты, такие как гликолевая кислота, L-молочная кислота, D-молочная кислота, гидроксипропионовая кислота, гидроксимасляная кислота, гидроксивалериановая кислота, гидроксикапроновая кислота, миндальная кислота и гидроксибензойная кислота; лактоны, такие как гликолид, капролактон, бутиролактон, валеролактон, пропиолактон и ундекалактон; и т.п.
Следует отметить, что в настоящем описании полимер, такой как гомополимер, сополимер или смесь, в которой щавелевая кислота полимеризуется в качестве по меньшей мере одного мономера, обозначен как полиоксалат.
Вышеописанные полиоксалаты и полигликолевая кислота являются легкогидролизуемыми смолами и быстро гидролизуются. По этой причине вышеописанные полиоксалаты и полигликолевую кислоту особенно отличает способность быстрого гидролиза трудногидролизуемых смол. Из их числа полиоксалаты, в особенности полиэтиленоксалат, проявляют значительно более выраженную способность быстрого гидролиза, чем полигликолевая кислота, и способны в существенной степени ускорить гидролиз трудногидролизуемой смолы, такой как полимолочная кислота, даже при температуре 80°C или ниже. Кроме того, стоимость полиоксалатов намного ниже, чем полигликолевой кислоты, что является значительным преимуществом в отношении затрат.
Биоразлагаемая смола, разлагаемая способом по первому аспекту настоящего изобретения, может быть в форме осадка, пленки, порошка, однослойного волокна, двухкомпонентного волокна с оболочкой, капсулы или т.п. Однако форма не ограничивается ими, и биоразлагаемую смолу можно получать способом, известным per se.
Фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, используемый в первом аспекте настоящего изобретения, конкретно не ограничен, при условии, что фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, имеет оптимальный уровень 7,5 или выше и, как правило, разлагает биоразлагаемую смолу. Специалист в данной области может использовать любой фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу. Оптимальным уровнем pH вышеописанного фермента является более предпочтительно 8,0 или выше и еще более предпочтительно 8,5 или выше. Ферментом предпочтительно является щелочная протеаза, щелочная целлюлаза, эстераза, кутиназа, липаза или т.п., и, например, можно использовать Савиназу производства Novozymes. Специалист в данной области может определить количество фермента, при необходимости, и количество фермента можно определять, например, в соответствии с видом биоразлагаемой смолы, подлежащей разложению, и т.п. на основе единицы активности, конкретной для используемого фермента.
Буферный раствор, используемым в первом аспекте настоящего изобретения, является таким, в котором отсутствует анион, полученный из буферного компонента в одной части уравнения равновесия буферного действия буферного раствора, и уровень pH буферного раствора корректируют в пределах диапазона pH, создающего условия для сдвига уравнения в ту сторону, в которой отсутствует анион. Такие буферные растворы включают те, которые содержат, например, буферный раствор трис-гидрохлорида(трисаминометана), буферный раствор 2-(циклогексиламино)этансульфоновой кислоты (CHES), буферный раствор Гуда, такой как бис-трис-буферный раствор, буферный раствор MOPS или буферный раствор HEPES, в качестве буферного компонента. Вышеописанный буферный раствор используют при корректировке уровня pH в пределах диапазона, создающего условия для сдвига уравнения в ту сторону, в которой отсутствует анион. Кроме того, исходя из допущения, что удовлетворено вышеописанное условие уровня pH, уровень pH буферного раствора также предпочтительно составляет 7,5 или выше, более предпочтительно 8,0 или выше и в особенности предпочтительно 8,5 или выше, 9,0 или выше, 9,5 или выше или 10,0 или выше.
В первом аспекте настоящего изобретения фраза «диапазон pH, создающий условия для сдвига уравнения в ту сторону, в которой отсутствует анион (полученный из буферного компонента)» полностью не исключает присутствие аниона, полученного из буферного компонента, в буферном растворе. Как правило, на основании значения константы диссоциации равновесия (согласно уравнению равновесия) диапазон pH, создающий условия для сдвига уравнения в ту сторону, в которой отсутствует анион, можно определять как диапазон, находящийся выше или ниже значения константы диссоциации. При условии удовлетворения вышеописанных условий pH буферного раствора может находиться за пределами буферного действия диапазона pH.
Например, при использовании в качестве буферного раствора буферного раствора трис-гидрохлорида (трисаминометана) (константа диссоциации =8,06) (см. пример 1-1, описанный далее) уровень pH может быть выше чем 8,06, и, например, уровень pH может быть 8,5 или выше, 9,0 или выше, 10,0 или выше, 10,5 или выше и т.д. Аналогично, при использовании буферного раствора CHES (константа диссоциации =9,3) (см. пример 1-2, описанный далее) уровень pH может быть ниже чем 9,3, и, например, уровень pH может быть 9,0 или ниже, 8,5 или ниже, 8,0 или ниже и т.д. Учитывая активный диапазон pH фермента, нижней границей уровня pH буферного раствора является предпочтительно 7,5 или выше, 8,0 или выше, 8,5 или выше и т.п.
Кроме того, специалист в данной области может определить, при необходимости, концентрацию буферного раствора и можно использовать буферный раствор с концентрацией солей, например, от 10 мМ до 200 мМ, предпочтительно от 50 мМ до 150 мМ.
Кроме того, при необходимости специалист в данной области может определять такие условия, как время и температура, для разложения биоразлагаемой смолы в буферном растворе, в соответствии с видом и количеством используемого фермента и биоразлагаемой смолы.
2. Между тем, второй аспект настоящего изобретения относится к способу разложения биоразлагаемой смолы, включающему разложение биоразлагаемой смолы в жидкости ферментативной реакции, содержащей фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, с оптимальной концентрацией, где разложение осуществляют в реакционной жидкости с концентрацией фермента, обеспечивающей коэффициент разложения биоразлагаемой смолы, составляющий 60% или выше, коэффициент разложения биоразлагаемой смолы при указанной оптимальной концентрации рассматривается как 100%.
Биоразлагаемая смола используемая во втором аспекте настоящего изобретения, конкретно не ограничена, и используют алифатический сложный полиэфир, который, как правило, является биоразлагаемым и т.п., как в случае вышеописанного первого аспекта настоящего изобретения. Такие же алифатические сложные полиэфиры, как те, которые описаны выше в первом аспекте настоящего изобретения, можно использовать в отношении всех пунктов, включая конкретные виды алифатических сложных полиэфиров, пригодные компоненты, образующие сополимеры, пригодные добавки, пригодные смолы, разлагающие сложный эфир, применимые формы и т.п.
В основном, фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, используемый во втором аспекте настоящего изобретения, конкретно не ограничен, при условии, что фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, имеет оптимальную концентрацию (т.е. пик разложения, зависящий от концентрации фермента), обеспечивающую максимально эффективное разложение биоразлагаемой смолы в растворе. Специалист в данной области может определить, при необходимости, вышеописанный фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, посредством проведения испытания и т.п. Например, щелочные протеазы, как правило, имеют оптимальную концентрацию для активности разложения биоразлагаемой смолы. Во втором аспекте настоящего изобретения предпочтительно можно использовать Савиназу, Эсперазу и т.п. Кроме того, оптимальным уровнем pH фермента, разлагающего биоразлагаемую смолу, используемого во втором аспекте настоящего изобретения, является предпочтительно 7,5 или выше, более предпочтительно 8,0 или выше и еще более предпочтительно 8,5 или выше.
В качестве концентрации фермента в реакционной жидкости, используемой в способе разложения биоразлагаемой смолы по второму аспекту настоящего изобретения, используется концентрация фермента, обеспечивающая коэффициент разложения биоразлагаемой смолы, составляющий 60% или выше, предпочтительно 70% или выше, более предпочтительно 80% или выше, особенно предпочтительно 90% или выше, где коэффициент разложения биоразлагаемой смолы при оптимальной концентрации, при которой достигается максимальное разложение биоразлагаемой смолы, рассматривается как 100%. Оптимальную концентрацию можно определять экспериментальным путем с помощью фактически осуществляемого разложения биоразлагаемой смолы в многочисленных реакционных жидкостях с различной концентрацией фермента. Во втором аспекте настоящего изобретения оптимальную концентрацию фермента для разложения биоразлагаемой смолы предпочтительно определяют, исходя из концентрации фермента на единицу площади поверхности биоразлагаемой смолы, не подвергнутой разложению. Возможно определение экспериментальным путем концентрации фермента, обеспечивающей максимальный коэффициент разложения биоразлагаемой смолы в реакционной жидкости, указанной в настоящей заявке, в соответствии с площадью поверхности биоразлагаемой смолы с любой массой или формой, такой как пленка, осадок или порошок.
В отношении площади поверхности биоразлагаемой смолы, когда биоразлагаемая смола находится в форме пленки, для удобства можно использовать площадь поверхности, рассчитываемую, исходя из двумерной величины верхнего и нижнего края пленки. Между тем, для осадка, порошка, однослойного волокна, двухкомпонентного волокна с оболочкой, капсулы и т.п., можно применять определение площади поверхности посредством расчета площади поверхности на основе метода проницаемости, метода адсорбции газа или измерения величины.
Буферный раствор, используемый во втором аспекте настоящего изобретения, конкретно не ограничен, при условии, что буферный раствор в основном используется с целью стабилизации уровня pH. Такие буферные растворы включают буферный раствор глицин-гидрохлорида, фосфатный буферный раствор, буферный раствор трис-соляной кислоты (трисаминометана), буферный раствор 2-(циклогексиламино)этансульфоновой кислоты (CHES), ацетатный буферный раствор, цитратный буферный раствор, цитрат-фосфатный буферный раствор, боратный буферный раствор, тартратный буферный раствор, буферный раствор глицин-гидроксида натрия и т.п. Кроме того, можно использовать твердый нейтрализующий агент, и его примеры включают карбонат кальция, хитозан, депротонированированные ионообменные смолы и т.п. Во втором аспекте настоящего изобретения предпочтительным является буферный раствор с буферной способностью в диапазоне pH от 7 до 12, более предпочтительно использовать буферный раствор с буферной способностью в диапазоне pH от 8 до 11 и еще более предпочтительно от 8,5 до 10,5. Во втором аспекте настоящего изобретения буферный раствор трис-соляной кислоты (трисаминометана) и буферный раствор 2-(циклогексиламино)этансульфоновой кислоты (CHES) являются предпочтительными, и буферный раствор 2-(циклогексиламино)этансульфоновой кислоты (CHES) является особенно предпочтительным.
При необходимости специалист в данной области может определять уровень pH буферного раствора в соответствии с видом используемого фермента и т.п., и предпочтительно он может составлять 7,5 или выше, более предпочтительно 8,0 или выше и особенно предпочтительно 8,5 или выше, 9,0 или выше, 9,5 или выше или 10,0 или выше.
Кроме того, специалист в данной области может определять концентрацию буферного раствора, при необходимости. Например, можно использовать буферный раствор с концентрацией солей от 10 мМ до 200 мМ и предпочтительно от 50 мМ до 150 мМ.
При необходимости специалист в данной области может определять такие условия, как время и температура, для разложения биоразлагаемой смолы в буферном растворе, в соответствии с видом и количеством используемого фермента и биоразлагаемой смолы.
ПРИМЕРЫ
Далее следует более конкретное описание настоящего изобретения на основе примеров.
1. Тест на ферментативное разложение биоразлагаемой пленки в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения
Разлагающие жидкости получали посредством 100 мкл жидкого фермента Савиназы к 30 мл каждого из буферных растворов, полученных при 100 мМ с pH 10,5 (только буферные растворы CHES получали с уровнями pH 9,0 и 10,5). Образцы, вырезанные из пленки из полимолочной кислоты, размером 2 см×2 см (120 мг) погружали в разлагающую жидкость, затем встряхивали при 45°C и при 100 об/мин в течение 16 часов. Образцы пленки вынимали через 16 часов и сушили при 70°C в течение 3 часов. Величину разложения определяли следующим образом:
Исходная масса пленки - масса после разложения = величина разложения (мг).
Получение пленки из полимолочной кислоты
Пленку из полимолочной кислоты получали из полимолочной кислоты (производства NatureWorks LLC) посредством использования Labo Plastomill (производства Toyo Seiki Seisaku-sho, Ltd.) при 210°C. Толщина пленки из полимолочной кислоты составляла 100 мкм.
Использовали следующие ферменты, разлагающие биоразлагаемую смолу:
Жидкий фермент Савиназа
Использовали 16,0 л Савиназы (Novozymes).
Использовали следующие буферные растворы.
(i) трис-буферный раствор (от 7,0 до 9,0; константа диссоциации=8,06)
(ii) буферные растворы CHES (от 8,6 до 10,0; константа диссоциации =9,3)
(iii) фосфатный буферный раствор (от 5,8 до 8,0; константа диссоциации 1=2,12, константа диссоциации 2=7,21, константа диссоциации 3=12,67)
(iv) бициновый буферный раствор (от 7,0 до 9,0; константа диссоциации =8,06)
(v) буферный раствор TAPS (от 7,5 до 9,4; константа диссоциации =8,44)
(vi) трициновый буферный раствор (от 7,2 до 9,1; константа диссоциации 1=2,3, константа диссоциации 2=8,15)
В отношении буферных растворов CHES(ii), описанных выше, получали два раствора с pH 9,0 и 10,5, и pH других использованных буферных растворов корректировали до 10,5.
(ПРИМЕР 1-1)
Разлагающую жидкость получали посредством добавления 100 мкл жидкого фермента Савиназы к 30 мл трис-буферного раствора, полученного при 100 мМ с pH 10,5. Образец, вырезанный из пленки из полимолочной кислоты, размером 2 см×2 см (120 мг) погружали в разлагающую жидкость, затем встряхивали при 45°C и при 100 об/мин в течение 16 часов. Пленку вынимали через 16 часов и сушили при 70°C в течение 3 часов. Величину разложения определяли следующим образом:
Исходная масса пленки - масса после разложения = величина разложения (мг).
(ПРИМЕР 1-2)
Пример 1-2 проводили таким же образом, как пример 1-1, за исключением того, что в качестве буферного раствора использовали буферный раствор CHES, полученный при 100 мМ с pH 9,0.
(СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1-1)
Сравнительный пример 1-1 проводили таким же образом, как пример 1-1, за исключением того, что в качестве буферного раствора использовали фосфатный буферный раствор.
(СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1-2)
Сравнительный пример 1-2 проводили таким же образом, как пример 1-1, за исключением того, что в качестве буферного раствора использовали бициновый буферный раствор.
(СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1-3)
Сравнительный пример 1-3 проводили таким же образом, как пример 1-1, за исключением того, что в качестве буферного раствора использовали буферный раствор TAPS.
(СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1-4)
Сравнительный пример 1-4 проводили таким же образом, как пример 1-1, за исключением того, что в качестве буферного раствора использовали трициновый буферный раствор.
(СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1-5)
Сравнительный пример 1-5 проводили таким же образом, как пример 1-2, за исключением того, что pH буферного раствора CHES корректировали до 10,5.
Результаты разложения пленки из полимолочной кислоты в примерах 1-1 и 1-2 и сравнительных примерах с 1-1 по 1-5 показаны ниже в таблице 1 и на фиг. 1.
Исходя из результатов, можно сделать вывод о высокой степени разложения пленки из полимолочной кислоты в каждом из примеров 1-1 и 1-2, в котором использовали буферные растворы, указанные в настоящей заявке.
| ТАБЛИЦА 1 | |||
| Вид буферного раствора | pH буферного раствора | Величина потери массы (мг) | |
| Пример 1-1 | Трис | 10,5 | 55,65 |
| Пример 1-2 | CHES | 9,0 | 35,37 |
| Сравн.пр. 1-1 | Фосфорная кислота | 10,5 | 0 |
| Сравн.пр. 1-2 | Бицин | 10,5 | 0,08 |
| Сравн.пр. 1-3 | TAPS | 10,5 | 0,72 |
| Сравн.пр. 1-4 | Трицин | 10,5 | 1,89 |
| Сравн.пр. 1-5 | CHES | 10,5 | 2,00 |
2. Испытание по ферментативному разложению биоразлагаемой пленки в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения
Образцы, вырезанные из пленки из полимолочной кислоты, размером 2 см×2 см (120 мг) погружали в разлагающую жидкость, полученную посредством добавления жидких ферментов - Савиназы, Эсперазы или Протеиназы K - к 30 мл из 100 мМ буферного раствора CHES (pH 9,0), затем встряхивали при 45°C и при 100 об/мин в течение 16 часов. Образцы пленки вынимали через 16 часов и сушили при 70°C в течение 3 часов. Величину разложения определяли следующим образом:
Исходная масса пленки - масса после разложения = величина разложения (мг).
Кривая зависимости величины разложения на единицу площади, равная величине разложения (мг), разделенной на исходную площадь поверхности (8 см2) пленки, изображена на вертикальной оси, а на горизонтальной оси нанесены данные исходного количества фермента, добавленного на единицу площади, равного исходной концентрации фермента (мг/мл), поделенной на исходную площадь поверхности (8 см2) пленки. Ферменты с оптимальной концентрацией были отмечены ○, и другой фермент был отмечен x. Кроме того, концентрации, при которых наблюдали коэффициент разложения 60% или выше, были отмечены ○, и концентрации, при которых наблюдали коэффициент разложения менее чем 60%, были отмечены x, коэффициент разложения при оптимальной концентрации принимали за 100%.
Получение пленки из полимолочной кислоты
Пленку из полимолочной кислоты получали из полимолочной кислоты (производства NatureWorks LLC) посредством использования Labo Plastomill (производства Toyo Seiki Seisaku-sho, Ltd.) при 210°C. Толщина пленки из полимолочной кислоты составляла 100 мкм.
Использовали следующие ферменты, разлагающие биоразлагаемую смолу.
(i) жидкий фермент Савиназа
Использовали Савиназу 16,0 л (Novozymes).
(ii) жидкий фермент Эспераза
Использовали Эсперазу 8,0 л (Novozymes).
(iii) раствор фермента Pro K (Протеиназы K)
В 1 мл 0,05 M трис-HCl буферного раствора (pH 8,0), содержащего 50 % масс./масс. глицерина, растворяли 20 мг порошка Протеиназы K, полученной из Tritirachium album. Использовали полученный таким образом раствор фермента pro K (Протеиназы K).
(ПРИМЕР 2-1)
Образец, вырезанный из пленки из полимолочной кислоты, размером 2 см×2 см (120 мг) погружали в 30 мл из 100 мМ буферного раствора CHES (pH 9,0), к которому добавляли 50 мкл жидкого фермента Савиназа, затем встряхивали при 45°C и при 100 об/мин в течение 16 часов. Пленку вынимали через 16 часов и сушили при 70°C в течение 3 часов. Величину разложения определяли следующим образом:
Исходная масса пленки - масса после разложения = величина разложения (мг).
(Примеры c 2-2 по 2-6 и cравнительные примеры c 2-1 по 2-18)
Испытания по ферментативному разложению проводили посредством использования такого же буферного раствора, пленки из молочной кислоты при условиях разложения, которые описаны в примере 2-1, и изменении раствора ферментов и количестве раствора ферментов, показанном ниже в таблице 2.
Ниже в таблице 2 и на фигурах с 2 по 4 показаны условия испытаний в примерах и сравнительных примерах и результаты испытаний по разложению.
| Присутствие/ отсутствие оптимальной концентрации |
Количество фермента, добавленного к разлагающей жидкости (мкл) | Концентрация фермента на единицу площади (мг/мл/см2) | Величина потери массы (мг) | Коэффициент разложения относительно величины разложения при оптимальной концентрации (%) | |
| Пример 2-1 | ○ | Савиназа 50 мкл | 0,078 | 8,36 | 72,99 |
| Пример 2-2 | ○ | Савиназа 100 мкл | 0,156 | 11,45 | 100 |
| Пример 2-3 | ○ | Савиназа 200 мкл | 0,313 | 10,76 | 93,95 |
| Пример 2-4 | ○ | Эспераза 50 мкл | 0,078 | 6,75 | 65,65 |
| Пример 2-5 | ○ | Эспераза 100 мкл | 0,156 | 9,98 | 97,09 |
| Пример 2-6 | ○ | Эспераза 200 мкл | 0,313 | 10,28 | 100 |
| Пример 2-7 | ○ | Эспераза 500 мкл | 0,781 | 7,5 | 72,99 |
| Сравн.пр. 2-1 | ○ | Савиназа 1 мкл | 0,002 | 0,06 | 0,53 |
| Сравн.пр. 2-2 | ○ | Савиназа 2 мкл | 0,003 | 0,07 | 0,58 |
| Сравн.пр. 2-3 | ○ | Савиназа 5 мкл | 0,008 | 0,13 | 1,15 |
| Сравн.пр. 2-4 | ○ | Савиназа 10 мкл | 0,016 | 0,46 | 4,03 |
| Сравн.пр. 2-5 | ○ | Савиназа 20 мкл | 0,031 | 2,35 | 20,49 |
| Сравн.пр. 2-6 | ○ | Савиназа 500 мкл | 0,781 | 5,5 | 48,11 |
| Сравн.пр. 2-7 | ○ | Савиназа 1000 мкл | 1,563 | 1,39 | 12,14 |
| Сравн.пр. 2-8 | ○ | Эспераза 1 мкл | 0,002 | 0,05 | 0,46 |
| Сравн.пр. 2-9 | ○ | Эспераза 2 мкл | 0,003 | 0,06 | 0,55 |
| Сравн.пр. 2-10 | ○ | Эспераза 5 мкл | 0,008 | 0,16 | 1,57 |
| Сравн.пр. 2-11 | ○ | Эспераза 10 мкл | 0,016 | 0,56 | 5,45 |
| Сравн.пр. 2-12 | ○ | Эспераза 20 мкл | 0,031 | 2,52 | 24,47 |
| Сравн.пр. 2-13 | ○ | Эспераза 1000 мкл | 1,562 | 2,36 | 22,96 |
| Сравн.пр. 2-14 | × | Протеиназа K 1 мкл | 0,083 | 0,0002 | - |
| Сравн.пр. 2-15 | × | Протеиназа K 100 мкл | 8,33 | 0,02 | - |
| Сравн.пр.. 2-16 | × | Протеиназа K 200 мкл | 16,67 | 0,09 | - |
| Сравн.пр. 2-17 | × | Протеиназа K 500 мкл | 41,67 | 0,42 | - |
| Сравн.пр. 2-18 | × | Протеиназа K 1000 мкл | 83,33 | 0,66 | - |
Как можно понять по фиг. 2 и 3, каждая из Савиназы и Эсперазы, являющихся разлагающими ферментами, обозначенными во втором аспекте настоящей заявки, имеет оптимальную концентрацию, обеспечивающую максимальное разложение биоразлагаемой смолы при различной концентрации фермента на единицу площади поверхности. В противоположность этому, фермент Протеиназа K, которую, как правило, используют в способах разложения, не имеет оптимальной концентрации, обеспечивающей максимальное разложение биоразлагаемой смолы, как показано на фиг. 4. Кроме того, даже при общепринятом использовании фермента, разлагающего биоразлагаемую смолу, с оптимальной концентрацией, не распознается присутствие пика разложения на основе концентрации фермента на единицу площади поверхности биоразлагаемой смолы, и разложение осуществляется при концентрации фермента, когда невозможно достижение высокой степени разложения. Во втором аспекте настоящего изобретения выявлено, что свойство оптимальной концентрации конкретного фермента можно использовать для повышения коэффициента разложения в условиях для разложения биоразлагаемой смолы в буферном растворе.
1. Способ разложения биоразлагаемой смолы, включающий разложение биоразлагаемой смолы в буферном растворе, содержащем фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, с оптимальным уровнем pH, составляющим 7,5 или выше, где буферный раствор представляет собой раствор трис-аминометана, pH которого доведен до уровня 9,5 или выше.
2. Способ по п. 1, где фермент, разлагающий биоразлагаемую смолу, является щелочной протеазой.
3. Способ разложения биоразлагаемой смолы, включающий разложение биоразлагаемой смолы в буферном растворе, содержащем савиназу и/или эсперазу, где
(i) определяют оптимальную концентрацию фермента, при которой достигается максимальное разложение биоразлагаемой смолы в реакционном растворе, и
(ii) осуществляют разложение биоразлагаемой смолы в буферном растворе с концентрацией фермента, обеспечивающей коэффициент разложения биоразлагаемой смолы, составляющий 60% или выше, где коэффициент разложения биоразлагаемой смолы при указанной оптимальной концентрации рассматривается как 100%.
4. Способ по п. 3, где на стадии (i) оптимальную концентрацию фермента определяют, исходя из расчета концентрации фермента на единицу площади поверхности биоразлагаемой смолы до ее разложения.
5. Способ по п. 3 или 4, где разложение биоразлагаемой смолы осуществляют в буферном растворе, содержащем фермент в оптимальной концентрации, определенной на стадии (i).
6. Способ по любому из пп. 3-5, где буферный раствор содержит буферный раствор трис-аминометана или буферный раствор 2-(циклогексиламино)этансульфоновой кислоты.
7. Способ по любому пп. 1-6, где биоразлагаемая смола содержит смолу на основе полимолочной кислоты.
8. Способ по любому пп. 1-7, где биоразлагаемая смола представлена в форме гранул, пленки, порошка, однослойного волокна, двухкомпонентного волокна с оболочкой или капсулы.
