Способ прогнозирования раннего развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки

Авторы патента:

Курамшина Ольга Анатольевна (RU)

Крюкова Антонина Яковлевна (RU)

Габбасова Лилия Вадимовна (RU)

Нургалиева Альфия Хаматьяновна (RU)

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

Владельцы патента RU 2652275:

Курамшина Ольга Анатольевна (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и касается раннего прогнозирования язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБДПК) у татар Республики Башкортостан в возрасте до 45 лет. Сущность способа: выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфизма rs1800872 гена IL10 методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом. При выявлении протективного генотипа А/А прогнозируют низкий риск развития ЯБДПК у лиц татарской этнической принадлежности в возрасте до 45 лет. Использование изобретения повышает точность прогноза за счет определения патогенетического механизма воспаления, упрощает исследование. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, гастроэнтерологии, генетике.

Значительная распространенность язвенной болезни (ЯБ) двенадцатиперстной кишки среди населения молодого возраста, хроническое рецидивирующее течение, вызывающее большие трудопотери и серьезные для жизни осложнения указывают на актуальность проблемы диагностики этого заболевания.

В настоящее время большинство гастроэнтерологов рассматривают ЯБ как мультифакторное, полиэтиологическое заболевание, имеющее наследственную предрасположенность [В.Т. Ивашкин, Т.П. Лапина, И.В. Маев, В.В. Чернин, Я.С. Циммерман и др.]. Известно наличие конкретных генетических факторов, обусловливающих наследственную предрасположенность к ЯБ.

В настоящее время в патогенезе ЯБ большую роль отводят цитокинам, в связи с чем проводится активное изучение генов провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, IL-8 и TNF-α для прогнозирования риска развития заболевания.

Известен способ прогнозирования вероятности возникновения язвенной болезни 12-перстной кишки (ЯБДПК), который основан на определении генетических маркеров системы АВО, систем MN, Р, Льюис, иммуноглобулина Gm 1, типа гаптоглобина (Hp), трансферрина (Tf), альфа-1-антитрипсина (αI-AT), кислой фосфатазы (АСР), фосфоглюкомутазы (PGM), эстеразы D (EsD). Определяют тип ушной серы. Каждому маркеру определяют прогностический коэффициент (ПК), суммируют полученные ПК. При сумме ПК, равной + 10 и выше, прогнозируют предрасположенность к развитию язвенной болезни 12-перстной кишки [патент РФ №2143684 от 27.12.1999]. Недостатком метода является необходимость исследования большого количества генетических маркеров и расчет суммарного ПК.

Известен способ раннего прогнозирования развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов Республики Хакасия, заключающийся в том, что проводят выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови и выявление генотипа СС АА полиморфизма + 3953 гена IL-1 методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и R2R2 IL-1Ra VNTR у пациентов носителей генотипа sls2 vacA Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции; установленным факторам риска присваивают градации (А1-А2) и числовые значения; после чего определяют прогностические коэффициенты P1, Р2 по формулам: Р1=-1,54+0,57⋅А1+0,53⋅А2 и Р2=0,21+1,77⋅А1+1,70⋅А2, где А1 - генотип полиморфизма С+3953Т IL-1: ТТ=0,44, TC=0,51, СС=2,63; А2 - генотип полиморфизма IL-1Ra VNTR: R2R2=1,74, R2R3=8,08, R2R4=1,33, R3R3=1,59, R3R4=0,30, R4R4=0,51 при P1>P2 прогнозируют низкий риск, a при P1<P2 прогнозируют высокий риск развития ЯБ [патент РФ №2542459 от 20.02.2015]. Недостатком данного метод является трудоемкость подсчета.

Наиболее близким аналогом изобретения является диссертационное исследование Габбасовой Л.В. (Габбасова Л.В. Клинико-генетическое исследование язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. Дисс. к.м.н. Ижевск, 2013), в которой показано, что в группе контроля по сравнению с больными чаще встречаются генотип rs1800872*AA и аллель rs1800872*A (р=0,017, OR=0,091 и р=0,025, OR=0,544, соответственно). Основным недостаткам аналога является то, что в исследование включены пациенты разных возрастных групп (18-60 лет).

Задачей изобретения стала разработка способа прогнозирования развития ЯБДПК у народов Башкортостана в возрасте от 18 до 45 лет на основе генетических маркеров и факторов риска развития заболевания.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности прогноза за счет определения патогенетического механизма воспаления, упрощение исследования.

Указанный технический результат достигается тем, в способе прогнозирования развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБДПК) у татар Республики Башкортостан, включающем выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови, генотипирование полиморфного локуса rs1800872 гена IL10 методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом, прогнозирование низкого риска развития ЯБДПК при выявлении генотипа АА, согласно изобретению, прогнозируют низкий риск развития ЯБДПК у лиц в возрасте от 18 до 45 лет.

Отбор пациентов проводился на основании клинических, эндоскопических и морфологических данных после получения информированного согласия на участие в исследовании. Диагноз язвенной болезни двенадцатиперстной кишки верифицировался на основании данных эндоскопического исследования. В исследование не включались пациенты с сочетанной патологией, а также пациенты, получавшие в последние 6 месяцев антибактериальные, противовоспалительные препараты.

Нами проведено изучение распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта IL10 (-627C>А) у 128 больных ЯБДПК и 102 человек контрольной группы в возрасте от 18 до 45 лет методом ПЦР-анализа в этнически подразделенных выборках. Исследование продемонстрировало достоверную разницу в распределении частот генотипов данного полиморфного локуса у татар, недостоверную разницу у русских и в общей выборке, которым применяли дополнительно подсчет нормированного интенсивного показателя.

Использование предлагаемого способа диагностики обеспечивает высокую информативность своевременного прогнозирования развития ЯБДПК, обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Молекулярно-генетические методы

Материалом для генетического исследования служили образцы ДНК, выделенные из венозной крови больных башкир, русских, татар по этнической принадлежности. Молекулярно-генетические исследования выполнены совместно с лабораторией молекулярной генетики человека отдела геномики ФБГУН Института биохимии и генетики Уфимского Научного Центра РАН РБ. Объектом исследования служили образцы ДНК, полученные из лимфоцитов периферической венозной крови больных ЯБ, практически здоровых лиц. ДНК выделяли из венозной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции с небольшими модификациями (Mathew С., 1984; Johns М. Et al., 1989; Sambrook I., 1989). Идентификацию продуктов амплификации проводили в ультрафиолетовом свете после электрофореза в 7%-ном полиакриламидном геле. После гель окрашивали раствором бромистого этидия и анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе «Vilber Lourmat», ТСР-20 М. Размеры аллелей определяли путем одновременного электрофореза с маркером (ДНК фага λ, гидролизированного рестриктазой Pstf). При анализе электрофореграмм использовали видеогельдокументирующую систему.

Анализ полиморфных вариантов генов осуществляли методом ПЦР-ПДРФ с использованием локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров (Kato S. et al., 2001; Keso Т. et al., 2000) (табл. 1).

Выделение геномной ДНК

ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции по Мэтью [Mathew С.С., 1984]. Кровь набирали в пробирки, в качестве консерванта использовали глюгицир в соотношении 8:2 (кровь:глюгицир), тщательно перемешивали и хранили при температуре 4°С не более двух недель. Для получения фракции клеточных ядер к 8 мл крови добавляли 40 мл лизирующего буфера (320 мМ сахароза; 5 мМ MgCl2; 1% тритон Х-100; 10 мМ трис-HCl, pH=7,6) и центрифугировали 20 мин при температуре 40°С и 4000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, к осадку повторно приливали 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при тех же условиях в течение 10 мин. К полученному осадку добавляли 400 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, pH 8,0 и 75 мМ NaCl), 40 мкл 10% SDS, 30-40 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 16 часов. Из полученного лизата выделяли ДНК. Экстракцию ДНК проводили в три этапа: забуференным фенолом (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCI, pH 7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах. Выделение ДНК проводили, смешивая лизат и растворитель до образования однородной эмульсии, разделение фаз осуществляли центрифугированием при 10000-12000 об/мин в течение 10 мин. ДНК осаждали двумя объемами 96% этанола. Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали на воздухе, затем растворяли в дистиллированной воде и хранили при -20°С.

Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК

Амплификацию изученных локусов проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе "Терцик" производства компании «ДНК-технология» (г. Москва). Для амплификации использовали реакционную смесь объемом 25 мкл, которая содержала 2,5 мкл 10xTaq-буфера (67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 16,6 мМ (NH₄)₂SO_4,, 1,5 мМ MgCl₂, 0,01% Tween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP по 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Силекс», г. Москва) и 5-10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров.

Рестрикционный анализ

Для определения нуклеотидных замен проводили гидролиз амплифицированных фрагментов соответствующей рестриктазой. Метод электрофореза в полиакриламидном геле. Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном из 30% раствора ПААГ (соотношение акриламид:N,N'-метиленбисакриламид - 29:1). Электрофорез проводили в 1×ТБЕ буфере (0,089 М трис-HCl; 0,089 М борная кислота; 0,002 ЭДТА, pH=8,0). Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 15% фикола. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и фотографировали при УФ-освещении.

Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга использовали критерий χ² с поправкой Йейтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов (OR), рассчитывали его 95% доверительный интервал (95% CI) (Животовский Л.А., 1991) с использованием компьютерной программы R×C (ROW×Columns) по алгоритму Roff D.A. (1989).

Исследование продемонстрировало достоверную разницу в распределении частот генотипов данного полиморфного локуса у татар: установлено, что гомозиготный генотип А/А достоверно чаще встречается в группе контроля, чем у больных ЯБДПК 17,39% и 1,92% соответственно, р=0,022, OR=0,093, CI 95% (0,011-0,777).

Маркером пониженного риска развития ЯБДПК у индивидов этнической татарской принадлежности является генотип АА полиморфного варианта - 627С>A (rs1800872) гена IL10 (табл. 2).

Ramis I.B. et al., 2015 показали, что инфекция Н.р. вызывает воспаление, приводящее к увеличению IL-10. Анализ полиморфизма гена IL-10 в позиции 819 в биоптате 151 пациента с Н.р. – инфекцией, и 76 лиц без Н.р. показал высокую связь развития воспаления, вызванного Н.р.

Пример

Больной М., 28 лет, татарской этнической принадлежности. Без наследственной отягощенности, диагноз хронический гастрит. Проведено исследование по предлагаемой методике. Установлено: является носителем генотипа А/А полиморфного локуса rs1800872 гена IL10, так как данный генотип встречается с большей частотой в группе контроля, соответственно, в отношении развития ЯБДПК риск низкий. В процессе динамического наблюдения образование язвенного дефекта слизистой двенадцатиперстной кишки не наблюдалось.

Способ прогнозирования развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБДПК) в возрасте до 45 лет у татар Республики Башкортостан, включающий выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови, генотипирование гена интерлейкина методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфного локуса rs1800872 гена IL10 и при выявлении генотипа АА прогнозируют низкий риск развития ЯБДПК у татар.

Изобретение относится к области медицины, к биохимической лабораторной диагностике, а именно к способу определения карбонилированного тиоредоксина. Способ включает инкубацию 0,25 мл лизированных 1% раствором тритона Х-100 клеток с 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М НСl, связывающегося с карбонильными группами белков, инкубацию пробы при комнатной температуре в течение 1 ч, добавление 0,5 мл 20% ТХУ и центрифугирование при 11000 g 10 минут, промывание осадка 3 раза 1 мл раствора этанол: этилацетат (1:1) для экстракции избытка 2,4-динитрофенилгидразина, не прореагировавшего с карбонильными группами окисленных белков, высушивание осадка и ресуспендирование, дальнейшее инкубирование клеточного лизата с 0,5 мл магнитных частиц, нагруженных антителами к 2,4-динитрофенолу, в течение 3 ч при 25°С и непрерывном перемешивании.

Способ оценки рецептивности эндометрия в период "имплантационного окна" // 2651762

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна».

Способ диагностики хронического гастрита, ассоциированного с helicobacter pylori // 2651033

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori. Проводят иммунологическое исследование гепаринизированной венозной крови больных.

Способ выделения фукозилированных антител // 2650873

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу выделения антител, обладающих различными степенями фукозилирования. Способ основан на аффинности связывания антител с Fc-рецептором, иммобилизованными на подложке.

Антитела к родственной раково-эмбриональному антигену молекуле клеточной адгезии (сеасам) // 2650869

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к моноклональному антителу, которое специфично связывается с CEACAM1 человека. Настоящее изобретение также раскрывает полинуклеотид, кодирующий указанное антитело, плазмиду для его продукции, фармацевтическую и диагностическую композиции для лечения злокачественного новообразования, характеризующегося сверхэкспрессией CEACAM1, и для детекции CEACAM1 человека у индивидуума соответственно.

Композиция и способ для обнаружения биопленок на жизнеспособных тканях // 2650803

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены композиция, набор и способ для обнаружения присутствия биопленки в жизнеспособных тканях.

Антитела к h7cr // 2650756

Настоящая группа объектов изобретения относится к области иммунологии. Предложено антитело, которое специфически связывает B7-H7CR человека, и его антигенсвязывающий фрагмент.

Способ прогнозирования развития бронхолегочной дисплазии тяжелой степени у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела в неонатальном периоде // 2649830

Изобретение относится к области медицины, а именно к пульмонологии и неонатологии, и может быть использовано для раннего прогнозирования бронхолегочной дисплазии (БЛД) тяжелой степени у недоношенных детей, родившихся с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ).

Способ выбора тактики ведения родов у женщин при сахарном диабете // 2649778

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, и может быть использовано для выбора акушерской тактики у беременных с сахарным диабетом. Для этого в сыворотке крови беременной в 37-38 недель гестации определяют уровень ИЛ-1β и окситоцина.

Способ прогнозирования исхода острой ишемии миокарда // 2649774

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и касается способа прогнозирования исхода острой ишемии миокарда. Способ включает определение в плазме крови уровня свободно циркулирующей митохондриальной ДНК (мтДНК) крови методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с амплифицированием фрагмента гена 16S рРНК прямым и обратным праймерами.

Способ прогнозирования риска развития сердечно-сосудистой патологии у особи женского пола // 2652304

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования риска развития сердечно-сосудистой патологии у особи женского пола, который включает: определение уровня про-нейротензина 1-117 в сыворотке крови, плазме крови или цельной крови, корреляцию уровня про-нейротензина 1-117 с риском развития сердечно-сосудистой патологии, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска и где указанная сердечно-сосудистая патология представляет собой инфаркт миокарда, инсульт, острую сердечную недостаточность и смерть, связанную с инфарктом миокарда, инсультом или острой сердечной недостаточностью, и где уровень про-нейротензина 1-117 определен натощак. Изобретение обеспечивает эффективное прогнозирование риска развития сердечно-сосудистой патологии у особи женского пола. 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 21 табл., 3 пр.

Кассета для тестирования со встроенным передаточным модулем // 2652441

Изобретение относится к области клинических диагностических приспособлений. Система кассеты для тестирования содержит кожух кассеты, включающий по меньшей мере одно впускное отверстие для образца, множество камер для хранения, множество камер для реакций и сеть для текучей среды, соединяющую по меньшей мере одно впускное отверстие для образца, по меньшей мере часть множества камер для хранения и по меньшей мере часть множества камер для реакций с первым множеством проходов, расположенных на внутренней поверхности кожуха кассеты. Система также содержит полый передаточный модуль, расположенный в кожухе кассеты, содержащий второе множество проходов вдоль внешней поверхности передаточного модуля, которые ведут в передаточную камеру передаточного модуля, при этом передаточный модуль выполнен с возможностью перемещения в боковом направлении вдоль длины кожуха кассеты. При этом при перемещении в боковом направлении передаточный модуль выполнен с возможностью выравнивания по меньшей мере части первого множества проходов по меньшей мере с частью второго множества проходов. Изобретение позволяет устранить перекрестное загрязнение образцов в диагностическом оборудовании. 39 з.п. ф-лы, 26 ил.

Способ диагностики присоединения преэклампсии у беременных с хронической артериальной гипертензией // 2652447

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для диагностики присоединения преэклампсии у беременных женщин с хронической артериальной гипертензией в сроки гестации 24-37 недель. Сущность изобретения состоит в том, что у женщин с хронической артериальной гипертензией в 24-37 недель гестации в периферической венозной крови определяют показатель относительного содержания CD11b+ клеток в популяции лимфоцитов и при его значении более 19,8% диагностируют присоединение преэклампсии. Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью диагностировать преэклампсию у беременных женщин с хронической артериальной гипертензией, расширяет арсенал диагностических средств при данной патологии, что способствует снижению тяжелых осложнений при беременности, в родах, связанных с развитием преэклампсии, у данной категории пациенток, уменьшению частоты перинатальной патологии. Точность способа – 91,7%, чувствительность – 88,2%, специфичность – 96,2%. 3 пр., 1 табл.