Способ клонального микроразмножения алычи in vitro
Владельцы патента RU 2652953:
Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "МИКРОКЛОН" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения алычи in vitro, включающий культивирование микропобегов алычи на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л, при этом этап мультипликации проводят в два пассажа по три недели каждый, причем на второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения, а этап укоренения проводят в течение первых 2-7 суток в темноте, а затем - 1-2 недели на свету. Изобретение позволяет повысить эффективность производства корнесобственных микрорастений. 4 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности плодоводству, и может быть использовано для оздоровления и микроразмножения растений алычи in vitro.
В современном сельском хозяйстве широко используются достижения биотехнологии растений для получения оздоровленного быстрорастущего посадочного материала. Для этого используют способ клонального микроразмножения растений.
Род Слива (Prunus sp.) включает в себя около 40 видов, таких как слива домашняя (P. domestica), абрикос (P. armeniaca), персик (P. persica), миндаль (P. dulcis), лавровишня (P. laurocerasus) и алыча гибридная (или слива русская - P. rossica). Несмотря на близкое родство этих видов способы их размножения в культуре in vitro имеют значительные различия. Из-за того, что алыча гибридная - молодая плодовая культура, проведено мало работ по размножению ее в культуре in vitro.
Известен способ размножения плодовых деревьев, в частности персика, «Rapid Recovery of Shoots through Thin Stem Slices after Preconditioning of Micropropagated Fruit Tree Shoots» (патент США №6127182). Он включает подготовку эксплантов, культивирование их на подходящей среде для получения побегов, деление стеблей на тонкие поперечные срезы (1 мм и тоньше), культивирование их на среде до получения побегов. Основным недостатком данного способа размножения является то, что получаемые побеги образуются de novo. Это значительно увеличивает риск сомаклональных изменений, влекущих за собой потерю сортовых качеств.
Наиболее близким техническим решением из известных является «Оптимизация этапов клонального микроразмножения при массовом производстве растений» (Лебедев В.Г. с соавт. // Плодоводство и ягодоводство России. 2011, т. 26, с. 307-314). В нем на этапе мультипликации культивирование проводится на искусственной питательной среде QL (Quorin М. & Lepoivre P. Elude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus // Acta Hort. 1977. V. 78. P. 437-442) с добавлением сахарозы 30 г/л, 6-бензиламинопурина (БАП) 2 мг/л в течение 4 недель на свету, получающиеся конгломераты переносятся на 6 суток в темноту, после снова выставляются на свет на 4 суток, нормально сформированные побеги используются для укоренения. На этапе укоренения культивирование проводится на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, индолилуксусной кислоты (ИУК) 0,1-1 мг/л и/или индолилмасляной кислоты (ИМК) 0,1-1 мг/л, и/или нафтилуксусной кислоты (НУК) 0,1-1 мг/л в течение 2-4 недель. Его недостатками является: получаемые на этапе мультипликации экспланты очень хрупкие (ломкие), и при пересадке на среду укоренения большая часть побегов повреждается и гибнет; схема размножения сложна для исполнения в условиях производства из-за увеличения в 2 раза требуемой культуральной поверхности.
Целью предлагаемого изобретения является упрощение схемы производства, повышение выхода качественных микропобегов алычи на этапе мультипликации, увеличение общей эффективности микроразмножения алычи в культуре in vitro для получения качественного посадочного материала без признаков плагиотропности.
Поставленная цель достигается за счет того, что культивирование на этапе мультипликации делится на 2 пассажа по 3 недели каждый. На второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения. Для обоих пассажей используют среду QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л. Культивирование на этапе укоренения проводится на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л в течение первых 2-7 суток в темноте, после 1-2 недели на свету.
Суть изобретения состоит в том, что предлагаемый способ, заключающийся в культивировании микропобегов на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л в течение 2 пассажей по 3 недели каждый, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л в течение первых 2-7 суток в темноте, после 1-2 недели на свету, значительно повышает выход качественных микропобегов на этапе мультипликации, увеличивает эффективность укоренения микропобегов, ускоряет темпы роста, устраняет плагиотропный рост осевого побега и благодаря вышеперечисленному увеличивает эффективность производства корнесобственных микрорастений.
Анализ известных способов клонального микроразмножения растений, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует условию патентоспособности изобретения - «новизна».
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
1. В нестерильных условиях готовится питательная среда. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, мио-инозита, объем доводится дистиллированной водой, рН 5,6-5,8. После этого растворяется навеска агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 ати (=1 изб. атм) в течение 25 минут. В остывшую до 55°С среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов, регуляторов роста. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам. Все манипуляции с растительным материалом производятся в стерильных условиях ламинар-бокса. На всех этапах культивирования число эксплантов в сосудах составляет 15-25 шт.
2. Размножение растительного материала проводят на среде мультипликации QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л в течение 2 пассажей длительностью 3 недели каждый. После первого пассажа получают конгломераты почек и побегов. Их без разделения переносят на свежую среду второго пассажа. Коэффициент мультипликации рассчитывается как среднее количество микропобегов, полученное с одного конгломерата.
3. Полученные микропобеги отделяются от конгломерата. Часть эксплантов повторно проходят этап мультипликации, остальные микропобеги высаживаются на укоренение. В качестве среды для укоренения используется половинная по макросолям среда QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л. Первые 2-7 суток культивирование проводится в темноте, после этого экспланты переносятся на 1-2 недели на свет. Эффективность укоренения оценивается долей укорененных хорошо сформированных микрорастений от числа всех эксплантов, выраженной в процентах.
В таблицах 1-4 представлены результаты исследований по влиянию способа культивирования алычи гибридной на этапе мультипликации на эффективность каждого из этапов клонального размножения in vitro.
Для большинства культур растений при возникновении затруднений на этапе мультипликации, таких как малый коэффициент размножения, укорочение междоузлий или витрифицированность (стекловидность), изменяют длительность и/или концентрацию фитогормонов цитокининов в меньшую сторону. В случае алычи гибридной наблюдается обратный эффект - суммарное увеличенное цитокининовое воздействие значительно улучшило не только качество получаемых микропобегов, но и их количество (таблица 1).
Данный способ культивирования на этапе мультипликации также влияет и на последующие этапы выращивания. Так, на этапе укоренения увеличивается выход укорененных микрорастений (таблица 2).
Кроме того, у предлагаемого способа размножения имеются следующие положительные эффекты. Ускоряется темп роста после адаптации микрорастений в 1,3-2 раза. За счет более коротких сроков доращивания увеличивается темп производства стандартного посадочного материала (таблица 3). Преодолевается плагиотропность роста осевого побега некоторых сортов как в условиях in vitro, так и ex vitro (в условиях защищенного грунта. За счет этого увеличивается выход качественного посадочного материала (таблица 4).
Преимуществом предложенного способа размножения является увеличение выхода качественных микропобегов на этапе мультипликации, увеличение доли укорененных микропобегов и ускорение темпов роста растений после адаптации к естественным условиям роста.
Способ применен в опытно-производственных условиях. Он позволяет произвести до 4000 микрорастений с 1 квадратного метра световой поверхности культуральной комнаты за 1 месяц производства. Получено и высажено более 30 тысяч микрорастений.
Способ клонального микроразмножения алычи in vitro, включающий культивирование микропобегов алычи на этапе мультипликации на среде QL с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, БАП 0,5-2 мг/л и зеатина 0,05-1 мг/л, укоренение микропобегов на половинной по макросолям среде QL с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 9 г/л, ИУК 0,1-1 мг/л и/или ИМК 0,1-1 мг/л, и/или НУК 0,1-1 мг/л, при этом этап мультипликации проводят в два пассажа по три недели каждый, причем на второй пассаж переносят целые конгломераты почек и побегов без разделения, а этап укоренения проводят в течение первых 2-7 суток в темноте, а затем - 1-2 недели на свету.
